सध्याचा†सध्याचा पत्ता: OX11 0DE, UK, डायमंड बिल्डिंग, हार्वेल सायन्स अँड इनोव्हेशन पार्क, डायटकोट, ऑक्सफर्डशायर, UK, डायमंड लाईट सोर्स कं, लि., इलेक्ट्रॉनिक बायोलॉजिकल इमेजिंग सेंटर.
रिॲक्शन सेंटर लाईट-हार्वेस्टिंग कॉम्प्लेक्स १ (RC-LH1) हा जांभळ्या प्रकाशपोषी जीवाणूंचा मुख्य प्रकाशसंश्लेषक घटक आहे. आम्ही रोडोप्सुडोमोनास पॅलस्ट्रिसमधील RC-LH1 कॉम्प्लेक्सच्या दोन क्रायो-इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी संरचना सादर केल्या आहेत. RC-LH114-W कॉम्प्लेक्सच्या २.६५-Å रिझोल्यूशन संरचनेत RC च्या भोवती १४ सबयुनिट LH1 लूप्स असतात, जे प्रोटीन W द्वारे खंडित होतात, तर प्रोटीन-W शिवाय असलेले कॉम्प्लेक्स पूर्णपणे RC रचनेचे असून ते RC च्या भोवती बंद १६ सबयुनिट LH1 लूपने वेढलेले असते. या संरचनांची तुलना RC-LH1 कॉम्प्लेक्समधील क्विनोनच्या गतिशीलतेबद्दल अंतर्दृष्टी प्रदान करते, ज्यामध्ये RC QB साइटवर क्विनोन बांधताना होणारे पूर्वी अज्ञात रचनात्मक बदल, तसेच सहाय्यक क्विनोन बंधन साइट्सचे स्थान यांचा समावेश आहे, जे त्यांना RC पर्यंत पोहोचवण्यास मदत करतात. डब्ल्यू प्रोटीनची अद्वितीय रचना एलएच१ लूप बंद होण्यास प्रतिबंध करते, त्यामुळे क्विनोन/क्विनोलोन विनिमयाला गती देण्यासाठी एक मार्ग तयार होतो.
प्रकाशसंश्लेषणाद्वारे मिळणारी ऊर्जा पृथ्वीवरील जवळजवळ सर्व जीवसृष्टीला आधार देऊ शकते आणि सौर जैवतंत्रज्ञानासाठी त्यात मोठी क्षमता आहे. जागतिक प्रकाशसंश्लेषणाला चालना देताना, जांभळे प्रकाशपोषी जीवाणू विविध ऊर्जा पद्धती आणि चयापचय क्षमता देखील प्रदर्शित करतात. ते प्रकाशसंश्लेषण टाळू शकतात आणि अंधारात परपोषी जीवाणू म्हणून वाढू शकतात, नायट्रोजन आणि कार्बन डायऑक्साइडचे स्थिरीकरण करू शकतात, हायड्रोजन तयार करू शकतात आणि सुगंधी संयुगांचे विघटन करू शकतात (१-३). या प्रक्रियांसाठी ऊर्जा पुरवण्यासाठी, प्रकाशाचे जलद आणि कार्यक्षमतेने रासायनिक ऊर्जेमध्ये रूपांतर करणे आवश्यक आहे. ही प्रक्रिया तेव्हा सुरू होते जेव्हा प्रकाश-पकडणारा अँटेना कॉम्प्लेक्स प्रकाश शोषून घेतो आणि पकडलेली ऊर्जा प्रतिक्रिया केंद्राकडे (RC) हस्तांतरित करतो, ज्यामुळे चार्ज विभक्त होण्यास सुरुवात होते (४-७). जांभळ्या प्रकाशपोषी जीवाणूंमधील प्रकाशसंश्लेषणाचे मूलभूत एकक टाइप २ RC ने बनलेले असते, जे प्रकाश-संकलन कॉम्प्लेक्स १ (LH1) ने वेढलेले असते, ज्यामुळे RC-LH1 कोर कॉम्प्लेक्स तयार होतो. LH1 हे वक्र αβ हेटेरोडायमर्सच्या रचनेने बनलेले असते, ज्यापैकी प्रत्येक दोन जीवाणू क्लोरोफिल (BChl) a रेणू आणि एक किंवा दोन कॅरोटीनॉइड्सला बांधतो (८-१२). सर्वात सोप्या LH1 अँटेनामध्ये RC (9-13) ला एका बंद लूपमध्ये वेढलेले 16 किंवा 17 αβ हेटेरोडायमर्स असतात, परंतु इतर कोअर कॉम्प्लेक्समध्ये, ट्रान्समेम्ब्रेन पेप्टाइड्स सभोवतालच्या LH1 ची अखंडता खंडित करतात, ज्यामुळे RC आणि सायटोक्रोम bc1 कॉम्प्लेक्स (11, 13-15) दरम्यान क्विनॉल/क्विनोन प्रसारास प्रोत्साहन मिळते. जांभळी प्रकाशसंश्लेषी वनस्पती रोडोप्सुडोमोनास (Rps.) हा एक मॉडेल जीव आहे जो प्रकाशसंश्लेषणाला आधार देणारे ऊर्जा आणि इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण समजू शकतो. Rps. ची पहिली क्रिस्टल रचना. पॅलस्ट्रिस RC-LH1 कॉम्प्लेक्सचे मॉडेल म्हणजे RC, जे 15 हेटेरोडायमेरिक LH1 लूपने वेढलेले आहे, जे "प्रोटीन W" नावाच्या अज्ञात प्रथिनाद्वारे खंडित केले जाते (14). प्रोटीन-W नंतर RPA4402 म्हणून ओळखले गेले, जे तीन अंदाजित ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्स (TMH) असलेले एक वैशिष्ट्यहीन 10.5kDa प्रथिन आहे (16). RC-L, M (pufL, pufM) आणि LH1α, β (pufA, pufB) उपघटकांना एन्कोड करणाऱ्या जनुकांसाठी वापरल्या जाणाऱ्या नामकरणाशी सुसंगतता राखण्यासाठी, आम्ही प्रोटीन W ला एन्कोड करणाऱ्या rpa4402 जनुकाचे नाव बदलून pufW असे ठेवण्याचा प्रस्ताव करत आहोत. विशेष म्हणजे, प्रोटीन-W हे RC-LH1 च्या केवळ सुमारे १०% मध्येच आढळते, यावरून असे दिसून येते की Rps. palustris दोन भिन्न RC-LH1 कॉम्प्लेक्स तयार करते. येथे, आम्ही दोन मुख्य कॉम्प्लेक्सच्या उच्च-रिझोल्यूशन क्रायो-ईएम (cryo-EM) संरचना सादर करत आहोत; एकामध्ये प्रोटीन W आणि १४ αβ हेटेरोडायमर्स आहेत, तर दुसऱ्यामध्ये प्रोटीन W नाही आणि एक बंद १६ हेटेरोडायमर LH1 लूप आहे. आमची संरचना Rps. palustris च्या RC-LH1 कॉम्प्लेक्सच्या समजात एक महत्त्वपूर्ण बदल दर्शवते, कारण आम्ही प्रत्येक प्रकारच्या एकजिनसी समूहाचे विश्लेषण केले आहे आणि प्रत्येक पेप्टाइड, त्याला जोडलेले रंगद्रव्ये, संबंधित लिपिड्स आणि क्विनोन्स यांना स्पष्टपणे नियुक्त करण्यासाठी आमच्याकडे पुरेसे रिझोल्यूशन आहे. या संरचनांच्या तुलनेवरून असे दिसून येते की, आतापर्यंत इतर कोणत्याही RC-LH1 कॉम्प्लेक्समध्ये न आढळलेले तीन TMH प्रोटीन्स-W, क्विनोन/क्विनोलोन विनिमयाला गती देण्यासाठी एक क्विनोन चॅनल तयार करतात. अनेक संरक्षित लिपिड आणि क्विनोन बंधन स्थळे ओळखली गेली आहेत, आणि आम्ही क्विनोन व RC यांच्या संयोगानंतर होणारा एक नवीन रचनात्मक बदल उघड केला आहे, जो ऑक्सिजनयुक्त प्रकाशपोषी जीवांच्या फोटोसिस्टम II (PSII) RC साठी योग्य असू शकतो. आमचे निष्कर्ष जांभळ्या प्रकाशपोषी जीवाणूंच्या RC-LH1 कोर कॉम्प्लेक्समधील क्विनोन/क्विनोलोन बंधन आणि विनिमयाच्या गतिकीवर नवीन अंतर्दृष्टी प्रदान करतात.
Rps. palustris मध्ये आढळणाऱ्या दोन कॉम्प्लेक्सचा सविस्तर अभ्यास सुलभ करण्यासाठी, आम्ही प्रत्येक RC-LH1 ला जैवरासायनिक पद्धतींनी वेगळे करतो. प्रोटीन W-कमतरता असलेला कॉम्प्लेक्स (यापुढे ΔpufW म्हणून उल्लेखित) pufW जीन नसलेल्या स्ट्रेनमधून शुद्ध केला गेला (16), आणि फक्त एकच RC-LH1 कॉम्प्लेक्स तयार केला जाऊ शकतो. प्रोटीन W-युक्त कॉम्प्लेक्स एका स्ट्रेनद्वारे तयार केला जातो. या स्ट्रेनच्या प्रोटीन W ला त्याच्या C-टर्मिनसवर 10x His टॅगने सुधारित केले जाते, जेणेकरून धातू स्थिर करून प्रोटीन W-युक्त कॉम्प्लेक्सला बहुतेक प्रोटीन W-कमतरता असलेल्या कॉम्प्लेक्ससोबत प्रभावीपणे एकत्र केले जाऊ शकेल. हा कॉम्प्लेक्स ॲफिनिटी क्रोमॅटोग्राफी (IMAC) द्वारे प्रभावीपणे वेगळा केला जातो (16).
आकृती १ मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, दोन्ही कॉम्प्लेक्समध्ये LH1 अँटेनाने वेढलेले तीन उप-युनिट RC (RC-L, RC-M आणि RC-H) असतात. प्रोटीन-W नसलेल्या कॉम्प्लेक्सच्या २.८०-Å संरचनेत १६ αβ हेटेरोडायमर्स दिसतात, जे RC ला पूर्णपणे वेढणारा एक बंद LH1 लूप तयार करतात, ज्याला यापुढे RC-LH116 कॉम्प्लेक्स म्हटले जाईल. प्रोटीन-W असलेल्या कॉम्प्लेक्सच्या २.६५Å संरचनेत प्रोटीन-W मुळे खंडित झालेला १४-हेटेरोडायमर LH1 असतो, ज्याला यापुढे RC-LH114-W म्हटले जाईल.
(A आणि B) संयुगाचे पृष्ठभागावरील चित्रण. (C आणि D) दंडाकृतींमध्ये व्यक्त केलेली बंधित रंगद्रव्ये. (E आणि F) पेशीद्रव्याच्या पृष्ठभागावरून निरीक्षण केलेल्या संकुलांमध्ये पेप्टाइड्स आणि LH1 उपघटक कार्टून्समध्ये दर्शविले आहेत, आणि प्रोटीन-W गॅपपासून घड्याळाच्या दिशेने क्रमांकित केले आहेत [Rba क्रमांकाशी सुसंगत. स्फेरोइड्स संकुल (13)]. LH1-α साठी, प्रोटीन उपघटकाचा रंग पिवळा आहे; LH1-β साठी, प्रोटीन उपघटकाचा रंग निळा आहे; प्रोटीन-W साठी, प्रोटीन लाल आहे; RC-H साठी, तो निळसर हिरवा (सायन) आहे; RC-L साठी, तो नारंगी आहे; RC-M साठी, किरमिजी (मॅजेंटा) आहे. सहघटक दंडाकृतींनी दर्शविले आहेत, हिरवा रंग BChl आणि BPh a रेणू दर्शवतो, जांभळा रंग कॅरोटीनॉइड्स दर्शवतो, आणि पिवळा रंग UQ10 रेणू दर्शवतो. (G आणि H) RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स (G) आणि RC-LH116 कॉम्प्लेक्स (H) च्या समतुल्य भागातील प्रोटीन-W गॅपचे विस्तारित दृश्य. कोफॅक्टर्स स्पेस फिलिंग स्वरूपात दर्शविले आहेत, चिलेटेड क्विनोन निळ्या रंगात दर्शविला आहे. (G) मध्ये प्रोटीन-W गॅप निळ्या तुटक रेषेने हायलाइट केली आहे, आणि (H) मध्ये LH116 रिंगवर क्विनोन/क्विनोलॉल विसरित होणारी लहान छिद्रे काळ्या तुटक रेषेने हायलाइट केली आहेत.
आकृती १ (A आणि B) मध्ये RC च्या भोवती LH1αβ हेटेरोडायमर्सची खुली किंवा बंद रचना दर्शविली आहे, ज्यापैकी प्रत्येक दोन BChl आणि एक कॅरोटीनॉइडला बांधतो (आकृती १, C आणि D). मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की Rps हा LH1 कॉम्प्लेक्स आहे. स्पिरुलिना झॅन्थिनच्या जैवसंश्लेषणाच्या मार्गात, या प्रजातींमध्ये कॅरोटीनॉइड्सची मिश्र लोकसंख्या असते (17). तथापि, स्पिरोपायरोक्सॅन्थिन हा प्रमुख कॅरोटीनॉइड आहे आणि त्याची घनता समाधानकारक आहे. म्हणून, आम्ही सर्व LH1 बंधन स्थळांवर स्पिरोक्सॅन्थिनचे मॉडेलिंग करणे निवडले. अल्फा आणि बीटा पॉलीपेप्टाइड्स हे लहान मेम्ब्रेन बाह्य प्रदेश असलेले एकल TMH आहेत (आकृती १, A, B, E, आणि F). जरी C-टर्मिनसवर १७ अवशेषांची घनता दिसून आली नाही, तरी दोन्ही कॉम्प्लेक्समध्ये अल्फा पॉलीपेप्टाइड Met1 पासून Ala46 पर्यंत कापला गेला होता. RC-LH116 मध्ये β पॉलीपेप्टाइड Gly4 पासून Tyr52 पर्यंत आणि RC-LH114-W मध्ये Ser5 पासून Tyr52 पर्यंत कमी झाले होते. 3 किंवा 4 N-टर्मिनल किंवा 13 C-टर्मिनल अवशेषांची कोणतीही घनता दिसून आली नाही (आकृती S1). वाइल्ड-टाइप स्ट्रेनपासून तयार केलेल्या मिश्र RC-LH1 कॉम्प्लेक्सच्या मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषणातून असे दिसून आले की, गहाळ झालेला भाग हा या पेप्टाइड्सच्या हेटेरोलॉगस क्लीव्हेजचा परिणाम होता (आकृती S1 आणि S2). α-Met1 चे N-टर्मिनल फॉर्मिलेशन देखील दिसून आले (f). विश्लेषणातून असे दिसून आले की, α-पेप्टाइडमध्ये fMet1 ते Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 हे अवशेष आहेत आणि β-पेप्टाइडमध्ये Ser2 ते Ala53 हे अवशेष आहेत, जे कमी-तापमानाच्या EM घनता नकाशाशी सुसंगत आहे.
α-His29 आणि β-His36 यांच्या समन्वयामुळे BChls एकमेकांसमोर येतात; प्रत्येक αβ हेटेरोडायमर त्याच्या शेजाऱ्यांसोबत एकत्र येऊन RC एक्सायटन कपल्ड पिगमेंट अॅरेभोवती एक ओपन लूप (RC-LH114-W) किंवा एक क्लोज्ड लूप (RC-LH116) तयार करतो (आकृती 1, C आणि D). RC-LH114-W च्या 877 nm बँडच्या तुलनेत, RC-LH116 चा 880 nm अॅबसॉर्प्शन रेड शिफ्ट 3 nm आहे (आकृती 2A). तथापि, सर्क्युलर डायक्रोइझम स्पेक्ट्रम जवळजवळ सारखाच आहे (आकृती 2B), हे दर्शवते की ओपन आणि क्लोज्ड लूपमध्ये स्पष्ट फरक असला तरी, BChls चे स्थानिक वातावरण खूप समान आहे. अॅबसॉर्प्शन रेडशिफ्ट हा क्लोज्ड लूपवरील कमी झालेली थर्मल मोशन आणि वाढलेली स्थिरता (18, 19), क्लोज्ड लूपमुळे होणारा पिगमेंट कपलिंगमधील बदल (20, 21), किंवा या दोन्ही परिणामांचे संयोजन (11) यांचा परिणाम असू शकतो.
(अ) अतिनील/दृश्यमान/निकट-अवरक्त शोषण वर्णपट, ज्याची शिखरे त्यांच्या संबंधित रंगद्रव्यांनी चिन्हांकित केली आहेत आणि ७७५ एनएम (nm) वरील बीपीएच (BPh) शिखराच्या तुलनेत सामान्यीकृत केली आहेत. (ब) ८०५ एनएम (nm) वरील बीसीएचएल (BChl) शोषणाच्या तुलनेत सामान्यीकृत केलेला वर्तुळाकार द्विवर्णता वर्णपट. (क आणि ड) आरसी-एलएच११४-डब्ल्यू (RC-LH114-W) संकुल (क) आणि आरसी-एलएच११६ (RC-LH116) संकुल (ड) यांच्या कालबद्ध शोषण वर्णपटांमधून निवडलेले ΔA वर्णपट. चांगल्या तुलनेसाठी, सर्व वर्णपट ०.२ पीएस (ps) वरील −ए च्या ∆ए च्या तुलनेत सामान्यीकृत केले आहेत. (इ) यूक्यू२ (UQ2) च्या विविध सांद्रतांच्या उपस्थितीत किरणोत्सर्गानंतर सायटोक्रोम सी२ (cytochrome c2) ऑक्सिडीकरणाचा दर (मूळ माहितीसाठी आकृती एस८ (S8) पहा). (फ) कमी, मध्यम किंवा उच्च तीव्रतेच्या प्रकाशाखाली (अनुक्रमे १०, ३० किंवा ३००μMm-2 s-1) वाढलेल्या पेशींमध्ये, शुद्ध केलेल्या संकुलातील आणि विभक्त पटलातील प्रथिन डब्ल्यू (W) आणि आरसी-एल (RC-L) उपघटकांचे गुणोत्तर. एसडीएस-पॉलिॲक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस आणि इम्युनोॲसेद्वारे प्रथिनांची पातळी निश्चित करा (मूळ डेटासाठी आकृती S9 पहा). शुद्ध केलेल्या RC-LH114-W कॉम्प्लेक्सच्या सापेक्ष गुणोत्तर निश्चित करा. कॉम्प्लेक्समधील RC-L आणि प्रोटीन-W यांचे स्टॉइकियोमेट्रिक गुणोत्तर 1:1 आहे.
RC-LH114-W च्या विकृत αβ14 लूपमधील स्थान 1 वरील BChls (आकृती 1, A, C, आणि E) हे RC-LH116 मधील समतुल्य BChls पेक्षा RC प्राथमिक दाता (P) च्या 6.8Å ने अधिक जवळ आहेत (आकृती 1, B, D, आणि F, आणि आकृती S3); तथापि, दोन्ही कॉम्प्लेक्सचे क्षणिक शोषण गतिकशास्त्र दर्शवते की RC-LH114-W आणि RC-LH116 साठी, LH1 पासून RC पर्यंत उत्तेजन ऊर्जा हस्तांतरण वेळ स्थिरांक अनुक्रमे 40 ±4 आणि 44±3 ps आहेत (आकृती 2, C आणि D, ​​आकृती S4 आणि तक्ता S2). RC मध्ये इलेक्ट्रॉनिक हस्तांतरणात देखील कोणताही लक्षणीय फरक नाही (आकृती S5 आणि संबंधित पूरक मजकूर). आम्हाला शंका आहे की LH1 आणि RC-P मधील ऊर्जा हस्तांतरण वेळेतील जवळचा ताळमेळ हा दोन्ही LH1 लूपमधील बहुतेक BChl चे समान अंतर, कोन आणि संभाव्य ऊर्जा यामुळे आहे. असे दिसते की किमान अंतर गाठण्यासाठी LH1 ऊर्जा नमुन्याचा अभ्यास करणे, अयोग्य जागांवरून RC कडे थेट ऊर्जा हस्तांतरणापेक्षा वेगवान नाही. संरचनात्मक विश्लेषणासाठी, RC-LH114-W मधील ओपन-लूप LH1 लूप कमी तापमानाच्या परिस्थितीत नगण्य औष्णिक गतीतून जाऊ शकतो, आणि RC 1 च्या जागी βBChls च्या रंगद्रव्य अंतरावरून खोलीच्या तापमानाला αβ14 रिंगची अधिक लांब रचना आढळते.
RC-LH116 कॉम्प्लेक्समध्ये 32 BChls आणि 16 कॅरोटीनॉइड्स असतात, आणि त्याची एकूण रचना थर्मोक्रोमॅटियम (Tch.) पिडपिडम [प्रोटीन डेटा बँक (PDB) आयडी 5Y5S] (9), थिओरोडोव्हिब्रिओ (Trv.) 970 स्ट्रेन (PDB आयडी 7C9R) (12) आणि हिरवे शैवाल (Blc.viridis) (PDB आयडी 6ET5) (10) पासून मिळवलेल्या रचनेसारखीच आहे. अलाइनमेंटनंतर, αβ हेटेरोडायमर्सच्या स्थितींमध्ये फक्त लहान विचलने दिसून आली, विशेषतः 1-5, 15, आणि 16 (आकृती S6). प्रोटीन-W च्या उपस्थितीचा LH1 च्या संरचनेवर महत्त्वपूर्ण परिणाम होतो. त्याचे तीन TMH लहान लूपद्वारे जोडलेले आहेत, ज्यामध्ये N-टर्मिनल कॉम्प्लेक्सच्या ल्युमेन बाजूला आणि C-टर्मिनल सायटोप्लाज्मिक बाजूला आहे (आकृत्या 1A आणि 3, A ते D). प्रोटीन-डब्ल्यू हे मोठ्या प्रमाणात हायड्रोफोबिक आहे (आकृती ३बी), आणि टीएमएच२ व टीएमएच३ हे एलएच१αβ-१४ सोबत आंतरक्रिया करून एक ट्रान्समेम्ब्रेन पृष्ठभाग तयार करतात (आकृती ३, बी आणि ई ते जी). हा इंटरफेस प्रामुख्याने ट्रान्समेम्ब्रेन भागातील फेनिलॅलानिन (Phe), ल्युसिन (Leu) आणि व्हॅल (Val) अवशेषांनी बनलेला असतो. हे अवशेष हायड्रोफोबिक अमिनो आम्ले आणि αβ-१४ रंगद्रव्यांसोबत रचलेले असतात. काही ध्रुवीय अवशेष देखील या आंतरक्रियेत योगदान देतात, ज्यात कॉम्प्लेक्सच्या पोकळीच्या पृष्ठभागावरील डब्ल्यू-थ्रेनो (W-Thr68) आणि β-ट्रिप्टोफॅन (β-Trp42) यांच्यातील हायड्रोजन बंधाचा समावेश आहे (आकृती ३, एफ आणि जी). सायटोप्लाझमच्या पृष्ठभागावर, ग्लुटामाइन (Gln34) हे αβ-१४ कॅरोटीनॉइड्सच्या केटो गटाला लागून असते. याव्यतिरिक्त, एन-डोडिसिल बीटा-डी-माल्टोसाइड (β-DDM) रेणूचे पृथक्करण झाले, आणि त्याची हायड्रोफोबिक शेपटी प्रोटीन-डब्ल्यू आणि अल्फाबीटा-१४ यांच्यातील इंटरफेसपर्यंत विस्तारलेली होती, तर लिपिड शेपटी मुख्य भागात स्थित असू शकते. आमच्या असेही लक्षात आले की प्रोटीन डब्ल्यू आणि आरसीएच यांचे सी-टर्मिनल पृथक्करण क्षेत्र खूप जवळ आहेत, परंतु विशिष्ट आंतरक्रिया तयार करण्याच्या कक्षेत नाहीत (आकृती १, ए आणि ई). तथापि, या दोन प्रथिनांच्या न-पडलेल्या सी-टर्मिनल अमिनो ॲसिडमध्ये आंतरक्रिया असू शकतात, जे आरसी-एलएच११४-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्सच्या जुळणीदरम्यान प्रोटीन-डब्ल्यूच्या भरतीसाठी एक यंत्रणा प्रदान करू शकते.
(अ) प्रोटीन-डब्ल्यू, जे कार्टून स्वरूपात LH1αβ14 च्या इंटरफेसच्या समोर आहे, त्याला एक रॉड-आकाराची साइड चेन (लाल) आहे, जी इलेक्ट्रोस्टॅटिक पोटेन्शियल डायग्रामच्या एका भागात (०.१३ च्या कॉन्टूर लेव्हलसह पारदर्शक राखाडी पृष्ठभाग) दर्शविली आहे. (ब) हायड्रोफोबिक रंगाच्या पृष्ठभागाद्वारे दर्शविलेले प्रोटीन-डब्ल्यू. ध्रुवीय आणि चार्ज केलेले भाग सायन रंगात, हायड्रोफोबिक भाग पांढऱ्या रंगात आणि तीव्र हायड्रोफोबिक भाग नारंगी रंगात दर्शविले आहेत. (क आणि ड) कार्टूनमध्ये दर्शविलेले प्रोटीन-डब्ल्यू, त्याची दिशा (अ) (क) प्रमाणेच आहे आणि १८०° ने फिरवलेली आहे (ड). सिक्वेन्समधील स्थानानुसार, ओळखण्यायोग्य रेसिड्यूज इंद्रधनुष्यी रंगसंगतीचा अवलंब करतात, जिथे एन-टर्मिनल निळा आणि सी-टर्मिनल लाल आहे. (इ) (अ) प्रमाणेच दिसणारे प्रोटीन-डब्ल्यू, आणि प्रोटीन-डब्ल्यू:LH1 च्या इंटरफेसवरील रेसिड्यूज जोडलेल्या खुणांसह रॉडद्वारे दर्शविले आहेत. (F) कार्टून सादरीकरणामध्ये प्रोटीन-W हे (E) आणि LH1αβ14 च्या सापेक्ष, आणि बार सादरीकरणामध्ये इंटरफेस अवशेषांच्या सापेक्ष ९०° ने फिरवलेले आहे. बीटा पॉलीपेप्टाइडमधील ओव्हरहँगिंग अवशेषांना लेबल केले आहे. कोफॅक्टर आकृती १ च्या रंगाशी जुळणाऱ्या बारच्या स्वरूपात दाखवला आहे, विघटित β-DDM राखाडी रंगात, आणि ऑक्सिजन लाल रंगात दाखवला आहे. (G) (F) मधील दृश्य १८०° ने फिरवलेले आहे, ज्यामध्ये लेबल केलेल्या अल्फा पॉलीपेप्टाइडचे प्रमुख अवशेष दिसतात.
प्रोटीन-डब्ल्यू एका αβ हेटेरोडायमरची (आकृती 1F मधील १५वा) जागा घेते, ज्यामुळे लूप बंद होण्यास प्रतिबंध होतो आणि पहिले तीन αβ हेटेरोडायमर झुकतात. असे दिसून आले की फिल्म नॉर्मलच्या सापेक्ष पहिल्या αβ-1 हेटेरोडायमरचा कमाल झुकण्याचा कोन २५° ते २९° होता (आकृती १, A आणि E), जो RC A शार्प कॉन्ट्रास्ट-LH116 मधील αβ-1 च्या २° ते ८° झुकण्यामुळे तयार झाला होता (आकृती १, B आणि F). दुसरे आणि तिसरे हेटेरोडायमर अनुक्रमे १२° ते २२° आणि ५° ते १०° झुकलेले आहेत. RC च्या स्टेरिकल अडथळ्यामुळे, αβ-1 च्या झुकावामध्ये αβ ची दुसरी जोडी (जी आकृती 1F मधील 16 व्या αβ शी जुळते) समाविष्ट होत नाही, त्यामुळे LH1 रिंगमध्ये एक स्पष्ट पोकळी तयार होते (आकृती 1, A आणि E). दोन αβ हेटेरोडायमर्सच्या अभावामुळे, तसेच चार BChl आणि दोन कॅरोटीनॉइड्सच्या नुकसानीमुळे, कोणतेही कॅरोटीनॉइड्स पिळवटलेल्या αβ-1 सबयुनिटला जोडले जात नाहीत, परिणामी LH114-W रिंगमध्ये 13 व्हेजिटेरियन कॅरोटीनॉइड्स आणि 28 BChls असतात. αβ1 ते 7 भागांमधील दोन कॉम्प्लेक्सचे स्थानिक रिझोल्यूशन अंदाज LH1 लूपच्या उर्वरित भागापेक्षा कमी आहेत, जे RC QB साइटला लागून असलेल्या LH1 सबयुनिटची अंगभूत लवचिकता दर्शवू शकते (आकृती 4).
RC-LH114-W (A आणि B) आणि RC-LH116 (C आणि D) यांची चित्रे एकाच टॉप व्ह्यू/साइड व्ह्यू (A आणि B) (A आणि C) आणि आकृती १ च्या कॅव्हिटी पृष्ठभागावरून (B आणि D) दाखवली आहेत. रंगीत खुणा उजवीकडे दाखवल्या आहेत.
१:१४ च्या स्टॉइकियोमेट्रिक गुणोत्तरासह असलेला एकमेव दुसरा वैशिष्ट्यपूर्ण कोर कॉम्प्लेक्स म्हणजे रोडोकोकस स्फेरोइड्स (Rba.) RC-LH1-PufX डायमर (13). तथापि, प्रोटीन W आणि PufX मध्ये कोणतीही स्पष्ट समरूपता नाही आणि त्यांच्या संबंधित LH1 संरचनांवर त्यांचा महत्त्वपूर्ण परिणाम होतो. PufX हे एक सिंगल TMH आहे ज्यामध्ये N-टर्मिनल सायटोप्लाज्मिक डोमेन आहे, जे Rps. palustris LH116αβ-16 शी संबंधित असलेल्या स्थितीवर RC-H सबयुनिटच्या सायटोप्लाज्मिक बाजूशी संवाद साधते (13). PufX हे RC-LH1 आणि सायटोक्रोम bcl कॉम्प्लेक्स दरम्यान क्विनोन/क्विनोलोन देवाणघेवाणीसाठी एक चॅनल तयार करते आणि ते सर्व Rba. स्फेरोइड्स कोर कॉम्प्लेक्समध्ये उपस्थित असते (13). जरी मोनोमर-मोनोमर इंटरफेस Rba. मध्ये असला तरी... स्फेरोइड्स RC-LH1-PufX डायमर हा RC-LH114-W मध्ये प्रोटीन W च्या बंधन स्थितीवर स्थित आहे, आणि PufX व प्रोटीन-W मुळे निर्माण झालेली पोकळी समतुल्य स्थितीवर आहे (आकृती S7A). RC-LH114-W मधील पोकळी ही स्यूडोमोनास रोझिया LH1 च्या काल्पनिक क्विनोन चॅनल (8) शी देखील संरेखित आहे, जे प्रोटीन W किंवा PufX शी संबंधित नसलेल्या पेप्टाइड्सद्वारे तयार होते (आकृती S7B). याव्यतिरिक्त, एक γ सबयुनिट वगळून तयार झालेले Blc. द एमराल्ड ग्रीन LH1 मधील क्विनोन चॅनल (7) देखील अशाच स्थितीत स्थित आहे (आकृती S7C). जरी वेगवेगळ्या प्रथिनांद्वारे मध्यस्थी केली जात असली तरी, RC-LH1 कॉम्प्लेक्समध्ये या क्विनोन/क्विनोलॉल चॅनल्सचे एकाच सामान्य स्थितीत दिसणे हे अभिसारी उत्क्रांतीचे एक उदाहरण असल्याचे दिसते, जे सूचित करते की प्रोटीन W द्वारे तयार झालेली पोकळी क्विनोन चॅनल म्हणून कार्य करू शकते.
LH114-W लूपमधील अंतर, प्रथिनांप्रमाणे दोन डोमेन्सना प्रोटीन पोअरद्वारे जोडण्याऐवजी, RC-LH114-W कॉम्प्लेक्सच्या अंतर्गत जागेत आणि बल्क मेम्ब्रेनमध्ये एक सलग मेम्ब्रेन क्षेत्र तयार करण्यास अनुमती देते (आकृती 1G). RC-LH116 कॉम्प्लेक्स हे बंद Tch. नीडल-लाइक कॉम्प्लेक्स (22) (आकृती 1H) सारखे आहे. मेम्ब्रेनमधून क्विनोनचा प्रसार अरुंद प्रोटीन चॅनेलमधून होणाऱ्या प्रसारापेक्षा जलद असल्यामुळे, उघडा LH114-W लूप बंद LH116 लूपपेक्षा जलद RC टर्नओव्हरला परवानगी देऊ शकतो आणि RC मध्ये क्विनोनचा प्रसार अधिक प्रतिबंधित असू शकतो. प्रोटीन W, RC द्वारे क्विनोनच्या रूपांतरणावर परिणाम करते की नाही हे तपासण्यासाठी, आम्ही युबिक्विनोन 2 (UQ2) (नैसर्गिक UQ10 चा एक अॅनालॉग ज्याची आयसोप्रीन शेपटी लहान आहे) च्या एका विशिष्ट सांद्रतेवर सायटोक्रोम ऑक्सिडेशन चाचणी केली (आकृती 2E). जरी चिलेटेड क्विनोनच्या उपस्थितीमुळे स्पष्ट मायकेलिस स्थिरांकाचे अचूक निर्धारण करण्यात अडथळा येतो (RC-LH114-W आणि RC-LH116 अनुक्रमे 0.2 ± 0.1 μM आणि 0.5 ± 0.2 μM साठी योग्य आहेत), RC-LH114-W चा कमाल दर (4.6 ± 0.2 e-RC-1 s-1) हा RC-LH116 (3.6 ± 0.1 e-RC-1 s-1) पेक्षा 28 ± 5% जास्त आहे.
आम्ही सुरुवातीला असा अंदाज लावला होता की प्रोटीन-डब्ल्यू कोर कॉम्प्लेक्सच्या सुमारे १०% मध्ये उपस्थित आहे (१६); येथे, कमी-प्रकाश, मध्यम-प्रकाश आणि उच्च-प्रकाशात वाढणाऱ्या पेशींचे व्यापण्याचे प्रमाण अनुक्रमे १५±०.६%, ११±१% आणि ०.९±०.५% आहे (आकृती २एफ). मास स्पेक्ट्रोमेट्रीच्या संख्यात्मक तुलनेने असे दिसून आले की, वाइल्ड-टाइप स्ट्रेनच्या तुलनेत हिस्टिडिन टॅग जोडल्याने प्रोटीन-डब्ल्यूचे सापेक्ष प्रमाण कमी झाले नाही (पी = ०.५९), त्यामुळे हे स्तर सुधारित प्रोटीन-डब्ल्यूमुळे आलेले कृत्रिम परिणाम नाहीत (आकृती एस१०). तथापि, आरसी-एलएच१ कॉम्प्लेक्समधील प्रोटीन-डब्ल्यूचे हे कमी व्यापण्याचे प्रमाण काही आरसींना वाढीव दराने फ्लिप करण्याची परवानगी देऊ शकते, ज्यामुळे आरसी-एलएच११६ कॉम्प्लेक्समधील मंद क्विनोन/क्विनोलोन विनिमय कमी होतो. आमच्या लक्षात आले की उच्च प्रकाश व्यापण्याचा दर अलीकडील ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स डेटाशी विसंगत आहे, जो दर्शवितो की तीव्र प्रकाशाखाली pufW जीन अभिव्यक्ती वाढते (आकृती S11) (23). pufW ट्रान्सक्रिप्शन आणि RC-LH1 कॉम्प्लेक्समध्ये प्रोटीन-W चे समावेशन यातील फरक गोंधळात टाकणारा आहे आणि तो प्रोटीनच्या जटिल नियमनाचे प्रतिबिंब असू शकतो.
RC-LH114-W मध्ये, 6 कार्डिओलिपिन (CDL), 7 फॉस्फॅटिडिलकोलीन (POPC), 1 फॉस्फॅटिडिलग्लिसरॉल (POPG) आणि 29 β-DDM रेणूंचे वाटप केले आहे आणि RC-LH116 मध्ये 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs आणि 12 βDDMs असे मॉडेल केले आहे (आकृती 5, A आणि B). या दोन संरचनांमध्ये, CDL जवळजवळ कॉम्प्लेक्सच्या सायटोप्लाज्मिक बाजूला स्थित आहे, तर POPC, POPG आणि β-DDM बहुतेक ल्युमिनल बाजूला स्थित आहेत. RC-LH114-W कॉम्प्लेक्सच्या αβ-1 ते αβ-6 क्षेत्रात दोन लिपिड आणि डिटर्जंट रेणू वेगळे केले गेले (आकृती 5A), आणि RC-LH116 च्या समतुल्य क्षेत्रात पाच वेगळे केले गेले (आकृती 5B). कॉम्प्लेक्सच्या दुसऱ्या बाजूला अधिक लिपिड्स आढळले, प्रामुख्याने CDL, जे RC आणि αβ-7 ते αβ-13 दरम्यान जमा झाले होते (आकृती 5, A आणि B). इतर संरचनात्मकदृष्ट्या निश्चित केलेले लिपिड्स आणि डिटर्जंट्स LH1 रिंगच्या बाहेर स्थित आहेत, आणि सुस्पष्टपणे निश्चित केलेल्या एसिल चेन्स LH1 सबयुनिट्समध्ये पसरलेल्या आहेत, ज्यांना RC-LH114-W मध्ये तात्पुरते β-DDM असे नाव दिले आहे, आणि RC A मध्ये β-DDM आणि POPC-LH116 च्या मिश्रणात β-DDM असे परिभाषित केले आहे. आमच्या संरचनेतील चिलेटिंग लिपिड्स आणि डिटर्जंट्सची समान स्थाने हे दर्शवतात की ती शारीरिकदृष्ट्या संबंधित बंधन स्थळे आहेत (आकृती S12A). Tch मधील समतुल्य रेणूंच्या स्थानांमध्ये देखील चांगली सुसंगतता आहे. जेंटल आणि ट्रव्ह. स्ट्रेन 970 RC-LH1s (आकृती S12, B ते E) (9, 12) आणि लिपिड हेड ग्रुपचे हायड्रोजन-बॉन्डिंग अवशेष यांनी सिक्वेन्स अलाइनमेंटमध्ये (आकृती S13) बऱ्यापैकी चांगले संवर्धन दर्शवले, जे सूचित करते की RC (24) ला बांधणारे संवर्धित CDL, ही स्थळे RC-LH1 कॉम्प्लेक्समध्ये संवर्धित असू शकतात.
(अ आणि ब) आकृती १ मधील रंगसंगती वापरून, RC-LH114-W (अ) आणि RC-LH116 (ब) पेप्टाइड्स कार्टून्सने, तर पिगमेंट्स रॉड्सने दर्शविले आहेत. लिपिड्स लाल रंगात, तर डिटर्जंट्स राखाडी रंगात दाखवले आहेत. RC QA आणि QB साइट्सला जोडलेले UQ पिवळ्या रंगात, तर विलग UQ निळ्या रंगात आहे. (क आणि ड) (अ) आणि (ब) प्रमाणेच दृश्ये, ज्यात लिपिड्स वगळले आहेत. (इ ते ग) RC-LH116 मधील Q1(इ), Q2(फ) आणि Q3(ग) यांचे विस्तारित दृश्य, ज्यात एकमेकांवर प्रभाव टाकणाऱ्या साइड चेन्स आहेत. हायड्रोजन बंध काळ्या तुटक रेषांनी दर्शविले आहेत.
RC-LH116 मध्ये, चार्ज विभक्त होण्याच्या प्रक्रियेत इलेक्ट्रॉन हस्तांतरणात भाग घेणारे RC QA आणि QB UQ दोन्ही त्यांच्या बंधन स्थळांवर विघटित होतात. तथापि, RC-LH114-W मध्ये, QB क्विनोनचे निराकरण झालेले नाही आणि त्यावर खाली तपशीलवार चर्चा केली जाईल. QA आणि QB क्विनोन्स व्यतिरिक्त, दोन चिलेटेड UQ रेणू (RC आणि LH1 रिंगांच्या दरम्यान स्थित) RC-LH114-W संरचनेत त्यांच्या सुस्पष्ट हेड ग्रुप्सनुसार (अनुक्रमे Q1 आणि Q2 मध्ये स्थित) वाटप केलेले आहेत (आकृती 5C). दोन आयसोप्रीन युनिट्स Q1 ला नियुक्त केले आहेत, आणि घनता नकाशा Q2 च्या संपूर्ण 10 आयसोप्रीन शेपटींचे निराकरण करतो. RC-LH116 च्या संरचनेत, तीन चिलेटेड UQ10 रेणू (Q1 ते Q3, आकृती 5D) निराकरण केले गेले, आणि सर्व रेणूंची शेपटीभर स्पष्ट घनता आहे (आकृती 5, D ते G). दोन संरचनांमध्ये, Q1 आणि Q2 च्या क्विनोन हेड ग्रुप्सच्या स्थितींमध्ये उत्कृष्ट सुसंगतता आहे (आकृती S12F), आणि ते फक्त RC शी आंतरक्रिया करतात. Q1 हे RC-LH114-W च्या W गॅपच्या प्रवेशद्वारावर स्थित आहे (आकृती 1G आणि 5, C, D आणि E), आणि Q2 हे QB बंधन स्थळाजवळ स्थित आहे (आकृती 5, C, D आणि F). संरक्षित L-Trp143 आणि L-Trp269 हे अवशेष Q1 आणि Q2 च्या अगदी जवळ आहेत आणि संभाव्य π-स्टॅकिंग आंतरक्रिया प्रदान करतात (आकृती 5, E आणि F, आणि आकृती S12). Q1 च्या डिस्टल ऑक्सिजनपासून 3.0 Å अंतरावर असलेला L-Gln88, एक मजबूत हायड्रोजन बंध प्रदान करतो (आकृती 5E); हा अवशेष सर्वात दूरच्या नात्याव्यतिरिक्त सर्व RCs मध्ये संरक्षित आहे (आकृती S13). इतर बहुतेक RCs मध्ये L-Ser91 च्या जागी Thr चे प्रतिस्थापन केलेले असते (आकृती S13), ते Q1 च्या मिथाइल ऑक्सिजनपासून 3.8 अँगस्ट्रॉम अंतरावर आहे आणि कमकुवत हायड्रोजन बंध प्रदान करू शकते (आकृती 5E). Q3 ची कोणतीही विशिष्ट आंतरक्रिया असल्याचे दिसत नाही, परंतु ते RC-M सबयुनिट आणि LH1-α सबयुनिट 5 ते 6 यांच्यामधील हायड्रोफोबिक प्रदेशात स्थित आहे (आकृती 5, D आणि G). Tch. Gentle, Trv. Strain 970 आणि Blc मध्ये Q1, Q2 आणि Q3 किंवा जवळपासचे किलेटेड क्विनोन्स देखील निश्चित केले गेले आहेत. आयरीस संरचना (9, 10, 12) RC-LH1 कॉम्प्लेक्समधील एका संरक्षित सहायक क्विनोन बंधन स्थळाकडे निर्देश करते (आकृती S12G). RC-LH116 मधील पाच विघटित UQs हे हाय परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (HPLC) द्वारे निर्धारित केलेल्या प्रत्येक कॉम्प्लेक्सच्या 5.8±0.7 मूल्यांशी चांगले जुळतात, तर RC-LH114-W मधील तीन विघटित UQs हे मोजलेल्या 6.2±0.3 मूल्यापेक्षा कमी आहेत (आकृती S14) जे दर्शवते की संरचनेत न सुटलेले UQ रेणू आहेत.
स्यूडो-सिमेट्रिक L आणि M पॉलीपेप्टाइड्स प्रत्येकी पाच TMHs ने बनलेले असतात आणि ते एक हेटेरोडायमर तयार करतात, ज्यात एक BChl डायमर, दोन BChl मोनोमर्स, दोन बॅक्टेरिओफेज (BPh) मोनोमर्स, एक नॉन-हीम आयर्न आणि एक किंवा दोन UQ10 रेणू एकत्र येतात. टर्मिनल कीटोन गटावरील हायड्रोजन बंधांच्या उपस्थितीमुळे आणि Rps मध्ये त्याच्या ज्ञात संचयनामुळे, कॅरोटीनॉइड्स M-सबयुनिटमध्ये समाविष्ट केले जातात, ज्याला cis-3,4-डीहायड्रोओरोडोपिन असे नाव दिले आहे. प्रजाती (25). RC-H चा बाह्य पडदा डोमेन एकाच TMH द्वारे पडद्याला जोडलेला असतो. एकूण RC रचना संबंधित प्रजातींच्या (जसे की Rba) तीन सबयुनिट RC सारखीच आहे. स्फेरोइड्स (PDB ID: 3I4D). या संरचनांच्या रिझोल्यूशन रेंजमध्ये BChl आणि BPh चे मॅक्रोसायकल्स, कॅरोटीनॉइड बॅकबोन आणि नॉन-हीम आयर्न ओव्हरलॅप होतात, तसेच QA साइटवरील UQ10 हेड ग्रुप आणि RC-LH116 वरील QB क्विनोन देखील ओव्हरलॅप होतात (आकृती S15).
वेगवेगळ्या QB साईट ऑक्युपन्सी दरांसह दोन RC संरचनांच्या उपलब्धतेमुळे, QB क्विनोन बंधनासोबत होणाऱ्या सातत्यपूर्ण रचनात्मक बदलांचे परीक्षण करण्याची एक नवीन संधी मिळते. RC-LH116 कॉम्प्लेक्समध्ये, QB क्विनोन पूर्णपणे बद्ध "प्रॉक्सिमल" स्थितीत (26) स्थित आहे, परंतु RC-LH114-W च्या विलगतेमध्ये QB क्विनोन नाही. RC-LH114-W मध्ये QB क्विनोन नाही, जे आश्चर्यकारक आहे कारण हा कॉम्प्लेक्स सक्रिय आहे, आणि संरचनात्मकदृष्ट्या निराकरण झालेल्या QB क्विनोनसह असलेल्या RC-LH116 कॉम्प्लेक्सपेक्षाही अधिक सक्रिय आहे. जरी दोन LH1 रिंग्स सुमारे सहा क्विनोन्सना कीलेट करत असल्या तरी, बंद RC-LH116 रिंगमध्ये पाच संरचनात्मकदृष्ट्या निराकरण झालेले आहेत, तर खुल्या RC-LH114-W रिंगमध्ये केवळ तीन संरचनात्मकदृष्ट्या मर्यादित आहेत. ही वाढलेली संरचनात्मक अव्यवस्था RC-LH114-W QB साइट्सच्या जलद प्रतिस्थापनाला, कॉम्प्लेक्समधील जलद क्विनोन कायनेटिक्सला आणि LH1 लूप ओलांडण्याच्या वाढलेल्या शक्यतेला प्रतिबिंबित करू शकते. आम्ही असे सुचवतो की RC-LH114-W च्या RC QB साइटमध्ये UQ चा अभाव हा अधिक जटिल आणि अधिक सक्रिय कॉम्प्लेक्सचा परिणाम असू शकतो, आणि RC-LH114-W ची QB साइट UQ टर्नओव्हरमध्ये त्वरित गोठवली गेली आहे. विशिष्ट टप्पा (QB साइटचा प्रवेशद्वार बंद झाला आहे) या क्रियेची रचना दर्शवतो.
QB शिवाय, L-Phe217 चे UQ10 बंधनाशी विसंगत स्थितीत रोटेशन होते, कारण त्यामुळे शेपटीच्या पहिल्या आयसोप्रीन युनिटशी अवकाशीय टक्कर होईल (आकृती 6A). याव्यतिरिक्त, स्पष्ट मुख्य रचनात्मक बदल स्पष्ट दिसतात, विशेषतः हेलिक्स de (TMH D आणि E मधील लूपमधील लहान हेलिक्स) जिथे L-Phe217 हे QB बंधन पॉकेटमध्ये सरकले आहे आणि L-Tyr223 चे रोटेशन (आकृती 6A) M-Asp45 फ्रेमवर्कसोबतचा हायड्रोजन बंध तोडण्यासाठी आणि QB बंधन स्थळाचे प्रवेशद्वार बंद करण्यासाठी होते (आकृती 6B). हेलिक्स de त्याच्या तळाशी फिरतो, L-Ser209 चा Cα 0.33Å ने सरकला आहे, तर L-Val221 चा Cα 3.52Å ने सरकला आहे. TMH D आणि E मध्ये कोणतेही निरीक्षण करण्यायोग्य बदल नाहीत, जे दोन्ही संरचनांमध्ये एकमेकांवर जुळणारे आहेत (आकृती 6A). आमच्या माहितीनुसार, नैसर्गिक RC मधील ही पहिली रचना आहे जी QB साइट बंद करते. संपूर्ण (QB-बद्ध) रचनेशी तुलना केल्यास असे दिसून येते की, क्विनोनचे क्षपण होण्यापूर्वी, त्याला क्विनोनमध्ये प्रवेश करण्यासाठी एक रचनात्मक बदल आवश्यक असतो. L-Phe217 फिरून क्विनोन हेड ग्रुपसोबत π-स्टॅकिंग आंतरक्रिया तयार करते आणि हेलिक्स बाहेरच्या बाजूला सरकतो, ज्यामुळे L-Gly222 चा सांगाडा आणि L-Tyr223 ची बाजूची साखळी एका स्थिर हायड्रोजन बंध रचनेसह हायड्रोजन बंधांचे जाळे तयार करू शकतात (आकृती ६, A आणि C).
(अ) होलोग्राम (एल चेन, नारंगी/एम चेन, किरमिजी) आणि अपो (राखाडी) संरचनेचे आच्छादित कार्टून, ज्यामध्ये मुख्य अवशेष दांड्यासारख्या स्वरूपात दर्शविले आहेत. UQ10 पिवळ्या पट्टीने दर्शविले आहे. तुटक रेषा संपूर्ण संरचनेत तयार झालेले हायड्रोजन बंध दर्शवते. (ब आणि क) अपोलिपोप्रोटीन आणि संपूर्ण रिंग संरचनेचे पृष्ठभागीय प्रतिनिधित्व, अनुक्रमे L-Phe217 च्या बाजूच्या साखळीतील ऑक्सिजन निळ्या रंगात आणि L-Tyr223 लाल रंगात हायलाइट केले आहे. एल सबयुनिट नारंगी आहे; एम आणि एच सबयुनिट्स रंगवलेले नाहीत. (ड आणि इ) अपोलिपोप्रोटीन (ड) आणि संपूर्ण (इ) आरसी क्यूबी साइट्स [अनुक्रमे (अ) नुसार रंग] आणि थर्मोफिलस थर्मोफिलस पीएस II (हिरवा, प्लास्टिक क्विनोनसह निळा; PDB ID: 3WU2) अलाइन (58).
अनपेक्षितपणे, LH1 शिवाय QB-कमतरता असलेल्या RCs च्या अनेक संरचना उपलब्ध असूनही, या अभ्यासात आढळलेले रचनात्मक बदल यापूर्वी नोंदवले गेलेले नाहीत. यामध्ये Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) आणि Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) मधील QB क्षीणता संरचनांचा समावेश आहे, ज्या सर्व त्यांच्या एकूण QB संरचनेसारख्याच आहेत. 3PRC चे बारकाईने निरीक्षण केल्यावर असे दिसून आले की LDAO (लॉरिल डायमिथाइल अमाइन ऑक्साइड) डिटर्जंटचे रेणू QB स्थितीच्या प्रवेशद्वारावर बांधले जातात, ज्यामुळे बंद संरचनेत पुनर्रचना रोखली जाऊ शकते. जरी LDAO हे 1EYS किंवा 1OGV मध्ये त्याच स्थितीत विघटित होत नसले तरी, हे RCs समान डिटर्जंट वापरून तयार केले जातात आणि त्यामुळे समान परिणाम देऊ शकतात. Rba. ची स्फटिक संरचना. सायटोक्रोम सी२ (PDB ID: 1L9B) सह सह-स्फटिकीकृत स्फेरोइड्स आरसीमध्ये देखील एक बंद क्यूबी साइट असल्याचे दिसते. तथापि, या प्रकरणात, आरसी-एम पॉलीपेप्टाइडचा एन-टर्मिनल प्रदेश (क्यू हेलिक्सवरील टायरोसिन अवशेषाच्या एच बंधाद्वारे क्यूबी बंधन साइटशी संवाद साधणारा) एक अप्राकृतिक रचना स्वीकारतो, आणि क्यूबी रचनात्मक बदलाचा अधिक शोध घेतला गेला नाही (30). दिलासादायक बाब ही आहे की, आरसी-एलएच११४-डब्ल्यू संरचनेत आम्हाला एम पॉलीपेप्टाइडचे अशा प्रकारचे विरूपण दिसले नाही, जे आरसी-एलएच११६ आरसीच्या एन-टर्मिनल प्रदेशासारखेच आहे. हे देखील लक्षात घेतले पाहिजे की डिटर्जंट-आधारित एलएच१ अँटेना काढून टाकल्यानंतर, पीडीबीमधील ॲपोलीपोप्रोटीन आरसीचे निराकरण झाले, ज्यामुळे आरसी आणि सभोवतालच्या एलएच१ रिंगच्या आतील पृष्ठभागामधील अंतरातील अंतर्गत क्विनोन पूल आणि लिपिड्स काढून टाकले गेले (31, 32). RC कार्यात्मक राहते कारण ते विघटनशील QB क्विनोन वगळता सर्व सहघटक टिकवून ठेवते, जे कमी स्थिर असते आणि तयार करण्याच्या प्रक्रियेदरम्यान अनेकदा नष्ट होते (33). याव्यतिरिक्त, हे ज्ञात आहे की RC मधून LH1 आणि नैसर्गिक चक्रीय लिपिड्स काढून टाकल्याने कार्यांवर परिणाम होऊ शकतो, जसे की चार्ज-सेपरेटेड P+QB-स्टेटचे आयुष्यमान कमी होणे (31, 34, 35). म्हणून, आम्ही असा अंदाज लावतो की RC भोवती स्थानिक LH1 रिंगचे अस्तित्व "बंद" QB साइट टिकवून ठेवू शकते, ज्यामुळे QB जवळील स्थानिक वातावरण जपले जाते.
जरी ॲपोलीपोप्रोटीन (QB क्विनोनशिवाय) आणि संपूर्ण रचना ही घटनांची मालिका नसून, QB साइटच्या उलाढालीची केवळ दोन क्षणचित्रे आहेत, तरी असे संकेत आहेत की सबस्ट्रेट इनहिबिशनला प्रतिबंध करण्यासाठी हायड्रोक्विनोनद्वारे होणारे पुनर्बंधन रोखण्याकरिता बंधन नियंत्रित केले जाऊ शकते. ॲपोलीपोप्रोटीनच्या QB साइटजवळ क्विनोलॉल आणि क्विनोनची आंतरक्रिया वेगळी असू शकते, ज्यामुळे RC द्वारे त्याचा अस्वीकार होतो. क्विनोन्सच्या बंधनात आणि क्षपणामध्ये रचनात्मक बदलांची भूमिका असते, असे बऱ्याच काळापासून प्रस्तावित आहे. अंधारानुकूलनानंतर गोठवलेल्या RCs ची क्विनोन्स क्षपित करण्याची क्षमता कमी होते (36); एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी दर्शवते की हे नुकसान QB क्विनोन्स सक्रिय समीपस्थ स्थितीपासून सुमारे 4.5 Å अंतरावर "दूरस्थ" रचनेत अडकल्यामुळे होते (26, 37). आम्ही असे सुचवतो की ही दूरस्थ बंधन रचना ॲपोलीपोप्रोटीन आणि पूर्ण रिंग रचनेमधील मध्यवर्ती अवस्थेचे एक क्षणचित्र आहे, जे क्विनोनसोबतच्या सुरुवातीच्या आंतरक्रियेनंतर आणि QB साइट उघडल्यानंतर येते.
काही प्रकाशपोषी जीवाणू आणि सायनोबॅक्टेरिया, शैवाल आणि वनस्पतींच्या PSII कॉम्प्लेक्समध्ये आढळणाऱ्या प्रकार II RC मध्ये संरचनात्मक आणि कार्यात्मक संवर्धन आहे (38). आकृती 6 (D आणि E) मध्ये दर्शविलेले संरचनात्मक संरेखन, PSII RCs आणि जीवाणूंच्या RC कॉम्प्लेक्सच्या QB साइटमधील साम्य अधोरेखित करते. क्विनोन बंधन आणि क्षपणाच्या जवळच्या संबंधित प्रणालींचा अभ्यास करण्यासाठी ही तुलना बऱ्याच काळापासून एक मॉडेल राहिली आहे. पूर्वीच्या प्रकाशनांनी असे सुचवले आहे की क्विनोनच्या PSII क्षपणासोबत रचनात्मक बदल होतात (39, 40). म्हणून, RC चे उत्क्रांतीवादी संवर्धन लक्षात घेता, ही पूर्वी न पाहिलेली बंधन यंत्रणा ऑक्सिजनयुक्त प्रकाशपोषी वनस्पतींमधील PSII RC च्या QB साइटला देखील लागू होऊ शकते.
Rps ΔpufW (लेबल नसलेले pufW विलोपन) आणि PufW-His (नैसर्गिक pufW लोकसमधून व्यक्त केलेले C-टर्मिनल 10x His-टॅग केलेले प्रोटीन-W) स्ट्रेन्स. palustris CGA009 चे वर्णन आमच्या मागील कामात (16) केले आहे. हे स्ट्रेन्स आणि समजनुकीय वन्य-प्रकारचे पालक, PYE (प्रत्येकी 5 ग्रॅम प्रति लिटर) (LB मध्ये -80 °C वर साठवलेले, ज्यात 50% (w/v) ग्लिसरॉल, प्रोटीन, यीस्ट अर्क आणि सक्सिनेट) आगर [1.5% (w/v)] प्लेटवर थोड्या संख्येने पेशी पसरवून फ्रीझरमधून मिळवण्यात आले. प्लेट रात्रभर खोलीच्या तापमानावर अंधारात अवायुजीवी परिस्थितीत उबवण्यात आली, आणि नंतर OSRAM 116-W हॅलोजन बल्ब (RS Components, UK) द्वारे पुरवलेल्या पांढऱ्या प्रकाशाने (~50 μmolm-2 s-1) 3 ते 5 दिवसांपर्यंत प्रकाशित करण्यात आली, जोपर्यंत एकच कॉलनी दिसत नाही. एकाच कॉलनीचा वापर 0.1% (w/v) कॅसामिनो ॲसिड्स (यापुढे M22 म्हणून संदर्भित) असलेल्या 10 मिली M22+ माध्यमात (41) इनोक्युलेट करण्यासाठी केला गेला. हे कल्चर कमी ऑक्सिजनच्या परिस्थितीत, अंधारात 34°C तापमानावर, 180 rpm वेगाने हलवत 48 तास वाढवले ​​गेले, आणि नंतर त्याच परिस्थितीत 70 मिली कल्चर 24 तासांसाठी इनोक्युलेट केले गेले. 1 मिली व्हॉल्यूमचे सेमी-एरोबिक कल्चर 30 मिली युनिव्हर्सल स्क्रू-टॉप पारदर्शक काचेच्या बाटलीतील 30 मिली M22 माध्यमात इनोक्युलेट करण्यासाठी वापरले जाते आणि निर्जंतुक चुंबकीय शक्तीच्या स्टिरिंग रॉडद्वारे 48 तासांसाठी ढवळत (~50μmolm-2 s-1) किरणोत्सर्जित केले जाते. त्यानंतर त्याच परिस्थितीत सुमारे १ लिटर कल्चरमध्ये ३० मिली कल्चरचे इनोक्युलेशन करण्यात आले, आणि नंतर त्याचा उपयोग ~२०० μmolm-2 s-1 तीव्रतेच्या प्रकाशात ७२ तास ठेवलेल्या सुमारे ९ लिटर कल्चरमध्ये इनोक्युलेशन करण्यासाठी करण्यात आला. ७१३२ RCF वर ३० मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्युगेशन करून पेशी गोळा करण्यात आल्या, त्यांना ~१० मिली २० mM ट्रिस-HCl (pH ८.०) मध्ये पुन्हा सस्पेंड करण्यात आले, आणि आवश्यकतेनुसार वापर होईपर्यंत -२०°C तापमानावर साठवून ठेवण्यात आले.
विरघळल्यानंतर, पुन्हा विरघळलेल्या पेशींमध्ये डीऑक्सीरिबोन्यूक्लिएज I (मर्क, यूके), लायसोझाइम (मर्क, यूके) चे काही स्फटिक आणि रोश होलोएन्झाइम प्रोटीएज इनहिबिटरच्या दोन गोळ्या (मर्क, यूके) घाला. २०,००० psi फ्रेंच प्रेशर सेलमध्ये (अमिन्को, यूएसए), पेशी ८ ते १२ वेळा विखंडित करण्यात आल्या. ४°C तापमानावर १५ मिनिटांसाठी १८,५०० RCF वेगाने सेंट्रीफ्यूगेशन करून न तुटलेल्या पेशी आणि अविद्राव्य कचरा काढून टाकल्यानंतर, ४३,०००°C तापमानावर २ तासांसाठी ११३,००० RCF वेगाने सेंट्रीफ्यूगेशन करून रंगद्रव्ययुक्त लायसेटमधून पडदा अवक्षेपित करण्यात आला. विद्राव्य भाग टाकून द्या आणि रंगीत पडदा १०० ते २०० मिली २० mM ट्रिस-HCl (pH ८.०) मध्ये पुन्हा विरघळवा आणि जोपर्यंत कोणतेही दृश्यमान समूह दिसत नाहीत तोपर्यंत एकजीव करा. निलंबित मेम्ब्रेनला 2% (w/v) β-DDM असलेल्या 20 mM ट्रिस-HCl (pH 8.0) (ॲनाट्रेस, यूएसए) मध्ये 4°C तापमानावर अंधारात हळुवारपणे ढवळत 1 तास इनक्युबेट केले. त्यानंतर, उर्वरित अविद्राव्य पदार्थ काढून टाकण्यासाठी 4°C तापमानावर 1 तासासाठी 150,000 RCF विरघळवण्यासाठी 70°C तापमानावर सेंट्रीफ्यूज केले.
ΔpufW स्ट्रेनपासून मिळवलेला सोल्युबिलायझिंग मेम्ब्रेन, तीन कॉलम व्हॉल्यूम (CV) बाइंडिंग बफर [२० mM ट्रिस-HCl (pH ८.०) ज्यामध्ये ०.०३% (w/v) β-DDM आहे] वापरून ५० मिली DEAE सेफारोज आयन एक्सचेंज कॉलमवर लावला गेला. कॉलमला दोन CV बाइंडिंग बफरने धुतले, आणि नंतर ५० mM NaCl असलेल्या दोन बाइंडिंग बफरने धुतले. RC-LH116 कॉम्प्लेक्स १.७५ CV वर १५० ते ३०० mM NaCl (बाइंडिंग बफरमध्ये) च्या लिनियर ग्रेडियंटने इल्युट केला गेला, आणि उरलेला बाइंडिंग कॉम्प्लेक्स ०.५ CV वर ३०० mM NaCl असलेल्या बाइंडिंग बफरने इल्युट केला गेला. 250 ते 1000 nm दरम्यान शोषण स्पेक्ट्रम गोळा करा, 880 ते 280 nm वर 1 पेक्षा जास्त शोषण गुणोत्तर (A880/A280) असलेला अंश ठेवा, त्याला बाइंडिंग बफरमध्ये दोनदा विरल करा आणि शुद्धीकरणासाठी DEAE कॉलमवर पुन्हा तीच प्रक्रिया वापरा. ​​1.7 पेक्षा जास्त A880/A280 गुणोत्तर आणि 3.0 पेक्षा जास्त A880/A805 गुणोत्तर असलेले अंश विरल करा, आयन एक्सचेंजची तिसरी फेरी करा आणि 2.2 पेक्षा जास्त A880/A280 गुणोत्तर आणि 5.0 पेक्षा जास्त A880/A805 गुणोत्तर असलेले अंश राखून ठेवा. अर्धशुद्ध कॉम्प्लेक्सला अॅमिकॉन 100,000 मॉलिक्युलर वेट कट-ऑफ (MWCO) सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर (मर्क, यूके) मध्ये ~2 मिली पर्यंत संहत करण्यात आले, आणि 200 mM NaCl बफर असलेल्या सुपरडेक्स 200 16/600 साइज एक्सक्लूजन कॉलम (जीई हेल्थकेअर, यूएस) वर लोड करण्यात आले, आणि नंतर त्याच बफरमध्ये 1.5 CV वर इल्युट करण्यात आले. साइज एक्सक्लूजन फ्रॅक्शनचे ॲबसॉर्प्शन स्पेक्ट्रा गोळा करा, आणि 2.4 पेक्षा जास्त A880/A280 गुणोत्तर आणि 5.8 पेक्षा जास्त A880/A805 गुणोत्तरासह ॲबसॉर्प्शन स्पेक्ट्रा 100 A880 पर्यंत संहत करा, आणि क्रायो-TEM ग्रिड तयार करण्यासाठी किंवा साठवणुकीसाठी त्यांचा त्वरित वापर करा. आवश्यकतेनुसार -80°C वर ठेवा.
PufW-His स्ट्रेनपासून मिळवलेला सोल्युबिलायझिंग मेम्ब्रेन IMAC बफरमधील (GE हेल्थकेअर) 20 मिली HisPrep FF Ni-NTA सेफारोज कॉलमवर (20 mM ट्रिस-HCl (pH 8.0) ज्यामध्ये 200 mM NaCl आणि 0.03% (w/w) आहे) लावला गेला. कॉलम IMAC बफरच्या पाच CVs ने आणि नंतर 10 mM हिस्टिडिन असलेल्या IMAC बफरच्या पाच CVs ने धुतला गेला. कोअर कॉम्प्लेक्स 100 mM हिस्टिडिन असलेल्या पाच IMAC बफरने कॉलममधून इल्युट केला गेला. RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स असलेला फ्रॅक्शन Amicon 100,000 MWCO फिल्टर (मर्क, यूके) असलेल्या स्टर्ड टँकमध्ये ~10 मिली पर्यंत कॉन्सन्ट्रेट केला जातो, बाइंडिंग बफरने 20 पट डायल्यूट केला जातो आणि नंतर 25 मिली DEAE सेफारोज कॉलममध्ये टाकला जातो, बफरला बाउंड झालेले चार CVs आधीच वापरले जातात. कॉलमला चार CV बाइंडिंग बफरने धुवा, नंतर 0 ते 100 mM NaCl (बाइंडिंग बफरमध्ये) च्या लिनियर ग्रेडियंटवर आठ CVs वर कॉम्प्लेक्स इल्युट करा, आणि उर्वरित चार CVs मध्ये 100 mM बाइंडिंग बफर वापरा. ​​सोडियम क्लोराईडवर इल्युट झालेले अवशिष्ट कॉम्प्लेक्स, ज्यांचे A880/A280 गुणोत्तर 2.4 पेक्षा जास्त आणि A880/A805 गुणोत्तर 4.6 पेक्षा जास्त होते, त्यांना Amicon 100,000 MWCO सेंट्रीफ्यूगल फिल्टरमध्ये ~2 ml पर्यंत कॉन्सन्ट्रेट करण्यात आले, आणि 1.5 CV IMAC ने आधीच बफर इक्विलिब्रेटेड Superdex 200 16/600 साइज एक्सक्लूजन कॉलममध्ये भरण्यात आले, आणि नंतर त्याच बफरमध्ये 1.5 CV वर इल्युट करण्यात आले. आकार-वियोजन अंशांचे शोषण वर्णपट गोळा करा आणि 2.1 पेक्षा जास्त A880/A280 गुणोत्तर आणि 4.6 पेक्षा जास्त A880/A805 गुणोत्तर असलेले शोषण वर्णपट 100 A880 पर्यंत संकेंद्रित करा, जे गोठवलेल्या TEM ग्रिड तयार करण्यासाठी त्वरित वापरले जातात किंवा गरजेपर्यंत -80°C तापमानावर साठवले जातात.
कमी तापमानाचे TEM ग्रिड तयार करण्यासाठी लायका EM GP इमर्शन फ्रीझरचा वापर करण्यात आला. कॉम्प्लेक्सला IMAC बफरमध्ये A880 चे प्रमाण ५० पर्यंत विरल करण्यात आले, आणि नंतर ५μl एका नवीन ग्लो-डिस्चार्ज केलेल्या क्वांटिफॉइल १.२/१.३ कार्बन-कोटेड कॉपर मेशवर (अगार सायंटिफिक, यूके) टाकण्यात आले. ग्रिडला २०°C आणि ६०% सापेक्ष आर्द्रतेमध्ये ३० सेकंदांसाठी इनक्युबेट करा, नंतर ३ सेकंदांसाठी ते पुसून कोरडे करा, आणि मग -१७६°C तापमानावर द्रव इथेनमध्ये त्याची प्रक्रिया थांबवा.
RC-LH114-W कॉम्प्लेक्सचा डेटा eBIC (इलेक्ट्रॉनिक बायोइमेजिंग सेंटर) (ब्रिटिश डायमंड लाइट सोर्स) वर टायटन क्रिओस मायक्रोस्कोपद्वारे रेकॉर्ड करण्यात आला, जो 300kV च्या प्रवेगक व्होल्टेजवर, 130,000× च्या नाममात्र मॅग्निफिकेशनवर आणि 20 eV च्या एनर्जी गॅपवर काम करतो. डेटा गोळा करण्यासाठी काउंटिंग मोडमध्ये प्रतिमा रेकॉर्ड करण्याकरिता K2 पीक डिटेक्टरसह गॅटन 968 GIF क्वांटमचा वापर करण्यात आला. कॅलिब्रेटेड पिक्सेल आकार 1.048Å आहे आणि डोस रेट 3.83 e-Å-2s-1 आहे. 11 सेकंदात मूव्ही गोळा करून तिचे 40 भागांमध्ये विभाजन करण्यात आले. मायक्रोस्कोपला रिफोकस करण्यासाठी कार्बन-कोटेड भागाचा वापर करून, प्रत्येक होलसाठी तीन मूव्ही गोळा करण्यात आल्या. एकूण 3130 मूव्ही गोळा करण्यात आल्या, ज्यामध्ये डिफोकस व्हॅल्यूज -1 ते -3μm दरम्यान होत्या.
RC-LH116 कॉम्प्लेक्सचा डेटा अॅस्टरबरी बायोस्ट्रक्चर लॅबोरेटरी (लीड्स विद्यापीठ, यूके) येथील त्याच मायक्रोस्कोपचा वापर करून गोळा करण्यात आला. हा डेटा 130 k च्या मॅग्निफिकेशनसह काउंटिंग मोडमध्ये गोळा करण्यात आला आणि पिक्सेलचा आकार 4.6 e-Å-2s-1 च्या डोससह 1.065 Å वर कॅलिब्रेट करण्यात आला. हा चित्रपट 12 सेकंदांसाठी रेकॉर्ड करण्यात आला आणि त्याचे 48 भागांमध्ये विभाजन करण्यात आले. एकूण 3359 फिल्म्स गोळा करण्यात आल्या, ज्यामध्ये डिफोकसची मूल्ये -1 ते -3μm दरम्यान होती.
सर्व डेटा प्रोसेसिंग रेलिऑन ३.० पाइपलाइन (४२) मध्ये केले जाते. डोस वेटिंगद्वारे बीम मोशन दुरुस्त करण्यासाठी मोशनकॉर २ (४३) वापरा, आणि नंतर सीटीएफ (कॉन्ट्रास्ट ट्रान्सफर फंक्शन) पॅरामीटर निर्धारित करण्यासाठी सीटीएफफाईएनडी ४.१ (४४) वापरा. ​​या सुरुवातीच्या प्रक्रिया टप्प्यांनंतरचे ठराविक फोटोमायक्रोग्राफ आकृती २. एस१६ मध्ये दर्शविले आहेत. स्वयंचलित निवड टेम्पलेट २५०-पिक्सेल फ्रेममधील १००० कणांपैकी सुमारे २५० पिक्सेल मॅन्युअली निवडून आणि कोणतेही संदर्भ द्विमितीय (२डी) वर्गीकरण न वापरता तयार केले जाते, ज्यामुळे नमुना दूषित असलेले किंवा कोणतीही ओळखण्यायोग्य वैशिष्ट्ये नसलेले वर्गीकरण नाकारले जाते. त्यानंतर, सर्व मायक्रोफोटोग्राफवर स्वयंचलित निवड केली गेली, आणि आरसी-एलएच११४-डब्ल्यू मध्ये ८४९,३५९ कण, तर आरसी-एलएच११६ कॉम्प्लेक्समध्ये ४७६,५४७ कण होते. सर्व निवडलेल्या कणांवर नॉन-रेफरन्स 2D वर्गीकरणाच्या दोन फेऱ्या करण्यात आल्या आहेत, आणि प्रत्येक फेरीनंतर, कार्बन क्षेत्र, नमुना दूषितता, स्पष्ट वैशिष्ट्यांचा अभाव किंवा तीव्रतेने एकमेकांवर येणारे कण या अटी पूर्ण करणारे कण नाकारले जातात, परिणामी अनुक्रमे RC-LH114-W आणि RC-LH116 च्या 3D वर्गीकरणासाठी 772,033 (90.9%) आणि 359,678 (75.5%) कण वापरले जातात. प्रारंभिक 3D संदर्भ मॉडेल स्टोकॅस्टिक ग्रेडियंट डिसेंट पद्धतीचा वापर करून तयार केले गेले. प्रारंभिक मॉडेलला संदर्भ म्हणून वापरून, निवडलेल्या कणांचे 3D मध्ये चार श्रेणींमध्ये वर्गीकरण केले जाते. या श्रेणीतील मॉडेलला संदर्भ म्हणून वापरून, सर्वात मोठ्या श्रेणीतील कणांवर 3D रिफायनिंग केले जाते, त्यानंतर सॉल्व्हेंट क्षेत्र व्यापण्यासाठी प्रारंभिक 15Å लो-पास फिल्टर वापरला जातो, 6 पिक्सेलच्या सॉफ्ट कडा जोडल्या जातात, आणि टॉप डिटेक्टरच्या गॅटन K2 पीक मॉड्युलेशन ट्रान्सफर फंक्शनला दुरुस्त करण्यासाठी पिक्सेलवर पोस्ट-प्रोसेसिंग केले जाते. RC-LH114-W डेटासेटसाठी, मास्कच्या कडांवरील तीव्र घनता (UCSF Chimera मधील कोअर कॉम्प्लेक्स घनतेपासून विलग) काढून टाकून या प्रारंभिक मॉडेलमध्ये बदल करण्यात आला. परिणामी मॉडेल्स (RC-LH114-W आणि RC-LH116 चे रिझोल्यूशन अनुक्रमे 3.91 आणि 4.16 Å आहे) 3D वर्गीकरणाच्या दुसऱ्या फेरीसाठी संदर्भ म्हणून वापरले जातात. वापरलेले कण प्रारंभिक 3D वर्गात गटबद्ध केलेले आहेत आणि त्यांचा शेजारच्या कणांशी तीव्र सहसंबंध नाही. ओव्हरलॅप किंवा स्पष्ट संरचनात्मक वैशिष्ट्यांचा अभाव. 3D वर्गीकरणाच्या दुसऱ्या फेरीनंतर, सर्वाधिक रिझोल्यूशन असलेली श्रेणी निवडली गेली [RC-LH114-W साठी, एका श्रेणीत 377,703 कण (44.5%) आहेत, RC-LH116 साठी, दोन श्रेणी आहेत, एकूण 260,752 कण (54.7%), जेथे ते केवळ प्रारंभिक रोटेशननंतर संरेखित केल्यावर थोड्या फरकाने समान आहेत]. निवडलेले कण ४००-पिक्सेलच्या बॉक्समध्ये पुन्हा काढले जातात आणि ३डी रिफायनिंगद्वारे परिष्कृत केले जातात. सुरुवातीचा १५Å लो-पास फिल्टर, ३ पिक्सेल मॅप एक्सपान्शन आणि ३ पिक्सेल सॉफ्ट मास्क वापरून सॉल्व्हेंट मास्क तयार केला जातो. परिणामी टेक्सचरला अधिक परिष्कृत करण्यासाठी, प्रत्येक टप्प्यानंतर प्रति-कण सीटीएफ रिफायनमेंट, प्रति-कण मोशन करेक्शन आणि प्रति-कण सीटीएफ रिफायनमेंटची दुसरी फेरी, ३डी रिफायनमेंट, सॉल्व्हेंट मास्किंग आणि पोस्ट-प्रोसेसिंग केले जाते. ०.१४३ च्या एफएससी (फूरियर शेल कोरिलेशन कोएफिशिएंट) कट-ऑफ व्हॅल्यूचा वापर करून, RC-LH114-W आणि RC-LH116 च्या अंतिम मॉडेल्सचे रिझोल्यूशन अनुक्रमे २.६५ आणि २.८०Å आहे. अंतिम मॉडेलचा एफएससी वक्र आकृती २. एस१७ मध्ये दर्शविला आहे.
सर्व प्रथिन अनुक्रम UniProtKB वरून डाउनलोड केले आहेत: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). RC चे होमोलॉजी मॉडेल तयार करण्यासाठी SWISS-MODEL (45) चा वापर करण्यात आला, ज्यामध्ये RC-L, RC-M आणि RC-H चे प्रथिन अनुक्रम आणि Rba ची क्रिस्टल रचना आहे. sphaeroides RC चा टेम्पलेट म्हणून वापर करण्यात आला (PDB ID: 5LSE) (46). तयार केलेले मॉडेल नकाशावर बसवण्यासाठी (47), प्रथिनांची रचना सुधारण्यासाठी आणि सहघटक [4×BChl a (मोनोमर लायब्ररी अवशेषाचे नाव = BCL), 2×BPh a (BPH), एक किंवा दोन प्रकारचे UQ10 (U10), एक नॉन-हीम लोह (Fe) आणि एक 3,4-डायहायड्रोहेक्साकार्बोनिलकोलीन (QAK)] जोडण्यासाठी Coot (48) वापरा. ​​QAK मोनोमर लायब्ररीमध्ये उपलब्ध नसल्यामुळे, PHENIX (49) मधील eLBOW टूल वापरून त्याचे पॅरामीटरायझेशन करण्यात आले.
पुढे, LH1 सबयुनिट तयार करण्यात आले. सुरुवातीला, PHENIX (49) मधील स्वयंचलित बांधकाम साधनाचा वापर करून, नकाशा आणि LH1-α व LH1-β प्रथिन अनुक्रम इनपुट म्हणून वापरून LH1 अनुक्रमाचा काही भाग स्वयंचलितपणे तयार करण्यात आला. सर्वात पूर्ण LH1 सबयुनिट निवडा, ते एक्स्ट्रॅक्ट करा आणि Coot मध्ये लोड करा, त्यामध्ये गहाळ असलेला अनुक्रम स्वतः जोडा, आणि दोन BCls a (BCL) आणि एक स्पिरिलोक्सॅन्थिन (CRT) [संबंधित Rps LH1 कॉम्प्लेक्सची घनता आणि ज्ञात कॅरोटीनॉइड सामग्रीनुसार. प्रजाती (17)] जोडण्यापूर्वी संपूर्ण रचना स्वतः परिष्कृत करा. पूर्ण LH1 सबयुनिटची प्रत तयार करा, आणि UCSF Chimera च्या “डॉकिंग मॅप टूल” चा वापर करून LH1 घनतेच्या लगतच्या नॉन-मॉडेल क्षेत्रात डॉक करा, आणि नंतर Coot मध्ये ते परिष्कृत करा; जोपर्यंत सर्व LH1 सबयुनिट्स मॉडेल होत नाहीत तोपर्यंत ही प्रक्रिया पुन्हा करा. RC-LH114-W संरचनेसाठी, Coot मध्ये अनअलोकेटेड डेन्सिटी काढून, USCF कायमेरा मॅपमध्ये प्रोटीनला उर्वरित नॉन-प्रोटीन घटकांपासून सेगमेंट केले जाते आणि ऑटोबिल्ड टूलचा वापर करून प्रारंभिक मॉडेल स्थापित केले जाते, आणि उर्वरित सबयुनिट्सचे (प्रोटीन-W) मॉडेलिंग केले जाते. PHENIX (49) मध्ये, Coot (48) मध्ये परिणामी मॉडेलमध्ये कोणतीही गहाळ सिक्वेन्सेस जोडा आणि नंतर संपूर्ण सबयुनिट मॅन्युअली रिफाइन करा. उर्वरित अनअलोकेटेड डेन्सिटी लिपिड्स (PDB मोनोमर लायब्ररी ID CDL = CDL, POPC = 6PL आणि POPG = PGT), β-DDM डिटर्जंट (LMT) आणि UQ10 मॉलिक्यूल्स (U10) यांच्या संयोजनाशी जुळते. जोपर्यंत मॉडेलची सांख्यिकी आणि फिटची दृश्य गुणवत्ता आणखी सुधारली जाऊ शकत नाही, तोपर्यंत संपूर्ण प्रारंभिक मॉडेल परिपूर्ण करण्यासाठी PHENIX ऑप्टिमायझेशन (49) आणि Coot (48) मध्ये मॅन्युअल ऑप्टिमायझेशन वापरा. शेवटी, स्थानिक नकाशा तीक्ष्ण करण्यासाठी LocScale (50) वापरा आणि नंतर वाटप न केलेल्या घनतेचे मॉडेलिंग आणि स्वयंचलित आणि मॅन्युअल ऑप्टिमायझेशनच्या इतर अनेक फेऱ्या करा.
संबंधित पेप्टाइड्स, कोफॅक्टर्स आणि इतर लिपिड्स आणि क्विनोन्स त्यांच्या संबंधित घनतेमध्ये डॉक केलेले आकृती 1 आणि 2. S18 ते S23 मध्ये दर्शविले आहेत. अंतिम मॉडेलची सांख्यिकीय माहिती तक्ता S1 मध्ये दर्शविली आहे.
अन्यथा निर्दिष्ट केल्याशिवाय, UV/Vis/NIR शोषण स्पेक्ट्रा कॅरी60 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (अजिलेंट, यूएसए) वर 250 nm ते 1000 nm पर्यंत 1 nm च्या अंतराने आणि 0.1s च्या एकत्रीकरण वेळेसह गोळा केले गेले.
A880 चे मूल्य 1 असलेल्या 2 मिमी पाथच्या क्वार्ट्झ क्युव्हेटमध्ये नमुना विरल करा आणि 400 ते 1000 nm दरम्यान शोषण स्पेक्ट्रम गोळा करा. वर्तुळाकार डायक्रोइक स्पेक्ट्रा जास्को 810 स्पेक्ट्रोपोलॅरिमीटरवर (जास्को, जपान) 400 nm ते 950 nm दरम्यान 1 nm च्या अंतराने 20 nm min-1 च्या स्कॅन दराने गोळा केले गेले.
मोलर एक्सटिंक्शन कोएफिशिएंट कोर कॉम्प्लेक्सला अंदाजे ५० च्या A880 पर्यंत पातळ करून निर्धारित केला जातो. १०μl व्हॉल्यूम ९९०μl बाइंडिंग बफर किंवा मिथेनॉलमध्ये पातळ करा आणि BChl ऱ्हास कमी करण्यासाठी शोषण स्पेक्ट्रम त्वरित गोळा करा. प्रत्येक मिथेनॉल नमुन्यातील BChl सामग्रीची गणना ७७१ nm वरील ५४.८ mM-1 cm-1 च्या एक्सटिंक्शन कोएफिशिएंटद्वारे केली गेली आणि एक्सटिंक्शन कोएफिशिएंट निर्धारित केला गेला (५१). कोर कॉम्प्लेक्सची एकाग्रता निर्धारित करण्यासाठी मोजलेल्या BChl एकाग्रतेला ३२ (RC-LH114-W) किंवा ३६ (RC-LH116) ने भागा, ज्याचा उपयोग नंतर बफरमध्ये गोळा केलेल्या त्याच नमुन्याच्या शोषण स्पेक्ट्रमचे एक्सटिंक्शन कोएफिशिएंट समांतर निर्धारित करण्यासाठी केला जातो. प्रत्येक नमुन्यासाठी तीन पुनरावृत्त मोजमाप घेण्यात आले आणि BChl Qy कमाल शोषणाची सरासरी गणना करण्यासाठी वापरली गेली. 878 nm वर मोजलेला RC-LH114-W चा विलुप्तता गुणांक 3280±140 mM-1 cm-1 आहे, तर 880 nm वर मोजलेला RC-LH116 चा विलुप्तता गुणांक 3800±30 mM-1 cm-1 आहे.
(52) मधील पद्धतीनुसार UQ10 चे प्रमाण निश्चित करण्यात आले. थोडक्यात, Agilent 1200 HPLC प्रणाली वापरून रिव्हर्स फेज HPLC (RP-HPLC) करण्यात आले. सुमारे 0.02 nmol RC-LH116 किंवा RC-LH114-W हे 0.02% (w/v) फेरिक क्लोराईड असलेल्या 50:50 मेथॅनॉल:क्लोरोफॉर्मच्या 50μl मध्ये विरघळवा, आणि पूर्व-संतुलित Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm ×25 cm कॉलमवर HPLC द्रावकात (80:20 मेथॅनॉल:2-प्रोपेनॉल) 40°C तापमानावर 1 ml-1 min-1 दराने विरघळवा. 1 तासासाठी 275 nm (UQ10), 450 nm (कॅरोटीनॉइड्स) आणि 780 nm (BChl) येथे शोषणक्षमता तपासण्यासाठी HPLC द्रावकात आयसोक्रॅटिक इल्युशन करा. २७५ एनएम क्रोमॅटोग्राममधील २५.५ मिनिटांवरील शिखराचे इंटिग्रेशन करण्यात आले, ज्यामध्ये इतर कोणतेही शोधण्यायोग्य संयुगे नव्हते. ० ते ५.८ एनएमओएल पर्यंतच्या शुद्ध मानकांच्या इंजेक्शनमधून गणना केलेल्या कॅलिब्रेशन वक्राच्या संदर्भात, काढलेल्या UQ10 च्या मोलर प्रमाणाची गणना करण्यासाठी इंटिग्रेटेड क्षेत्राचा वापर केला जातो (आकृती S14). प्रत्येक नमुन्याचे तीन वेळा विश्लेषण करण्यात आले आणि नोंदवलेली त्रुटी सरासरीच्या एसडी (SD) शी संबंधित आहे.
30 μM रिड्यूस्ड हॉर्स हार्ट सायटोक्रोम सी2 (मर्क, यूके) आणि 0 ते 50 μM MUQ2 (मर्क, यूके) वापरून, 0.1 चे कमाल Qy शोषण असलेले RC-LH1 कॉम्प्लेक्स असलेले द्रावण तयार करण्यात आले. प्रत्येक UQ2 सांद्रतेवर 1-ml चे तीन नमुने तयार करण्यात आले आणि मोजमाप करण्यापूर्वी अंधाराशी पूर्ण अनुकूलन सुनिश्चित करण्यासाठी ते 4°C तापमानावर रात्रभर अंधारात ठेवण्यात आले. हे द्रावण 300 nm फ्लेम/500 लाइन ग्रेटिंग, 1.24 mm इनलेट, 0.12 mm मध्य आणि 0.6 mm आउटलेट स्लिट्सने सुसज्ज असलेल्या OLIS RSM1000 मॉड्युलर स्पेक्ट्रोफोटोमीटरमध्ये भरण्यात आले. उत्तेजित प्रकाश वगळण्यासाठी नमुना फोटोट्यूब आणि संदर्भ फोटोमल्टिप्लायर ट्यूबच्या प्रवेशद्वारावर 600 nm लाँग पास फिल्टर ठेवण्यात आला आहे. 0.15 सेकंदांच्या इंटिग्रेशन वेळेसह 550 nm वर शोषणाचे निरीक्षण करण्यात आले. उत्तेजन प्रकाश 880 nm M880F2 LED (लाइट एमिटिंग डायोड) (थॉरलाब्ज लि., यूके) मधून फायबर ऑप्टिक केबलद्वारे 90% तीव्रतेने DC2200 कंट्रोलर (थॉरलाब्ज लि., यूके) मधून उत्सर्जित होतो आणि प्रकाश स्रोताकडे 90° च्या कोनातून पाठवला जातो. नमुन्याद्वारे सुरुवातीला शोषला न गेलेला कोणताही प्रकाश परत पाठवण्यासाठी मोजमाप किरणपुंज आरशाच्या विरुद्ध दिशेने ठेवला जातो. 50 सेकंदांच्या प्रदीपनाच्या 10 सेकंद आधी शोषणक्षमतेचे निरीक्षण करा. त्यानंतर, क्विनोलॉल सायटोक्रोम c23+ चे स्वयंस्फूर्तपणे किती प्रमाणात क्षपण करते हे तपासण्यासाठी अंधारात 60 सेकंदांसाठी शोषणक्षमतेचे निरीक्षण केले गेले (मूळ डेटासाठी आकृती S8 पहा).
UQ2 च्या सांद्रतेनुसार 0.5 ते 10 सेकंदांच्या आत एक रेषीय प्रारंभिक दर जुळवून आणि प्रत्येक UQ2 सांद्रतेवर तिन्ही नमुन्यांच्या दरांची सरासरी काढून डेटावर प्रक्रिया करण्यात आली. संबंधित विलुप्तता गुणांकाद्वारे गणना केलेल्या RC-LH1 सांद्रतेचा उपयोग दराचे उत्प्रेरक कार्यक्षमतेमध्ये रूपांतर करण्यासाठी केला गेला, जो Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) मध्ये आलेखित करण्यात आला आणि स्पष्ट Km व Kcat मूल्ये निश्चित करण्यासाठी मायकेलिस-मेंटेन मॉडेलमध्ये जुळवून घेण्यात आला.
क्षणिक शोषण मापनासाठी, RC-LH1 नमुना 50 mM सोडियम एस्कॉर्बेट (मर्क, यूएसए) आणि 0.4 mM टर्ब्युटिन (मर्क, यूएसए) असलेल्या IMAC बफरमध्ये ~2μM पर्यंत विरल करण्यात आला. एस्कॉर्बिक ॲसिडचा वापर त्याग करणारा इलेक्ट्रॉन दाता म्हणून केला जातो आणि टर्ट-ब्युटाक्लोफेनचा वापर QB अवरोधक म्हणून केला जातो, जेणेकरून संपूर्ण मापन प्रक्रियेदरम्यान मुख्य RC दाता क्षीण (म्हणजेच, प्रकाश-ऑक्सिडीकृत नाही) राहील याची खात्री करता येते. सुमारे 3 मिली नमुना एका विशेष फिरणाऱ्या सेलमध्ये (सुमारे 0.1 मीटर व्यास, 350 RPM) टाकला जातो, ज्याचा प्रकाशीय मार्ग लांबी 2 मिमी आहे, जेणेकरून लेझर मार्गातील नमुन्याला उत्तेजन स्पंदांच्या दरम्यान अंधाराशी जुळवून घेण्यासाठी पुरेसा वेळ मिळेल. नमुन्याला 880 nm वर 1 kHz च्या पुनरावृत्ती दराने (NIR साठी 20 nJ किंवा Vis साठी 100 nJ) उत्तेजित करण्यासाठी, Ti: Sapphire लेझर प्रणालीला (स्पेक्ट्रा फिजिक्स, यूएसए) प्रवर्धित करण्याकरिता ~100-fs लेझर पल्सेस वापरा. ​​डेटा गोळा करण्यापूर्वी, नमुन्याला सुमारे 30 मिनिटांसाठी उत्तेजन प्रकाशात ठेवा. या प्रदर्शनामुळे QA निष्क्रिय होईल (शक्यतो QA एकदा किंवा दोनदा कमी होईल). परंतु कृपया लक्षात घ्या की ही प्रक्रिया उलटवता येण्याजोगी आहे, कारण दीर्घकाळ अंधारात जुळवून घेतल्यानंतर, RC हळूहळू QA सक्रियतेकडे परत येईल. -10 ते 7000 ps च्या विलंब वेळेसह क्षणिक स्पेक्ट्रा मोजण्यासाठी हेलिओस स्पेक्ट्रोमीटर (अल्ट्राफास्ट सिस्टीम्स, यूएसए) वापरण्यात आला. डेटा सेट्सचे गट वेगळे करण्यासाठी, नंतर विलीन करण्यासाठी आणि प्रमाणित करण्यासाठी सरफेस एक्सप्लोरर सॉफ्टवेअर (अल्ट्राफास्ट सिस्टीम्स, यूएसए) वापरा. क्षयाशी संबंधित विभेदक स्पेक्ट्रा मिळविण्यासाठी एकत्रित डेटा सेट वापरण्याकरिता कार्पेटव्ह्यू सॉफ्टवेअर पॅकेज (लाइट कन्व्हर्जन लिमिटेड, लिथुआनिया) वापरा, किंवा ओरिजिन (ओरिजिनलॅब, यूएसए) मध्ये एकल-तरंगलांबी स्पेक्ट्रल उत्क्रांती फिट करण्यासाठी इन्स्ट्रुमेंट रिस्पॉन्ससह एकाधिक एक्सपोनेंट्स कॉन्व्हॉल्व्ह करणारे फंक्शन वापरा.
वर नमूद केल्याप्रमाणे (53), RC आणि परिधीय LH2 अँटेना दोन्ही नसलेला LH1 कॉम्प्लेक्स असलेला एक प्रकाशसंश्लेषक फिल्म तयार करण्यात आला. मेम्ब्रेन 20 mM ट्रिस (pH 8.0) मध्ये विरघळवण्यात आला आणि नंतर 2 मिमी ऑप्टिकल पाथ असलेल्या क्वार्ट्झ क्युव्हेटमध्ये लोड करण्यात आला. नमुन्याला 540 nm वर उत्तेजित करण्यासाठी -10 ते 7000 ps च्या विलंब वेळेसह 30nJ लेसर पल्स वापरण्यात आला. Rps.pal नमुन्यासाठी वर्णन केल्याप्रमाणे डेटा सेटवर प्रक्रिया करा.
मेम्ब्रेनला 4°C तापमानावर 2 तासांसाठी 150,000 RCF वर सेंट्रीफ्यूगेशन करून पेलेट केले गेले, आणि नंतर त्याचे 880 nm वरील ॲबसॉर्बन्स 20 mM ट्रिस-HCl (pH 8.0) आणि 200 mM NaCl मध्ये पुन्हा सस्पेंड केले गेले. 4°C तापमानावर अंधारात 1 तासासाठी 2% (w/v) β-DDM मध्ये हळूहळू ढवळून मेम्ब्रेन विरघळवा. नमुना 100 mM ट्रायइथिलअमोनियम कार्बोनेट (pH 8.0) (TEAB; मर्क, यूके) मध्ये 2.5 mg ml-1 (बायो-रॅड विश्लेषण) प्रोटीन सांद्रतेपर्यंत डायल्यूट केला गेला. पुढील प्रक्रिया पूर्वी प्रकाशित केलेल्या पद्धतीनुसार (54) केली गेली, ज्याची सुरुवात 1% (w/v) सोडियम लॉरेट (मर्क, यूके) असलेल्या एकूण 50 μl TEAB मध्ये 50 μg प्रोटीन डायल्यूट करण्यापासून झाली. ६० सेकंदांसाठी सोनिकेशन केल्यानंतर, ३७°C तापमानावर ३० मिनिटांसाठी ५ mM ट्रिस(२-कार्बोक्सीइथिल)फॉस्फिन (मर्क, यूके) वापरून त्याचे रिडक्शन करण्यात आले. एस-अल्किलेशनसाठी, नमुना खोलीच्या तापमानावर १० मिनिटांसाठी १० mM मिथिल एस-मिथिलथायोमेथेनसल्फोनेट (मर्क, यूके) सोबत इनक्युबेट करा आणि २०० mM आयसोप्रोपेनॉल स्टॉक सोल्यूशनमधून ते घाला. २ μg ट्रायप्सिन/एंडोप्रोटीनेज Lys-C मिश्रण (प्रोमेगा यूके) घालून प्रोटीओलायटिक डायजेशन करण्यात आले आणि ३७°C तापमानावर ३ तासांसाठी इनक्युबेट करण्यात आले. ५० μl इथिल ॲसिटेट आणि १० μl १०% (v/v) LC ग्रेड ट्रायफ्लुरोॲसिटिक ॲसिड (TFA; थर्मो फिशर सायंटिफिक, यूके) घालून आणि ६० सेकंदांसाठी व्हॉर्टेक्सिंग करून लॉरेट सर्फॅक्टंटचे निष्कर्षण करण्यात आले. १५,७०० RCF वर ५ मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूगेशन करून टप्प्यांचे विलगीकरण वाढवण्यात आले. उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार, पेप्टाइड असलेल्या खालच्या टप्प्याला काळजीपूर्वक शोषून घेण्यासाठी आणि त्यातील क्षार काढून टाकण्यासाठी C18 स्पिन कॉलम (थर्मो फिशर सायंटिफिक, यूके) वापरण्यात आला. व्हॅक्यूम सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे सुकवल्यानंतर, नमुना ०.५% TFA आणि ३% ॲसिटोनायट्राइलमध्ये विरघळवण्यात आला, आणि पूर्वी तपशीलवार वर्णन केलेल्या सिस्टीम पॅरामीटर्सचा वापर करून मास स्पेक्ट्रोमेट्रीसह जोडलेल्या नॅनोफ्लो RP क्रोमॅटोग्राफीद्वारे ५०० नॅनोग्रॅमचे विश्लेषण करण्यात आले.
Rps. palustris प्रोटीओम डेटाबेस (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) शोधण्यासाठी प्रथिने ओळख आणि प्रमाणीकरणाकरिता MaxQuant v.1.5.3.30 (56) वापरा. ​​मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीओमिक्स डेटा, PRIDE पार्टनर रिपॉझिटरी (http://proteomecentral.proteomexchange.org) द्वारे ProteomeXchange Alliance मध्ये PXD020402 या डेटासेट आयडेंटिफायर अंतर्गत जमा करण्यात आला आहे.
इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्रीसह जोडलेल्या RPLC द्वारे विश्लेषणासाठी, वाइल्ड-टाइप Rps पासून RC-LH1 कॉम्प्लेक्स तयार करण्यात आला. पूर्वी प्रकाशित पद्धत (16) वापरून, पॅलस्ट्रिस पेशींमध्ये तयार झालेली प्रथिनांची सांद्रता 20 mM हेपेस (pH 7.8), 100 mM NaCl आणि 0.03% (w/v) β- (बायो-रॅड विश्लेषण) DDM मध्ये 2 mg ml-1 होती. उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार, अवक्षेपण पद्धतीने 10 μg प्रथिने काढण्यासाठी 2D प्युरिफिकेशन किट (GE हेल्थकेअर, USA) वापरा आणि अवक्षेप 20 μl 60% (v/v) फॉर्मिक ऍसिड (FA), 20% (v/v) ऍसिटोनायट्राइल आणि 20% (v/v) पाण्यात विरघळवा. पाच मायक्रोलिटरचे विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मॅक्सिस UHR-TOF, ब्रुकर) सह जोडलेल्या RPLC (डायोनेक्स RSLC) द्वारे करण्यात आले. 60°C आणि 100μlmin -1 वर विलगीकरणासाठी MabPac 1.2×100 mm कॉलम (Thermo Fisher Scientific, UK) वापरा, ज्यामध्ये 85% (v / v) सॉल्व्हेंट A [0.1% (v / v) FA आणि 0.02% (v/v) TFA जलीय द्रावण] ते 85%(v/v) सॉल्व्हेंट B [0.1%(v/v) FA आणि 90%(v/v) ॲसिटोनायट्राइल TFA मध्ये 0.02%(v/v)] असा ग्रेडियंट असेल. स्टँडर्ड इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत आणि डीफॉल्ट पॅरामीटर्स वापरून 60 मिनिटांपेक्षा जास्त वेळ प्रक्रिया केल्यावर, मास स्पेक्ट्रोमीटर 100 ते 2750 m/z (मास-टू-चार्ज रेशो) प्राप्त करतो. ExPASy बायोइन्फॉर्मेटिक्स रिसोर्स पोर्टलच्या FindPept टूलच्या (https://web.expasy.org/findpept/) मदतीने, मास स्पेक्ट्रमला कॉम्प्लेक्सच्या सबयुनिट्सशी मॅप करा.
पेशींना 100 मिली स्क्रू-टॉप बाटलीमध्ये (23) 100 मिली NF-कमी (10μMm-2 s-1), मध्यम (30μMm-2 s-1) किंवा उच्च (300μMm-2 s-1) प्रकाशाखाली 72 तास वाढवण्यात आले. M22 माध्यम (M22 माध्यम ज्यामध्ये अमोनियम सल्फेट वगळले आहे आणि सोडियम सक्सिनेटच्या जागी सोडियम ॲसिटेट वापरले आहे). पाच 30-सेकंदांच्या चक्रांमध्ये, पेशींचे विघटन करण्यासाठी 0.1 मायक्रॉनचे काचेचे मणी 1:1 च्या घनफळ गुणोत्तराने टाकण्यात आले आणि 5 मिनिटांसाठी बर्फावर थंड करण्यात आले. बेंचटॉप मायक्रोसेंट्रीफ्यूजमध्ये 16,000 RCF वर 10 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूगेशन करून अविद्राव्य पदार्थ, न फुटलेल्या पेशी आणि काचेचे मणी काढून टाकण्यात आले. मेम्ब्रेनला Ti 70.1 रोटरमध्ये 100,000 RCF सह 20 mM ट्रिस-HCl (pH 8.0) मध्ये 40/15% (w/w) सुक्रोज ग्रेडियंटसह 10 तासांसाठी वेगळे केले गेले.
आमच्या मागील कामात वर्णन केल्याप्रमाणे, PufW वरील His टॅगचे इम्युनोडिटेक्शन (16). थोडक्यात, शुद्ध केलेले कोअर कॉम्प्लेक्स (11.8 nM) किंवा RC च्या त्याच एकाग्रतेचे (ऑक्सिडेशनद्वारे कमी केलेला फरक स्पेक्ट्रम वजा करून आणि डाग दिलेल्या जेलवरील लोड जुळवून निर्धारित केलेले) मेम्ब्रेन, 2x SDS लोडिंग बफरमध्ये (मर्क, यूके) दोनदा पातळ करून वापरण्यात आले. प्रथिने एका प्रतिकृती 12% बिस-ट्रिस न्यूपेज जेलवर (थर्मो फिशर सायंटिफिक, यूके) वेगळी करण्यात आली. RC-L सबयुनिट लोड करण्यासाठी आणि पाहण्यासाठी जेलला कुमासी ब्रिलियंट ब्लूने (बायो-रॅड, यूके) डाग देण्यात आला. दुसऱ्या जेलवरील प्रथिने इम्युनोअसेसाठी मिथेनॉल-सक्रिय पॉलीविनायलिडीन फ्लोराइड (PVDF) मेम्ब्रेनवर (थर्मो फिशर सायंटिफिक, यूके) हस्तांतरित करण्यात आली. PVDF पडदा 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 आणि 5% (w/v) स्किम्ड मिल्क पावडरमध्ये ब्लॉक करण्यात आला आणि नंतर अँटी-His प्राथमिक अँटीबॉडीसह (अँटीबॉडी बफर [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl आणि 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, बेथिल लॅबोरेटरीज, यूएसए मध्ये पातळ करा) 4 तासांसाठी इनक्यूबेट करण्यात आला. अँटीबॉडी बफरमध्ये 5 मिनिटांसाठी 3 वेळा धुतल्यानंतर, मेम्ब्रेनला हॉर्सरॅडिश पेरॉक्सिडेज (सिग्मा-अल्ड्रिच, यूके) अँटी-माऊस सेकंडरी अँटीबॉडी (अँटीबॉडी बफरमध्ये 1:10,000 पातळ केलेले) सोबत जोडण्यात आले. वेस्टार ईटीए सी 2.0 केमिल्युमिनेसन्स सबस्ट्रेट (सायनाजेन, इटली) आणि अ‍ॅमर्शेम इमेजर 600 (जीई हेल्थकेअर, यूके) वापरून डिटेक्शनसाठी (अँटीबॉडी बफरमध्ये 3 वेळा धुतल्यानंतर 5 मिनिटे) इनक्युबेट करा.
प्रत्येक स्टेन केलेल्या जेल किंवा इम्युनोएसे लेनच्या तीव्रतेचे वितरण रेखाटून, शिखराखालील क्षेत्र एकत्रित करून आणि RC-L (स्टेन केलेले जेल) आणि प्रोटीन-W (इम्युनोएसे) यांच्या तीव्रतेचे गुणोत्तर काढून, ImageJ (57) मध्ये प्रतिमेवर प्रक्रिया केली. शुद्ध RC-LH114-W नमुन्यामध्ये RC-L ते प्रोटीन-W चे गुणोत्तर 1:1 आहे असे गृहीत धरून आणि त्यानुसार संपूर्ण डेटा सेट सामान्यीकृत करून, ही गुणोत्तरे मोलर गुणोत्तरांमध्ये रूपांतरित केली गेली.
या लेखासाठीच्या पूरक सामग्रीकरिता, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 येथे पहा.
हा एक मुक्त प्रवेश लेख आहे जो क्रिएटिव्ह कॉमन्स ॲट्रिब्युशन लायसन्सच्या अटींनुसार वितरित केला जातो. मूळ कामाचा योग्य संदर्भ देण्याच्या अटीवर, या लेखाचा कोणत्याही माध्यमात अप्रतिबंधित वापर, वितरण आणि पुनरुत्पादनास परवानगी आहे.
टीप: आम्ही तुम्हाला तुमचा ईमेल पत्ता देण्यास फक्त यासाठी सांगतो, जेणेकरून तुम्ही ज्या व्यक्तीची या पेजवर शिफारस कराल, त्या व्यक्तीला हे कळावे की तुम्ही त्यांना हा ईमेल दाखवू इच्छिता आणि तो स्पॅम नाही. आम्ही कोणताही ईमेल पत्ता नोंदवून घेणार नाही.
तुम्ही अभ्यागत आहात की नाही हे तपासण्यासाठी आणि स्वयंचलित स्पॅम सबमिशन रोखण्यासाठी या प्रश्नाचा वापर केला जातो.
डेव्हिड जेके स्वेन्सबरी, पार्क कियान, फिलिप जे. जॅक्सन, केटलिन एम. फेरीज, डॅरियस एम. निड्झविझकी, एलिझाबेथ सी. मार्टिन, डेव्हिड ए. फार्मर, लॉर्ना ए. मॅलोन, रेबेका एफ. थॉम्पसन, नील ए. रॅन्सन, डॅनियल पी. कॅनिफ, मार्क जे. डिकमन, ड्युई होल्टेन, क्रिस्टीन किर्मायर, अँड्र्यू हिचकॉक, सी. नील हंटर
अभिक्रिया केंद्रामधील लाईट ट्रॅप 1 कॉम्प्लेक्सची उच्च-रिझोल्यूशन रचना क्विनोन डायनॅमिक्सबद्दल नवीन अंतर्दृष्टी प्रदान करते.
डेव्हिड जेके स्वेन्सबरी, पार्क कियान, फिलिप जे. जॅक्सन, केटलिन एम. फेरीज, डॅरियस एम. निड्झविझकी, एलिझाबेथ सी. मार्टिन, डेव्हिड ए. फार्मर, लॉर्ना ए. मॅलोन, रेबेका एफ. थॉम्पसन, नील ए. रॅन्सन, डॅनियल पी. कॅनिफ, मार्क जे. डिकमन, ड्युई होल्टेन, क्रिस्टीन किर्मायर, अँड्र्यू हिचकॉक, सी. नील हंटर
अभिक्रिया केंद्रामधील लाईट ट्रॅप 1 कॉम्प्लेक्सची उच्च-रिझोल्यूशन रचना क्विनोन डायनॅमिक्सबद्दल नवीन अंतर्दृष्टी प्रदान करते.
©2021 अमेरिकन असोसिएशन फॉर द ॲडव्हान्समेंट ऑफ सायन्स. सर्व हक्क राखीव. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef आणि COUNTER चे भागीदार आहे. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.