सध्याचा पत्ता: OX11 0DE, UK, डायमंड बिल्डिंग, हार्वेल सायन्स अँड इनोव्हेशन पार्क, डायटकोट, ऑक्सफर्डशायर, UK, डायमंड लाईट सोर्स कंपनी लिमिटेड, इलेक्ट्रॉनिक बायोलॉजिकल इमेजिंग सेंटर.
प्रतिक्रिया केंद्र प्रकाश-हार्वेस्टिंग कॉम्प्लेक्स १ (RC-LH1) हा जांभळ्या फोटोट्रॉफिक बॅक्टेरियाचा मुख्य प्रकाशसंश्लेषण घटक आहे. आम्ही रोडोप्स्यूडोमोनास पॅलुस्ट्रिसपासून RC-LH1 कॉम्प्लेक्सच्या दोन क्रायो-इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी स्ट्रक्चर्स सादर केल्या. RC-LH114-W कॉम्प्लेक्सच्या 2.65-Å रिझोल्यूशन स्ट्रक्चरमध्ये RC भोवती 14 सबयूनिट LH1 लूप असतात, जे प्रथिने W द्वारे व्यत्यय आणतात, तर प्रथिने-W नसलेले कॉम्प्लेक्स पूर्णपणे RC द्वारे वेढलेले RC रचना असते. बंद 16 सबयूनिट LH1 लूप. या स्ट्रक्चर्सची तुलना RC-LH1 कॉम्प्लेक्समधील क्विनोनच्या गतिशीलतेबद्दल अंतर्दृष्टी प्रदान करते, ज्यामध्ये RC QB साइटवर क्विनोन बांधताना पूर्वी अनिश्चित कॉन्फॉर्मेशनल बदल तसेच सहाय्यक क्विनोन बाइंडिंग साइट्सचे स्थान समाविष्ट आहे, जे त्यांना RC मध्ये पास करण्यास मदत करतात. W प्रोटीनची अद्वितीय रचना LH1 लूप बंद होण्यास प्रतिबंध करते, ज्यामुळे क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेंजला गती देण्यासाठी एक चॅनेल तयार होते.
प्रकाशसंश्लेषणातून मिळणारी ऊर्जा पृथ्वीवरील जवळजवळ सर्व जीवसृष्टी टिकवून ठेवू शकते आणि त्यात सौर जैवतंत्रज्ञानासाठी मोठी क्षमता आहे. जागतिक प्रकाशसंश्लेषणाला चालना देताना, जांभळ्या फोटोट्रॉफिक बॅक्टेरिया विविध ऊर्जा पद्धती आणि चयापचय क्षमता देखील प्रदर्शित करतात. ते प्रकाशसंश्लेषण टाळू शकतात आणि अंधारात हेटेरोट्रॉफिक बॅक्टेरिया म्हणून वाढू शकतात, नायट्रोजन आणि कार्बन डायऑक्साइड निश्चित करू शकतात, हायड्रोजन तयार करू शकतात आणि सुगंधी संयुगे खराब करू शकतात (1-3). या प्रक्रियांसाठी ऊर्जा प्रदान करण्यासाठी, प्रकाशाचे जलद आणि कार्यक्षमतेने रासायनिक उर्जेमध्ये रूपांतर करणे आवश्यक आहे. ही प्रक्रिया तेव्हा सुरू होते जेव्हा प्रकाश-ट्रॅपिंग अँटेना कॉम्प्लेक्स प्रकाश शोषून घेतो आणि अडकलेली ऊर्जा प्रतिक्रिया केंद्रात (RC) स्थानांतरित करतो, ज्यामुळे चार्ज वेगळे करणे सुरू होते (4-7). जांभळ्या फोटोट्रॉफिक बॅक्टेरियामध्ये प्रकाशसंश्लेषणाचे मूलभूत एकक टाइप 2 RC ने बनलेले असते, जे प्रकाश-कापणी कॉम्प्लेक्स 1 (LH1) ने वेढलेले असते, ज्यामुळे RC-LH1 कोर कॉम्प्लेक्स तयार होते. LH1 वक्र αβ हेटेरोडायमरच्या अॅरेने तयार होते, ज्यापैकी प्रत्येक दोन बॅक्टेरियल क्लोरोफिल (BChl) a रेणू आणि एक किंवा दोन कॅरोटीनॉइड्स (8-12) बांधतो. सर्वात सोप्या LH1 अँटेनामध्ये RC (9-13) ला एका बंद लूपमध्ये घेरलेले 16 किंवा 17 αβ हेटेरोडायमर असतात, परंतु इतर कोर कॉम्प्लेक्समध्ये, ट्रान्समेम्ब्रेन पेप्टाइड्स आसपासच्या LH1 च्या सातत्यतेमध्ये व्यत्यय आणतात, ज्यामुळे RC आणि सायटोक्रोम bc1 कॉम्प्लेक्स (11, 13-15) मधील क्विनॉल/क्विनोन प्रसार वाढतो. जांभळा फोटोट्रॉफिक वनस्पती रोडोप्स्यूडोमोनास (Rps.) हा एक मॉडेल जीव आहे जो प्रकाशसंश्लेषणास समर्थन देणारी ऊर्जा आणि इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण समजू शकतो. Rps ची पहिली क्रिस्टल रचना. पॅलस्ट्रिस RC-LH1 कॉम्प्लेक्सचे मॉडेल RC आहे, जे 15 हेटेरोडायमेरिक LH1 लूपने वेढलेले आहे, जे "प्रोटीन W" (14) नावाच्या अज्ञात प्रथिनाने व्यत्यय आणले आहे. प्रोटीन-W नंतर RPA4402 म्हणून ओळखले गेले, जे तीन अंदाजित ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिसेस (TMH) (16) असलेले एक अनकॅरेक्टराइज्ड 10.5kDa प्रोटीन आहे. RC-L, M (pufL, pufM) आणि LH1α, β (pufA, pufB) उपयुनिट्स एन्कोडिंग जीन्ससाठी वापरल्या जाणाऱ्या नामकरणाशी सुसंगत राहण्यासाठी आम्ही rpa4402 जीन एन्कोडिंग प्रोटीन W चे नाव pufW असे ठेवण्याचा प्रस्ताव ठेवतो. मनोरंजक म्हणजे, प्रोटीन-W हे RC-LH1 च्या फक्त 10% मध्ये असते, ज्यामुळे Rps दिसून येते. palustris दोन भिन्न RC-LH1 कॉम्प्लेक्स तयार करते. येथे, आम्ही दोन कोर कॉम्प्लेक्सच्या उच्च-रिझोल्यूशन क्रायो-EM (क्रायो-EM) संरचनांचा अहवाल देतो, एक प्रोटीन W आणि 14 αβ हेटरोडायमरसह, दुसरा प्रोटीन W शिवाय आणि बंद 16 हेटरोडायमर LH1 लूपसह. आमची रचना Rps. palustris च्या RC-LH1 कॉम्प्लेक्सच्या समजुतीमध्ये एक पाऊल बदल दर्शवते, कारण आम्ही प्रत्येक प्रकाराच्या एकसंध लोकसंख्येचे विश्लेषण केले आहे आणि प्रत्येक पेप्टाइड आणि बद्ध रंगद्रव्ये आणि संबंधित लिपिड्स आणि क्विनोन स्पष्टपणे नियुक्त करण्यासाठी पुरेसे रिझोल्यूशन आहे. या रचनांची तुलना दर्शविते की आतापर्यंत इतर कोणत्याही RC-LH1 कॉम्प्लेक्समध्ये आढळलेले तीन TMH प्रथिने-W क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेंजला गती देण्यासाठी क्विनोन चॅनेल तयार करतात. अनेक संरक्षित लिपिड आणि क्विनोन बाइंडिंग साइट्स ओळखल्या गेल्या आहेत आणि क्विनोन आणि RC च्या संयोजनानंतर आम्हाला एक नवीन रचनात्मक बदल आढळला आहे, जो ऑक्सिजनयुक्त फोटोट्रॉफिक जीवांच्या फोटोसिस्टम II (PSII) RC साठी योग्य असू शकतो. आमचे निष्कर्ष जांभळ्या फोटोट्रॉफिक बॅक्टेरियाच्या RC-LH1 कोर कॉम्प्लेक्समध्ये क्विनोन/क्विनोलोन बाइंडिंग आणि एक्सचेंजच्या गतीशास्त्रात नवीन अंतर्दृष्टी प्रदान करतात.
Rps. palustris मध्ये आढळणाऱ्या दोन कॉम्प्लेक्सचा सविस्तर अभ्यास करण्यासाठी, आम्ही प्रत्येक RC-LH1 बायोकेमिकल पद्धतींनी वेगळे करतो. प्रथिने W-कमी असलेले कॉम्प्लेक्स (यापुढे ΔpufW म्हणून संदर्भित) pufW जनुक नसलेल्या स्ट्रेनपासून शुद्ध केले गेले (16), आणि फक्त एक RC-LH1 कॉम्प्लेक्स तयार केला जाऊ शकतो. प्रथिने W-युक्त कॉम्प्लेक्स एका स्ट्रेनद्वारे तयार केले जाते. या स्ट्रेनचे प्रथिने W त्याच्या C-टर्मिनसवर 10x His टॅगसह सुधारित केले जाते, जेणेकरून प्रथिने W-युक्त कॉम्प्लेक्स धातू स्थिर करून बहुतेक कमतरता असलेल्या प्रोटीन W सह प्रभावीपणे एकत्र केले जाऊ शकते. कॉम्प्लेक्स प्रभावीपणे वेगळे केले आहे (16) अ‍ॅफिनिटी क्रोमॅटोग्राफी (IMAC).
आकृती १ मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, दोन्ही कॉम्प्लेक्समध्ये तीन उप-युनिट RC (RC-L, RC-M आणि RC-H) आहेत ज्याभोवती LH1 अँटेना आहे. प्रथिने-W नसलेल्या कॉम्प्लेक्सच्या 2.80-A रचनेत 16 αβ हेटेरोडायमर आहेत, जे RC भोवती पूर्णपणे बंद LH1 लूप तयार करतात, ज्याला यापुढे RC-LH116 कॉम्प्लेक्स म्हणून संबोधले जाईल. प्रथिने-W-युक्त कॉम्प्लेक्सच्या 2.65Å रचनेत 14-हेटेरोडायमर LH1 आहे जो प्रथिने-W द्वारे व्यत्यय आणला जाईल, ज्याला यापुढे RC-LH114-W म्हणून संबोधले जाईल.
(A आणि B) संयुगाचे पृष्ठभागाचे प्रतिनिधित्व. (C आणि D) रॉड्समध्ये व्यक्त केलेले बंधित रंगद्रव्ये. (E आणि F) सायटोप्लाज्मिक पृष्ठभागावरून पाहिलेल्या संकुलांमध्ये कार्टूनमध्ये दर्शविलेले पेप्टाइड्स आणि LH1 उपयुनिट्स असतात आणि प्रथिने-W अंतरापासून घड्याळाच्या दिशेने क्रमांकित केले जातात [Rba क्रमांकनाशी सुसंगत. स्फेरोइड्स कॉम्प्लेक्स (13)]. LH1-α साठी, प्रथिने उपयुनिटचा रंग पिवळा आहे; LH1-β साठी, प्रथिने उपयुनिटचा रंग निळा आहे; प्रथिने-W साठी, प्रथिने लाल आहे; RC-H साठी, ते निळसर आहे; RC-L साठी, ते नारंगी आहे; RC-M साठी, मॅजेन्टा आहे. सहघटक रॉड्सद्वारे दर्शविले जातात, हिरवा BChl आणि BPh a रेणू दर्शवितो, जांभळा कॅरोटीनोइड्स दर्शवितो आणि पिवळा UQ10 रेणू दर्शवितो. (G आणि H) RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स (G) आणि RC-LH116 कॉम्प्लेक्स (H) च्या समतुल्य प्रदेशात प्रथिने-W अंतराचे विस्तारित दृश्य. सहघटक जागा भरण्याच्या स्वरूपात प्रदर्शित केले जातात, चिलेटेड क्विनोन निळ्या रंगात प्रदर्शित केले जाते. प्रथिने-डब्ल्यू अंतर (G) मध्ये निळ्या तुटक रेषेने हायलाइट केले जाते आणि LH116 रिंगवर क्विनोन/क्विनोलोल पसरणारे लहान छिद्र (H) मध्ये काळ्या तुटक रेषेने हायलाइट केले जातात.
आकृती १ (अ आणि ब) मध्ये LH1αβ हेटेरोडायमरच्या खुल्या किंवा बंद अ‍ॅरेने वेढलेले RC दाखवले आहे, ज्यापैकी प्रत्येक दोन BChl आणि एक कॅरोटीनॉइड बांधतो (आकृती १, C आणि D). मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की Rps हे LH1 कॉम्प्लेक्स आहे. स्पायरुलिना झेंथिनच्या बायोसिंथेटिक मार्गात, या प्रजातींमध्ये कॅरोटीनॉइड्सची मिश्र लोकसंख्या असते (१७). तथापि, स्पायरोपायरॉक्सॅन्थिन हे प्रमुख कॅरोटीनॉइड आहे आणि त्याची घनता समाधानकारक आहे. म्हणून, आम्ही सर्व LH1 बंधन स्थळांवर स्पायरोक्सॅन्थिनचे मॉडेलिंग करण्याचे निवडले. अल्फा आणि बीटा पॉलीपेप्टाइड्स हे एकल TMH आहेत ज्यात लहान पडदा बाह्य क्षेत्रे आहेत (आकृती १, A, B, E आणि F). जरी C-टर्मिनसवर १७ अवशेषांची घनता पाहिली गेली नाही, तरीही दोन्ही कॉम्प्लेक्समध्ये अल्फा पॉलीपेप्टाइड Met1 पासून Ala46 पर्यंत विभाजित करण्यात आला. RC-LH116 मध्ये β पॉलीपेप्टाइड Gly4 वरून Tyr52 पर्यंत आणि RC-LH114-W मध्ये Ser5 वरून Tyr52 पर्यंत कमी करण्यात आले. 3 किंवा 4 N-टर्मिनल किंवा 13 C-टर्मिनल अवशेषांची घनता आढळली नाही (आकृती S1). वाइल्ड-टाइप स्ट्रेनपासून तयार केलेल्या मिश्र RC-LH1 कॉम्प्लेक्सच्या मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषणातून असे दिसून आले की गहाळ प्रदेश या पेप्टाइड्सच्या विषम क्लीवेजचा परिणाम होता (आकृती S1 आणि S2). α-Met1 चे N-टर्मिनल फॉर्मिलेशन देखील आढळले (f). विश्लेषणातून असे दिसून आले की α-पेप्टाइडमध्ये fMet1 ते Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 पर्यंतचे अवशेष असतात आणि β-पेप्टाइडमध्ये Ser2 ते Ala53 पर्यंतचे अवशेष असतात, जे कमी-तापमान EM घनता नकाशाशी चांगले जुळते.
α-His29 आणि β-His36 च्या समन्वयामुळे BChls समोरासमोर येतात; प्रत्येक αβ हेटेरोडायमर त्याच्या शेजाऱ्यांसोबत एकत्र येऊन RC भोवती एक ओपन लूप (RC-LH114-W) किंवा बंद लूप (RC-LH116) तयार करतो. एक्सिटॉन जोडलेल्या रंगद्रव्य अ‍ॅरे (आकृती 1, C आणि D). RC-LH114-W च्या 877 nm बँडच्या तुलनेत, RC-LH116 चा 880 nm शोषण लाल शिफ्ट 3 nm आहे (आकृती 2A). तथापि, वर्तुळाकार द्विभाजकता स्पेक्ट्रम जवळजवळ सारखाच आहे (आकृती 2B), जो दर्शवितो की जरी खुल्या आणि बंद लूपमध्ये स्पष्ट फरक असला तरी, BChls चे स्थानिक वातावरण खूप समान आहे. शोषण लाल शिफ्ट कमी झालेल्या थर्मल गतीचा आणि बंद लूपवरील वाढीव स्थिरतेचा परिणाम असू शकतो (18, 19), बंद लूपमुळे रंगद्रव्य जोडणीतील बदल (20, 21), किंवा या दोन प्रभावांचे संयोजन (11).
(अ) अल्ट्राव्हायोलेट/दृश्यमान/जवळ-अवरक्त शोषण स्पेक्ट्रम, ज्यांचे शिखर त्यांच्या संबंधित रंगद्रव्यांनी चिन्हांकित केले जातात आणि 775 nm वर BPh शिखरावर सामान्यीकृत केले जातात. (ब) 805 nm वर BChl शोषणावर सामान्यीकृत केलेले वर्तुळाकार द्विभाजक स्पेक्ट्रम. (C आणि D) RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स (C) आणि RC-LH116 कॉम्प्लेक्स (D) च्या वेळेनुसार निराकरण केलेल्या शोषण स्पेक्ट्रामधून निवडलेला ΔA स्पेक्ट्रा. चांगल्या तुलनात्मकतेसाठी, सर्व स्पेक्ट्रा 0.2 ps वर ∆A च्या ∆A वर सामान्यीकृत केले जातात. (E) UQ2 च्या विविध सांद्रतांच्या उपस्थितीत विकिरणानंतर सायटोक्रोम c2 ऑक्सिडेशनचा दर (कच्च्या डेटासाठी आकृती S8 पहा). (फ) कमी, मध्यम किंवा उच्च तीव्रतेच्या प्रकाशाखाली वाढलेल्या पेशींमध्ये (अनुक्रमे 10, 30 किंवा 300μMm-2 s-1), प्रथिने W आणि RC-L शुद्ध केलेल्या कॉम्प्लेक्समध्ये आणि विभक्त पडद्याच्या प्रमाणात उपयुनिट्स असतात. SDS-पॉलीअ‍ॅक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस आणि इम्युनोअसेद्वारे प्रथिन पातळी निश्चित करा (कच्च्या डेटासाठी आकृती S9 पहा). शुद्ध केलेल्या RC-LH114-W कॉम्प्लेक्सच्या सापेक्ष गुणोत्तर निश्चित करा. कॉम्प्लेक्सच्या प्रोटीन-W चे RC-L चे स्टोइचियोमेट्रिक गुणोत्तर 1:1 आहे.
RC-LH114-W (आकृती 1, A, C, आणि E) च्या विकृत αβ14 लूपमध्ये स्थान 1 वरील BChls हे RC-LH116 (आकृती 1, B, D, आणि F, आणि आकृती S3) मधील समतुल्य BChls पेक्षा RC प्राथमिक दाता (P) च्या 6.8Å ने जवळ आहेत; तथापि, दोन्ही संकुलांचे क्षणिक शोषण गतिशास्त्र दर्शविते की RC-LH114-W आणि RC-LH116 साठी, LH1 ते RC पर्यंत उत्तेजना ऊर्जा हस्तांतरण वेळ स्थिरांक 40 ±4 आणि 44±3 ps आहेत (आकृती 2). , C आणि D, ​​आकृती S4 आणि सारणी S2). RC मध्ये इलेक्ट्रॉनिक हस्तांतरणात देखील कोणताही महत्त्वपूर्ण फरक नाही (आकृती S5 आणि संबंधित पूरक मजकूर). आम्हाला शंका आहे की LH1 आणि RC-P मधील ऊर्जा हस्तांतरण वेळेचा जवळचा पत्रव्यवहार दोन LH1 लूपमधील बहुतेक BChl च्या समान अंतर, कोन आणि संभाव्य उर्जेमुळे आहे. असे दिसते की किमान अंतर गाठण्यासाठी LH1 ऊर्जा पॅटर्नचा शोध घेणे हे सबऑप्टिमल साइट्सपासून RC पर्यंत थेट ऊर्जा हस्तांतरणापेक्षा वेगवान नाही. स्ट्रक्चरल विश्लेषणासाठी RC-LH114-W मधील ओपन-लूप LH1 लूप कमी तापमानाच्या परिस्थितीत देखील क्षुल्लक थर्मल गती अनुभवू शकतो आणि RC 1 च्या स्थानावर βBChls च्या पिग्मेंटेशन अंतरापासून खोलीच्या तापमानावर αβ14 रिंग कॉन्फॉर्मेशन जास्त असते.
RC-LH116 कॉम्प्लेक्समध्ये 32 BChls आणि 16 कॅरोटीनॉइड्स आहेत आणि त्याची एकूण व्यवस्था थर्मोक्रोमॅटियम (Tch.) पिडपिडम [प्रोटीन डेटा बँक (PDB) ID 5Y5S] (9), थिओरहोडोव्हिब्रिओ (Trv.) 970 स्ट्रेन (PDB ID 7C9R) (12) आणि हिरवी शैवाल (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) पासून मिळवलेल्या सारखीच आहे. संरेखनानंतर, αβ हेटेरोडायमरच्या स्थानांमध्ये फक्त लहान विचलन दिसून आले, विशेषतः 1-5, 15 आणि 16 (आकृती S6). प्रथिने-W च्या उपस्थितीचा LH1 च्या संरचनेवर महत्त्वपूर्ण प्रभाव पडतो. त्याचे तीन TMH लहान लूपद्वारे जोडलेले आहेत, कॉम्प्लेक्सच्या लुमेन बाजूला N-टर्मिनल आणि सायटोप्लाज्मिक बाजूला C-टर्मिनल (आकृती 1A आणि 3, A ते D). प्रथिने-डब्ल्यू मोठ्या प्रमाणात हायड्रोफोबिक आहे (आकृती 3B), आणि TMH2 आणि TMH3 LH1αβ-14 शी संवाद साधून ट्रान्समेम्ब्रेन पृष्ठभाग तयार करतात (आकृती 3, B आणि E ते G). इंटरफेस प्रामुख्याने ट्रान्समेम्ब्रेन प्रदेशातील Phe, Leu आणि Val अवशेषांपासून बनलेला असतो. हे अवशेष हायड्रोफोबिक अमीनो आम्ल आणि αβ-14 रंगद्रव्यांनी रचलेले असतात. काही ध्रुवीय अवशेष देखील परस्परसंवादात योगदान देतात, ज्यामध्ये जटिल पोकळीच्या पृष्ठभागावर W-Thr68 आणि β-Trp42 मधील हायड्रोजन बंध समाविष्ट आहे (आकृती 3, F आणि G). सायटोप्लाझमच्या पृष्ठभागावर, Gln34 αβ-14 कॅरोटीनोइड्सच्या केटो गटाला लागून आहे. याव्यतिरिक्त, n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) रेणूचे निराकरण झाले आणि त्याची हायड्रोफोबिक शेपटी प्रथिने-डब्ल्यू आणि αβ-14 मधील इंटरफेसपर्यंत वाढली आणि लिपिड शेपटी शरीरात असू शकते. आम्हाला असेही आढळून आले की प्रथिने W आणि RCH चे C-टर्मिनल रिझोल्यूशन क्षेत्र खूप जवळ आहेत, परंतु विशिष्ट परस्परसंवाद तयार करण्याच्या व्याप्तीमध्ये नाहीत (आकृती 1, A आणि E). तथापि, या दोन प्रथिनांच्या निराकरण न झालेल्या C-टर्मिनल अमीनो आम्लांमध्ये परस्परसंवाद असू शकतात, जे RC-LH114-W कॉम्प्लेक्सच्या असेंब्ली दरम्यान प्रथिने-W च्या भरतीसाठी एक यंत्रणा प्रदान करू शकतात.
(A) कार्टून स्वरूपात LH1αβ14 च्या इंटरफेसला तोंड देणारे प्रोटीन-W, रॉड-आकाराचे साइड चेन (लाल) आहे, जे इलेक्ट्रोस्टॅटिक पॉटेंशियल आकृतीच्या एका भागात प्रदर्शित केले आहे (0.13 च्या कॉन्टूर लेव्हलसह पारदर्शक राखाडी पृष्ठभाग). (B) प्रोटीन-W जलविद्युत रंगीत पृष्ठभागाद्वारे दर्शविले जाते. ध्रुवीय आणि चार्ज केलेले क्षेत्र निळसर रंगात प्रदर्शित केले जातात, जलविद्युत क्षेत्र पांढऱ्या रंगात प्रदर्शित केले जातात आणि जोरदार जलविद्युत क्षेत्र नारिंगी रंगात प्रदर्शित केले जातात. (C आणि D) कार्टूनमध्ये दर्शविलेले प्रोटीन-W, त्याचे अभिमुखता (A) (C) प्रमाणेच आहे आणि 180° (D) ने फिरवले आहे. अनुक्रमातील स्थितीनुसार, वेगळे करता येणारे अवशेष इंद्रधनुष्य रंग योजना स्वीकारतात, जिथे N-टर्मिनल निळा असतो आणि C-टर्मिनल लाल असतो. (E) प्रोटीन-W (A) सारख्याच दृश्यात, आणि प्रोटीन-W:LH1 च्या इंटरफेसवरील अवशेष संलग्न चिन्हांसह रॉड्सद्वारे दर्शविले जातात. (F) कार्टून प्रेझेंटेशनमध्ये (E) आणि LH1αβ14 च्या सापेक्ष आणि बार प्रेझेंटेशनमधील इंटरफेस रेसिड्यूजच्या सापेक्ष प्रोटीन-W 90° फिरवले आहे. बीटा पॉलीपेप्टाइडमधील ओव्हरहँगिंग रेसिड्यूज लेबल केलेले आहेत. कोफॅक्टर आकृती 1 च्या रंगाशी जुळणाऱ्या बार म्हणून दाखवला आहे, विघटित β-DDM राखाडी रंगात दाखवला आहे आणि ऑक्सिजन लाल रंगात दाखवला आहे. (G) (F) मधील दृश्य 180° फिरवले आहे, लेबल केलेल्या अल्फा पॉलीपेप्टाइडच्या प्रमुख रेसिड्यूजसह.
प्रोटीन-डब्ल्यू αβ हेटेरोडायमर (आकृती 1F मधील 15 वा) बदलतो, ज्यामुळे लूप बंद होण्यास प्रतिबंध होतो आणि पहिले तीन αβ हेटेरोडायमर झुकतात. असे आढळून आले की फिल्म नॉर्मलच्या सापेक्ष पहिल्या αβ-1 हेटेरोडायमरचा कमाल झुकण्याचा कोन 25° ते 29° होता (आकृती 1, A आणि E), जो RC A तीव्र कॉन्ट्रास्ट-LH116 (आकृती 1, B आणि F) मधील αβ-1 च्या 2° ते 8° झुकण्याने तयार झाला होता. दुसरे आणि तिसरे हेटेरोडायमर अनुक्रमे 12° ते 22° आणि 5° ते 10° वर झुकलेले आहेत. RC च्या स्टेरिक अडथळामुळे, αβ-1 च्या झुकण्यात αβ ची दुसरी जोडी समाविष्ट नाही (जी आकृती 1F मधील 16 व्या αβ शी संबंधित आहे), अशा प्रकारे LH1 रिंगमध्ये स्पष्ट अंतर तयार होते (आकृती 1, A आणि E). दोन αβ हेटेरोडायमर नसल्यामुळे, चार BChl आणि दोन कॅरोटीनॉइड्सच्या नुकसानासह, कोणतेही कॅरोटीनॉइड वळलेल्या αβ-1 सबयूनिटशी बांधले जात नाहीत, परिणामी LH114-W रिंग तयार होते ज्यामध्ये 13 कॅरोटीनॉइड्स व्हेजिटेरियन आणि 28 BChl असतात. αβ1 ते 7 प्रदेशांमधील दोन कॉम्प्लेक्सचे स्थानिक रिझोल्यूशन अंदाज उर्वरित LH1 लूपपेक्षा कमी आहेत, जे RC QB साइटला लागून असलेल्या LH1 सबयूनिटची अंतर्निहित प्लास्टिसिटी प्रतिबिंबित करू शकतात (आकृती 4).
आकृती १ (ब आणि ड) मधील RC-LH114-W (A आणि B) आणि RC-LH116 (C आणि D) चे चित्र एकाच वरच्या दृश्य/बाजूच्या दृश्यातून (A आणि B) (A आणि C) आणि पोकळीच्या पृष्ठभागावरून दाखवले आहेत. रंगीत कळा उजवीकडे दाखवल्या आहेत.
१:१४ च्या स्टोइचियोमेट्रिक गुणोत्तरासह एकमेव वैशिष्ट्यपूर्ण कोर कॉम्प्लेक्स म्हणजे रोडोकोकस स्फेरोइड्स (Rba.) RC-LH1-PufX डायमर (१३). तथापि, प्रथिने W आणि PufX मध्ये कोणतेही स्पष्ट समरूपता नाही आणि त्यांचा त्यांच्या संबंधित LH1 संरचनांवर महत्त्वपूर्ण प्रभाव पडतो. PufX हा एक सिंगल TMH आहे ज्यामध्ये N-टर्मिनल सायटोप्लाज्मिक डोमेन आहे जो Rps. palustris LH116αβ-16 शी संबंधित स्थितीत RC-H सबयूनिट (१३) च्या सायटोप्लाज्मिक बाजूशी संवाद साधतो. PufX RC-LH1 आणि सायटोक्रोम bcl कॉम्प्लेक्स दरम्यान क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेंजसाठी एक चॅनेल तयार करतो आणि सर्व Rba. sphaeroides कोर कॉम्प्लेक्स (१३) मध्ये उपस्थित असतो. जरी मोनोमर-मोनोमर इंटरफेस Rba मध्ये आहे. स्फेरोइड्स RC-LH1-PufX डायमर हा RC-LH114-W मधील प्रथिने W च्या बंधनकारक स्थितीत स्थित आहे आणि PufX आणि प्रथिने-W द्वारे प्रेरित अंतर समतुल्य स्थितीत आहे (आकृती S7A). RC-LH114-W मधील अंतर देखील स्यूडोमोनास रोझा LH1 च्या काल्पनिक क्विनोन चॅनेल (8) शी संरेखित आहे, जो प्रथिने W किंवा PufX शी संबंधित नसलेल्या पेप्टाइड्सद्वारे तयार होतो (आकृती S7B). याव्यतिरिक्त, Blc मधील क्विनोन चॅनेल. एक γ सबयूनिट (7) वगळून तयार झालेला पन्ना हिरवा LH1 समान स्थितीत स्थित आहे (आकृती S7C). जरी वेगवेगळ्या प्रथिनांनी मध्यस्थी केली असली तरी, RC-LH1 कॉम्प्लेक्समध्ये या क्विनोन/क्विनोलोल चॅनेलचे सामान्य स्थितीत दिसणे हे अभिसरण उत्क्रांतीचे उदाहरण असल्याचे दिसते, जे दर्शवते की प्रथिने W द्वारे निर्माण केलेले अंतर क्विनोन चॅनेल म्हणून कार्य करू शकते.
LH114-W लूपमधील अंतरामुळे RC-LH114-W कॉम्प्लेक्सच्या अंतर्गत जागेत आणि बल्क मेम्ब्रेन (आकृती 1G) दरम्यान एक सतत मेम्ब्रेन प्रदेश तयार होतो, जो प्रथिनांप्रमाणे प्रोटीन पोरद्वारे दोन डोमेनला जोडण्याऐवजी असतो. RC-LH116 कॉम्प्लेक्स बंद Tch. सुईसारख्या कॉम्प्लेक्स (22) (आकृती 1H) सारखा असतो. मेम्ब्रेनद्वारे क्विनोनचे प्रसार अरुंद प्रोटीन चॅनेलद्वारे प्रसारापेक्षा जलद असल्याने, उघडे LH114-W लूप बंद LH116 लूपपेक्षा जलद RC टर्नओव्हरला अनुमती देऊ शकते आणि RC मध्ये क्विनोनचे प्रसार अधिक मर्यादित असू शकते. प्रोटीन W RC द्वारे क्विनोनच्या रूपांतरणावर परिणाम करते की नाही हे तपासण्यासाठी, आम्ही ubiquinone 2 (UQ2) (नैसर्गिक UQ10 चे अॅनालॉग लहान आयसोप्रीन शेपटीसह) (आकृती 2E) च्या विशिष्ट एकाग्रतेवर सायटोक्रोम ऑक्सिडेशन परख केली. जरी चिलेटेड क्विनोनची उपस्थिती स्पष्ट मायकेलिस स्थिरांकाच्या अचूक निर्धारणात अडथळा आणते (RC-LH114-W आणि RC-LH116 अनुक्रमे 0.2±0.1μM आणि 0.5±0.2μM साठी योग्य आहेत), RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) चा कमाल दर RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) पेक्षा 28±5% जास्त आहे.
आम्ही सुरुवातीला अंदाज लावला होता की कोर कॉम्प्लेक्सच्या सुमारे १०% मध्ये प्रथिने-डब्ल्यू उपस्थित आहे (१६); येथे, कमी-प्रकाश, मध्यम-प्रकाश आणि उच्च-प्रकाश वाढीच्या पेशींचे व्याप्ती दर अनुक्रमे १५±०.६%, ११±१% आणि ०.९±०.५ आहेत (आकृती २F). मास स्पेक्ट्रोमेट्रीची परिमाणात्मक तुलना दर्शविते की हिस्टिडाइन टॅग जोडल्याने वन्य-प्रकारच्या स्ट्रेनच्या तुलनेत प्रथिने-डब्ल्यूची सापेक्ष विपुलता कमी झाली नाही (P = ०.५९), म्हणून हे स्तर सुधारित प्रथिने-डब्ल्यूचे कृत्रिम भाग नाहीत (आकृती S10). तथापि, RC-LH1 कॉम्प्लेक्समध्ये प्रथिने-डब्ल्यूची ही कमी व्याप्ती काही RCs ला प्रवेगक दराने फ्लिप करण्यास अनुमती देऊ शकते, ज्यामुळे RC-LH116 कॉम्प्लेक्समध्ये मंद क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेंज कमी होते. आम्हाला आढळले की उच्च प्रकाश व्याप्ती दर अलीकडील ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स डेटाशी विसंगत आहे, जो दर्शवितो की तीव्र प्रकाशाखाली pufW जनुक अभिव्यक्ती वाढते (आकृती S11) (23). pufW ट्रान्सक्रिप्शन आणि RC-LH1 कॉम्प्लेक्समध्ये प्रथिने-W समाविष्ट करण्यामधील फरक गोंधळात टाकणारा आहे आणि प्रथिनांच्या जटिल नियमनाला प्रतिबिंबित करू शकतो.
RC-LH114-W मध्ये, 6 कार्डिओलिपिन (CDL), 7 फॉस्फेटिडायलकोलीन (POPC), 1 फॉस्फेटिडायलग्लिसेरॉल (POPG) आणि 29 β-DDM रेणू वाटप केले जातात आणि त्यामध्ये 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs आणि 12 βDDMs मॉडेल केले जातात. RC-LH116 (आकृती 5, A आणि B). या दोन रचनांमध्ये, CDL जवळजवळ कॉम्प्लेक्सच्या सायटोप्लाज्मिक बाजूला स्थित आहे, तर POPC, POPG आणि β-DDM बहुतेक ल्युमिनल बाजूला स्थित आहेत. RC-LH114-W कॉम्प्लेक्सच्या αβ-1 ते αβ-6 प्रदेशात दोन लिपिड आणि डिटर्जंट रेणू वेगळे केले गेले (आकृती 5A), आणि पाच RC-LH116 च्या समतुल्य प्रदेशात वेगळे केले गेले (आकृती 5B). कॉम्प्लेक्सच्या दुसऱ्या बाजूला अधिक लिपिड आढळले, प्रामुख्याने CDL, जे RC आणि αβ-7 ते αβ-13 दरम्यान जमा झाले (आकृती 5, A आणि B). इतर संरचनात्मकदृष्ट्या निराकरण केलेले लिपिड आणि डिटर्जंट्स LH1 रिंगच्या बाहेर स्थित आहेत आणि चांगल्या प्रकारे निराकरण केलेले अ‍ॅसिल साखळ्या LH1 उपयुनिट्समध्ये पसरलेले आहेत, ज्यांना RC-LH114-W मध्ये तात्पुरते β-DDM म्हणून नियुक्त केले आहे आणि RC मध्ये β-DDM म्हणून परिभाषित केले आहे. β-DDM आणि POPC-LH116 चे मिश्रण. आमच्या संरचनेतील चेलेटिंग लिपिड आणि डिटर्जंट्सच्या समान स्थिती दर्शवितात की ते शारीरिकदृष्ट्या संबंधित बंधनकारक स्थळे आहेत (आकृती S12A). Tch मधील समतुल्य रेणूंच्या स्थितींमध्ये देखील चांगली सुसंगतता आहे. सौम्य आणि Trv. स्ट्रेन 970 RC-LH1s (आकृती S12, B ते E) (9, 12) आणि लिपिड हेड ग्रुपच्या हायड्रोजन-बॉन्डिंग अवशेषांनी अनुक्रम संरेखन (आकृती S13) मध्ये बऱ्यापैकी चांगले संवर्धन दर्शविले, जे दर्शविते की RC (24) शी बांधलेले संवर्धित CDL, या साइट्स RC-LH1 कॉम्प्लेक्समध्ये संरक्षित केल्या जाऊ शकतात.
(A आणि B) RC-LH114-W (A) आणि RC-LH116 (B) पेप्टाइड्स कार्टूनद्वारे दर्शविले आहेत आणि रंगद्रव्ये रॉड्सद्वारे दर्शविली आहेत, आकृती 1 मधील रंगसंगती वापरून. लिपिड लाल रंगात दाखवले आहेत आणि डिटर्जंट्स राखाडी रंगात दाखवले आहेत. RC QA आणि QB साइट्सशी जोडलेले UQ पिवळे आहे, तर वेगळे केलेले UQ निळे आहे. (C आणि D) लिपिड्स वगळून (A) आणि (B) सारखेच दृश्ये. (E ते G) RC-LH116 वरून Q1(E), Q2(F) आणि Q3(G) चे मोठे दृश्य, एकमेकांवर प्रभाव पाडणाऱ्या बाजूच्या साखळ्यांसह. हायड्रोजन बंध काळ्या तुटक रेषांसारखे दाखवले आहेत.
RC-LH116 मध्ये, चार्ज सेपरेशन प्रक्रियेत इलेक्ट्रॉन ट्रान्सफरमध्ये सहभागी होणारे RC QA आणि QB UQ दोन्ही त्यांच्या बंधनकारक ठिकाणी विघटित होतात. तथापि, RC-LH114-W मध्ये, QB क्विनोनचे निराकरण झालेले नाही आणि खाली तपशीलवार चर्चा केली जाईल. QA आणि QB क्विनोन व्यतिरिक्त, दोन चिलेटेड UQ रेणू (RC आणि LH1 रिंग्ज दरम्यान स्थित) RC-LH114-W रचनेत त्यांच्या चांगल्या प्रकारे निराकरण झालेल्या हेड ग्रुप्स (अनुक्रमे Q1 आणि Q2 मध्ये स्थित) नुसार वाटप केले जातात. जागा). आकृती 5C). Q1 ला दोन आयसोप्रीन युनिट्स नियुक्त केल्या आहेत आणि घनता नकाशा Q2 च्या पूर्ण 10 आयसोप्रीन शेपटींचे निराकरण करतो. RC-LH116 च्या रचनेत, तीन चिलेटेड UQ10 रेणू (Q1 ते Q3, आकृती 5D) सोडवले गेले होते आणि सर्व रेणूंची शेपटीत स्पष्ट घनता आहे (आकृती 5, D ते G). दोन्ही रचनांमध्ये, Q1 आणि Q2 च्या क्विनोन हेड ग्रुप्सच्या पोझिशन्समध्ये उत्कृष्ट सुसंगतता आहे (आकृती S12F), आणि ते फक्त RC शी संवाद साधतात. Q1 हे RC-LH114-W (आकृती 1G आणि 5, C, D आणि E) च्या W गॅपच्या प्रवेशद्वारावर स्थित आहे, आणि Q2 हे QB बाइंडिंग साइट (आकृती 5, C, D) आणि F जवळ स्थित आहे. संरक्षित L-Trp143 आणि L-Trp269 अवशेष Q1 आणि Q2 च्या खूप जवळ आहेत आणि संभाव्य π-स्टॅकिंग परस्परसंवाद प्रदान करतात (आकृती 5, E आणि F, आणि आकृती S12). Q1 च्या दूरस्थ ऑक्सिजनमधून L-Gln88, 3.0 Å, एक मजबूत हायड्रोजन बंध प्रदान करते (आकृती 5E); हे अवशेष सर्वात दूरच्या संबंधाशिवाय सर्व RC मध्ये संरक्षित आहे (आकृती S13). बहुतेक इतर RCs मध्ये (आकृती S13) Thr ऐवजी L-Ser91 हे पारंपारिकपणे वापरले जाते, Q1 च्या मिथाइल ऑक्सिजनपासून 3.8 अँग्स्ट्रॉम्स असते आणि ते कमकुवत हायड्रोजन बंध प्रदान करू शकते (आकृती 5E). Q3 मध्ये विशिष्ट परस्परसंवाद असल्याचे दिसून येत नाही, परंतु ते RC-M सबयूनिट आणि LH1-α सबयूनिट 5 ते 6 (आकृती 5, D आणि G) दरम्यानच्या हायड्रोफोबिक प्रदेशात स्थित आहे. Q1, Q2 आणि Q3 किंवा जवळील चेलेटेड क्विनोन्स देखील Tch. Gentle, Trv. Strain 970 आणि Blc मध्ये सोडवले गेले आहेत. आयरीस स्ट्रक्चर (9, 10, 12) RC-LH1 कॉम्प्लेक्स (आकृती S12G) मधील संरक्षित सहाय्यक क्विनोन बंधन साइटकडे निर्देश करते. RC-LH116 मधील पाच विघटित UQ हे उच्च कार्यक्षमता द्रव क्रोमॅटोग्राफी (HPLC) द्वारे निर्धारित केलेल्या प्रत्येक कॉम्प्लेक्सच्या 5.8±0.7 शी चांगले सहमत आहेत, तर RC-LH114-W मधील तीन विघटित UQ हे 6.2±0.3 (आकृती S14) च्या मोजलेल्या मूल्यापेक्षा कमी आहेत असे दर्शविते की संरचनेत निराकरण न झालेले UQ रेणू आहेत.
स्यूडो-सिमेट्रिक L आणि M पॉलीपेप्टाइड्समध्ये प्रत्येकी पाच TMH असतात आणि एक हेटेरोडायमर तयार करतात जो एक BChl डायमर, दोन BChl मोनोमर, दोन बॅक्टेरियोफेज (BPh) मोनोमर आणि एक नॉन-हेम आयर्न आणि एक किंवा दोन UQ10 रेणू एकत्र करतो. टर्मिनल केटोन गटावरील हायड्रोजन बंधांच्या उपस्थितीद्वारे आणि Rps मध्ये त्याचे ज्ञात संचय, कॅरोटीनॉइड्स M-सबयूनिटमध्ये समाविष्ट केले जातात, ज्याला cis-3,4-dehydroorhodopin असे नाव दिले जाते. प्रजाती (25). RC-H चे बाह्य पडदा डोमेन एकाच TMH द्वारे पडद्याशी जोडलेले असते. एकूण RC रचना संबंधित प्रजातींच्या (जसे की Rba) तीन सबयूनिट RC सारखीच असते. स्फेरोइड्स (PDB ID: 3I4D). या संरचनांच्या रिझोल्यूशन श्रेणीमध्ये BChl आणि BPh, कॅरोटीनॉइड बॅकबोन आणि नॉन-हेम आयर्नचे मॅक्रोसायकल ओव्हरलॅप होतात, जसे QA साइटवर UQ10 हेड ग्रुप आणि RC-LH116 वर QB क्विनोन (आकृती S15).
वेगवेगळ्या QB साइट ऑक्युपन्सी रेटसह दोन RC स्ट्रक्चर्सची उपलब्धता QB क्विनोन बाइंडिंगसह सुसंगत कॉन्फॉर्मेशनल बदलांचे परीक्षण करण्याची एक नवीन संधी प्रदान करते. RC-LH116 कॉम्प्लेक्समध्ये, QB क्विनोन पूर्णपणे बांधलेल्या "प्रॉक्सिमल" स्थितीत स्थित आहे (26), परंतु RC-LH114-W च्या पृथक्करणात QB क्विनोन नाही. RC-LH114-W मध्ये QB क्विनोन नाही, जे आश्चर्यकारक आहे कारण कॉम्प्लेक्स सक्रिय आहे, स्ट्रक्चरली रिझोल्व्ड QB क्विनोन असलेल्या RC-LH116 कॉम्प्लेक्सपेक्षा जास्त. जरी दोन LH1 रिंग्ज सुमारे सहा क्विनोन चेलेट करतात, तरी बंद RC-LH116 रिंगमध्ये पाच स्ट्रक्चरली रिझोल्व्ड असतात, तर खुल्या RC-LH114-W रिंगमध्ये फक्त तीन स्ट्रक्चरली मर्यादित असतात. ही वाढलेली संरचनात्मक विकृती RC-LH114-W QB साइट्सची जलद बदली, कॉम्प्लेक्समधील जलद क्विनोन गतीशास्त्र आणि LH1 लूप ओलांडण्याची वाढलेली शक्यता दर्शवू शकते. आम्ही असे सुचवितो की RC-LH114-W च्या RC QB साइटमध्ये UQ ची कमतरता अधिक जटिल आणि अधिक सक्रिय कॉम्प्लेक्सचा परिणाम असू शकते आणि RC-LH114-W ची QB साइट UQ टर्नओव्हरमध्ये ताबडतोब गोठवली गेली आहे. विशिष्ट टप्पा (QB साइटचे प्रवेशद्वार बंद केले गेले आहे) या क्रियाकलापाच्या स्वरूपाचे प्रतिबिंबित करते.
QB शिवाय, L-Phe217 चे सोबतचे रोटेशन UQ10 बाइंडिंगशी विसंगत असलेल्या स्थितीत करणे, कारण त्यामुळे शेपटीच्या पहिल्या आयसोप्रीन युनिटशी अवकाशीय टक्कर होईल (आकृती 6A). याव्यतिरिक्त, स्पष्ट मुख्य रचनात्मक बदल स्पष्ट आहेत, विशेषतः हेलिक्स डी (TMH D आणि E मधील लूपमधील लहान हेलिक्स) जिथे L-Phe217 QB बाइंडिंग पॉकेटमध्ये हलवले जाते आणि L-Tyr223 चे रोटेशन (आकृती 6A) M-Asp45 फ्रेमवर्कसह हायड्रोजन बंध तोडण्यासाठी आणि QB बाइंडिंग साइटचे प्रवेशद्वार बंद करण्यासाठी (आकृती 6B). हेलिक्स डी त्याच्या बेसवर पिव्होट करते, L-Ser209 चा Cα 0.33Å ने हलवला जातो, तर L-Val221Cα 3.52Å ने हलवला जातो. TMH D आणि E मध्ये कोणतेही निरीक्षण करण्यायोग्य बदल नाहीत, जे दोन्ही संरचनांमध्ये सुपरइम्पोजेबल आहेत (आकृती 6A). आपल्या माहितीनुसार, नैसर्गिक RC मधील ही पहिली रचना आहे जी QB साइट बंद करते. पूर्ण (QB-बाउंड) रचनेशी तुलना केल्यास असे दिसून येते की क्विनोन कमी होण्यापूर्वी, क्विनोनमध्ये प्रवेश करण्यासाठी एक रचनात्मक बदल आवश्यक आहे. L-Phe217 क्विनोन हेड ग्रुपसह π-स्टॅकिंग परस्परसंवाद तयार करण्यासाठी फिरते आणि हेलिक्स बाहेर सरकते, ज्यामुळे L-Gly222 चा सांगाडा आणि L-Tyr223 च्या बाजूच्या साखळीला स्थिर हायड्रोजन बाँड स्ट्रक्चरसह हायड्रोजन बाँड नेटवर्क तयार करण्याची परवानगी मिळते (आकृती 6, A आणि C).
(अ) होलोग्राम (एल चेन, नारंगी/एम चेन, मॅजेन्टा) आणि अपो (राखाडी) रचनेचे ओव्हरलॅपिंग कार्टून, ज्यामध्ये की अवशेष रॉडसारख्या प्रतिनिधित्वाच्या स्वरूपात प्रदर्शित केले जातात. UQ10 पिवळ्या पट्टीने दर्शविले जाते. ठिपकेदार रेषा संपूर्ण रचनेत तयार झालेल्या हायड्रोजन बंधांना दर्शवते. (ब आणि क) अपोलिपोप्रोटीन आणि संपूर्ण रिंग स्ट्रक्चरचे पृष्ठभाग प्रतिनिधित्व, अनुक्रमे निळ्या रंगात L-Phe217 आणि लाल रंगात L-Tyr223 च्या साइड चेन ऑक्सिजनला हायलाइट करते. L सबयुनिट नारंगी आहे; M आणि H सबयुनिट रंगीत नाहीत. (ड आणि ई) अपोलिपोप्रोटीन (ड) आणि संपूर्ण (ई) आरसी क्यूबी साइट्स [अनुक्रमे (ए) द्वारे रंगीत] आणि थर्मोफिलस थर्मोफिलस पीएसआयआय (प्लास्टिक क्विनोनसह हिरवा, निळा; पीडीबी आयडी: 3WU2) संरेखित करा (58).
अनपेक्षितपणे, जरी LH1 शिवाय QB-कमी असलेल्या RCs च्या अनेक संरचना उपलब्ध असल्या तरी, या अभ्यासात आढळलेले रचनात्मक बदल यापूर्वी नोंदवले गेले नाहीत. यामध्ये Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) आणि Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) मधील QB depletion structure समाविष्ट आहे, जे सर्व त्यांच्या एकूण QB संरचनेसारखेच आहेत. 3PRC च्या बारकाईने तपासणीतून असे दिसून आले की LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) डिटर्जंट रेणू QB स्थितीच्या प्रवेशद्वारावर बांधले जातात, जे बंद रचनामध्ये पुनर्रचना रोखू शकतात. जरी LDAO 1EYS किंवा 1OGV मध्ये त्याच स्थितीत विघटित होत नाही, तरी हे RCs समान डिटर्जंट वापरून तयार केले जातात आणि म्हणून समान परिणाम निर्माण करू शकतात. Rba ची क्रिस्टल रचना. सायटोक्रोम c2 (PDB ID: 1L9B) सह सह-स्फटिकीकृत स्फेरोइड्स RC मध्ये देखील एक बंद QB साइट असल्याचे दिसते. तथापि, या प्रकरणात, RC-M पॉलीपेप्टाइडचा N-टर्मिनल प्रदेश (Q हेलिक्सवरील टायर अवशेषाच्या H बंधाद्वारे QB बंधन साइटशी संवाद साधत) एक अनैसर्गिक रचना स्वीकारतो आणि QB रचनात्मक बदलाचा अधिक शोध घेतला जात नाही (30). आश्वासक गोष्ट म्हणजे RC-LH114-W संरचनेत M पॉलीपेप्टाइडचे या प्रकारचे विकृतीकरण आपण पाहिलेले नाही, जे जवळजवळ RC-LH116 RC च्या N-टर्मिनल क्षेत्रासारखेच आहे. हे देखील लक्षात घेतले पाहिजे की डिटर्जंट-आधारित LH1 अँटेनाच्या निर्मूलनानंतर, PDB मधील अपोलिपोप्रोटीन RCs निराकरण झाले, ज्यामुळे RC आणि आसपासच्या LH1 रिंगच्या आतील पृष्ठभागामधील अंतरातील अंतर्गत क्विनोन पूल आणि लिपिड्स नष्ट झाले (31, 32). RC कार्यशील राहते कारण ते सर्व सहघटक राखून ठेवते, विघटनशील QB क्विनोन वगळता, जे कमी स्थिर असते आणि तयारी प्रक्रियेदरम्यान अनेकदा नष्ट होते (33). याव्यतिरिक्त, हे ज्ञात आहे की RC मधून LH1 आणि नैसर्गिक चक्रीय लिपिड्स काढून टाकल्याने कार्यांवर परिणाम होऊ शकतो, जसे की चार्ज-सेप्रेटेड P+QB-स्टेटचे कमी आयुष्यमान (31, 34, 35). म्हणून, आम्ही असा अंदाज लावतो की RC भोवती असलेल्या स्थानिक LH1 रिंगचे अस्तित्व "बंद" QB साइट राखू शकते, ज्यामुळे QB जवळील स्थानिक वातावरण संरक्षित राहते.
जरी अपोलिपोप्रोटीन (QB क्विनोनशिवाय) आणि संपूर्ण रचना ही घटनांच्या मालिकेऐवजी QB साइटच्या टर्नओव्हरचे फक्त दोन स्नॅपशॉट दर्शविते, तरी असे संकेत आहेत की सब्सट्रेट इनहिबिशन रोखण्यासाठी हायड्रोक्विनोनद्वारे रिबाइंडिंग रोखण्यासाठी बंधन गेट केले जाऊ शकते. अपोलिपोप्रोटीनच्या QB साइटजवळ क्विनोलोल आणि क्विनोनचा परस्परसंवाद वेगळा असू शकतो, ज्यामुळे RC द्वारे त्याचा नकार होतो. क्विनोनच्या बंधनात आणि घटात रचनात्मक बदल भूमिका बजावतात असे फार पूर्वीपासून प्रस्तावित केले जात आहे. गडद अनुकूलनानंतर क्विनोन कमी करण्यासाठी गोठवलेल्या RC ची क्षमता बिघडते (36); एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी दर्शवते की हे नुकसान QB क्विनोन सक्रिय प्रॉक्सिमल स्थितीपासून सुमारे 4.5 Å "दूरस्थ" रचनामध्ये अडकल्यामुळे होते (26), 37). आम्ही असे सुचवितो की हे दूरस्थ बंधनकारक स्वरूप अपोलिपोप्रोटीन आणि पूर्ण रिंग स्ट्रक्चरमधील मध्यवर्ती अवस्थेचा स्नॅपशॉट आहे, जे क्विनोनशी प्रारंभिक परस्परसंवाद आणि QB साइट उघडल्यानंतर होते.
विशिष्ट फोटोट्रॉफिक बॅक्टेरिया आणि सायनोबॅक्टेरिया, शैवाल आणि वनस्पतींच्या PSII कॉम्प्लेक्समध्ये आढळणाऱ्या प्रकार II RC मध्ये संरचनात्मक आणि कार्यात्मक संवर्धन आहे (38). आकृती 6 (D आणि E) मध्ये दर्शविलेले स्ट्रक्चरल संरेखन PSII RCs आणि बॅक्टेरिया RC कॉम्प्लेक्सच्या QB साइटमधील समानतेवर भर देते. ही तुलना क्विनोन बंधन आणि घट यांच्या जवळून संबंधित प्रणालींचा अभ्यास करण्यासाठी दीर्घकाळापासून एक मॉडेल आहे. मागील प्रकाशनांनी असे सुचवले आहे की क्विनोनच्या PSII घटासह रचनात्मक बदल होतात (39, 40). म्हणून, RC च्या उत्क्रांती संवर्धनाचा विचार करता, ही पूर्वी न पाहिलेली बंधन यंत्रणा ऑक्सिजनयुक्त फोटोट्रॉफिक वनस्पतींमध्ये PSII RC च्या QB साइटवर देखील लागू होऊ शकते.
Rps ΔpufW (लेबल न केलेले pufW डिलीशन) आणि PufW-His (C-टर्मिनल 10x His-टॅग केलेले प्रोटीन-W नैसर्गिक pufW लोकसमधून व्यक्त केलेले) स्ट्रेन. पॅलुस्ट्रिस CGA009 चे वर्णन आमच्या मागील कामात (16) करण्यात आले होते. हे स्ट्रेन आणि आयसोजेनिक वाइल्ड-टाइप पॅरेंट फ्रीजरमधून PYE (प्रत्येक 5 ग्रॅम लिटर -1) (-80 °C वर LB मध्ये साठवलेले, 50% (w/v) ग्लिसरॉल) प्रथिने, यीस्ट अर्क आणि सक्सीनेट) अगर [1.5% (w/v)] प्लेटवर थोड्या प्रमाणात पेशी स्ट्रीक करून पुनर्प्राप्त केले गेले. प्लेटला अनॅरोबिक परिस्थितीत खोलीच्या तपमानावर अंधारात रात्रभर उष्मायन केले गेले आणि नंतर OSRAM 116-W हॅलोजन बल्ब (RS Components, UK) द्वारे प्रदान केलेल्या पांढऱ्या प्रकाशाने (~50 μmolm-2 s-1) 3 ते 5 दिवसांसाठी प्रकाशित केले गेले जोपर्यंत एकच कॉलनी दिसली नाही. एकाच वसाहतीत १० मिली M22+ माध्यम (४१) मध्ये ०.१% (w/v) कॅसामिनो आम्ल (यापुढे M22 म्हणून संदर्भित) घालून टोचण्यात आले. हे कल्चर कमी ऑक्सिजनच्या परिस्थितीत अंधारात ३४°C तापमानात १८० rpm वर ४८ तासांसाठी हलवून वाढवले ​​गेले आणि नंतर ७० मिली कल्चर त्याच परिस्थितीत २४ तासांसाठी टोचण्यात आले. १ मिली आकारमानाचे अर्ध-एरोबिक कल्चर ३० मिली युनिव्हर्सल स्क्रू-टॉप पारदर्शक काचेच्या बाटलीत ३० मिली M22 माध्यम टोचण्यासाठी वापरले जाते आणि निर्जंतुक चुंबकीय शक्ती स्टिरिंग रॉडद्वारे ४८ तासांसाठी आंदोलन (~५०μmolm-२ s-१) सह विकिरणित केले जाते. नंतर त्याच परिस्थितीत ३० मिली कल्चरमध्ये सुमारे १ लिटर कल्चर टोचण्यात आले, जे नंतर ७२ तासांसाठी ~२०० μmolm-२ s-१ वर प्रकाशित झालेल्या सुमारे ९ लिटर कल्चर टोचण्यासाठी वापरले गेले. पेशींचे संकलन ७१३२ आरसीएफ वर ३० मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे केले गेले, २० एमएम ट्रायस-एचसीएल (पीएच ८.०) च्या ~१० मिली मध्ये पुन्हा निलंबित केले गेले आणि गरजेपर्यंत -२०°C वर साठवले गेले.
वितळल्यानंतर, पुन्हा सस्पेंड केलेल्या पेशींमध्ये डीऑक्सिरायबोन्यूक्लिअस I (मर्क, यूके), लायसोझाइम (मर्क, यूके) आणि दोन रोश होलोएन्झाइम प्रोटीज इनहिबिटर टॅब्लेट (मर्क, यूके) चे काही क्रिस्टल्स घाला. २०,००० पीएसआय फ्रेंच प्रेशर सेल (अमिंको, यूएसए) मध्ये, पेशी ८ ते १२ वेळा विस्कळीत झाल्या. १८,५०० आरसीएफ वर ४° सेल्सिअस वर १५ मिनिटे सेंट्रीफ्यूगेशन करून अखंड पेशी आणि अघुलनशील कचरा काढून टाकल्यानंतर, ४३,००० डिग्री सेल्सिअस वर २ तासांसाठी ११३,००० आरसीएफ वर सेंट्रीफ्यूगेशन करून पिग्मेंटेड लायसेटमधून पडदा बाहेर काढला गेला. विरघळणारा अंश काढून टाका आणि रंगीत पडदा १०० ते २०० मिली २० एमएम ट्रायस-एचसीएल (पीएच ८.०) मध्ये पुन्हा सस्पेंड करा आणि दृश्यमान समुच्चय होईपर्यंत एकरूप करा. निलंबित पडदा २० मिमी ट्रायस-एचसीएल (पीएच ८.०) (अ‍ॅनाट्रेस, यूएसए) मध्ये २% (w/v) β-DDM असलेल्या ४°C तापमानावर अंधारात १ तासासाठी हलक्या हाताने ढवळत उष्मायन केले गेले. नंतर ७०°C वर सेंट्रीफ्यूज करून १ तासासाठी ४°C तापमानावर १५०,००० आरसीएफ विरघळवून अवशिष्ट अद्राव्य पदार्थ काढून टाकले.
ΔpufW स्ट्रेनमधील विद्राव्य पडदा ५० मिली DEAE सेफरोज आयन एक्सचेंज कॉलमवर तीन कॉलम व्हॉल्यूम (CV) बाइंडिंग बफर [२० mM tris-HCl (pH ८.०) ज्यामध्ये ०.०३% (w/v) β-DDM] होते, लागू करण्यात आला. कॉलम दोन CV बाइंडिंग बफरने धुवा आणि नंतर ५० mM NaCl असलेल्या दोन बाइंडिंग बफरने धुवा. RC-LH116 कॉम्प्लेक्सला १.७५ CV वर १५० ते ३०० mM NaCl (बाइंडिंग बफरमध्ये) च्या रेषीय ग्रेडियंटसह एल्युटेड करण्यात आले आणि उर्वरित बाइंडिंग कॉम्प्लेक्सला ०.५ CV वर ३०० mM NaCl असलेल्या बाइंडिंग बफरने एल्युटेड करण्यात आले. २५० ते १००० एनएम दरम्यान शोषण स्पेक्ट्रम गोळा करा, १ पेक्षा जास्त शोषण गुणोत्तर (A880/A280) असलेले अंश ८८० ते २८० एनएम वर ठेवा, ते बाइंडिंग बफरमध्ये दोनदा पातळ करा आणि DEAE स्तंभावर शुद्धीकरण चालू करा वर पुन्हा तीच प्रक्रिया वापरा. ​​१.७ पेक्षा जास्त A880/A280 गुणोत्तर आणि ३.० पेक्षा जास्त A880/A805 गुणोत्तर असलेले अपूर्णांक पातळ करा, आयन एक्सचेंजची तिसरी फेरी करा आणि २.२ पेक्षा जास्त A880/A280 गुणोत्तर आणि ५.० पेक्षा जास्त A880/A805 गुणोत्तर असलेले अपूर्णांक राखून ठेवा. अंशतः शुद्ध केलेले कॉम्प्लेक्स अमिकॉन १००,००० आण्विक वजन कट-ऑफ (MWCO) सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर (मर्क, यूके) मध्ये ~२ मिली पर्यंत केंद्रित केले गेले आणि २०० एमएम NaCl बफर असलेल्या सुपरडेक्स २०० १६/६०० आकाराच्या एक्सक्लुजन कॉलम (जीई हेल्थकेअर, यूएस) वर लोड केले गेले आणि नंतर त्याच बफरमध्ये १.५ सीव्हीवर एल्युट केले गेले. आकार एक्सक्लुजन फ्रॅक्शनचा शोषण स्पेक्ट्रा गोळा करा आणि शोषण स्पेक्ट्रा २.४ पेक्षा जास्त A880/A280 गुणोत्तर आणि ५.८ ते १०० A880 पेक्षा जास्त A880/A805 गुणोत्तरांसह केंद्रित करा आणि क्रायो-टीईएम ग्रिड तयार करण्यासाठी किंवा स्टोरेजसाठी त्वरित वापरा. ​​गरज पडेपर्यंत -८०°C वर ठेवा.
PufW-His स्ट्रेनमधील विद्राव्य पडदा IMAC बफर (GE Healthcare) मध्ये 20 मिली HisPrep FF Ni-NTA Sepharose कॉलम (20 mM tris-HCl (pH 8.0) मध्ये 200 mM NaCl आणि 0.03% (w/w)) असलेल्या 20 मिली HisPrep FF Ni-NTA Sepharose कॉलमवर (GE Healthcare) लागू करण्यात आला. v) β-DDM]. कॉलम IMAC बफरच्या पाच CVs ने धुतला गेला आणि नंतर 10 mM हिस्टिडाइन असलेल्या IMAC बफरच्या पाच CVs ने धुतला गेला. कोर कॉम्प्लेक्स 100 mM हिस्टिडाइन असलेल्या पाच IMAC बफरसह कॉलममधून बाहेर काढण्यात आला. RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स असलेला अंश Amicon 100,000 MWCO फिल्टर (Merck, UK) ने सुसज्ज असलेल्या एका ढवळलेल्या टाकीमध्ये ~10 ml पर्यंत केंद्रित केला जातो, बाइंडिंग बफरसह 20 वेळा पातळ केला जातो आणि नंतर 25 ml मध्ये जोडला जातो. DEAE Sepharose कॉलममध्ये, बफरशी बांधलेले चार CVs आगाऊ वापरले जातात. चार CV बाइंडिंग बफरने कॉलम धुवा, नंतर आठ CV वर 0 ते 100 mM NaCl च्या रेषीय ग्रेडियंटवर (बाइंडिंग बफरमध्ये) कॉम्प्लेक्स एल्युट करा आणि उर्वरित चार CV मध्ये 100 mM बाइंडिंग बफर आहे. सोडियम क्लोराईडवर एल्युट केलेले अवशिष्ट कॉम्प्लेक्स 2.4 पेक्षा जास्त A880/A280 गुणोत्तर आणि 4.6 पेक्षा जास्त A880/A805 गुणोत्तर असलेल्या अपूर्णांकांसह एकत्रित केले गेले. Amicon 100,000 MWCO सेंट्रीफ्यूगल फिल्टरमध्ये ~2 मिली पर्यंत केंद्रित केले गेले आणि आगाऊ 1.5 CV IMAC ने भरले गेले. बफरने सुपरडेक्स 200 16/600 आकाराच्या एक्सक्लुजन कॉलमला समतोल केले आणि नंतर 1.5 CV वर त्याच बफरमध्ये एल्युट केले गेले. आकार-अपवर्जन अपूर्णांकांचे शोषण स्पेक्ट्रा गोळा करा आणि शोषण स्पेक्ट्रा 2.1 पेक्षा जास्त A880/A280 गुणोत्तर आणि 4.6 ते 100 A880 पेक्षा जास्त A880/A805 गुणोत्तरांसह केंद्रित करा, जे गोठवलेल्या TEM ग्रिड तयार करण्यासाठी ताबडतोब वापरले जातात किंवा गरज पडेपर्यंत -80°C वर साठवले जातात.
कमी तापमानाच्या TEM ग्रिड तयार करण्यासाठी Leica EM GP इमर्सन फ्रीजरचा वापर करण्यात आला. कॉम्प्लेक्स IMAC बफरमध्ये 50 च्या A880 पर्यंत पातळ केले गेले आणि नंतर 5μl नवीन ग्लो-डिस्चार्ज केलेल्या QUANTIFOIL 1.2/1.3 कार्बन-लेपित तांब्याच्या जाळीवर लोड केले गेले (Agar Scientific, UK). ग्रिडला 20°C आणि 60% सापेक्ष आर्द्रतेवर 30 सेकंदांसाठी उबवा, नंतर ते 3 सेकंदांसाठी कोरडे करा आणि नंतर -176°C वर द्रव इथेनमध्ये ते शांत करा.
RC-LH114-W कॉम्प्लेक्सचा डेटा eBIC (इलेक्ट्रॉनिक बायोइमेजिंग सेंटर) (ब्रिटिश डायमंड लाइट सोर्स) वर टायटन क्रिओस मायक्रोस्कोप वापरून रेकॉर्ड करण्यात आला, जो 300kV च्या प्रवेगक व्होल्टेजवर काम करतो, ज्याचे नाममात्र मॅग्निफिकेशन 130,000× आहे आणि ऊर्जा - 20 eV चे अंतर निवडा. डेटा गोळा करण्यासाठी मोजणी मोडमध्ये प्रतिमा रेकॉर्ड करण्यासाठी K2 पीक डिटेक्टरसह Gatan 968 GIF क्वांटम वापरण्यात आला. कॅलिब्रेटेड पिक्सेल आकार 1.048Å आहे आणि डोस रेट 3.83 e-Å-2s-1 आहे. 11 सेकंदात चित्रपट गोळा केला आणि तो 40 भागांमध्ये विभागला. सूक्ष्मदर्शकाला पुन्हा फोकस करण्यासाठी कार्बन-लेपित क्षेत्र वापरा आणि नंतर प्रत्येक छिद्रात तीन चित्रपट गोळा करा. एकूण, 3130 चित्रपट गोळा करण्यात आले, ज्यांचे डिफोकस मूल्य -1 आणि -3μm दरम्यान होते.
आरसी-एलएच११६ कॉम्प्लेक्ससाठीचा डेटा अॅस्टरबरी बायोस्ट्रक्चर लॅबोरेटरी (लीड्स विद्यापीठ, यूके) येथे त्याच सूक्ष्मदर्शकाचा वापर करून गोळा करण्यात आला. १३० किलोवॅटच्या वाढीसह मोजणी मोडमध्ये डेटा गोळा करण्यात आला आणि ४.६ ई-Å-२एस-१ च्या डोससह पिक्सेल आकार १.०६५ Å पर्यंत कॅलिब्रेट करण्यात आला. चित्रपट १२ सेकंदात रेकॉर्ड करण्यात आला आणि ४८ भागांमध्ये विभागण्यात आला. एकूण ३३५९ चित्रपट गोळा करण्यात आले, ज्यांचे डीफोकस मूल्य -१ आणि -३μm दरम्यान होते.
सर्व डेटा प्रोसेसिंग रिलायन ३.० पाइपलाइन (४२) मध्ये केले जाते. डोस वेटिंगद्वारे बीम मोशन दुरुस्त करण्यासाठी मोशनकॉर २ (४३) वापरा आणि नंतर CTF (कॉन्ट्रास्ट ट्रान्सफर फंक्शन) पॅरामीटर निश्चित करण्यासाठी CTFFIND ४.१ (४४) वापरा. ​​या प्रारंभिक प्रक्रिया टप्प्यांनंतरचे ठराविक फोटोमायक्रोग्राफ आकृती २ मध्ये दाखवले आहेत. S१६. स्वयंचलित निवड टेम्पलेट २५०-पिक्सेल फ्रेममध्ये १००० कणांचे सुमारे २५० पिक्सेल मॅन्युअली निवडून आणि कोणताही संदर्भ द्विमितीय (२D) वर्गीकरण न करता तयार केले जाते, ज्यामुळे नमुना दूषिततेशी जुळणारे किंवा कोणतेही स्पष्ट वैशिष्ट्य नसलेले वर्गीकरण नाकारले जाते. त्यानंतर, सर्व मायक्रोफोटोग्राफवर स्वयंचलित निवड केली गेली आणि RC-LH114-W ८४९,३५९ कण होते आणि RC-LH116 कॉम्प्लेक्स ४७६,५४७ कण होते. सर्व निवडलेल्या कणांनी नॉन-रेफरन्स 2D वर्गीकरणाच्या दोन फेऱ्या केल्या आहेत आणि प्रत्येक रननंतर, कार्बन क्षेत्र, नमुना दूषितता, कोणतीही स्पष्ट वैशिष्ट्ये किंवा जोरदारपणे ओव्हरलॅपिंग कण पूर्ण करणारे कण नाकारले जातात, परिणामी RC-LH114-W आणि RC-LH116 च्या 3D वर्गीकरणासाठी अनुक्रमे 772,033 (90.9%) आणि 359,678 (75.5%) कण वापरले जातात. प्रारंभिक 3D संदर्भ मॉडेल स्टोकास्टिक ग्रेडियंट डिसेंट पद्धतीचा वापर करून तयार केले गेले. प्रारंभिक मॉडेलचा संदर्भ म्हणून वापर करून, निवडलेल्या कणांचे 3D मध्ये चार श्रेणींमध्ये वर्गीकरण केले आहे. या श्रेणीतील मॉडेलचा संदर्भ म्हणून वापर करून, सर्वात मोठ्या श्रेणीतील कणांवर 3D परिष्करण करा, नंतर सॉल्व्हेंट क्षेत्र कव्हर करण्यासाठी प्रारंभिक 15Å लो-पास फिल्टर वापरा, मऊ कडांचे 6 पिक्सेल जोडा आणि टॉप डिटेक्टरच्या गॅटन K2 पीक मॉड्युलेशन ट्रान्सफर फंक्शन दुरुस्त करण्यासाठी पिक्सेलवर प्रक्रिया केल्यानंतर. RC-LH114-W डेटासेटसाठी, हे प्रारंभिक मॉडेल मास्कच्या कडांवरील मजबूत घनता काढून टाकून सुधारित केले गेले (UCSF Chimera मधील कोर कॉम्प्लेक्स घनतेपासून डिस्कनेक्ट केलेले). परिणामी मॉडेल्स (RC-LH114-W आणि RC-LH116 चे रिझोल्यूशन अनुक्रमे 3.91 आणि 4.16 Å आहेत) 3D वर्गीकरणाच्या दुसऱ्या फेरीसाठी संदर्भ म्हणून वापरले जातात. वापरलेले कण प्रारंभिक 3D वर्गात गटबद्ध केले जातात आणि त्यात शेजारच्या भागाशी मजबूत सहसंबंध नसतो. स्पष्ट संरचनात्मक वैशिष्ट्यांचा ओव्हरलॅप किंवा अभाव. 3D वर्गीकरणाच्या दुसऱ्या फेरीनंतर, सर्वोच्च रिझोल्यूशन असलेली श्रेणी निवडली गेली [RC-LH114-W साठी, एक श्रेणी 377,703 कण (44.5%) आहे, RC-LH116 साठी, दोन श्रेणी आहेत, एकूण 260,752 कण (54.7%) आहेत, जिथे ते फक्त लहान फरकाने प्रारंभिक रोटेशननंतर संरेखित केल्यावर समान असतात]. निवडलेले कण ४००-पिक्सेल बॉक्समध्ये पुन्हा काढले जातात आणि ३D रिफायनिंगद्वारे रिफाइन केले जातात. सॉल्व्हेंट मास्क प्रारंभिक १५Å लो-पास फिल्टर, ३ पिक्सेल मॅप एक्सपेंशन आणि ३ पिक्सेल सॉफ्ट मास्क वापरून तयार केला जातो. परिणामी पोत अधिक परिष्कृत करण्यासाठी प्रत्येक पायरीनंतर प्रति-कण CTF रिफाइनमेंट, प्रति-कण गती सुधारणा आणि प्रति-कण CTF रिफाइनमेंटचा दुसरा टप्पा, ३D रिफाइनमेंट, सॉल्व्हेंट मास्किंग आणि पोस्ट-प्रोसेसिंग केले जाते. ०.१४३ च्या FSC (फूरियर शेल सहसंबंध गुणांक) कट-ऑफ मूल्याचा वापर करून, RC-LH114-W आणि RC-LH116 च्या अंतिम मॉडेल्सचे रिझोल्यूशन अनुक्रमे २.६५ आणि २.८०Å आहेत. अंतिम मॉडेलचा FSC वक्र आकृती २. S१७ मध्ये दर्शविला आहे.
सर्व प्रथिने अनुक्रम UniProtKB वरून डाउनलोड केले आहेत: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). RC चे समरूपता मॉडेल तयार करण्यासाठी SWISS-MODEL (45) वापरण्यात आला होता, ज्यामध्ये RC-L, RC-M आणि RC-H चे प्रथिने अनुक्रम आणि Rba ची क्रिस्टल रचना असते. sphaeroides RC टेम्पलेट म्हणून वापरण्यात आला होता (PDB ID: 5LSE) (46). जनरेट केलेले मॉडेल नकाशात बसवण्यासाठी UCSF Chimera मधील “फिट मॅप” टूल वापरा (47), प्रथिने रचना सुधारा आणि सहघटक [4×BChl a (मोनोमर लायब्ररी रेसिड्यू नाव = BCL), 2×BPh a (BPH), एक किंवा दोन प्रकारचे UQ10 (U10), एक नॉन-हेम आयर्न (Fe) आणि एक 3,4-डायहाइड्रोहेक्साकार्बोनिलकोलीन (QAK)] जोडण्यासाठी Coot (48) वापरा. ​​QAK मोनोमर लायब्ररीमध्ये उपलब्ध नसल्यामुळे, PHENIX (49) मधील eLBOW टूल वापरून ते पॅरामीटराइज केले गेले.
पुढे, LH1 सबयुनिट तयार करण्यात आले. सुरुवातीला, PHENIX (49) मधील स्वयंचलित बांधकाम साधनाचा वापर नकाशा वापरून LH1 अनुक्रमाचा भाग स्वयंचलितपणे तयार करण्यासाठी आणि LH1-α आणि LH1-β प्रथिने अनुक्रम इनपुट म्हणून वापरण्यासाठी केला गेला. सर्वात पूर्ण LH1 सबयुनिट निवडा, ते काढा आणि ते Coot मध्ये लोड करा, त्यात गहाळ अनुक्रम मॅन्युअली जोडा आणि दोन BCls a (BCL) आणि एक स्पिरिलोक्सॅन्थिन (CRT) जोडण्यापूर्वी संपूर्ण रचना मॅन्युअली परिष्कृत करा [संबंधित Rps नुसार LH1 कॉम्प्लेक्सची घनता आणि ज्ञात कॅरोटीनॉइड सामग्री. प्रजाती (17)]. संपूर्ण LH1 सबयुनिट कॉपी करा आणि LH1 घनतेच्या लगतच्या नॉन-मॉडेल क्षेत्रात डॉक करण्यासाठी UCSF चिमेरा “डॉकिंग मॅप टूल” वापरा आणि नंतर ते Coot मध्ये परिष्कृत करा; सर्व LH1 सबयुनिट मॉडेल होईपर्यंत प्रक्रिया पुन्हा करा. RC-LH114-W रचनेसाठी, Coot मधील न वाटलेली घनता काढून, USCF Chimera नकाशामधील उर्वरित नॉन-प्रोटीन घटकांमधून प्रथिने विभागली जातात आणि ऑटोबिल्ड टूलचा वापर प्रारंभिक मॉडेल आणि उर्वरित उपयुनिट्स (प्रोटीन-W) मॉडेलिंग स्थापित करण्यासाठी केला जातो. PHENIX (49) मध्ये. Coot (48) मध्ये परिणामी मॉडेलमध्ये कोणतेही गहाळ अनुक्रम जोडा आणि नंतर संपूर्ण उपयुनिट मॅन्युअली रिफाइन करा. उर्वरित न वाटलेली घनता लिपिड्स (CDL = CDL, POPC = 6PL आणि POPG = PGT चा PDB मोनोमर लायब्ररी ID), β-DDM डिटर्जंट (LMT) आणि UQ10 रेणू (U10) च्या संयोजनाशी जुळते. मॉडेल आकडेवारी आणि फिटची दृश्य गुणवत्ता आणखी सुधारली जाऊ शकत नाही तोपर्यंत संपूर्ण प्रारंभिक मॉडेल परिपूर्ण करण्यासाठी Coot (49) मध्ये PHENIX ऑप्टिमायझेशन (49) आणि मॅन्युअल ऑप्टिमायझेशन वापरा. ​​शेवटी, स्थानिक नकाशाला तीक्ष्ण करण्यासाठी LocScale (50) वापरा आणि नंतर न वाटलेली घनता आणि स्वयंचलित आणि मॅन्युअल ऑप्टिमायझेशन मॉडेलिंगचे इतर अनेक चक्र करा.
संबंधित पेप्टाइड्स, सहघटक आणि इतर लिपिड्स आणि क्विनोन त्यांच्या संबंधित घनतेमध्ये डॉक केलेले आहेत. आकृती 1 आणि 2 मध्ये दर्शविले आहेत. S18 ते S23. अंतिम मॉडेलची सांख्यिकीय माहिती तक्ता S1 मध्ये दर्शविली आहे.
अन्यथा निर्दिष्ट केल्याशिवाय, UV/Vis/NIR शोषण स्पेक्ट्रा Cary60 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (Agilent, USA) वर 250 nm ते 1000 nm पर्यंत 1 nm अंतराने आणि 0.1s च्या एकत्रीकरण वेळेवर गोळा केले गेले.
नमुना एका क्वार्ट्ज क्युवेटमध्ये पातळ करा ज्याचा A880 चा 2 मिमी मार्ग 1 आहे आणि 400 ते 1000 nm दरम्यान शोषण स्पेक्ट्रम गोळा करा. वर्तुळाकार डायक्रोइक स्पेक्ट्रा जास्को 810 स्पेक्ट्रोपोलारमीटर (जास्को, जपान) वर 400 nm आणि 950 nm दरम्यान 1 nm अंतराने 20 nm किमान-1 च्या स्कॅन दराने गोळा केले गेले.
कोर कॉम्प्लेक्सला अंदाजे ५० च्या A880 पर्यंत पातळ करून मोलर एक्स्टिंक्शन कोएन्शियंट निश्चित केला जातो. १०μl व्हॉल्यूम ९९०μl बाइंडिंग बफर किंवा मिथेनॉलमध्ये पातळ करा आणि BChl डिग्रेडेशन कमी करण्यासाठी ताबडतोब शोषण स्पेक्ट्रम गोळा करा. प्रत्येक मिथेनॉल नमुन्यातील BChl सामग्रीची गणना ५४.८ mM-१ cm-१ च्या ७७१ nm वर एक्स्टिंशन कोएन्शियंटद्वारे केली गेली आणि एक्स्टिंशन कोएन्शियंट निश्चित केला गेला (५१). कोर कॉम्प्लेक्स कॉन्सन्ट्रेट निश्चित करण्यासाठी मोजलेल्या BChl एकाग्रतेला ३२ (RC-LH114-W) किंवा ३६ (RC-LH116) ने विभाजित करा, जे नंतर बफर एक्स्टिंक्शन कोएन्शियंटमध्ये गोळा केलेल्या समान नमुन्याचे शोषण स्पेक्ट्रम निश्चित करण्यासाठी वापरले जाते. समांतर. प्रत्येक नमुन्यासाठी तीन पुनरावृत्ती मोजमाप घेतले गेले आणि गणनासाठी BChl Qy कमाल सरासरी शोषण वापरले गेले. ८७८ nm वर मोजलेला RC-LH114-W चा विलोपन गुणांक ३२८०±१४० mM-१ cm-१ आहे, तर ८८० nm वर मोजलेला RC-LH116 चा विलोपन गुणांक ३८००±३० mM-१ cm-१ आहे.
(५२) मधील पद्धतीनुसार UQ10 चे प्रमाण निश्चित करण्यात आले. थोडक्यात, रिव्हर्स फेज HPLC (RP-HPLC) Agilent 1200 HPLC प्रणाली वापरून केले गेले. RC-LH116 किंवा RC-LH114-W चे सुमारे 0.02 nmol 50:50 मिथेनॉलच्या 50μl मध्ये विरघळवा: 0.02% (w/v) फेरिक क्लोराईड असलेले क्लोरोफॉर्म, आणि पूर्व-संतुलित बेकमन कुल्टर अल्ट्रास्फीअर ODS 4.6 मिमी इंजेक्ट करा. ×25 सेमी स्तंभावर HPLC सॉल्व्हेंट (80:20 मिथेनॉल:2-प्रोपेनॉल) मध्ये 40°C वर 1 ml-1 min-1 मध्ये विरघळवा. 275 nm (UQ10), 450 nm (कॅरोटीनोइड्स) आणि 780 nm (BChl) वर शोषणाचे निरीक्षण करण्यासाठी HPLC सॉल्व्हेंटमध्ये 1 तासासाठी आयसोक्रॅटिक एल्युशन करा. २५.५ मिनिटांवर २७५ एनएम क्रोमॅटोग्राममधील शिखर एकात्मिक केले गेले होते, ज्यामध्ये इतर कोणतेही शोधण्यायोग्य संयुगे नव्हते. एकात्मिक क्षेत्राचा वापर ० ते ५.८ एनएमओएल (आकृती एस१४) शुद्ध मानकांच्या इंजेक्शनवरून गणना केलेल्या कॅलिब्रेशन वक्रच्या संदर्भात काढलेल्या UQ10 च्या मोलर प्रमाणाची गणना करण्यासाठी केला जातो. प्रत्येक नमुन्याचे तीन प्रतिकृतींमध्ये विश्लेषण केले गेले आणि नोंदवलेली त्रुटी सरासरीच्या SD शी संबंधित आहे.
३० μM कमी केलेल्या घोड्याच्या हृदयाच्या सायटोक्रोम c2 (मर्क, यूके) आणि ० ते ५० μMUQ2 (मर्क, यूके) सह RC-LH1 कॉम्प्लेक्स असलेले द्रावण तयार करण्यात आले ज्यामध्ये ०.१ च्या जास्तीत जास्त Qy शोषणाचा समावेश होता. प्रत्येक UQ2 एकाग्रतेवर तीन १-मिली नमुने तयार करण्यात आले आणि मापन करण्यापूर्वी अंधाराशी पूर्णपणे जुळवून घेण्यासाठी ४°C वर रात्रीच्या वेळी अंधारात उबवले गेले. हे द्रावण ३०० nm फ्लेम/५०० लाइन ग्रेटिंग, १.२४ mm इनलेट, ०.१२ mm मिडल आणि ०.६ mm आउटलेट स्लिट्सने सुसज्ज असलेल्या OLIS RSM1000 मॉड्यूलर स्पेक्ट्रोफोटोमीटरमध्ये लोड करण्यात आले. उत्तेजना प्रकाश वगळण्यासाठी नमुना फोटोट्यूब आणि संदर्भ फोटोमल्टीप्लायर ट्यूबच्या प्रवेशद्वारावर ६०० nm लांबीचा पास फिल्टर ठेवला आहे. ०.१५ सेकंदांच्या एकात्मिक वेळेसह ५५० nm वर शोषणाचे निरीक्षण करण्यात आले. उत्तेजना प्रकाश ८८० एनएम एम८८०एफ२ एलईडी (लाइट एमिटिंग डायोड) (थोरलॅब्स लिमिटेड, यूके) मधून ९०% तीव्रतेवर फायबर ऑप्टिक केबलद्वारे डीसी२२०० कंट्रोलर (थोरलॅब्स लिमिटेड, यूके) द्वारे उत्सर्जित केला जातो आणि ९०° च्या कोनात प्रकाश स्रोताकडे उत्सर्जित केला जातो. नमुन्याद्वारे सुरुवातीला शोषलेला नसलेला कोणताही प्रकाश परत करण्यासाठी मापन बीम आरशाच्या विरुद्ध आहे. ५० सेकंदांच्या प्रकाशमानतेपूर्वी १० सेकंद शोषणाचे निरीक्षण करा. नंतर क्विनोलॉल सायटोक्रोम c२३+ किती प्रमाणात उत्स्फूर्तपणे कमी करते याचे मूल्यांकन करण्यासाठी अंधारात ६० सेकंदांसाठी शोषणाचे निरीक्षण केले गेले (कच्च्या डेटासाठी आकृती S८ पहा).
डेटावर प्रक्रिया ०.५ ते १० सेकंदांच्या आत एक रेषीय प्रारंभिक दर बसवून (UQ2 एकाग्रतेवर अवलंबून) आणि प्रत्येक UQ2 एकाग्रतेवर तिन्ही नमुन्यांचे सरासरी दर ठरवून केली गेली. संबंधित विलोपन गुणांकाद्वारे गणना केलेली RC-LH1 एकाग्रता दर उत्प्रेरक कार्यक्षमतेत रूपांतरित करण्यासाठी वापरली गेली, जी ओरिजिन प्रो २०१९ (ओरिजिनलॅब, यूएसए) मध्ये प्लॉट केली गेली आणि स्पष्ट Km आणि Kcat मूल्ये निश्चित करण्यासाठी मायकेलिस-मेंटेन मॉडेलमध्ये बसवली गेली.
क्षणिक शोषण मापनांसाठी, RC-LH1 नमुना IMAC बफरमध्ये ~2μM पर्यंत पातळ केला गेला ज्यामध्ये 50 mM सोडियम एस्कॉर्बेट (मर्क, यूएसए) आणि 0.4 mM टर्ब्युटिन (मर्क, यूएसए) होते. एस्कॉर्बिक अॅसिडचा वापर बलिदान इलेक्ट्रॉन दाता म्हणून केला जातो आणि टर्ट-ब्युटाक्लोफेनचा वापर QB इनहिबिटर म्हणून केला जातो जेणेकरून मापन प्रक्रियेदरम्यान मुख्य RC दाता कमी राहतो (म्हणजे फोटोऑक्सिडाइज्ड नाही). लेसर मार्गातील नमुना उत्तेजित डाळींमध्ये गडद अनुकूलनासाठी पुरेसा वेळ मिळतो याची खात्री करण्यासाठी 2 मिमी ऑप्टिकल पथ लांबीसह कस्टम रोटेटिंग सेलमध्ये (सुमारे 0.1 मीटर व्यासाचा, 350 RPM) अंदाजे 3 मिली नमुना जोडला जातो. Ti: नीलम लेसर सिस्टम (स्पेक्ट्रा फिजिक्स, यूएसए) वाढविण्यासाठी ~100-fs लेसर पल्स वापरा जेणेकरून नमुना 1 kHz (NIR साठी 20 nJ किंवा Vis साठी 100 nJ) च्या पुनरावृत्ती दराने 880 nm वर उत्तेजित होईल. डेटा गोळा करण्यापूर्वी, नमुना सुमारे 30 मिनिटे उत्तेजित प्रकाशात ठेवा. एक्सपोजरमुळे QA निष्क्रिय होईल (कदाचित एक किंवा दोनदा QA कमी होईल). परंतु कृपया लक्षात ठेवा की ही प्रक्रिया उलट करता येते कारण गडद अनुकूलनाच्या दीर्घ कालावधीनंतर, RC हळूहळू QA क्रियाकलापात परत येईल. -10 ते 7000 ps च्या विलंब वेळेसह क्षणिक स्पेक्ट्रा मोजण्यासाठी हेलिओस स्पेक्ट्रोमीटर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम्स, यूएसए) वापरण्यात आला. डेटा सेट्सचे गट रद्द करण्यासाठी, नंतर विलीन करण्यासाठी आणि मानकीकरण करण्यासाठी सरफेस एक्सप्लोरर सॉफ्टवेअर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम्स, यूएसए) वापरा. ​​क्षयशी संबंधित विभेदक स्पेक्ट्रा मिळविण्यासाठी एकत्रित डेटा सेट वापरण्यासाठी कार्पेटव्ह्यू सॉफ्टवेअर पॅकेज (लाइट कन्व्हर्जन लिमिटेड, लिथुआनिया) वापरा, किंवा मूळ (ओरिजिनलॅब, यूएसए) मध्ये एकल-तरंगलांबी वर्णक्रमीय उत्क्रांतीमध्ये बसण्यासाठी इन्स्ट्रुमेंट प्रतिसादासह अनेक घातांकांना एकत्रित करणारे फंक्शन वापरा.
वर नमूद केल्याप्रमाणे (५३), RC आणि पेरिफेरल LH2 अँटेना नसलेला LH1 कॉम्प्लेक्स असलेला प्रकाशसंश्लेषक फिल्म तयार करण्यात आला. पडदा २० मिमी ट्रिस (pH ८.०) मध्ये पातळ करण्यात आला आणि नंतर २ मिमी ऑप्टिकल पाथसह क्वार्ट्ज क्युव्हेटमध्ये लोड करण्यात आला. नमुना उत्तेजित करण्यासाठी ३०nJ लेसर पल्सचा वापर ५४० nm वर करण्यात आला आणि त्याचा विलंब वेळ -१० ते ७००० ps होता. Rps. pal नमुन्यासाठी वर्णन केल्याप्रमाणे डेटा सेटवर प्रक्रिया करा.
४°C तापमानावर २ तासांसाठी १५०,००० RCF तापमानावर सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे पडदा पेलेट केला गेला आणि नंतर ८८० nm तापमानावर त्याचे शोषण २० mM tris-HCl (pH ८.०) आणि २०० mM NaCl मध्ये पुन्हा सस्पेंड केले गेले. ४°C तापमानावर अंधारात १ तासासाठी २% (w/v) β-DDM मध्ये हळूहळू ढवळत पडदा विरघळवा. नमुना १०० mM ट्रायथिलॅमोनियम कार्बोनेट (pH ८.०) (TEAB; मर्क, यूके) मध्ये २.५ मिलीग्राम मिली-१ (बायो-रॅड विश्लेषण) च्या प्रथिन सांद्रतेपर्यंत पातळ केला गेला. पूर्वी प्रकाशित पद्धती (५४) वरून पुढील प्रक्रिया केली गेली, ५० μg प्रथिने १% (w/v) सोडियम लॉरेट (मर्क, यूके) असलेल्या एकूण ५० μl TEAB मध्ये पातळ करून सुरुवात केली गेली. ६० सेकंदांसाठी सोनिकेशन केल्यानंतर, ते ३७°C वर ५ mM tris(२-कार्बोक्साइथिल)फॉस्फिन (मर्क, यूके) ने ३० मिनिटांसाठी कमी केले. एस-अल्किलेशनसाठी, नमुना १० mM मिथाइल एस-मिथाइलथायोमेथेनेसल्फोनेट (मर्क, यूके) ने इनक्युबेट करा आणि २०० mM आयसोप्रोपॅनॉल स्टॉक सोल्युशनमधून खोलीच्या तपमानावर १० मिनिटे घाला. २ μg ट्रिप्सिन/एंडोप्रोटीनेज लायस-सी मिश्रण (प्रोमेगा यूके) घालून प्रोटिओलिटिक पचन केले गेले आणि ३७°C वर ३ तासांसाठी इनक्युबेट केले गेले. ५० μl इथाइल एसीटेट आणि १० μl १०% (v/v) LC ग्रेड ट्रायफ्लुरोएसेटिक अॅसिड (TFA; थर्मो फिशर सायंटिफिक, यूके) घालून आणि ६० सेकंदांसाठी व्होर्टेक्सिंग करून लॉरेट सर्फॅक्टंट काढला गेला. १५,७०० RCF वर ५ मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे फेज सेपरेशनला प्रोत्साहन देण्यात आले. उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार, पेप्टाइड असलेल्या खालच्या टप्प्याला काळजीपूर्वक एस्पिरेट करण्यासाठी आणि डिसॉल्ट करण्यासाठी C18 स्पिन कॉलम (थर्मो फिशर सायंटिफिक, यूके) वापरण्यात आला. व्हॅक्यूम सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे कोरडे केल्यानंतर, नमुना 0.5% TFA आणि 3% एसीटोनिट्राइलमध्ये विरघळवला गेला आणि नॅनोफ्लो RP क्रोमॅटोग्राफीद्वारे 500 एनजीचे विश्लेषण केले गेले, ज्यामध्ये पूर्वी तपशीलवार सिस्टम पॅरामीटर्सचा वापर करून मास स्पेक्ट्रोमेट्री जोडली गेली.
Rps. palustris proteome डेटाबेस (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) शोधण्यासाठी प्रथिने ओळख आणि परिमाणीकरणासाठी MaxQuant v.1.5.3.30 (56) वापरा. ​​डेटासेट आयडेंटिफायर PXD020402 अंतर्गत PRIDE पार्टनर रिपॉझिटरी (http://proteomecentral.proteomexchange.org) द्वारे मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स डेटा प्रोटिओमएक्सचेंज अलायन्समध्ये जमा केला गेला आहे.
इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्रीसह RPLC द्वारे विश्लेषणासाठी, RC-LH1 कॉम्प्लेक्स वाइल्ड-टाइप Rps पासून तयार केले गेले. पूर्वी प्रकाशित पद्धती (16) वापरून, पॅलस्ट्रिस पेशींमध्ये उत्पादित प्रथिनांचे प्रमाण 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl आणि 0.03% (w/v) β- (बायो-रॅड विश्लेषण)) DDM मध्ये 2 mg ml-1 होते. उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार, पर्जन्य पद्धतीने 10 μg प्रथिने काढण्यासाठी 2D शुद्धीकरण किट (GE Healthcare, USA) वापरा आणि 20 μl 60% (v / v) फॉर्मिक अॅसिड (FA), 20% (v / v) एसीटोनिट्राइल आणि 20% (v / v) पाण्यात अवक्षेपण विरघळवा. RPLC (डायोनेक्स RSLC) द्वारे मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मॅक्सिस UHR-TOF, ब्रुकर) सह पाच मायक्रोलिटरचे विश्लेषण केले गेले. ९०%(v/v) एसीटोनिट्राइल TFA मध्ये ८५%(v/v) सॉल्व्हेंट A [०.१%(v/v) FA आणि ०.०२%(V/v) जलीय द्रावण] ते ८५%(v/v) सॉल्व्हेंट B [०.१%(v/v) FA आणि ०.०२%(v/v) च्या ग्रेडियंटसह ६०°C आणि १००μlmin -१ वर वेगळे करण्यासाठी MabPac १.२×१०० मिमी कॉलम (थर्मो फिशर सायंटिफिक, यूके) वापरा. ​​मानक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत आणि डीफॉल्ट पॅरामीटर्सचा वापर ६० मिनिटांपेक्षा जास्त काळ करण्यासाठी, मास स्पेक्ट्रोमीटर १०० ते २७५० m/z (मास-टू-चार्ज रेशो) प्राप्त करतो. ExPASy बायोइन्फॉरमॅटिक्स रिसोर्स पोर्टल FindPept टूल (https://web.expasy.org/findpept/) च्या मदतीने, कॉम्प्लेक्सच्या उपयुनिट्समध्ये मास स्पेक्ट्रम मॅप करा.
१०० मिली स्क्रू-टॉप बाटलीमध्ये १०० मिली NF-कमी (१०μMm-२ s-१), मध्यम (३०μMm-२ s-१) किंवा उच्च (३००μMm-२ s-१) प्रकाशात ७२ तास पेशी वाढवल्या गेल्या. M22 मध्यम (M22 माध्यम ज्यामध्ये अमोनियम सल्फेट वगळले जाते आणि सोडियम सक्सीनेट सोडियम एसीटेटने बदलले जाते) (२३). पाच ३०-सेकंद चक्रांमध्ये, पेशींना लायझ करण्यासाठी १:१ च्या आकारमानाच्या प्रमाणात ०.१ मायक्रॉन काचेचे मणी मणी केले गेले आणि ५ मिनिटांसाठी बर्फावर थंड केले गेले. बेंचटॉप मायक्रोसेन्ट्रीफ्यूजमध्ये १६,००० RCF वर १० मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे अघुलनशील पदार्थ, अखंड पेशी आणि काचेचे मणी काढून टाकले गेले. हा पडदा Ti 70.1 रोटरमध्ये 100,000 RCF असलेल्या 20 mM tris-HCl (pH 8.0) मध्ये 40/15% (w/w) सुक्रोज ग्रेडियंटसह 10 तासांसाठी वेगळा करण्यात आला.
आमच्या मागील कामात वर्णन केल्याप्रमाणे, PufW (16) वरील His टॅगचे इम्युनोडिटेक्शन. थोडक्यात, 2x SDS लोडिंग बफर (मर्क, यूके) मध्ये RC ची समान सांद्रता (ऑक्सिडेशनद्वारे कमी झालेल्या फरक स्पेक्ट्रम वजा करून आणि स्टेन्ड जेलवरील भार जुळवून निर्धारित केले जाते) असलेले शुद्ध कोर कॉम्प्लेक्स (11.8 nM) किंवा पडदा दोनदा पातळ केले गेले. प्रथिने प्रतिकृती 12% बिस-ट्रिस नुपेज जेल (थर्मो फिशर सायंटिफिक, यूके) वर वेगळे केले गेले. RC-L सबयूनिट लोड करण्यासाठी आणि व्हिज्युअलायझ करण्यासाठी कूमासी ब्रिलियंट ब्लू (बायो-रॅड, यूके) ने एक जेल रंगवण्यात आला. दुसऱ्या जेलवरील प्रथिने इम्युनोअसेसाठी मिथेनॉल-सक्रिय पॉलीव्हिनिलिडीन फ्लोराइड (PVDF) पडदा (थर्मो फिशर सायंटिफिक, यूके) मध्ये हस्तांतरित करण्यात आली. PVDF पडदा ५० mM tris-HCl (pH ७.६), १५० mM NaCl, ०.२% (v / v) Tween-२० आणि ५% (w / v) स्किम्ड मिल्क पावडरमध्ये ब्लॉक करण्यात आला आणि नंतर अँटी-हिस प्रायमरी अँटीबॉडी (डायल्युट द अँटीबॉडी बफरमध्ये [५० mM tris-HCl (pH ७.६), १५० mM NaCl आणि ०.०५% (v / v) Tween-२०] १:१००० A१९०-११४A, बेथिल लॅबोरेटरीज, यूएसए) ४ तासांसाठी इनक्युबेट करण्यात आला. अँटीबॉडी बफरमध्ये ५ मिनिटे ३ वेळा धुतल्यानंतर, पडदा हॉर्सराडिश पेरोक्सिडेस (सिग्मा-अ‍ॅल्ड्रिच, यूके) अँटी-माऊस सेकंडरी अँटीबॉडी (अँटीबॉडी बफरमध्ये १:१०,००० पातळ केलेले) सह एकत्र केले गेले. वेस्टर ईटीए सी २.० केमिल्युमिनेसेन्स सब्सट्रेट (सायनाजेन, इटली) आणि अमरशम इमेजर ६०० (जीई हेल्थकेअर, यूके) वापरून शोधण्यासाठी (अँटीबॉडी बफरमध्ये ३ वॉश केल्यानंतर ५ मिनिटे) इनक्यूबेट केले गेले.
इमेजजे (57) मध्ये प्रत्येक स्टेन्ड जेल किंवा इम्युनोअसे लेनचे तीव्रता वितरण रेखाटून, शिखराखालील क्षेत्र एकत्रित करून आणि आरसी-एल (स्टेन्ड जेल) आणि प्रोटीन-डब्ल्यू (इम्युनोअसे) च्या तीव्रतेचे गुणोत्तर मोजून, प्रतिमेवर प्रक्रिया करा. शुद्ध आरसी-एलएच114-डब्ल्यू नमुन्यात आरसी-एल आणि प्रोटीन-डब्ल्यू चे गुणोत्तर 1:1 आहे असे गृहीत धरून आणि त्यानुसार संपूर्ण डेटा सेट सामान्य करून हे गुणोत्तर मोलर रेशोमध्ये रूपांतरित केले गेले.
या लेखासाठी पूरक साहित्यासाठी, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 पहा.
हा लेख क्रिएटिव्ह कॉमन्स अॅट्रिब्युशन लायसन्सच्या अटींनुसार वितरित केलेला एक मुक्त प्रवेश लेख आहे. मूळ काम योग्यरित्या उद्धृत केले असल्यास, हा लेख कोणत्याही माध्यमात अनिर्बंध वापर, वितरण आणि पुनरुत्पादन करण्यास परवानगी देतो.
टीप: आम्ही तुम्हाला फक्त तुमचा ईमेल पत्ता देण्यास सांगतो जेणेकरून तुम्ही पेजवर शिफारस केलेल्या व्यक्तीला कळेल की तुम्हाला ईमेल त्यांना दाखवायचा आहे आणि तो स्पॅम नाही. आम्ही कोणतेही ईमेल पत्ते कॅप्चर करणार नाही.
तुम्ही अभ्यागत आहात की नाही हे तपासण्यासाठी आणि स्वयंचलित स्पॅम सबमिशन रोखण्यासाठी हा प्रश्न वापरला जातो.
डेव्हिड जे.के. स्वेन्सबरी, पार्क कियान, फिलिप जे. जॅक्सन, केटलिन एम. फॅरीस, डॅरियस एम. निडझविड्झकी, एलिझाबेथ सी. मार्टिन, डेव्हिड ए. फार्मर, लोर्ना ए. मॅलोन, रेबेका एफ. थॉम्पसन, नील ए. रॅन्सन, डॅनियल पी. कॅनिफ, मार्क जे. डिकमन, ड्यूई होल्टेन, क्रिस्टीन किरमायर, अँड्र्यू हिचकॉक, सी. नील हंटर
प्रतिक्रिया केंद्रातील प्रकाश सापळा १ कॉम्प्लेक्सची उच्च-रिझोल्यूशन रचना क्विनोन गतिमानतेबद्दल नवीन अंतर्दृष्टी प्रदान करते.
डेव्हिड जे.के. स्वेन्सबरी, पार्क कियान, फिलिप जे. जॅक्सन, केटलिन एम. फॅरीस, डॅरियस एम. निडझविड्झकी, एलिझाबेथ सी. मार्टिन, डेव्हिड ए. फार्मर, लोर्ना ए. मॅलोन, रेबेका एफ. थॉम्पसन, नील ए. रॅन्सन, डॅनियल पी. कॅनिफ, मार्क जे. डिकमन, ड्यूई होल्टेन, क्रिस्टीन किरमायर, अँड्र्यू हिचकॉक, सी. नील हंटर
प्रतिक्रिया केंद्रातील प्रकाश सापळा १ कॉम्प्लेक्सची उच्च-रिझोल्यूशन रचना क्विनोन गतिमानतेबद्दल नवीन अंतर्दृष्टी प्रदान करते.
©2021 अमेरिकन असोसिएशन फॉर द ॲडव्हान्समेंट ऑफ सायन्स. सर्व हक्क राखीव. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef आणि COUNTER चे भागीदार आहे. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.