सध्याचा पत्ता: कोलोन 50931, जर्मनी, कोलोन एक्सलन्स क्लस्टर रिसर्च ऑन सेल्युलर स्ट्रेस रिस्पॉन्स इन एजिंग-रिलेटेड डिसीजेस (CECAD).
मायटोकाँड्रियल रोगांमुळे होणारा चेतापेशींचा ऱ्हास अपरिवर्तनीय मानला जातो, कारण चेतापेशींची चयापचय लवचिकता मर्यादित असते, परंतु शरीरातील चेतापेशींच्या चयापचयाच्या पेशी-स्वायत्ततेवर मायटोकाँड्रियल बिघाडाचा होणारा परिणाम फारसा समजलेला नाही. येथे, आम्ही विस्कळीत झालेल्या मायटोकाँड्रियल संलयन गतिशीलतेमुळे होणाऱ्या प्रगतीशील ऑक्सिफॉस (OXPHOS) कमतरतेसह पर्किंजे चेतापेशींच्या पेशी-विशिष्ट प्रोटिओमची ओळख करून देत आहोत. आम्हाला आढळले की मायटोकाँड्रियल बिघाडामुळे प्रोटिओमिक्सच्या क्षेत्रात एक गहन बदल घडला, ज्यामुळे अखेरीस पेशी मृत्यूपूर्वी अचूक चयापचय कार्यक्रमांचे अनुक्रमिक सक्रियकरण झाले. अनपेक्षितपणे, आम्ही पायरुवेट कार्बोक्झिलेज (PCx) आणि TCA चक्रातील मध्यस्थांना पूरक ठरणाऱ्या इतर पेरोक्सिडेसची स्पष्ट प्रेरणा निश्चित केली. PCx च्या प्रतिबंधामुळे ऑक्सिडेटिव्ह ताण आणि चेतापेशींचा ऱ्हास वाढला, जे दर्शवते की ऑक्सिफॉस (OXPHOS) नसलेल्या चेतापेशींमध्ये एथेरोस्क्लेरोसिसचा संरक्षणात्मक प्रभाव असतो. अंतिम ऱ्हास झालेल्या चेतापेशींमध्ये मायटोकाँड्रियल संलयनाची पुनर्स्थापना ही चयापचय वैशिष्ट्ये पूर्णपणे उलटवते, ज्यामुळे पेशी मृत्यू टाळला जातो. आमच्या संशोधनातून असे पूर्वी अज्ञात असलेले मार्ग समोर आले आहेत, जे मायटोकाँड्रियल बिघाडाला प्रतिकार करण्याची क्षमता देतात आणि हे दाखवून देतात की रोगाच्या शेवटच्या टप्प्यातही न्यूरोडीजनरेशनची प्रक्रिया उलटवता येते.
मानवी मायटोकाँड्रियल रोगांशी संबंधित व्यापक न्यूरोलॉजिकल लक्षणांमुळे न्यूरॉनल ऊर्जा चयापचय राखण्यात मायटोकाँड्रियाची मध्यवर्ती भूमिका अधोरेखित होते. यापैकी बहुतेक रोग मायटोकाँड्रियल जीन अभिव्यक्तीचे नियमन करणाऱ्या जीन उत्परिवर्तनामुळे (१, २) किंवा मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्सशी संबंधित जीन विनाशाने होतात, जे अप्रत्यक्षपणे मायटोकाँड्रियल डीएनए (mtDNA) च्या स्थिरतेवर परिणाम करतात (३, ४). प्राण्यांवरील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की आसपासच्या ऊतींमधील मायटोकाँड्रियल बिघाडाच्या प्रतिसादात, पारंपरिक चयापचय मार्ग (५-७) सक्रिय होऊ शकतात, ज्यामुळे या गुंतागुंतीच्या रोगांच्या रोगजननशास्त्राबद्दल महत्त्वपूर्ण अंतर्दृष्टी मिळते. याच्या अगदी उलट, मेंदूच्या मायटोकाँड्रियल ॲडेनोसिन ट्रायफॉस्फेट (ATP) उत्पादनाच्या सामान्य अपयशामुळे विशिष्ट पेशी प्रकारांमध्ये होणाऱ्या चयापचय बदलांविषयीची आपली समज मूलभूत आहे (८), ज्यामुळे रोग टाळण्यासाठी किंवा न्यूरोडीजनरेशन रोखण्यासाठी (९) वापरता येतील अशा उपचारात्मक लक्ष्यांची ओळख पटवण्याची गरज अधोरेखित होते. माहितीचा अभाव ही वस्तुस्थिती आहे की आसपासच्या ऊतींच्या पेशी प्रकारांच्या तुलनेत चेता पेशींमध्ये अत्यंत मर्यादित चयापचय लवचिकता असते असे सर्वसाधारणपणे मानले जाते (१०). या पेशी सिनॅप्टिक ट्रान्समिशनला चालना देण्यासाठी आणि इजा व आजाराच्या परिस्थितीला प्रतिसाद देण्यासाठी न्यूरॉन्सना मेटाबोलाइट्सचा पुरवठा समन्वयित करण्यात मध्यवर्ती भूमिका बजावतात, हे लक्षात घेता, मेंदूच्या ऊतींच्या आव्हानात्मक परिस्थितीशी पेशी चयापचय जुळवून घेण्याची क्षमता जवळजवळ केवळ ग्लायल पेशींपुरतीच मर्यादित आहे (11-14). याव्यतिरिक्त, मेंदूच्या ऊतींमधील अंगभूत पेशीय भिन्नता विशिष्ट न्यूरॉनल उपसमूहांमध्ये होणाऱ्या चयापचय बदलांच्या अभ्यासात मोठ्या प्रमाणात अडथळा आणते. परिणामी, न्यूरॉन्समधील मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनच्या नेमक्या पेशीय आणि चयापचय परिणामांबद्दल फारच कमी माहिती आहे.
माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनचे चयापचय परिणाम समजून घेण्यासाठी, आम्ही माइटोकॉन्ड्रियल बाह्य आवरणाच्या फ्यूजनच्या (Mfn2) विनाशाने होणाऱ्या न्यूरोडीजनरेशनच्या वेगवेगळ्या टप्प्यांवर पर्किंजे न्यूरॉन्स (PNs) वेगळे केले. जरी मानवांमध्ये Mfn2 उत्परिवर्तन हे शार्कोट-मारी-टूथ प्रकार 2A (15) म्हणून ओळखल्या जाणाऱ्या आनुवंशिक मोटर सेन्सरी न्यूरोपॅथीच्या एका प्रकाराशी संबंधित असले तरी, उंदरांमध्ये Mfn2 चा सशर्त विनाश ही ऑक्सिडेशन फॉस्फोरिलेशन (OXPHOS) डिसफंक्शन प्रेरित करण्याची एक सुप्रसिद्ध पद्धत आहे. विविध न्यूरॉनल उपप्रकार (16-19) आणि परिणामी न्यूरोडीजनरेटिव्ह फेनोटाइप हे प्रगतीशील न्यूरोलॉजिकल लक्षणांसोबत असतात, जसे की हालचालींचे विकार (18, 19) किंवा सेरेबेलर अ‍ॅटॅक्सिया (16). लेबल-फ्री क्वांटिटेटिव्ह (LFQ) प्रोटिओमिक्स, मेटाबोलॉमिक्स, इमेजिंग आणि व्हायरॉलॉजिकल पद्धतींच्या संयोजनाचा वापर करून, आम्ही हे दाखवून देतो की प्रगतीशील न्यूरोडीजनरेशनमुळे पायरुवेट कार्बोक्झिलेज (PCx) आणि PNs च्या आर्टेरिओस्क्लेरोसिसमध्ये सामील असलेल्या इतर घटकांच्या एंजाइम्सची अभिव्यक्ती इन विवोमध्ये तीव्रतेने प्रेरित होते. या निष्कर्षाची प्रासंगिकता तपासण्यासाठी, आम्ही विशेषतः Mfn2-कमतरता असलेल्या PNs मध्ये PCx ची अभिव्यक्ती कमी केली आणि आम्हाला आढळले की या प्रक्रियेमुळे ऑक्सिडेटिव्ह स्ट्रेस वाढला आणि न्यूरोडीजनरेशनला गती मिळाली, ज्यामुळे हे सिद्ध होते की अझोस्पर्मिया पेशी मृत्यूला चयापचय अनुकूलनक्षमता प्रदान करतो. MFN2 ची तीव्र अभिव्यक्ती गंभीर OXPHOS कमतरता, मायटोकॉन्ड्रियल डीएनएचा मोठ्या प्रमाणात वापर आणि स्पष्टपणे तुटलेले मायटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क असलेल्या अंतिम टप्प्यातील ऱ्हास झालेल्या PNs ला पूर्णपणे वाचवू शकते, जे यावर अधिक जोर देते की न्यूरोडीजनरेशनचा हा प्रकार पेशी मृत्यू होण्यापूर्वी रोगाच्या प्रगत अवस्थेत देखील बरा होऊ शकतो.
Mfn2 नॉकआउट PNs मधील मायटोकाँड्रिया पाहण्यासाठी, आम्ही एका माऊस स्ट्रेनचा वापर केला जो Cre-अवलंबित मायटोकाँड्रियाला पिवळ्या फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) (mtYFP) (20) Cre अभिव्यक्तीला लक्ष्य करण्याची परवानगी देतो आणि इन व्हिवो (in vivo) मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजी तपासली. आम्हाला आढळले की PNs मधील Mfn2 जनुकाच्या विनाशाने मायटोकाँड्रियल नेटवर्कचे हळूहळू विभाजन होते (आकृती S1A), आणि सर्वात पहिला बदल ३ आठवड्यांच्या वयात आढळला. याउलट, कॅलबिंडिन इम्युनोस्टेनिंगच्या नुकसानीवरून दिसून येणारा PN पेशींच्या थराचा लक्षणीय ऱ्हास, १२ आठवड्यांच्या वयापर्यंत सुरू झाला नाही (आकृती १, A आणि B). मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजीमधील सर्वात सुरुवातीचे बदल आणि न्यूरॉनल मृत्यूची दृश्यमान सुरुवात यांच्यातील वेळेच्या विसंगतीमुळे आम्हाला पेशी मृत्यूपूर्वी मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनमुळे सुरू होणाऱ्या चयापचय बदलांचा तपास करण्यास प्रवृत्त केले. आम्ही YFP (YFP+) व्यक्त करणारे PN (आकृती 1C) आणि नियंत्रण उंदरांमध्ये (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ज्यांना पुढे CTRL (आकृती S1B) म्हटले जाईल, यांना वेगळे करण्यासाठी एक फ्लुरोसेन्स-ॲक्टिव्हेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) आधारित धोरण विकसित केले. YFP सिग्नलच्या सापेक्ष तीव्रतेवर आधारित गेटिंग धोरणाच्या ऑप्टिमायझेशनमुळे आम्हाला PN च्या YFP+ बॉडी (YFPhigh) ला नॉन-PNs (YFPneg) (आकृती S1B) किंवा संभाव्य फ्लुरोसेन्स ॲक्सॉन/डेन्ड्रिटिक तुकड्यांपासून (YFPlow; आकृती S1D, डावीकडे) शुद्ध करता येते, ज्याची पुष्टी कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपद्वारे (आकृती S1D, उजवीकडे) झाली. वर्गीकृत लोकसंख्येची ओळख पडताळण्यासाठी, आम्ही LFQ प्रोटीओमिक्स आणि नंतर प्रिन्सिपल कंपोनेंट ॲनालिसिस केले आणि आम्हाला आढळले की YFPhigh आणि YFPneg पेशींमध्ये स्पष्ट विभाजन आहे (आकृती S1C). YFPhigh पेशींमध्ये ज्ञात PNs मार्कर्सचे (म्हणजे Calb1, Pcp2, Grid2 आणि Itpr3) निव्वळ संवर्धन दिसून आले (21, 22), परंतु न्यूरॉन्स किंवा इतर पेशी प्रकारांमध्ये सामान्यतः व्यक्त होणाऱ्या प्रथिनांचे संवर्धन दिसून आले नाही (आकृती 1D). स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये गोळा केलेल्या वर्गीकृत YFPhigh पेशींमधील नमुन्यांची तुलना केल्यावर सहसंबंध गुणांक > 0.9 दिसून आला, ज्यामुळे जैविक प्रतिकृतींमध्ये चांगली पुनरुत्पादकता सिद्ध झाली (आकृती S1E). थोडक्यात, या माहितीने व्यवहार्य PN च्या तीव्र आणि विशिष्ट विलगीकरणासाठीच्या आमच्या योजनेला मान्यता दिली. वापरलेली L7-cre ड्रायव्हर प्रणाली प्रसूतीनंतर पहिल्या आठवड्यात मोज़ेक पुनर्संयोजन घडवून आणत असल्यामुळे (23), आम्ही CTRL आणि कंडिशनल (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) उंदरांमधून न्यूरॉन्स गोळा करण्यास सुरुवात केली. पुनर्संयोजन पूर्ण झाल्यावर, वयाच्या ४ आठवड्यांत त्याला Mfn2cKO म्हटले जाते. अंतिम बिंदू म्हणून, आम्ही ८ आठवड्यांचे वय निवडले, जेव्हा स्पष्ट मायटोकाँड्रियल तुकडे असूनही पीएन थर अजूनही शाबूत होता (आकृती १बी आणि आकृती एस१ए). एकूण, आम्ही ३०१३ प्रथिनांचे परिमाणीकरण केले, त्यापैकी सुमारे २२% प्रथिने मायटोकाँड्रियल प्रोटीओमवर आधारित मायटोकार्टा २.० ॲनोटेशन्सनुसार मायटोकाँड्रिया म्हणून होती (आकृती १ई) (आकृती १ई) (२४). आठव्या आठवड्यात केलेल्या विभेदक जनुकीय अभिव्यक्ती विश्लेषणातून असे दिसून आले की सर्व प्रथिनांपैकी केवळ १०.५% प्रथिनांमध्ये लक्षणीय बदल झाले होते (आकृती १एफ आणि आकृती एस१एफ), त्यापैकी १९५ प्रथिने डाउन-रेग्युलेटेड आणि १२० प्रथिने अप-रेग्युलेटेड होती (आकृती १एफ). हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की या डेटा सेटचे "नाविन्यपूर्ण मार्ग विश्लेषण" दर्शवते की विभेदकपणे अभिव्यक्त झालेली जनुके मुख्यत्वे विशिष्ट चयापचय मार्गांच्या मर्यादित संचाशी संबंधित आहेत (आकृती १जी). विशेष म्हणजे, जरी OXPHOS आणि कॅल्शियम सिग्नलिंगशी संबंधित मार्गांचे डाउन-रेग्युलेशन हे फ्यूजन-डेफिशियंट PNs मध्ये मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनची पुष्टी करत असले तरी, प्रामुख्याने अमिनो ऍसिड चयापचयाशी संबंधित इतर श्रेणी लक्षणीयरीत्या अप-रेग्युलेटेड आहेत, जे मायटोकाँड्रियल PNs मध्ये होणाऱ्या चयापचयाशी सुसंगत आहे. रीवायरिंग सुसंगत आहे. डिसफंक्शन.
(अ) CTRL आणि Mfn2cKO उंदरांच्या सेरेबेलमच्या छेदांची प्रातिनिधिक कॉन्फोकल छायाचित्रे, ज्यात पर्किंजे न्यूक्लियसचा (PNs) प्रगतीशील ऱ्हास (कॅलबिंडिन, राखाडी) दिसून येतो; केंद्रकांना DAPI ने प्रतिरंजित केले होते. (ब) (अ) चे परिमाणीकरण (एक-मार्गी विचलन विश्लेषण, ***P<0.001; n = तीन उंदरांमधील ४ ते ६ वर्तुळे). (क) प्रायोगिक कार्यप्रवाह. (ड) पर्किंजे (वर) आणि इतर पेशी प्रकारांसाठी (मध्यभागी) विशिष्ट असलेल्या मार्कर्सचे हीट मॅप वितरण. (इ) वर्गीकृत पर्किंजे न्यूक्लियसमध्ये ओळखल्या गेलेल्या मायटोकॉन्ड्रियल प्रथिनांची संख्या दर्शवणारा वेन आकृती. (फ) ८ आठवड्यांत Mfn2cKO न्यूरॉन्समधील भिन्नपणे व्यक्त झालेल्या प्रथिनांचा व्होल्कॅनो प्लॉट (महत्व कट-ऑफ मूल्य १.३). (ग) सर्जनशीलता मार्ग विश्लेषण ८ आठवड्यांत वर्गीकृत केलेल्या Mfn2cKO पर्किंजे न्यूक्लियसमध्ये पाच सर्वात महत्त्वाचे अप-रेग्युलेशन (लाल) आणि डाउन-रेग्युलेशन (निळा) मार्ग दर्शवते. प्रत्येक शोधलेल्या प्रथिनाची सरासरी अभिव्यक्ती पातळी दर्शविली आहे. ग्रेस्केल हीट मॅप: समायोजित P मूल्य. ns, महत्त्वाचे नाही.
प्रोटिओमिक्स डेटाने दाखवले की कॉम्प्लेक्स I, III, आणि IV चे प्रोटीन एक्सप्रेशन हळूहळू कमी झाले. कॉम्प्लेक्स I, III, आणि IV या सर्वांमध्ये आवश्यक mtDNA-एनकोडेड सबयुनिट्स होते, तर कॉम्प्लेक्स II, जे फक्त न्यूक्लियर-एनकोडेड होते, त्यावर मूलतः कोणताही परिणाम झाला नाही (आकृती 2A आणि आकृती S2A). प्रोटिओमिक्सच्या निष्कर्षांशी सुसंगत, सेरेबेलर ऊतींच्या विभागांच्या इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीने दाखवले की PN मध्ये कॉम्प्लेक्स IV मधील MTCO1 (माइटोकॉन्ड्रियल सायटोक्रोम सी ऑक्सिडेस सबयुनिट 1) सबयुनिटची पातळी हळूहळू कमी झाली (आकृती 2B). mtDNA-एनकोडेड सबयुनिट Mtatp8 लक्षणीयरीत्या कमी झाले (आकृती S2A), तर न्यूक्लियर-एनकोडेड ATP सिंथेस सबयुनिटची स्थिर-स्थिती पातळी अपरिवर्तित राहिली, जे mtDNA एक्सप्रेशन स्थिर असताना ज्ञात स्थिर ATP सिंथेस सबअसेम्बली F1 कॉम्प्लेक्सच्या निर्मितीशी सुसंगत आहे. व्यत्यय (7). रिअल-टाइम पॉलिमरेज चेन रिॲक्शन (qPCR) द्वारे वर्गीकृत Mfn2cKO PNs मधील mtDNA पातळीच्या मूल्यांकनाने mtDNA कॉपी संख्येत हळूहळू घट झाल्याची पुष्टी केली. नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, ८ आठवड्यांच्या वयात, mtDNA पातळी केवळ सुमारे २०% टिकून राहिली होती (आकृती २C). या निष्कर्षांशी सुसंगत, DNA शोधण्यासाठी Mfn2cKO PNs च्या कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपी स्टेनिंगने मायटोकाँड्रियल न्यूक्लिओटाइड्सचा वेळेनुसार होणारा वापर दर्शविला (आकृती २D). आम्हाला आढळले की मायटोकाँड्रियल प्रथिन क्षरण आणि ताण प्रतिसादात सामील असलेले काही घटकच अप-रेग्युलेटेड होते, ज्यात Lonp1, Afg3l2 आणि Clpx, आणि OXPHOS कॉम्प्लेक्स असेंब्ली घटक यांचा समावेश होता. ॲपोप्टोसिसमध्ये सामील असलेल्या प्रथिनांच्या पातळीत कोणतेही लक्षणीय बदल आढळले नाहीत (आकृती S2B). त्याचप्रमाणे, आम्हाला आढळले की कॅल्शियम वाहतुकीत सामील असलेल्या मायटोकाँड्रिया आणि एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम चॅनेलमध्ये केवळ किरकोळ बदल आहेत (आकृती S2C). याव्यतिरिक्त, ऑटोफॅगी-संबंधित प्रथिनांच्या मूल्यांकनात कोणतेही लक्षणीय बदल आढळले नाहीत, जे इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री आणि इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपीद्वारे इन विवोमध्ये निरीक्षण केलेल्या ऑटोफॅगोसोम्सच्या दृश्यमान प्रेरणेशी सुसंगत आहे (आकृती S3). तथापि, पीएनमधील प्रगतीशील ऑक्सिफॉस (OXPHOS) बिघाड हा स्पष्ट अल्ट्रास्ट्रक्चरल मायटोकाँड्रियल बदलांसोबत असतो. ५ आणि ८ आठवड्यांच्या Mfn2cKO पीएनच्या पेशीदेहांमध्ये आणि डेंड्रिटिक ट्रीमध्ये मायटोकाँड्रियल क्लस्टर्स दिसू शकतात आणि आतील पडद्याच्या संरचनेत मोठे बदल झाले आहेत (आकृती S4, A आणि B). या अल्ट्रास्ट्रक्चरल बदलांशी आणि एमटीडीएनए (mtDNA) मधील लक्षणीय घटीशी सुसंगत, टेट्रामेथिलरोडामाइन मेथिल एस्टर (TMRM) वापरून केलेल्या तीव्र सेरेब्रल सेरेबेलर स्लाइसच्या विश्लेषणातून असे दिसून आले की Mfn2cKO पीएनमधील मायटोकाँड्रियल पडदा क्षमता लक्षणीयरीत्या कमी झाली होती (आकृती S4C).
(अ) OXPHOS कॉम्प्लेक्सच्या अभिव्यक्ती पातळीचे कालक्रमानुसार विश्लेषण. फक्त ८ आठवड्यांत P<0.05 असलेल्या प्रथिनांचा विचार करा (द्वि-मार्गी ANOVA). तुटक रेषा: CTRL च्या तुलनेत कोणतेही समायोजन नाही. (ब) डावीकडे: अँटी-MTCO1 अँटीबॉडीने लेबल केलेल्या सेरेबेलर सेक्शनचे एक उदाहरण (स्केल बार, २० μm). पर्किंजे पेशींच्या शरीरांनी व्यापलेला भाग पिवळ्या रंगाने दर्शविला आहे. उजवीकडे: MTCO1 पातळीचे परिमाणीकरण (एक-मार्गी विचलन विश्लेषण; n = तीन उंदरांमधील ७ ते २० पेशींचे विश्लेषण). (क) सॉर्ट केलेल्या PN मधील mtDNA कॉपी संख्येचे qPCR विश्लेषण (एक-मार्गी विचलन विश्लेषण; n = ३ ते ७ उंदीर). (ड) डावीकडे: अँटी-DNA अँटीबॉडीने लेबल केलेल्या सेरेबेलर स्लाईसचे एक उदाहरण (स्केल बार, २० μm). पर्किंजे पेशींच्या शरीरांनी व्यापलेला भाग पिवळ्या रंगाने दर्शविला आहे. उजवीकडे: mtDNA विकृतींचे परिमाणीकरण (एक-मार्गी विचलन विश्लेषण; n = तीन उंदरांमधील ५ ते ९ पेशी). (E) होल-सेल पॅच क्लॅम्प रेकॉर्डिंगमध्ये mitoYFP + पर्किंजे पेशी (बाण) दर्शविणाऱ्या एका तीव्र सेरेबेलर सेक्शनचे उदाहरण. (F) IV वक्राचे परिमाणीकरण. (G) CTRL आणि Mfn2cKO पर्किंजे पेशींमध्ये डीपोलरायझिंग करंट इंजेक्शनची प्रातिनिधिक रेकॉर्डिंग. वरचा ट्रेस: ​​AP ला चालना देणारा पहिला पल्स. खालचा ट्रेस: ​​कमाल AP वारंवारता. (H) पोस्टसिनॅप्टिक स्वयंप्रेरित इनपुटचे (sPSPs) परिमाणीकरण. प्रातिनिधिक रेकॉर्डिंग ट्रेस आणि त्याचे झूम गुणोत्तर (I) मध्ये दर्शविले आहे. वन-वे ॲनालिसिस ऑफ व्हेरिएन्सने तीन उंदरांमधील n = ५ ते २० पेशींचे विश्लेषण केले. डेटा सरासरी±SEM म्हणून व्यक्त केला आहे; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) परफोरेटेड पॅच क्लॅम्प मोड वापरून रेकॉर्ड केलेल्या स्वयंप्रेरित AP चे प्रातिनिधिक ट्रेस. वरचा ट्रेस: ​​कमाल AP वारंवारता. खालचा ट्रेस: ​​एका AP चा झूम. (K) (J) नुसार सरासरी आणि कमाल AP वारंवारतेचे परिमाणीकरण करा. मॅन-व्हिटनी चाचणी; चार उंदरांमधील n = ५ पेशींचे विश्लेषण केले. आकडेवारी सरासरी±SEM म्हणून दर्शविली आहे; हे महत्त्वाचे नाही.
८ आठवड्यांच्या Mfn2cKO PN मध्ये स्पष्ट OXPHOS नुकसान आढळून आले, जे दर्शवते की न्यूरॉन्सचे शारीरिक कार्य गंभीरपणे असामान्य आहे. म्हणून, आम्ही तीव्र सेरेबेलर स्लाइसमध्ये होल-सेल पॅच क्लॅम्प रेकॉर्डिंग करून ४ ते ५ आठवडे आणि ७ ते ८ आठवड्यांच्या OXPHOS-कमतरता असलेल्या न्यूरॉन्सच्या निष्क्रिय विद्युत वैशिष्ट्यांचे विश्लेषण केले (आकृती २E). अनपेक्षितपणे, Mfn2cKO न्यूरॉन्सचे सरासरी विश्राम झिल्ली विभव आणि इनपुट प्रतिरोध नियंत्रणासारखेच होते, जरी पेशींमध्ये सूक्ष्म फरक होते (तक्ता १). त्याचप्रमाणे, ४ ते ५ आठवड्यांच्या वयात, विद्युत प्रवाह-व्होल्टेज संबंधात (IV वक्र) कोणतेही महत्त्वपूर्ण बदल आढळले नाहीत (आकृती २F). तथापि, ७ ते ८ आठवड्यांचे कोणतेही Mfn2cKO न्यूरॉन्स IV रेजिमेन (हायपरपोलरायझेशन टप्पा) मध्ये टिकले नाहीत, जे दर्शवते की या उशिराच्या टप्प्यावर हायपरपोलरायझेशन विभवासाठी स्पष्ट संवेदनशीलता आहे. याउलट, Mfn2cKO न्यूरॉन्समध्ये, वारंवार ॲक्शन पोटेन्शियल (AP) डिस्चार्जला कारणीभूत ठरणारे डीपोलरायझिंग प्रवाह चांगल्या प्रकारे सहन केले जातात, जे दर्शवते की त्यांचे एकूण डिस्चार्ज पॅटर्न ८-आठवडे वयाच्या कंट्रोल न्यूरॉन्सपेक्षा लक्षणीयरीत्या वेगळे नाहीत (तक्ता १ आणि आकृती २G). त्याचप्रमाणे, स्वयंप्रेरित पोस्टसिनॅप्टिक प्रवाहांची (sPSCs) वारंवारता आणि आयाम कंट्रोल गटाच्या तुलनेत सारखेच होते, आणि घटनांची वारंवारता ४ आठवड्यांपासून ५ आठवड्यांपर्यंत, ७ आठवड्यांपर्यंत आणि ८ आठवड्यांपर्यंत सारख्याच वाढीसह वाढली (आकृती २, H आणि I). PNs मधील सिनॅप्टिक परिपक्वतेचा कालावधी (२५). छिद्रित PNs पॅचेसनंतर असेच परिणाम प्राप्त झाले. ही रचना पेशीय ATP दोषांच्या संभाव्य भरपाईस प्रतिबंध करते, जसे की होल-सेल पॅच क्लॅम्प रेकॉर्डिंगमध्ये होऊ शकते. विशेषतः, Mfn2cKO न्यूरॉन्सच्या रेस्टिंग मेंब्रेन पोटेन्शियल आणि स्वयंप्रेरित फायरिंग वारंवारतेवर परिणाम झाला नाही (आकृती २, J आणि K). थोडक्यात, या निष्कर्षांवरून असे दिसून येते की, स्पष्ट ऑक्सिफॉस (OXPHOS) बिघाड असलेले पीएन (PNs) उच्च-वारंवारतेच्या डिस्चार्ज पॅटर्नला चांगल्या प्रकारे हाताळू शकतात, जे सूचित करते की एक भरपाई यंत्रणा अस्तित्वात आहे जी त्यांना जवळपास सामान्य इलेक्ट्रोफिजिओलॉजिकल प्रतिसाद राखण्यास मदत करते.
डेटा सरासरी ± SEM (एक-मार्गी विचलन विश्लेषण, होल्म-सिडकची बहुविध तुलना चाचणी; *P<0.05) म्हणून व्यक्त केला आहे. एकक क्रमांक कंसात दर्शविला आहे.
प्रोटिओमिक्स डेटासेटमधील (आकृती 1G) कोणत्याही श्रेणीमध्ये गंभीर OXPHOS कमतरतेचा प्रतिकार करू शकणारे मार्ग आहेत का, हे तपासण्यासाठी आम्ही सुरुवात केली, जेणेकरून प्रभावित PN जवळजवळ सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का राखू शकते हे स्पष्ट होईल (आकृती 2, E ते K). प्रोटिओमिक्स विश्लेषणातून असे दिसून आले की ब्रँच्ड चेन अमिनो ॲसिडच्या (BCAA) कॅटाबोलिझममध्ये सामील असलेले एन्झाइम्स लक्षणीयरीत्या अप-रेग्युलेटेड होते (आकृती 3A आणि आकृती S5A), आणि अंतिम उत्पादन ॲसिटिल-कोए (CoA) किंवा सक्सिनिल कोए हे आर्टेरिओस्क्लेरोसिस ॲसिड (TCA) चक्रात ट्रायकार्बोक्सिलेट्सची पूर्तता करू शकतात. आम्हाला आढळले की BCAA ट्रान्समिनेज 1 (BCAT1) आणि BCAT2 या दोन्हींचे प्रमाण वाढले होते. त्यांनी α-केटोग्लुटारेटपासून ग्लुटामेट तयार करून BCAA कॅटाबोलिझमच्या पहिल्या टप्प्याचे उत्प्रेरण केले (26). ब्रँच्ड चेन कीटो ॲसिड डिहायड्रोजनेज (BCKD) कॉम्प्लेक्स बनवणारे सर्व उपघटक अपरेगुलेट केलेले असतात (हा कॉम्प्लेक्स परिणामी BCAA कार्बन सांगाड्याच्या त्यानंतरच्या आणि अपरिवर्तनीय डीकार्बॉक्सिलेशनला उत्प्रेरित करतो) (आकृती 3A आणि आकृती S5A). तथापि, सॉर्ट केलेल्या PN मध्ये BCAA मध्ये कोणतेही स्पष्ट बदल आढळले नाहीत, जे या अत्यावश्यक अमिनो ॲसिडच्या वाढलेल्या पेशीय ग्रहणामुळे किंवा TCA चक्राला पूरक म्हणून इतर स्रोतांच्या (ग्लुकोज किंवा लॅक्टिक ॲसिड) वापरामुळे असू शकते (आकृती S5B). OXPHOS नसलेल्या PNs मध्ये ८ आठवड्यांच्या वयात ग्लुटामाइन विघटन आणि ट्रान्सॲमिनेशन क्रियाकलापांमध्ये वाढ दिसून आली, जी मायटोकॉन्ड्रियल एन्झाइम्स ग्लुटामायनेज (GLS) आणि ग्लुटामाइन पायरुवेट ट्रान्सॲमिनेज २ (GPT2) च्या अप-रेग्युलेशनद्वारे प्रतिबिंबित होऊ शकते (आकृती ३, A आणि C). हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की GLS चे अप-रेग्युलेशन हे स्प्लिस केलेल्या आयसोफॉर्म ग्लूटामिनेज C (GLS-GAC) पर्यंत मर्यादित आहे (Mfn2cKO/CTRL चा बदल अंदाजे 4.5 पट आहे, P = 0.05), आणि कर्करोगाच्या ऊतींमध्ये त्याचे विशिष्ट अप-रेग्युलेशन माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जीला समर्थन देऊ शकते. (27).
(अ) हीट मॅप ८ आठवड्यांत निर्दिष्ट मार्गासाठी प्रथिन पातळीतील पटीतील बदल (फोल्ड चेंज) दर्शवतो. (ब) अँटी-PCx अँटीबॉडीने लेबल केलेल्या सेरेबेलर स्लाइसचे उदाहरण (स्केल बार, २० μm). पिवळा बाण पर्किंजे पेशीच्या मुख्य भागाकडे (सेल बॉडी) निर्देशित करतो. (क) एथेरोस्क्लेरोसिससाठी एक महत्त्वाचा उमेदवार म्हणून ओळखले गेलेले टाइम कोर्स प्रथिन अभिव्यक्ती विश्लेषण (मल्टिपल टी-टेस्ट, *FDR <५%; n = ३-५ उंदीर). (ड) वर: [१-१३C]पायरूव्हेट ट्रेसरमध्ये असलेल्या लेबल केलेल्या कार्बनच्या प्रवेशाचे वेगवेगळे मार्ग (म्हणजे, PDH किंवा ट्रान्स-आर्टेरियल मार्गाने) दर्शवणारी एक योजनाबद्ध आकृती. खाली: व्हायोलिन चार्ट [१-१३C]पायरूव्हेटने तीव्र सेरेबेलर स्लाइस लेबल केल्यानंतर एकल-लेबल केलेल्या कार्बनचे (M1) एस्पार्टिक ऍसिड, सायट्रिक ऍसिड आणि मॅलिक ऍसिडमध्ये रूपांतरित होण्याची टक्केवारी दर्शवतो (पेअर्ड टी-टेस्ट; ** P <०.०१). (इ) सूचित मार्गाचे सर्वसमावेशक टाइम हिस्ट्री विश्लेषण. फक्त ८ आठवड्यांत P<0.05 असलेल्या प्रथिनांचा विचार करा. तुटक रेषा: कोणतेही समायोजन मूल्य नाही (द्वि-मार्गी विचलन विश्लेषण; * P <0.05; *** P <0.001). डेटा सरासरी±SEM म्हणून व्यक्त केला आहे.
आमच्या विश्लेषणात, BCAA कॅटाबॉलिझम हा एक प्रमुख अप-रेग्युलेशन मार्ग बनला आहे. ही वस्तुस्थिती ठामपणे सूचित करते की OXPHOS नसलेल्या PN मध्ये TCA चक्रात प्रवेश करणारे व्हेंटिलेशन व्हॉल्यूम बदलले जाऊ शकते. हे न्यूरॉनल मेटाबॉलिक रीवायरिंगचे एक प्रमुख स्वरूप असू शकते, ज्याचा गंभीर OXPHOS डिसफंक्शनच्या देखभालीदरम्यान न्यूरॉनल फिजिओलॉजी आणि जगण्यावर थेट परिणाम होऊ शकतो. या गृहितकाशी सुसंगत, आम्हाला आढळले की मुख्य अँटी-एथेरोस्क्लेरोटिक एन्झाइम PCx अप-रेग्युलेटेड आहे (Mfn2cKO/CTRL मध्ये अंदाजे 1.5 पट बदल; आकृती 3A), जे पायरुवेटचे ऑक्सॅलोएसीटेटमध्ये रूपांतर उत्प्रेरित करते (28), ज्याची मेंदूच्या ऊतींमधील अभिव्यक्ती ॲस्ट्रोसाइट्सपुरती मर्यादित असल्याचे मानले जाते (29, 30). प्रोटिओमिक्सच्या निष्कर्षांशी सुसंगत, कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपीने दाखवले की OXPHOS-कमतरता असलेल्या PNs मध्ये PCx अभिव्यक्ती विशेषतः आणि लक्षणीयरीत्या वाढली होती, तर नियंत्रणामध्ये PCx प्रतिक्रिया मुख्यत्वे लगतच्या बर्गमन ग्लायल पेशींपुरती मर्यादित होती (आकृती 3B). PCx च्या निरीक्षित अपरेग्युलेशनची कार्यात्मक चाचणी करण्यासाठी, आम्ही ताज्या सेरेबेलर स्लाइसवर [1-13C]पायरूव्हेट ट्रेसरने प्रक्रिया केली. जेव्हा पायरूव्हेट डिहायड्रोजनेज (PDH) द्वारे पायरूव्हेटचे ऑक्सिडेशन झाले, तेव्हा त्याचे आयसोटोप लेबल नाहीसे झाले, परंतु जेव्हा रक्तवाहिन्यांच्या प्रतिक्रियांमुळे पायरूव्हेटचे चयापचय होते, तेव्हा ते TCA सायकलच्या इंटरमीडिएट्समध्ये समाविष्ट होते (आकृती 3D). आमच्या प्रोटिओमिक्स डेटाच्या समर्थनार्थ, आम्हाला Mfn2cKO स्लाइसच्या ॲस्पार्टिक ॲसिडमध्ये या ट्रेसरमधील मोठ्या संख्येने मार्कर्स आढळले, तर सायट्रिक ॲसिड आणि मॅलिक ॲसिडमध्येही एक मध्यम प्रवृत्ती दिसून आली, जरी ती लक्षणीय नव्हती (आकृती 3D).
डोपामाइन न्यूरॉन्समध्ये विशेषतः मायटोकाँड्रियल ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर A जीन (Tfam) नष्ट केल्यामुळे होणाऱ्या मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शन असलेल्या मायटोपार्क उंदरांच्या डोपामाइन न्यूरॉन्समध्ये (आकृती S6B), PCx अभिव्यक्ती देखील लक्षणीयरीत्या वाढली होती (31), जे दर्शवते की शरीरातील न्यूरोनल OXPHOS च्या डिसफंक्शन दरम्यान ऍसिटोन ऍसिड आर्टेरिओस्क्लेरोसिस या रोगाची घटना नियंत्रित केली जाते. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की असे आढळून आले आहे की आर्टेरिओस्क्लेरोसिसशी संबंधित असलेल्या न्यूरॉन्समध्ये व्यक्त होणारे विशिष्ट एन्झाइम्स (32-34) OXPHOS नसलेल्या PNs मध्ये लक्षणीयरीत्या वाढलेले असतात, जसे की प्रोपिओनाइल-CoA कार्बोक्झिलेज (PCC-A), जे प्रोपिओनाइल-CoA चे सक्सिनाइल-CoA मध्ये रूपांतर करते आणि मायटोकाँड्रियल मॅलिक एन्झाइम 3 (ME3), ज्याची मुख्य भूमिका मॅलेटमधून पायरुवेट पुनर्प्राप्त करणे आहे (आकृती 3, A आणि C) (33, 35). याव्यतिरिक्त, आम्हाला Pdk3 एन्झाइममध्ये लक्षणीय वाढ आढळली, जे PDH चे फॉस्फोरिलेशन करून त्याला निष्क्रिय करते (36), तर PDH ला सक्रिय करणाऱ्या Pdp1 एन्झाइममध्ये किंवा स्वतः PDH एन्झाइम कॉम्प्लेक्समध्ये कोणतेही बदल आढळले नाहीत (आकृती 3A). सातत्यपूर्णपणे, Mern2cKO PNs मध्ये, PDH कॉम्प्लेक्सच्या पायरुवेट डिहायड्रोजनेज E1 घटकाच्या α1 सबयुनिट α (PDHE1α) चे Ser293 मधील फॉस्फोरिलेशन वाढले होते (जे PDH ची एन्झाइम क्रियाशीलता रोखण्यासाठी ओळखले जाते) (आकृती S6C). पायरुवेटला रक्तवाहिन्यांमध्ये प्रवेश नसतो.
शेवटी, आम्हाला आढळले की अहवालानुसार, सक्रियकरण प्रक्रियेदरम्यान सेरीन आणि ग्लायसीन जैवसंश्लेषणाचा सुपर पाथवे, संबंधित मायटोकाँड्रियल फोलेट (1C) चक्र आणि प्रोलाइन जैवसंश्लेषण (आकृती 1G आणि आकृती S5C) हे सर्व लक्षणीयरीत्या अप-रेग्युलेटेड होतात. मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनमुळे (5-7) आसपासच्या ऊती सक्रिय होतात. या प्रोटिओमिक्स डेटाला समर्थन देणाऱ्या कॉन्फोकल विश्लेषणाने दाखवले की, OXPHOS नसलेल्या PN मध्ये, 8-आठवडे वयाच्या उंदरांच्या सेरेबेलर स्लाइसवर मायटोकाँड्रियल फोलेट चक्रातील एक प्रमुख एन्झाइम असलेल्या सेरीन हायड्रॉक्सीमिथाइलट्रान्सफरेज 2 (SHMT2) ची प्रक्रिया केली असता, लक्षणीय रोगप्रतिकारक प्रतिसाद दिसून आला (आकृती S5D). 13 CU-ग्लुकोज-इन्क्युबेटेड तीव्र सेरेबेलर स्लाइसमध्ये, मेटाबोलिक ट्रेसिंग प्रयोगांनी सेरीन आणि प्रोलाइन जैवसंश्लेषणाच्या अप-रेग्युलेशनची अधिक पुष्टी केली, ज्यामुळे असे दिसून आले की कार्बन आयसोफॉर्मचा सेरीन आणि प्रोलाइनमधील प्रवाह वाढला (आकृती S5E). GLS आणि GPT2 द्वारे प्रेरित प्रतिक्रिया ग्लुटामाइनपासून ग्लुटामेटचे संश्लेषण आणि ग्लुटामेट व α-केटोग्लुटारेटमधील ट्रान्सअमिनेशनसाठी जबाबदार असल्याने, त्यांचे अपरेग्युलेशन हे दर्शवते की OXPHOS-कमतरता असलेल्या न्यूरॉन्सना ग्लुटामेटची वाढीव मागणी आहे. याचा उद्देश प्रोलाइनचे वाढलेले जैवसंश्लेषण टिकवून ठेवणे असू शकतो (आकृती S5C). या बदलांच्या विपरीत, PN-विशिष्ट Mfn2cKO उंदरांच्या सेरेबेलर ॲस्ट्रोसाइट्सच्या प्रोटिओमिक विश्लेषणातून असे दिसून आले की या मार्गांच्या (सर्व अँटीपेरॉक्सिडेससह) अभिव्यक्तीमध्ये लक्षणीय बदल झाला नाही, ज्यामुळे हे सिद्ध होते की हे चयापचय पुनर्निर्देशन विघटित PN साठी निवडक आहे (आकृती S6, D ते G).
सारांशतः, या विश्लेषणांमधून पीएन (PNs) मध्ये विशिष्ट चयापचय मार्गांच्या कालिक सक्रियतेचे लक्षणीयरीत्या भिन्न नमुने दिसून आले. जरी असामान्य न्यूरॉनल मायटोकाँड्रियल कार्यामुळे लवकर एथेरोस्क्लेरोसिस आणि 1C रिमॉडेलिंग (आकृती 3E आणि आकृती S5C) होऊ शकते, आणि I व IV कॉम्प्लेक्सच्या अभिव्यक्तीमध्ये अपेक्षित बदल देखील होऊ शकतात, तरी सेरीनच्या नवसंश्लेषणातील बदल केवळ उशिराच्या टप्प्यातच स्पष्ट झाले. ऑक्सिफॉस (OXPHOS) बिघाड (आकृती 3E आणि आकृती S5C). हे निष्कर्ष एका अनुक्रमिक प्रक्रियेचे वर्णन करतात, ज्यामध्ये तणाव-प्रेरित मायटोकाँड्रियल (1C चक्र) आणि सायटोप्लाज्मिक (सेरीन जैवसंश्लेषण) प्रतिसाद, न्यूरॉनल चयापचयाला आकार देण्यासाठी टीसीए (TCA) चक्रातील एथेरोस्क्लेरोसिसच्या वाढीसह सहक्रियात्मकपणे कार्य करतात.
८ आठवड्यांच्या OXPHOS-कमतरता असलेल्या PNs (न्यूरॉनल न्यूरॉन्स) मायटोकाँड्रियल बिघाडाची भरपाई करण्यासाठी उच्च-वारंवारता उत्तेजन क्रिया टिकवून ठेवू शकतात आणि लक्षणीय चयापचय पुनर्संबंधातून जाऊ शकतात. या शोधातून एक मनोरंजक शक्यता निर्माण होते की, या क्षणीसुद्धा, न्यूरोडीजनरेशनला उशीर करण्यासाठी किंवा ते टाळण्यासाठी या पेशींवर उपचारात्मक हस्तक्षेप केला जाऊ शकतो. आम्ही दोन स्वतंत्र हस्तक्षेपांद्वारे ही शक्यता पडताळून पाहिली. पहिल्या पद्धतीत, आम्ही एक Cre-अवलंबित ॲडेनो-असोसिएटेड व्हायरस (AAV) व्हेक्टर तयार केला, जेणेकरून MFN2 हे OXPHOS-कमतरता असलेल्या PNs मध्ये इन विवो (in vivo) निवडकपणे व्यक्त केले जाऊ शकेल (आकृती S7A). MFN2 आणि फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन mCherry (Mfn2-AAV) एन्कोड करणाऱ्या AAV ची इन व्हिट्रो (in vitro) प्राथमिक न्यूरॉन कल्चरमध्ये पडताळणी करण्यात आली, ज्यामुळे MFN2 हे Cre-अवलंबित पद्धतीने व्यक्त झाले आणि मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजी सुधारली, परिणामी Mfn2cKO न्यूरॉन्समधील न्यूरोम्युटेशन टाळले गेले (आकृती S7, B, D आणि E). पुढे, आम्ही Mfn2cKO आणि नियंत्रण उंदरांच्या सेरेब्रल कॉर्टेक्समध्ये 8-आठवडे जुने Mfn2-AAV स्टिरिओटॅक्टिकली पोहोचवण्यासाठी इन व्हिवो प्रयोग केले आणि 12-आठवड्यांच्या उंदरांचे विश्लेषण केले (आकृती 4A). उपचार केलेले Mfn2cKO उंदीर मरण पावले (आकृती 1, A आणि B) (16). इन व्हिवो व्हायरल ट्रान्सडक्शनमुळे काही सेरेब्रल वर्तुळांमध्ये PN ची निवडक अभिव्यक्ती झाली (आकृती S7, G आणि H). केवळ mCherry व्यक्त करणाऱ्या नियंत्रण AAV (Ctrl-AAV) च्या इंजेक्शनचा Mfn2cKO प्राण्यांमधील न्यूरोडीजनरेशनच्या प्रमाणावर कोणताही महत्त्वपूर्ण परिणाम झाला नाही. याउलट, Mfn2-AAV ने ट्रान्सड्यूस केलेल्या Mfn2cKO च्या विश्लेषणाने PN पेशींच्या थराचा महत्त्वपूर्ण संरक्षक प्रभाव दर्शविला (आकृती 4, B आणि C). विशेषतः, न्यूरॉनची घनता नियंत्रण प्राण्यांपेक्षा जवळजवळ वेगळी ओळखता येत नाही असे दिसते (आकृती 4, B आणि C, आणि आकृती S7, H आणि I). MFN1 ची अभिव्यक्ती, MFN2 ची नाही, न्यूरॉनल मृत्यू वाचवण्यासाठी तितकीच प्रभावी आहे (आकृती 4C आणि आकृती S7, C आणि F), जे दर्शवते की एक्टोपिक MFN1 ची अभिव्यक्ती MFN2 च्या कमतरतेची प्रभावीपणे भरपाई करू शकते. एकल PN स्तरावर केलेल्या पुढील विश्लेषणातून असे दिसून आले की Mfn2-AAV ने मायटोकॉन्ड्रियाची अल्ट्रास्ट्रक्चर मोठ्या प्रमाणात वाचवली, mtDNA पातळी सामान्य केली आणि अँटी-अँजिओजेनेसिस मार्कर PCx ची उच्च अभिव्यक्ती उलटवली (आकृती 4, C ते E). वाचवलेल्या Mfn2cKO उंदरांची विश्रांतीच्या स्थितीत दृश्य तपासणी केली असता, त्यांची मुद्रा आणि मोटर लक्षणे (हालचाल S1 ते S3) सुधारली असल्याचे दिसून आले. निष्कर्षतः, हे प्रयोग दर्शवतात की OXPHOS ची तीव्र कमतरता असलेल्या PNs मध्ये MFN2 चा उशिरा पुन:प्रवेश करणे हे mtDNA चा वापर उलटवण्यासाठी आणि एथेरोस्क्लेरोसिस प्रेरित करण्यासाठी पुरेसे आहे, ज्यामुळे इन विवोमध्ये ॲक्सॉनचा ऱ्हास आणि न्यूरॉनल मृत्यू टाळता येतो.
(अ) दर्शविलेला चयापचय मार्ग सक्रिय झाल्यावर MFN2 एन्कोडिंग करणारे AAV इंजेक्ट करण्याचे प्रायोगिक वेळापत्रक दर्शवणारी एक योजना. (ब) ८ आठवड्यांत Mfn2cKO उंदरांमध्ये ट्रान्सड्यूस केलेल्या आणि अँटी-कॅलबिंडिन अँटीबॉडीने लेबल केलेल्या १२-आठवड्यांच्या सेरेबेलर सेक्शनची प्रातिनिधिक कॉन्फोकल छायाचित्रे. उजवीकडे: ॲक्सॉन फायबरचे स्केलिंग. ॲक्सॉन झूमचे स्केल ४५० आणि ७५ μm आहे. (क) डावीकडे: AAV ट्रान्सडक्शन लूपमधील (AAV+) पर्किंजे पेशी घनतेचे परिमाणीकरण (एक-मार्गी विचलन विश्लेषण; n = ३ उंदीर). उजवीकडे: १२ व्या आठवड्यात ट्रान्सड्यूस केलेल्या PN मधील mtDNA फोकस विश्लेषण (अनपेअर्ड टी-टेस्ट; n = तीन उंदरांमधील ६ पेशी). * P <०.०५; ** P <०.०१. (ड) दर्शविलेल्या व्हायरल व्हेक्टरसह ट्रान्सड्यूस केलेल्या Mfn2cKO सेरेबेलर सेक्शनच्या PN चे प्रातिनिधिक ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोग्राफ. गुलाबी मास्क डेंड्राइट्सनी व्यापलेला भाग दर्शवतो, आणि पिवळा ठिपक्यांचा चौरस उजवीकडे दिलेला झूम दर्शवतो; n केंद्रक दर्शवतो. स्केल बार, १μm. (E) १२ आठवड्यांत ट्रान्सड्यूस केलेल्या PN मधील PCx स्टेनिंगचे एक उदाहरण दाखवते. स्केल बार, २०μm. OE, ओव्हरएक्सप्रेशन; FC, फोल्ड चेंज.
शेवटी, आम्ही ऑक्सिफॉस (OXPHOS) बिघाड झालेल्या पीएन (PNs) मध्ये पेरोक्सिडेस-प्रेरित पेशी जगण्याच्या महत्त्वाचा अभ्यास केला. आम्ही विशेषतः माऊस पीसीएक्स एमआरएनए (PCx mRNA) ला लक्ष्य करणारे एएव्ही-एसएचआरएनए (AAV-shPCx) एन्कोड करणारे एमचेरी (mCherry) तयार केले आणि तो विषाणू किंवा त्याचे स्क्रॅम्बल्ड कंट्रोल (AAV-scr) एमएफएन२सीकेओ (Mfn2cKO) उंदरांच्या सेरेबेलममध्ये इंजेक्ट केले. हे इंजेक्शन वयाच्या चौथ्या आठवड्यात (आकृती ५अ) देण्यात आले, जेणेकरून पीसीएक्स अभिव्यक्ती वाढत असताना (आकृती ३क) आणि पीएन पेशींचा थर अजूनही शाबूत असताना (आकृती १अ) प्रभावी पीसीएक्स नॉकडाउन साधता येईल. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की पीसीएक्स नॉकडाउनमुळे (आकृती एस८अ) पीएन मृत्यूमध्ये लक्षणीय वाढ होते, जो संसर्गाचा एकमेव मर्यादित रिंग आहे (आकृती ५, ब आणि क). PCx अप-रेग्युलेशनमुळे होणाऱ्या चयापचय परिणामांची यंत्रणा समजून घेण्यासाठी, आम्ही ग्लुटाथिओन पेप्टाइड रेडॉक्स पोटेन्शिअलमधील सापेक्ष बदलाचे मूल्यांकन करण्याकरिता PCx नॉकडाउन आणि AAV-मध्यस्थ ऑप्टिकल बायोसेन्सर Grx1-roGFP2 एकाच वेळी व्यक्त केल्यानंतर PNs च्या रेडॉक्स स्थितीचा अभ्यास केला (आकृती S8, B ते D) (38). त्यानंतर, FLIM परिस्थिती तपासल्यानंतर सायटोप्लाज्मिक रेडॉक्स स्थितीतील संभाव्य बदल शोधण्यासाठी आम्ही 7-आठवडे वयाच्या Mfn2cKO किंवा कंट्रोल लिटरमेट्सच्या ताज्या मेंदूच्या स्लाइसमध्ये टू-फोटॉन फ्लुरोसेन्स लाइफटाइम इमेजिंग मायक्रोस्कोपी (FLIM) केली (आकृती S8, E ते G). विश्लेषणातून असे दिसून आले की PCx अभिव्यक्ती नसलेल्या एका Mfn2cKO PNs च्या ऑक्सिडेशन स्थितीत लक्षणीय वाढ झाली आहे, जी कंट्रोल न्यूरॉन्स किंवा केवळ स्क्रॅम्बल्ड shRNA व्यक्त करणाऱ्या Mfn2cKO PNs पेक्षा वेगळी आहे (आकृती 5, D आणि E). जेव्हा PCx अभिव्यक्ती कमी केली गेली तेव्हा अत्यंत ऑक्सिडाइज्ड स्थिती दर्शविणाऱ्या Mfn2cKO PNs ची टक्केवारी तीन पटींपेक्षा जास्त वाढली (आकृती 5E), हे दर्शविते की PCx वाढीने ऱ्हास झालेल्या न्यूरॉन्सची रेडॉक्स क्षमता टिकवून ठेवली.
(अ) दर्शवलेला चयापचय मार्ग सक्रिय झाल्यावर shPCx एन्कोडिंग करणारे AAV इंजेक्ट करण्याचे प्रायोगिक वेळापत्रक दर्शवणारी एक योजना. (ब) ४ आठवड्यांनी अँटी-कॅल्सिन्यूरिन अँटीबॉडीने ट्रान्सड्यूस आणि लेबल केलेल्या Mfn2cKO उंदरांच्या ८-आठवडे जुन्या सेरेबेलर सेक्शनची प्रातिनिधिक कॉन्फोकल छायाचित्रे. स्केल बार, ४५०μm. (क) AAV-ट्रान्सड्यूस केलेल्या लूपमधील पर्किंजे पेशींच्या घनतेचे परिमाणीकरण (एक-मार्गी विचलन विश्लेषण; n = ३ ते ४ उंदीर). डेटा सरासरी±SEM म्हणून व्यक्त केला आहे; ***P<0.001. (ड) प्रातिनिधिक FLIM चित्र निर्दिष्ट प्रायोगिक परिस्थितीत ग्लुटाथिओन रेडॉक्स सेन्सर Grx1-roGFP2 व्यक्त करणाऱ्या ७-आठवडे जुन्या PN चे सरासरी आयुर्मान दर्शवते. LUT (लुक-अप टेबल) गुणोत्तर: जगण्याचा कालावधी (पिकोसेकंदमध्ये). स्केल बार, २५μm. (E) हिस्टोग्राम (D) मधील Grx1-roGFP2 आयुर्मान मूल्यांचे वितरण दर्शवतो (प्रत्येक परिस्थितीत दोन उंदरांमधील n=१५८ ते ३६८ पेशी). प्रत्येक हिस्टोग्रामच्या वरील पाय चार्ट: CTRL-AAV-scr मधील सरासरी आयुर्मान मूल्याच्या १ SD पेक्षा जास्त, लक्षणीयरीत्या जास्त (लाल, ऑक्सिडाइज्ड) किंवा कमी (निळा, रिड्यूस्ड) आयुर्मान असलेल्या पेशींची संख्या दर्शवतो. (F) प्रस्तावित मॉडेल न्यूरॉनल PCx च्या अपरेग्युलेशनचा संरक्षणात्मक प्रभाव दर्शवते.
एकंदरीत, आम्ही येथे सादर केलेला डेटा दर्शवितो की MFN2 ची पुनर्अभिव्यक्ती गंभीर OXPHOS कमतरता, गंभीर mtDNA ऱ्हास आणि अत्यंत असामान्य इस्टा-सारख्या आकारविज्ञानासह प्रगत PN ला पूर्णपणे वाचवू शकते, ज्यामुळे प्रगत रोगांमध्येही सतत प्रगती होते. न्यूरोडीजनरेशन पेशी मृत्यूच्या आधीच्या अवस्थेचा उलटवता येण्याजोगा पुरावा प्रदान करते. चयापचय लवचिकतेची ही पातळी न्यूरॉन्सच्या एथेरोस्क्लेरोसिस (TCA चक्राची पुनर्रचना) प्रेरित करण्याच्या क्षमतेमुळे अधिक अधोरेखित होते, जे OXPHOS नसलेल्या PN मध्ये PCx अभिव्यक्तीला प्रतिबंधित करते आणि पेशी मृत्यू वाढवते, ज्यामुळे संरक्षणात्मक भूमिका बजावली जाते (आकृती 5F).
या अभ्यासात, आम्ही असा पुरावा सादर केला आहे की ऑक्सिफॉस (OXPHOS) बिघाडाला पीएन (PNs) चा प्रतिसाद म्हणजे चयापचय कार्यक्रमांद्वारे सक्रिय होणाऱ्या भिन्न सक्रियकरण मार्गाद्वारे हळूहळू टीसीए (TCA) चक्र एथेरोस्क्लेरोसिसमध्ये रूपांतरित होणे. आम्ही अनेक पूरक पद्धतींनी प्रोटिओमिक विश्लेषणाची पुष्टी केली आणि हे उघड केले की जेव्हा गंभीर मायटोकॉन्ड्रियल बिघाडाचे आव्हान असते, तेव्हा न्यूरॉन्समध्ये चयापचय लवचिकतेचे एक पूर्वी अज्ञात स्वरूप असते. आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, संपूर्ण पुनर्रचना प्रक्रिया हळूहळू आणि अपरिवर्तनीयपणे न्यूरोडीजनरेशनसोबत येणाऱ्या अंतिम चयापचय स्थितीला चिन्हांकित करतेच असे नाही, परंतु आमचा डेटा सूचित करतो की पेशी मृत्यूच्या आधीच्या टप्प्यातही ही एक देखभाल न्यूरॉन कार्यात्मक भरपाई यंत्रणा असू शकते. हा निष्कर्ष दर्शवितो की शरीरातील न्यूरॉन्समध्ये चयापचय लवचिकतेची लक्षणीय पातळी असते. ही वस्तुस्थिती सिद्ध करते की एमएफएन२ (MFN2) चा नंतरचा पुन:प्रवेश महत्त्वाच्या चयापचय मार्करची अभिव्यक्ती उलटवू शकतो आणि पीएन (PN) चा ऱ्हास रोखू शकतो. याउलट, ते एथेरोस्क्लेरोसिसला प्रतिबंधित करते आणि मज्जातंतूंच्या प्रक्रियेला गती देते.
आमच्या संशोधनातील सर्वात आकर्षक निष्कर्षांपैकी एक म्हणजे, ऑक्सिफॉस (OXPHOS) नसलेले पीएन (PNs) विशेषतः आर्टेरिओस्क्लेरोसिसला (arteriosclerosis) उत्तेजित करणाऱ्या एन्झाइम्सना अप-रेग्युलेट करून टीसीए (TCA) सायकलच्या चयापचयात बदल घडवू शकतात. चयापचयातील पुनर्रचना हे कर्करोगाच्या पेशींचे एक सामान्य वैशिष्ट्य आहे, त्यापैकी काही पेशी रिड्यूसिंग इक्विव्हॅलेंट्स (reducing equivalents) तयार करण्यासाठी टीसीए (TCA) सायकलच्या इंटरमीडिएट्सना पूरक म्हणून ग्लुटामाइनवर (glutamine) अवलंबून असतात, जे श्वसन साखळीला चालना देतात आणि लिपिड व न्यूक्लियोटाइड बायोसिंथेसिसच्या पूर्वसूचकांचे उत्पादन टिकवून ठेवतात (39, 40). एका अलीकडील अभ्यासात असे दिसून आले आहे की ऑक्सिफॉस (OXPHOS) डिसफंक्शन अनुभवणाऱ्या पेरिफेरल टिश्यूजमध्ये, ग्लुटामाइन/ग्लुटामेट चयापचयाचे पुनर्संयोजन हे देखील एक प्रमुख वैशिष्ट्य आहे (5, 41), जिथे टीसीए (TCA) सायकलमध्ये ग्लुटामाइनच्या प्रवेशाची दिशा ऑक्सिफॉस (OXPHOS) इजा किती गंभीर आहे यावर अवलंबून असते (41). तथापि, शरीरातील न्यूरोनल मेटाबोलिक प्लास्टिसिटीमधील कोणत्याही समानतेवर आणि रोगाच्या संदर्भात त्याच्या संभाव्य प्रासंगिकतेवर स्पष्ट पुराव्याचा अभाव आहे. अलिकडच्या एका इन विट्रो अभ्यासात, प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स न्यूरोट्रान्समिशनसाठी ग्लुटामेट पूल एकत्रित करतात, ज्यामुळे चयापचय तणावाच्या परिस्थितीत ऑक्सिडेटिव्ह चयापचय आणि एथेरोस्क्लेरोसिसला चालना मिळते असे दिसून आले (42). हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की TCA सायकल एन्झाइम सक्सिनेट डिहायड्रोजनेजच्या औषधीय प्रतिबंधाखाली, पायरुवेट कार्बोक्सिलेशनमुळे कल्चर केलेल्या सेरेबेलर ग्रॅन्युल न्यूरॉन्समध्ये ऑक्सॅलोएसीटेटचे संश्लेषण टिकून राहते असे मानले जाते (34). तथापि, मेंदूच्या ऊतींसाठी या यंत्रणांची शारीरिक प्रासंगिकता (जिथे एथेरोस्क्लेरोसिस मुख्यत्वे ॲस्ट्रोसाइट्सपुरता मर्यादित असल्याचे मानले जाते) अजूनही महत्त्वपूर्ण शारीरिक महत्त्व आहे (43). या प्रकरणात, आमचा डेटा दर्शवितो की शरीरातील OXPHOS मुळे खराब झालेले PNs BCAA डिग्रेडेशन आणि पायरुवेट कार्बोक्सिलेशनकडे वळवले जाऊ शकतात, जे TCA पूल इंटरमीडिएट्सच्या पूरकतेचे दोन मुख्य स्रोत आहेत. जरी न्यूरोनल ऊर्जा चयापचयामध्ये BCAA कॅटाबोलिझमच्या संभाव्य योगदानाचा प्रस्ताव मांडला गेला असला तरी, न्यूरोट्रान्समिशनसाठी ग्लुटामेट आणि GABA च्या भूमिकेव्यतिरिक्त (44), इन विवोमध्ये या यंत्रणांसाठी अद्याप कोणताही पुरावा नाही. म्हणून, असा अंदाज लावणे सोपे आहे की अकार्यक्षम PNs एथेरोस्क्लेरोसिस वाढवून आत्मसातीकरण प्रक्रियेद्वारे चालवल्या जाणाऱ्या TCA इंटरमीडिएट्सच्या वापराची आपोआप भरपाई करू शकतात. विशेषतः, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन असलेल्या प्रसारक पेशींमध्ये (45) दर्शविल्याप्रमाणे, एस्पार्टिक ऍसिडची वाढलेली मागणी पूर्ण करण्यासाठी PCx चे अपरेग्युलेशन आवश्यक असू शकते. तथापि, आमच्या मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषणात Mfn2cKO PNs मधील एस्पार्टिक ऍसिडच्या स्थिर-स्थिती पातळीत कोणतेही महत्त्वपूर्ण बदल दिसून आले नाहीत (आकृती S6A), जे कदाचित प्रसारक पेशी आणि पोस्ट-मायटोटिक न्यूरॉन्समधील एस्पार्टिक ऍसिडच्या भिन्न चयापचय वापराला प्रतिबिंबित करते. जरी इन विवो (in vivo) मध्ये अकार्यक्षम न्यूरॉन्समध्ये PCx अपरेग्युलेशनची नेमकी यंत्रणा अद्याप स्पष्ट व्हायची असली तरी, आम्ही हे दाखवून दिले की हा अकाली प्रतिसाद न्यूरॉन्सची रेडॉक्स स्थिती राखण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावतो, जे सेरेबेलर स्लाइसवरील FLIM प्रयोगांमध्ये सिद्ध झाले आहे. विशेषतः, PNs ला PCx अपरेग्युलेट करण्यापासून रोखल्यास अधिक ऑक्सिडाइज्ड स्थिती निर्माण होऊ शकते आणि पेशींचा मृत्यू वेगवान होऊ शकतो. BCAA ऱ्हासाची सक्रियता आणि पायरुवेटचे कार्बोक्सिलेशन हे मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनच्या परिघीय ऊतींचे वैशिष्ट्य दर्शविण्याचे मार्ग नाहीत (7). म्हणून, जरी ते एकमेव वैशिष्ट्य नसले तरी, ते OXPHOS-कमतरता असलेल्या न्यूरॉन्सचे एक प्राधान्य वैशिष्ट्य असल्याचे दिसते, जे न्यूरोडीजनरेशनसाठी महत्त्वाचे आहे.
सेरेबेलर रोग हा न्यूरोडीजनरेटिव्ह रोगाचा एक विषम प्रकार आहे जो सामान्यतः अ‍ॅटॅक्सिया म्हणून प्रकट होतो आणि अनेकदा पीएन (PNs) ला नुकसान पोहोचवतो (46). ही न्यूरॉन लोकसंख्या मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनसाठी विशेषतः असुरक्षित आहे कारण उंदरांमध्ये त्यांचा निवडक ऱ्हास मानवी स्पिनोसेरेबेलर अ‍ॅटॅक्सियाची वैशिष्ट्ये असलेल्या अनेक मोटर लक्षणांची पुनरावृत्ती करण्यासाठी पुरेसा आहे (16, 47, 48). अहवालानुसार, उत्परिवर्तित जनुक असलेले एक ट्रान्सजेनिक उंदीर मॉडेल मानवी स्पिनोसेरेबेलर अ‍ॅटॅक्सियाशी संबंधित आहे आणि त्यात मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन आहे (49, 50), जे पीएनपीएच (PNPH) मध्ये ऑक्सिफॉस (OXPHOS) कमतरतेच्या परिणामांचा अभ्यास करण्याचे महत्त्व अधोरेखित करते. म्हणून, या अद्वितीय न्यूरॉन लोकसंख्येला प्रभावीपणे वेगळे करण्यासाठी आणि त्यांचा अभ्यास करण्यासाठी हे विशेषतः योग्य आहे. तथापि, पीएन (PNs) दबावाला खूप संवेदनशील असल्याने आणि संपूर्ण सेरेबेलर पेशींच्या लोकसंख्येत त्यांचे प्रमाण कमी असल्याने, अनेक ओमिक्स-आधारित अभ्यासांसाठी, त्यांना संपूर्ण पेशी म्हणून निवडकपणे वेगळे करणे हे अजूनही एक आव्हानात्मक पैलू आहे. जरी इतर पेशी प्रकारांचे (विशेषतः प्रौढ ऊतींचे) पूर्णपणे संदूषण टाळणे जवळजवळ अशक्य असले तरी, आम्ही पुढील प्रोटिओमिक्स विश्लेषणासाठी पुरेशा संख्येने व्यवहार्य न्यूरॉन्स मिळवण्यासाठी FACS सह एक प्रभावी विलगन पायरी एकत्र केली, आणि संपूर्ण सेरेबेलमच्या (51) विद्यमान डेटा सेटच्या तुलनेत बरेच उच्च प्रोटीन कव्हरेज (सुमारे 3000 प्रथिने) मिळवले आहे. संपूर्ण पेशींची व्यवहार्यता जतन करून, आम्ही येथे दिलेली पद्धत आम्हाला केवळ मायटोकॉन्ड्रियामधील चयापचय मार्गांमधील बदल तपासण्याचीच नव्हे, तर त्याच्या सायटोप्लाज्मिक समकक्षांमधील बदल तपासण्याची देखील परवानगी देते, जे जटिल ऊतींमधील मायटोकॉन्ड्रियाच्या संख्येसाठी पेशी प्रकारांनुसार विशिष्ट मायटोकॉन्ड्रियल मेम्ब्रेन लेबल एनरिचमेंटच्या वापराला पूरक ठरते (52, 53). आम्ही वर्णन केलेली पद्धत केवळ पर्किंजे पेशींच्या अभ्यासाशी संबंधित नाही, तर ती कोणत्याही प्रकारच्या पेशींवर सहजपणे लागू केली जाऊ शकते, ज्यामुळे रोगग्रस्त मेंदूतील चयापचय बदलांचा अभ्यास करता येतो, ज्यात मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनच्या इतर मॉडेल्सचा समावेश आहे.
शेवटी, आम्ही या चयापचय पुनर्रचना प्रक्रियेदरम्यान एक उपचारात्मक संधी ओळखली आहे, जी पेशीय ताणाची प्रमुख लक्षणे पूर्णपणे उलटवू शकते आणि चेतापेशींचा ऱ्हास रोखू शकते. त्यामुळे, येथे वर्णन केलेल्या पुनर्रचनेचे कार्यात्मक परिणाम समजून घेतल्यास, मायटोकाँड्रियल बिघाडादरम्यान चेतापेशींची कार्यक्षमता टिकवून ठेवण्यासाठीच्या संभाव्य उपचारांविषयी मूलभूत अंतर्दृष्टी मिळू शकते. या तत्त्वाची इतर चेतासंस्थेच्या आजारांना असलेली उपयुक्तता पूर्णपणे उलगडण्यासाठी, मेंदूतील इतर पेशी प्रकारांमधील ऊर्जा चयापचयातील बदलांचे विश्लेषण करण्याच्या उद्देशाने भविष्यातील संशोधनाची आवश्यकता आहे.
मायटोपार्क उंदरांचे वर्णन पूर्वी केले गेले आहे (31). Mfn2 जनुकांच्या सभोवताली loxP असलेले C57BL/6N उंदीर यांचे वर्णन पूर्वी केले गेले आहे (18) आणि त्यांचे L7-Cre उंदरांसोबत संकरण केले गेले (23). परिणामी मिळालेल्या दुहेरी विषमयुग्मजी संततीचे नंतर समयुग्मजी Mfn2loxP/Mfn2loxP उंदरांसोबत संकरण करून Mfn2 साठी पर्किंजे-विशिष्ट जनुकीय नॉकआउट्स (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) तयार करण्यात आले. काही विशिष्ट प्रजननामध्ये, अतिरिक्त संकरणांद्वारे Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP अ‍ॅलील (stop-mtYFP) समाविष्ट करण्यात आले (20). प्राण्यांवरील सर्व प्रक्रिया युरोपियन, राष्ट्रीय आणि संस्थात्मक मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार पार पाडण्यात आल्या आणि त्यांना जर्मनीतील नॉर्थ ऱ्हाईन-वेस्टफेलिया येथील 'लँडेसअम्तफुरनॅचर ऑफ उमवेल्ट अँड वेरब्राउचशुत्झ' द्वारे मान्यता देण्यात आली. प्राण्यांवरील काम 'युरोपियन फेडरेशन ऑफ लॅबोरेटरी अ‍ॅनिमल सायन्सेस असोसिएशन्स'च्या मार्गदर्शनाचे देखील पालन करते.
गर्भवती महिलेच्या मानेच्या हाडाला भूल दिल्यानंतर, उंदराचा गर्भ वेगळा केला जातो (E13). कॉर्टेक्स 10 mM हेपेस असलेल्या हँक्स बॅलन्स्ड सॉल्ट सोल्युशन (HBSS) मध्ये वेगळा करण्यात आला आणि पॅपेन (20 U/ml) व सिस्टीन (1μg/ml) असलेल्या डल्बेकोज मॉडिफाइड ईगल्स मीडियमवर पसरवला गेला. ऊतीला DMEM मध्ये 37°C तापमानावर 20 मिनिटांसाठी उबवून एन्झायमॅटिक पचनाने विलग केले गेले, आणि नंतर 10% फेटल बोवाइन सीरम असलेल्या DMEM मध्ये यांत्रिकरित्या दळले गेले. पेशींना पॉलीलायसिनने लेपित केलेल्या काचेच्या कव्हरस्लिप्सवर 6 सेमी कल्चर डिशमध्ये 2×10⁶ या घनतेने किंवा इमेजिंग विश्लेषणासाठी 0.5×10⁵ पेशी/सेमी² या घनतेने पेरण्यात आले. 4 तासांनंतर, माध्यम बदलून 1% B27 सप्लिमेंट आणि 0.5 mM ग्लुटामॅक्स असलेले न्यूरोबेसल सीरम-फ्री माध्यम टाकण्यात आले. त्यानंतर संपूर्ण प्रयोगादरम्यान न्यूरॉन्सना 37°C आणि 5% CO2 मध्ये ठेवण्यात आले आणि आठवड्यातून एकदा त्यांना खाद्य देण्यात आले. इन विट्रोमध्ये पुनर्संयोजन प्रेरित करण्यासाठी, इन विट्रोच्या दुसऱ्या दिवशी न्यूरॉन्सवर उपचार करण्यासाठी खालील AAV9 व्हायरस व्हेक्टरचे 3μl (24-वेल कल्चर डिश) किंवा 0.5μl (24-वेल प्लेट) वापरण्यात आले: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (ॲडजीन, कॅटलॉग क्रमांक 105530-AAV9) आणि AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (ॲडजीन, कॅटलॉग क्रमांक 105545-AAV9).
माऊस Mfn1 आणि Mfn2 कॉम्प्लिमेंटरी डीएनए (अनुक्रमे Addgene प्लास्मिड #23212 आणि #23213 मधून मिळवलेले) C-टर्मिनसवर V5 अनुक्रमाने (GKPIPNPLLGLDST) चिन्हांकित केलेले आहेत, आणि T2A अनुक्रमाद्वारे mCherry सोबत इन-फ्रेम जोडलेले आहेत. Grx1-roGFP2 हे हायडेलबर्ग टीपी डिक डीएफकेझेड (Deutsches Krebsforschungszentrum) कडून मिळालेली देणगी आहे. पारंपरिक क्लोनिंग पद्धती वापरून tdTomato कॅसेट बदलून, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 आणि pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 व्हेक्टर तयार करण्यासाठी, या कॅसेटचे pAAV-CAG-FLEX-tdTomato बॅकबोनमध्ये (Addgene संदर्भ क्रमांक 28306) सबक्लोनिंग करण्यात आले. pAAV-CAG-FLEX-mCherry हा कंट्रोल व्हेक्टर तयार करण्यासाठीही अशीच एक पद्धत वापरण्यात आली. AAV-shPCx कन्स्ट्रक्ट तयार करण्यासाठी, एका प्लास्मिड AAV व्हेक्टरची (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) आवश्यकता असते, ज्यामध्ये माऊस PCx ला लक्ष्य करणाऱ्या shRNA साठी एन्कोडिंग करणारा DNA सिक्वेन्स (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) असतो. U6 प्रमोटरच्या नियंत्रणाखाली, CMV प्रमोटरच्या नियंत्रणाखाली mCherry चा वापर केला जातो. सहाय्यक AAV व्हेक्टर्सचे उत्पादन उत्पादकाच्या सूचनांनुसार (Cell Biolabs) करण्यात आले. थोडक्यात, कॅल्शियम फॉस्फेट पद्धतीचा वापर करून, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) किंवा Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) कोडिंग जीन, तसेच AAV1 कॅप्सिड प्रोटीन आणि ॲक्सेसरी प्रोटीनचे कोडिंग असलेले ट्रान्सफर प्लास्मिड पॅकेजिंग प्लास्मिड वापरा. ​​ड्राय आईस/इथेनॉल बाथमध्ये फ्रीझ-थॉ सायकलद्वारे क्रूड व्हायरस सुपरनॅटंट मिळवण्यात आला आणि फॉस्फेट बफर्ड सलाईन (PBS) मध्ये पेशींचे लायसिस करण्यात आले. AAV वेक्टरचे शुद्धीकरण असंतत आयोडिक्सॅनॉल ग्रेडियंट अल्ट्रासेंट्रीफ्युगेशन (32,000 rpm आणि 4°C वर 24 तास) द्वारे करण्यात आले आणि अॅमिकॉन अल्ट्रा-15 सेंट्रीफ्युगल फिल्टर वापरून ते संकेंद्रित करण्यात आले. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 जीनोम कॉपी (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) आणि AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) यांचे जीनोम टायटर पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे (54) रिअल-टाइम क्वांटिटेटिव्ह PCR (qPCR) द्वारे मोजण्यात आले.
प्राथमिक न्यूरॉन्स बर्फासारख्या थंड 1x PBS मध्ये खरवडून काढले, त्यांचा गोळा बनवला, आणि नंतर फॉस्फेटेज आणि प्रोटीएज इनहिबिटर (रोश) असलेल्या 0.5% ट्रायटन X-100 / 0.5% सोडियम डीऑक्सीकोलेट/PBS लायसिस बफरमध्ये एकजीव केले. बायसिंचोनिनिक ॲसिड ॲसे (थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरून प्रथिनांचे प्रमाण निश्चित करण्यात आले. त्यानंतर प्रथिने SDS-पॉलिॲक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसद्वारे वेगळी करण्यात आली, आणि नंतर पॉलिव्हिनिलिडेन फ्लोराइड मेम्ब्रेनवर (जीई हेल्थकेअर) ब्लॉट केली. विशिष्ट नसलेल्या जागा ब्लॉक करा आणि प्राथमिक अँटीबॉडीसह (तपशिलांसाठी तक्ता S1 पहा) TBST (ट्विनसह ट्रिस-बफर्ड सलाइन) मधील 5% दुधात इनक्युबेट करा, धुण्याच्या पायऱ्या आणि दुय्यम अँटीबॉडीसह TBST मध्ये इनक्युबेट करा. प्राथमिक अँटीबॉडीसह +4°C वर रात्रभर इनक्युबेट करा. धुतल्यानंतर, खोलीच्या तापमानावर 2 तासांसाठी दुय्यम अँटीबॉडी लावा. त्यानंतर, त्याच ब्लॉटला अँटी-β-ॲक्टिन अँटीबॉडीसह इनक्युबेट करून, त्याच लोडिंगची पुष्टी केली गेली. केमिल्युमिनेसन्समध्ये रूपांतरित करून आणि केमिल्युमिनेसन्स वाढवून शोध (जीई हेल्थकेअर).
काचेच्या कव्हरस्लिप्सवर आधीच पेरलेले न्यूरॉन्स, निर्दिष्ट वेळेनुसार खोलीच्या तापमानावर १० मिनिटांसाठी ४% पॅराफॉर्मल्डिहाइड (PFA)/PBS मध्ये स्थिर करण्यात आले. कव्हरस्लिप्स प्रथम खोलीच्या तापमानावर ५ मिनिटांसाठी ०.१% ट्रायटन X-100/PBS मध्ये आणि नंतर ब्लॉकिंग बफरमध्ये [३% बोवाइन सीरम अल्ब्युमिन (BSA)/PBS] भिजवण्यात आल्या. दुसऱ्या दिवशी, कव्हरस्लिप्स ब्लॉकिंग बफरने धुतल्या गेल्या आणि खोलीच्या तापमानावर २ तासांसाठी योग्य फ्लोरोफोर-संयुग्मित दुय्यम अँटीबॉडीसह इनक्यूबेट केल्या गेल्या; शेवटी, नमुने PBS मध्ये पूर्णपणे धुतले गेले, ४′,६-डायअमिडिनो-२-फेनिलइंडोल (DAPI) ने काउंटरस्टेन केले गेले आणि नंतर ॲक्वा-पॉली/माउंट वापरून मायक्रोस्कोप स्लाइडवर स्थिर केले गेले.
उंदरांना (नर आणि मादी) केटामाइन (१३० मिग्रॅ/किलो) आणि झायलाझिन (१० मिग्रॅ/किलो) यांचे इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन देऊन भूल देण्यात आली आणि त्वचेखाली कार्प्रोफेन वेदनाशामक (५ मिग्रॅ/किलो) देण्यात आले. त्यानंतर त्यांना वॉर्म पॅड लावलेल्या स्टीरिओटॅक्टिक उपकरणात (कॉप) ठेवण्यात आले. कवटी उघडी करून, मिस बोनशी संबंधित सेरेब्रल कॉर्टेक्सचा भाग (लॅम्डापासून: टेल १.८, लॅटरल १, जो लोब्यूल्स IV आणि V शी संबंधित आहे) पातळ करण्यासाठी डेंटल ड्रिलचा वापर करा. खालील रक्तवाहिन्यांना धक्का लागणार नाही याची काळजी घेत, कवटीमध्ये काळजीपूर्वक एक लहान छिद्र करण्यासाठी वक्र सिरिंजच्या सुईचा वापर करा. नंतर पातळ ओढलेली काचेची केशिका (कॅपिलरी) हळूहळू सूक्ष्म छिद्रामध्ये (ड्यूरा मॅटरच्या अधर बाजूला -१.३ ते -१ पर्यंत) घातली जाते, आणि १० ते २० मिनिटांच्या कालावधीत, मॅन्युअल सिरिंजने (नारिशिगे) २०० ते ३०० एनएल एएव्ही (AAV) सूक्ष्म-इंजेक्टरमध्ये (नारिशिगे) कमी दाबाने अनेक वेळा इंजेक्ट केले जाते. हे मिश्रण दिल्यानंतर, विषाणूला पूर्णपणे पसरू देण्यासाठी केशिका आणखी १० मिनिटे तशीच ठेवावी. केशिका बाहेर काढल्यानंतर, जखमेची सूज कमी करण्यासाठी आणि प्राण्याला बरे होण्यासाठी वेळ मिळावा म्हणून त्वचेला काळजीपूर्वक टाके घातले जातात. शस्त्रक्रियेनंतर अनेक दिवस प्राण्यांना वेदनाशामक (कॅस्पोफेन) औषधे दिली गेली, ज्या दरम्यान त्यांच्या शारीरिक स्थितीवर काळजीपूर्वक लक्ष ठेवले गेले आणि नंतर नमूद केलेल्या वेळी त्यांना इच्छामरण देण्यात आले. सर्व प्रक्रिया युरोपीय, राष्ट्रीय आणि संस्थात्मक मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार पार पाडण्यात आल्या आणि त्यांना जर्मनीच्या नॉर्थ ऱ्हाईन-वेस्टफेलिया येथील 'लँडेसअम्तफुरनॅचर ऑफ उमवेल्ट अँड वेरब्राउचशुट्झ' द्वारे मान्यता देण्यात आली.
प्राण्यांना केटामाइन (१०० मिग्रॅ/किलो) आणि झायलाझिन (१० मिग्रॅ/किलो) देऊन भूल देण्यात आली, आणि हृदयाला प्रथम ०.१ एम पीबीएसने, आणि नंतर पीबीएसमधील ४% पीएफएने परफ्यूज करण्यात आले. ऊती वेगळ्या करून ४°C तापमानावर रात्रभर ४% पीएफए/पीबीएसमध्ये स्थिर करण्यात आल्या. पीबीएसमध्ये स्थिर केलेल्या मेंदूतून सॅजिट्ल सेक्शन्स (५० μm जाडीचे) तयार करण्यासाठी व्हायब्रेटिंग नाइफ (लायका मायक्रोसिस्टम्स जीएमबीएच, व्हिएन्ना, ऑस्ट्रिया) वापरण्यात आला. अन्यथा निर्दिष्ट केल्याशिवाय, फ्री-फ्लोटिंग सेक्शन्सचे स्टेनिंग वर वर्णन केल्याप्रमाणे (१३) खोलीच्या तापमानावर आणि ढवळत केले गेले. थोडक्यात, प्रथम, मिळालेल्या स्लाइसना खोलीच्या तापमानावर १५ मिनिटांसाठी ०.५% ट्रायटन एक्स-१००/पीबीएसने पारगम्य करण्यात आले; काही एपिटोप्ससाठी (पीसीएक्स आणि एसएचएमटी२), या पायरीऐवजी स्लाइसना ८०°C (पीएच ९) तापमानावर २५ मिनिटांसाठी ट्रिस-ईडीटीए बफरमध्ये गरम करून पारगम्य करण्यात आले. पुढे, सेक्शन्सना ब्लॉकिंग बफरमध्ये (3% BSA/PBS) प्रायमरी अँटीबॉडी (तक्ता S1 पहा) सोबत 4°C तापमानावर रात्रभर ढवळत इनक्युबेट केले गेले. दुसऱ्या दिवशी, सेक्शन्सना ब्लॉकिंग बफरने धुतले गेले आणि खोलीच्या तापमानावर 2 तासांसाठी योग्य फ्लोरोफोर-कॉन्जुगेटेड सेकंडरी अँटीबॉडीसोबत इनक्युबेट केले गेले; शेवटी, सेक्शन्सना PBS मध्ये पूर्णपणे धुतले गेले, DAPI ने काउंटर-स्टेन केले गेले आणि नंतर मायक्रोस्कोप स्लाइडवर ॲक्वापॉलीमाउंटने फिक्स केले गेले.
नमुन्याची प्रतिमा घेण्यासाठी, व्हाईट लाईट लेझर आणि ४०५ डायोड अल्ट्राव्हायोलेट लेझरने सुसज्ज असलेल्या लेझर स्कॅनिंग कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपचा (TCS SP8-X किंवा TCS डिजिटल लाईट शीट, लायका मायक्रोसिस्टम्स) वापर करण्यात आला. फ्लोरोफोरला उत्तेजित करून आणि हायब्रिड डिटेक्टर (HyDs) द्वारे सिग्नल गोळा करून, LAS-X सॉफ्टवेअरचा वापर अनुक्रमिक मोडमध्ये नायक्विस्ट सॅम्पलिंगनुसार स्टॅक्ड इमेजेस गोळा करण्यासाठी केला गेला: गैर-परिमाणात्मक पॅनेलसाठी, हे अत्यंत डायनॅमिक सिग्नल (उदाहरणार्थ, सोमॅटिक पेशी आणि डेंड्राइट्समध्ये mtYFP) ब्राइटआर मोडमध्ये PNs ची संख्या शोधण्यासाठी HyD चा वापर करते. बॅकग्राउंड कमी करण्यासाठी ०.३ ते ६ ns चे गेटिंग लागू केले जाते.
वर्गीकृत पेशींचे रिअल-टाइम इमेजिंग. १% B27 सप्लिमेंट आणि ०.५ mM ग्लुटामॅक्स असलेल्या न्यूरोबेसल-ए माध्यमात वर्गीकरण केल्यानंतर, पेशी ताबडतोब पॉली-एल-लायसिन-लेपित काचेच्या स्लाईड्सवर (μ-स्लाईड८ वेल, इबिडी, कॅटलॉग क्रमांक ८०८२६) पेरण्यात आल्या, आणि नंतर पेशी स्थिरावण्यासाठी त्यांना १ तासासाठी ३७°C आणि ५% CO2 मध्ये ठेवण्यात आले. रिअल-टाइम इमेजिंग एका लायका SP8 लेझर स्कॅनिंग कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपवर करण्यात आले, जो व्हाईट लेझर, HyD, ६३×[१.४ न्यूमेरिकल अपर्चर (NA)] ऑइल ऑब्जेक्टिव्ह लेन्स आणि हीटिंग स्टेजने सुसज्ज होता.
उंदराला कार्बन डायऑक्साइडने त्वरित भूल देऊन त्याचे शिरच्छेद करण्यात आले, मेंदू कवटीतून त्वरित बाहेर काढण्यात आला आणि त्याचे 200μm जाडीचे (13C लेबलिंग प्रयोगासाठी) किंवा 275μm जाडीचे (दोन फोटॉन प्रयोगांसाठी) सॅजिट्ल सेक्शन कापण्यात आले, जे खालील पदार्थांनी भरलेले होते: 125 mM बर्फासारखे थंड, कार्बन-संतृप्त (95% O2 आणि 5% CO2) कमी Ca2 + कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25 mM NaHCO3, 25 mM ग्लुकोज, 0.5 mM CaCl2 आणि 3.5 mM MgCl2 (ऑस्मोटिक दाब 310 ते 330 mmol). मिळवलेले मेंदूचे तुकडे उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लुकोज, 1.0 mM CaCl2 आणि 2.0 mM MgCl2) माध्यम) pH 7.4 आणि 310 ते 320 mmol) असलेल्या प्री-इन्क्युबेशन चेंबरमध्ये स्थानांतरित करा.
इमेजिंग प्रक्रियेदरम्यान, स्लाइस एका विशेष इमेजिंग रूममध्ये हलवण्यात आले आणि 32° ते 33°C च्या स्थिर तापमानात सतत ACSF परफ्यूजन अंतर्गत प्रयोग करण्यात आला. स्लाइस इमेजिंगसाठी, लायका 25x ऑब्जेक्टिव्ह लेन्स (NA 0.95, वॉटर), Ti: सफायर लेझर (Chameleon Vision II, Coherent) ने सुसज्ज असलेला मल्टीफोटॉन लेझर स्कॅनिंग मायक्रोस्कोप (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) आणि FLIM मॉड्यूल (PicoHarp300, PicoQuant) वापरण्यात आला.
Grx1-roGFP2 चे FLIM. सॅजिट्ल ब्रेन स्लाइसमध्ये, जिथे Grx1-roGFP2 बायोसेन्सरने PNs ला लक्ष्य केले होते, तिथे टू-फोटॉन FLIM द्वारे PNs च्या सायटोप्लाज्मिक रेडॉक्स स्थितीतील बदल मोजले गेले. PN थरात, स्लाइसच्या पृष्ठभागापासून सुमारे ५० ते ८० μm खाली अधिग्रहण क्षेत्र निवडले जाते, जेणेकरून तिथे एक व्यवहार्य PN (म्हणजे, डेन्ड्राइट्सच्या बाजूने मण्यांसारखी रचना किंवा न्यूरॉनल मॉर्फोलॉजिकल बदलांचा अभाव) आणि डबल पॉझिटिव्ह roGFP2 सेन्सर व shRNA PCx किंवा त्याच्या कंट्रोल सिक्वेन्सला एन्कोड करणारा AAV (प्रत्येक mCherry सह-व्यक्त करणारा) असल्याची खात्री करता येईल. २x डिजिटल झूमसह सिंगल-स्टॅक प्रतिमा गोळा केल्या [उत्तेजन तरंगलांबी: ८९० nm; ५१२ nm ५१२ पिक्सेल]. कर्व्ह फिटिंगसाठी पुरेसे फोटॉन (एकूण १००० फोटॉन) गोळा केले जातील याची खात्री करण्यासाठी डिटेक्शन: अंतर्गत HyD, फ्लुरोसीन आयसोथायोसायनेट (FITC) फिल्टर गट] आणि २ ते ३ मिनिटांच्या आत इमेज ॲव्हरेजिंगचा वापर केला जातो. Grx1-roGFP2 प्रोबची संवेदनशीलता आणि FLIM परिस्थितीची पडताळणी, परफ्यूजन ACSF मध्ये बाहेरून १० mM H2O2 (ऑक्सिडेशन कमाल करण्यासाठी, ज्यामुळे आयुर्मान वाढते) टाकल्यावर आणि नंतर २ mM डायथियोथ्रिटॉल (रिडक्शनची पातळी कमी करण्यासाठी, ज्यामुळे आयुर्मान कमी होते) टाकल्यावर roGFP2 च्या आयुर्मान मूल्याचे निरीक्षण करून करण्यात आली (आकृती S8, D ते G). मिळालेल्या परिणामांचे विश्लेषण करण्यासाठी FLIMfit 5.1.1 सॉफ्टवेअर वापरा, संपूर्ण प्रतिमेचा एकल घातांकीय क्षय वक्र मोजलेल्या IRF (इन्स्ट्रुमेंट रिस्पॉन्स फंक्शन) शी जुळवा आणि χ² चे मूल्य अंदाजे १ आहे. एका PN चे आयुर्मान मोजण्यासाठी, नर्व्ह बॉडीभोवतीचा मास्क हाताने काढण्यात आला आणि प्रत्येक मास्कमधील सरासरी आयुर्मानाचा वापर परिमाणीकरणासाठी करण्यात आला.
मायटोकाँड्रियल पोटेन्शिअल विश्लेषण. तीव्र सेक्शनला परफ्यूज्ड ACSF मध्ये थेट 100 nM TMRM घालून 30 मिनिटे इनक्यूबेट केल्यानंतर, PNs च्या मायटोकाँड्रियल पोटेन्शिअलमधील बदल टू-फोटॉन मायक्रोस्कोपद्वारे मोजण्यात आले. TMRM इमेजिंग 920 nm वर प्रोबला उत्तेजित करून आणि सिग्नल गोळा करण्यासाठी अंतर्गत HyD (टेट्रामेथिलरोडामाइन आयसोथायोसायनेट: 585/40 nm) वापरून; आणि mtYFP चे इमेजिंग करण्यासाठी त्याच उत्तेजन तरंगलांबीचा वापर करून परंतु वेगळ्या अंतर्गत HyD (FITC: 525/50) चा वापर करून केले गेले. एकल पेशी स्तरावर मायटोकाँड्रियल पोटेन्शिअलचे मूल्यांकन करण्यासाठी ImageJ चे इमेज कॅल्क्युलेटर प्लग-इन वापरा. ​​थोडक्यात, संबंधित चॅनेलच्या सिंगल-स्टॅक कॉन्फोकल इमेजमध्ये पर्किंजे सोमालीमध्ये TMRM सिग्नल दर्शवणारा मायटोकाँड्रियल प्रदेश ओळखण्यासाठी प्लग-इन समीकरण: signal = min (mtYFP, TMRM) वापरले जाते. त्यानंतर परिणामी मास्कमधील पिक्सेल क्षेत्राचे परिमाणीकरण केले जाते, आणि नंतर मायटोकाँड्रियल क्षमता दर्शवणारा मायटोकाँड्रियल अंश मिळवण्यासाठी mtYFP चॅनेलच्या संबंधित थ्रेशोल्ड सिंगल-स्टॅक प्रतिमेवर त्याचे सामान्यीकरण केले जाते.
ह्युजेन्स प्रो (सायंटिफिक व्हॉल्यूम इमेजिंग) सॉफ्टवेअर वापरून प्रतिमेचे डीकन्व्होल्यूशन करण्यात आले. टाइल्सच्या स्कॅन केलेल्या चित्रांसाठी, LAS-X सॉफ्टवेअरने दिलेल्या ऑटोमॅटिक स्टिचिंग अल्गोरिदमचा वापर करून एका टाइलचा मॉन्टेज तयार केला जातो. इमेज कॅलिब्रेशननंतर, प्रतिमेवर पुढील प्रक्रिया करण्यासाठी आणि ब्राइटनेस व कॉन्ट्रास्ट एकसमानपणे समायोजित करण्यासाठी इमेजजे (ImageJ) आणि ॲडोबी फोटोशॉप (Adobe Photoshop) वापरा. ​​ग्राफिक्सच्या तयारीसाठी ॲडोबी इलस्ट्रेटर (Adobe Illustrator) वापरा.
एमटीडीएनए केंद्रित विश्लेषण. डीएनए विरुद्ध अँटीबॉडीजने लेबल केलेल्या सेरेबेलर सेक्शन्सवर कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपद्वारे एमटीडीएनएच्या विकृतींची संख्या मोजण्यात आली. प्रत्येक पेशीच्या पेशीदेह आणि केंद्रकासाठी एक लक्ष्य क्षेत्र तयार केले गेले आणि मल्टी मेजर प्लग-इन (इमेजजे सॉफ्टवेअर) वापरून संबंधित क्षेत्रफळाची गणना करण्यात आली. पेशीदेहाच्या क्षेत्रफळातून केंद्रकाचे क्षेत्रफळ वजा करून सायटोप्लाझमिक क्षेत्रफळ मिळवण्यात आले. शेवटी, थ्रेशोल्ड इमेजवरील एमटीडीएनए दर्शविणाऱ्या सायटोप्लाझमिक डीएनए पॉइंट्सची स्वयंचलितपणे संख्या निश्चित करण्यासाठी ॲनालाइज पार्टिकल्स प्लग-इन (इमेजजे सॉफ्टवेअर) वापरण्यात आले आणि मिळालेले परिणाम सीटीआरएल उंदरांच्या पीएन सरासरीनुसार सामान्यीकृत करण्यात आले. हे परिणाम प्रति पेशी न्यूक्लियोसाइड्सच्या सरासरी संख्येच्या स्वरूपात व्यक्त केले आहेत.
प्रथिन अभिव्यक्ती विश्लेषण. एकल पेशी स्तरावर PN मधील प्रथिन अभिव्यक्तीचे मूल्यांकन करण्यासाठी ImageJ चे इमेज कॅल्क्युलेटर प्लग-इन वापरा. ​​थोडक्यात, संबंधित चॅनेलच्या सिंगल-लेयर कॉन्फोकल प्रतिमेमध्ये, 'signal = min (mtYFP, antibody)' या समीकरणाद्वारे, पुरकिनामध्ये एका विशिष्ट अँटीबॉडीला इम्युनोरिॲक्टिव्हिटी दर्शवणारा मायटोकाँड्रियल प्रदेश ओळखला जातो. त्यानंतर परिणामी मास्कमधील पिक्सेल क्षेत्राचे परिमाणीकरण केले जाते, आणि नंतर प्रदर्शित प्रथिनाचा मायटोकाँड्रियल अंश मिळवण्यासाठी mtYFP चॅनेलच्या संबंधित थ्रेशोल्ड सिंगल-स्टॅक प्रतिमेवर त्याचे सामान्यीकरण केले जाते.
पर्किंजे पेशी घनता विश्लेषण. मोजलेल्या पर्किंजे पेशींच्या संख्येला, त्या पेशींनी व्यापलेल्या सेरेबेलर रिंगच्या लांबीने भागून पर्किंजे घनतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी ImageJ च्या सेल काउंटर प्लग-इनचा वापर करण्यात आला.
नमुना तयार करणे आणि गोळा करणे. नियंत्रण गट आणि Mfn2cKO उंदरांचे मेंदू 0.1 M फॉस्फेट बफर (PB) मधील 2% PFA/2.5% ग्लुटाराल्डिहाइडमध्ये स्थिर (fix) करण्यात आले, आणि नंतर सिलिएट्स (Leica Mikrosysteme GmbH, व्हिएन्ना, ऑस्ट्रिया) वापरून कोरोनल सेक्शन्स (जाडी 50 ते 60 μm) तयार करण्यात आले. त्यानंतर ते खोलीच्या तापमानावर 1 तासासाठी 1% ओएस टेट्राऑक्साइड आणि 1.5% पोटॅशियम फेरोसायनाइड असलेल्या PB बफरमध्ये स्थिर करण्यात आले. हे सेक्शन्स डिस्टिल्ड वॉटरने तीन वेळा धुतले गेले, आणि नंतर 20 मिनिटांसाठी 1% युरॅनिल ॲसिटेट असलेल्या 70% इथेनॉलने रंगवले गेले. त्यानंतर हे सेक्शन्स श्रेणीबद्ध अल्कोहोलमध्ये निर्जलित (dehydrated) केले गेले आणि सिलिकॉन-कोटेड काचेच्या स्लाईड्समध्ये डरक्युपॅन एसीएम (अराल्डाइट कास्टिंग रेझिन एम) इपॉक्सी रेझिन (इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी सायन्सेस, कॅटलॉग क्रमांक 14040) मध्ये एम्बेड (embedded) केले गेले, आणि शेवटी ओव्हनमध्ये 60°C तापमानावर 48 तासांसाठी पॉलिमराइझ (polymerize) केले गेले. सेरेब्रल कॉर्टेक्सचा भाग निवडण्यात आला आणि लायका अल्ट्राकट (लायका मायक्रोसिस्टेम जीएमबीएच, व्हिएन्ना, ऑस्ट्रिया) वर ५० एनएमचे अतिसूक्ष्म छेद कापण्यात आले व ते पॉलिस्टीरिन फिल्मने लेपित केलेल्या २×१ मिमी तांब्याच्या स्लिट ग्रिडवर ठेवण्यात आले. हे छेद पाण्यात (H2O) असलेल्या ४% युरॅनिल ॲसिटेटच्या द्रावणाने १० मिनिटांसाठी रंगवण्यात आले, पाण्याने अनेक वेळा धुतले गेले, त्यानंतर पाण्यात (H2O) असलेल्या रेनॉल्ड्स लेड सायट्रेटने १० मिनिटांसाठी रंगवले गेले आणि पुन्हा पाण्याने अनेक वेळा धुतले गेले. फिलिप्स सीएम१०० (थर्मो फिशर सायंटिफिक, वॉल्थम, एमए, यूएसए) या ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपद्वारे टीव्हीआयपीएस (टिट्झ व्हिडिओ अँड इमेज प्रोसेसिंग सिस्टीम) टेमकॅम-एफ४१६ डिजिटल कॅमेरा (टीव्हीआयपीएस जीएमबीएच, गौटिंग, यूएसए, जर्मनी) वापरून मायक्रोग्राफ्स घेण्यात आले.
AAV ने संक्रमित केलेल्या उंदरांमध्ये, मेंदू वेगळा करून त्याचे १ मिमी जाडीचे सॅजिट्ल सेक्शन कापण्यात आले आणि AAV-संक्रमित रिंग (म्हणजेच, mCherry व्यक्त करणारी) ओळखण्यासाठी सेरेबेलमची तपासणी फ्लुरोसेन्स मायक्रोस्कोप वापरून करण्यात आली. केवळ तेच प्रयोग वापरले जातात ज्यात AAV इंजेक्शनमुळे किमान दोन सलग सेरेबेलर रिंग्समधील पर्किंजे पेशींच्या थरात (म्हणजेच जवळजवळ संपूर्ण थरात) अत्यंत उच्च ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता दिसून येते. AAV-ट्रान्सड्यूस्ड लूपचे मायक्रोडिसेक्शन करून रात्रभर पोस्ट-फिक्सेशन (०.१ M कोकोएट बफरमध्ये ४% PFA आणि २.५% ग्लुटाराल्डिहाइड) करण्यात आले आणि त्यावर पुढील प्रक्रिया करण्यात आली. EPON एम्बेडिंगसाठी, फिक्स्ड टिश्यू ०.१ M सोडियम कोकोएट बफरने (ॲप्लिकेम) धुतला गेला आणि ०.१ M सोडियम कोकोएट बफरमध्ये (ॲप्लिकेम) २% OsO4 (os, सायन्स सर्व्हिसेस; कॅको) सह ४ तास इनक्युबेट करण्यात आला, त्यानंतर २ तासांसाठी धुतला गेला. ही प्रक्रिया ०.१ M कोकामाइड बफरने ३ वेळा पुनरावृत्त करण्यात आली. त्यानंतर, ऊती निर्जलित करण्यासाठी इथेनॉलच्या चढत्या क्रमानुसार प्रत्येक इथेनॉल द्रावणात ४°C तापमानावर १५ मिनिटे उबवण्यात आले. ऊती प्रोपिलीन ऑक्साईडमध्ये स्थानांतरित करून EPON (सिग्मा-अल्ड्रिच) मध्ये ४°C तापमानावर रात्रभर उबवण्यात आली. ऊती खोलीच्या तापमानावर ताज्या EPON मध्ये २ तास ठेवा आणि नंतर ६२°C तापमानावर ७२ तासांसाठी एम्बेड करा. ७० nm चे अतिसूक्ष्म छेद कापण्यासाठी अल्ट्रामायक्रोटोम (लायका मायक्रोसिस्टम्स, UC6) आणि डायमंड नाईफ (डायटोम, बील, स्वित्झर्लंड) वापरा, आणि ३७°C तापमानावर १५ मिनिटांसाठी १.५% युरॅनिल ॲसिटेटने रंगवा, आणि ४ मिनिटांसाठी लेड सायट्रेट द्रावणाने रंगवा. इलेक्ट्रॉन मायक्रोग्राफ कॅमेरा वनव्ह्यू ४के १६-बिट (गॅटन) आणि डिजिटलमायक्रोग्राफ सॉफ्टवेअर (गॅटन) ने सुसज्ज असलेल्या JEM-2100 प्लस ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (जेईओएल) चा वापर करून घेण्यात आले. विश्लेषणासाठी, 5000× किंवा 10,000× डिजिटल झूम वापरून इलेक्ट्रॉन मायक्रोग्राफ मिळवण्यात आले.
मायटोकाँड्रियाचे आकारशास्त्रीय विश्लेषण. सर्व विश्लेषणांसाठी, इमेजजे (ImageJ) सॉफ्टवेअर वापरून डिजिटल प्रतिमांमध्ये प्रत्येक मायटोकाँड्रियाची बाह्यरेखा हाताने रेखाटण्यात आली. विविध आकारशास्त्रीय मापदंडांचे विश्लेषण केले जाते. मायटोकाँड्रियल घनता ही टक्केवारीमध्ये व्यक्त केली जाते, जी प्रत्येक पेशीच्या एकूण मायटोकाँड्रियल क्षेत्रफळाला पेशीद्रव्याच्या क्षेत्रफळाने (पेशीद्रव्य क्षेत्रफळ = पेशी क्षेत्रफळ - पेशी केंद्रक क्षेत्रफळ) भागून १०० ने गुणून मिळते. मायटोकाँड्रियाचा गोलाकारपणा [४π∙(क्षेत्रफळ/परिघ²)] या सूत्राने मोजला जातो. मायटोकाँड्रियाच्या आकारशास्त्राचे विश्लेषण करून, त्यांच्या मुख्य आकारांनुसार (“नळीच्या आकाराचे” आणि “फोडाच्या आकाराचे”) अशा दोन श्रेणींमध्ये विभागणी करण्यात आली.
ऑटोफॅगोसोम/लायसोसोम संख्या आणि घनता विश्लेषण. डिजिटल प्रतिमेमध्ये प्रत्येक ऑटोफॅगोसोम/लायसोसोमच्या बाह्यरेषा हाताने आखण्यासाठी इमेजजे (ImageJ) सॉफ्टवेअर वापरा. ​​ऑटोफॅगोसोम/लायसोसोमचे क्षेत्रफळ टक्केवारीत व्यक्त केले जाते, जे प्रत्येक पेशीच्या एकूण ऑटोफॅगोसोम/लायसोसोम संरचनेच्या क्षेत्रफळाला पेशीद्रव्याच्या क्षेत्रफळाने (पेशीद्रव्याचे क्षेत्रफळ = पेशीचे क्षेत्रफळ - केंद्रकाचे क्षेत्रफळ) भागून आणि त्याला १०० ने गुणून मोजले जाते. ऑटोफॅगोसोम/लायसोसोमची घनता एकूण संख्येला प्रति पेशी ऑटोफॅगोसोम/लायसोसोम संरचनांच्या संख्येने (पेशीद्रव्याच्या क्षेत्रफळाच्या संदर्भात) भागून मोजली जाते (पेशीद्रव्याचे क्षेत्रफळ = पेशीचे क्षेत्रफळ - केंद्रकाचे क्षेत्रफळ).
तीव्र छेदन आणि नमुना तयार करण्यासाठी लेबलिंग. ज्या प्रयोगांमध्ये ग्लुकोज लेबलिंगची आवश्यकता असते, त्यासाठी मेंदूचे तीव्र स्लाइस एका प्री-इन्क्युबेशन चेंबरमध्ये स्थानांतरित करा, ज्यामध्ये संतृप्त कार्बन (95% O2 आणि 5% CO2), उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM d-ग्लुकोज, 1.0 mM CaCl 2 आणि 2.0 mM MgCl 2, pH 7.4 आणि 310 ते 320 mOsm वर समायोजित) असते, ज्यामध्ये ग्लुकोज 13 C 6- ग्लुकोज सब्स्टिट्यूशन (युरिसोटॉप, कॅटलॉग क्रमांक CLM-1396) असते. पायरुवेट लेबलिंगची आवश्यकता असलेल्या प्रयोगांसाठी, मेंदूचे ताजे तुकडे (अक्यूट ब्रेन स्लाइसेस) उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लुकोज, 1.0 mM CaCl2 आणि 2.0mM MgCl2 घालून, pH 7.4 आणि 310 ते 320mOsm वर समायोजित करा) मध्ये स्थानांतरित करा आणि 1mM 1-[1-13C]पायरुवेट (युरिसोटॉप, कॅटलॉग क्रमांक CLM-1082) घाला. हे तुकडे 37°C तापमानावर 90 मिनिटांसाठी इनक्युबेट करा. प्रयोगाच्या शेवटी, हे तुकडे 75 mM अमोनियम कार्बोनेट असलेल्या जलीय द्रावणाने (pH 7.4) पटकन धुतले गेले आणि नंतर 40:40:20 (v:v:v) ॲसिटोनायट्राइल (ACN): मिथेनॉल: पाणी या द्रावणात एकजीव (होमोजिनाइज) केले गेले. सेक्शन्सना ३० मिनिटे बर्फावर ठेवल्यानंतर, नमुन्यांना ४°C तापमानावर १० मिनिटांसाठी २१,००० g वेगाने सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले आणि स्वच्छ सुपरनॅटंटला स्पीडव्हॅक कॉन्सेंट्रेटरमध्ये सुकवण्यात आले. परिणामी मिळालेला सुकवलेला मेटाबोलाइट पेलेट विश्लेषणापर्यंत -८०°C तापमानावर साठवून ठेवण्यात आला.
१३ C-लेबल केलेल्या अमिनो ॲसिडचे लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण. लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) विश्लेषणासाठी, मेटाबोलाइट पेलेट ७५μl LC-MS ग्रेड पाण्यात (हनीवेल) पुन्हा विरघळवण्यात आले. ४°C तापमानावर ५ मिनिटांसाठी २१,००० g वर सेंट्रीफ्यूगेशन केल्यानंतर, स्पष्ट केलेल्या सुपरनॅटंटपैकी २० μl अमिनो ॲसिड फ्लक्स विश्लेषणासाठी वापरण्यात आले, तर उर्वरित अर्क लगेचच ॲनायन विश्लेषणासाठी वापरण्यात आला (खाली पहा). अमिनो ॲसिड विश्लेषण पूर्वी वर्णन केलेल्या बेंझॉयल क्लोराईड डेरिव्हटायझेशन प्रोटोकॉलचा (५५, ५६) वापर करून करण्यात आले. पहिल्या टप्प्यात, २०μl मेटाबोलाइट अर्कामध्ये १०० mM सोडियम कार्बोनेटचे (सिग्मा-अल्ड्रिच) १०μl टाकण्यात आले, आणि नंतर LC ग्रेड ACN मध्ये २% बेंझॉयल क्लोराईडचे (सिग्मा-अल्ड्रिच) १०μl टाकण्यात आले. नमुना थोडक्यात व्हॉर्टेक्स करण्यात आला आणि नंतर २०°C तापमानावर ५ मिनिटांसाठी २१,००० g वर सेंट्रीफ्यूज करण्यात आला. स्वच्छ केलेला सुपरनॅटंट (वरचा द्रव) शंकूच्या आकाराच्या काचेच्या इन्सर्टसह (२०० μl आकारमान) २ मिलीच्या ऑटोसेम्पलर व्हायलमध्ये स्थानांतरित करा. नमुन्यांचे विश्लेषण Q-Exactive (QE)-HF (अल्ट्रा हाय फील्ड ऑर्बिट्रॅप) हाय-रिझोल्यूशन प्रिसिजन मास स्पेक्ट्रोमीटरला (थर्मो फिशर सायंटिफिक) जोडलेल्या Acquity iClass अल्ट्रा-हाय परफॉर्मन्स LC सिस्टीमचा (वॉटर्स) वापर करून करण्यात आले. विश्लेषणासाठी, डेरिव्हेटाइज्ड नमुन्याचे २μl, १.८μm कण असलेल्या १००×१.० मिमी हाय-स्ट्रेंथ सिलिका T3 कॉलममध्ये (वॉटर्स) इंजेक्ट करण्यात आले. प्रवाहाचा दर १००μl/मिनिट आहे, आणि बफर सिस्टीममध्ये बफर A (पाण्यामध्ये १० mM अमोनियम फॉर्मेट आणि ०.१५% फॉर्मिक ऍसिड) आणि बफर B (ACN) यांचा समावेश आहे. ग्रेडियंट खालीलप्रमाणे आहे: 0 मिनिटांवर 0%B; 0%B. 0 ते 0.1 मिनिटांवर 0 ते 15% B; 0.1 ते 0.5 मिनिटांवर 15 ते 17% B; 0.5 ते 14 मिनिटांवर 17 ते 55% B; 14 ते 14.5 मिनिटांवर 55 ते 70% B; 18 मिनिटांवर 14.5 ते 70 ते 100% B; 18 ते 19 मिनिटांवर 100% B; 19 ते 19.1 मिनिटांवर 100 ते 0% B; 19.1 ते 28 मिनिटांवर 0% B (55, 56). QE-HF मास स्पेक्ट्रोमीटर पॉझिटिव्ह आयनीकरण मोडमध्ये m/z (मास/चार्ज गुणोत्तर) ५० ते ७५० च्या मास रेंजसह कार्य करतो. लागू केलेले रिझोल्यूशन ६०,००० आहे, आणि गेन कंट्रोल (AGC) द्वारे मिळवलेले आयन टार्गेट ३×१०⁶ आहे, आणि कमाल आयन वेळ १०० मिलिसेकंद आहे. हीटेड इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI) सोर्स ३.५ kV च्या स्प्रे व्होल्टेजवर, २५०°C च्या कॅपिलरी तापमानावर, ६० AU (आर्बिट्ररी युनिट्स) च्या शीथ एअरफ्लोवर आणि २० AU च्या ऑक्झिलरी एअरफ्लोवर कार्य करतो. S ​​लेन्स ६० AU वर सेट केलेली आहे.
१३C लेबल केलेल्या सेंद्रिय आम्लांचे ॲनायन क्रोमॅटोग्राफी-एमएस विश्लेषण. उर्वरित मेटाबोलाइट अवक्षेपाचे (५५μl) विश्लेषण QE-HF मास स्पेक्ट्रोमीटरला (थर्मो फिशर सायंटिफिक) जोडलेल्या डायोनेक्स आयन क्रोमॅटोग्राफी प्रणालीचा (ICS 5000+, थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापर करून करण्यात आले. थोडक्यात, ५μl मेटाबोलाइट अर्क HPLC ने सुसज्ज असलेल्या डायोनेक्स आयनपॅक AS11-HC कॉलममध्ये (२ मिमी × २५० मिमी, कणांचा आकार ४μm, थर्मो फिशर सायंटिफिक) १:१ च्या फिलिंग रेशिओसह पुश-इन पार्शियल लूप मोडमध्ये इंजेक्ट करण्यात आला. सोबत डायोनेक्स आयनपॅक AG11-HC गार्ड कॉलम (२ मिमी x ५० मिमी, ४μm, थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरण्यात आला. कॉलमचे तापमान ३०°C वर राखले जाते आणि ऑटोसेम्पलर ६°C वर सेट केला जातो. एल्युएंट जनरेटरद्वारे पोटॅशियम हायड्रॉक्साईड ग्रेडियंट तयार करण्यासाठी डीआयनाइज्ड पाण्याने युक्त पोटॅशियम हायड्रॉक्साईड कार्ट्रिजचा वापर करा. 380μl/min च्या प्रवाह दराने, खालील ग्रेडियंट वापरून मेटाबोलाइट्सचे विलगीकरण केले: 0 ते 3 मिनिटे, 10 mM KOH; 3 ते 12 मिनिटे, 10 ते 50 mM KOH; 12 ते 19 मिनिटे, 50 ते 100 mM KOH; 19 ते 21 मिनिटे, 100 mM KOH; 21 ते 21.5 मिनिटे, 100 ते 10 mM KOH. कॉलमला 8.5 मिनिटांसाठी 10 mM KOH च्या वातावरणात पुन्हा संतुलित करण्यात आले.
स्तंभातून बाहेर पडलेले मेटाबोलाइट्स स्तंभा नंतर १५०μl/मिनिट आयसोप्रोपेनॉल पूरक प्रवाहासह एकत्र केले जातात आणि नंतर नकारात्मक आयनीकरण मोडमध्ये कार्यरत असलेल्या उच्च-रिझोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटरकडे निर्देशित केले जातात. एमएस (MS) ६०,००० च्या रिझोल्यूशनसह m/z ५० ते ७५० पर्यंतच्या मास रेंजचे निरीक्षण करत आहे. एजीसी (AGC) १×१०⁶ वर सेट केले आहे आणि कमाल आयन वेळ १०० ms ठेवला आहे. हीटेड ईएसआय (ESI) स्रोत ३.५ kV च्या स्प्रे व्होल्टेजवर चालवला गेला. आयन स्रोताची इतर सेटिंग्ज खालीलप्रमाणे आहेत: केशिका तापमान २७५°C; शीथ गॅस प्रवाह, ६० AU; सहाय्यक गॅस प्रवाह, ३००°C वर २० AU, आणि एस लेन्स सेटिंग ६० AU वर.
१३C लेबल केलेल्या मेटाबोलाइट्सच्या डेटाचे विश्लेषण. आयसोटोप गुणोत्तराच्या डेटा विश्लेषणासाठी ट्रेसफाइंडर सॉफ्टवेअर (आवृत्ती ४.२, थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरा. ​​प्रत्येक संयुगाची ओळख एका विश्वसनीय संदर्भ संयुगाद्वारे सत्यापित केली गेली आणि स्वतंत्रपणे विश्लेषण केले गेले. आयसोटोप संवर्धन विश्लेषण करण्यासाठी, प्रत्येक १३C आयसोटोप (Mn) च्या एक्सट्रॅक्टेड आयन क्रोमॅटोग्राम (XIC) चे क्षेत्रफळ [M + H]+ मधून काढले गेले, जिथे n हे लक्ष्य संयुगाचे कार्बन संख्या आहे, जे अमिनो ॲसिडचे विश्लेषण करण्यासाठी वापरले जाते किंवा [MH]+ ॲनायनचे विश्लेषण करण्यासाठी वापरले जाते. XIC ची वस्तुमान अचूकता पाच पार्ट्स पर मिलियन पेक्षा कमी आहे आणि RT ची अचूकता ०.०५ मिनिटे आहे. संवर्धन विश्लेषण हे प्रत्येक शोधलेल्या आयसोटोपचे संबंधित संयुगाच्या सर्व आयसोटोपच्या बेरजेशी गुणोत्तर काढून केले जाते. ही गुणोत्तरे प्रत्येक आयसोटोपसाठी टक्केवारी मूल्यांमध्ये दिली जातात आणि परिणाम मोलर टक्केवारी संवर्धन (MPE) म्हणून व्यक्त केले जातात, जसे पूर्वी वर्णन केले आहे (४२).
गोठवलेल्या न्यूरॉन पेलेटला बर्फासारख्या थंड ८०% मिथेनॉलमध्ये (v/v) एकजीव करून, व्हॉर्टेक्स केले आणि -२०°C तापमानावर ३० मिनिटांसाठी उबवले. नमुना पुन्हा व्हॉर्टेक्स करा आणि +४°C तापमानावर ३० मिनिटांसाठी ढवळा. नमुना ४°C तापमानावर २१,००० g वेगाने ५ मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज करण्यात आला, आणि नंतर मिळालेला सुपरनॅटंट गोळा करून पुढील विश्लेषणासाठी २५°C तापमानावर स्पीडव्हॅक कॉन्सेंट्रेटर वापरून वाळवण्यात आला. वर वर्णन केल्याप्रमाणे, वेगळ्या केलेल्या पेशींमधील अमिनो ॲसिडवर LC-MS विश्लेषण करण्यात आले. ट्रेसफाइंडर (आवृत्ती ४.२, थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरून, प्रत्येक संयुगाच्या मोनोआयसोटोपिक वस्तुमानाचा वापर करून डेटा विश्लेषण करण्यात आले. मेटाबोलाइट डेटाचे क्वान्टाइल नॉर्मलायझेशन प्रीप्रोसेसकोर सॉफ्टवेअर पॅकेज (५७) वापरून करण्यात आले.
स्लाइसची तयारी. उंदराला कार्बन डायऑक्साइड देऊन त्वरित भूल देण्यात आली आणि त्याचे शिरच्छेद करण्यात आले, कवटीतून मेंदू त्वरित बाहेर काढण्यात आला, आणि बर्फाने भरलेल्या व्हायब्रेटिंग नाईफचा (HM-650 V, थर्मो फिशर सायंटिफिक, वाल्डॉर्फ, जर्मनी) वापर करून त्याचे ३०० ते ३७५ μm जाडीचे सॅजिट्ल सेक्शन्स कापण्यात आले. कोल्ड कार्बन गॅसिफिकेशन (९५% O2 आणि ५% CO2) कमी Ca2 + ACSF (१२५.० mM NaCl, २.५ mM KCl, १.२५ mM सोडियम फॉस्फेट बफर, २५.० mM NaHCO3, २५.० mM d-ग्लुकोज, १.० mM CaCl2 आणि ६.० mM MgCl2 pH ७.४ आणि ३१० ते ३३० mOsm वर समायोजित करा). मिळवलेले मेंदूचे तुकडे जास्त Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लुकोज, 4.0 mM CaCl2 आणि 3.5 mM MgCl2) pH 7.4 आणि 310 ते 320 mOsm) असलेल्या चेंबरमध्ये स्थानांतरित करा. रेकॉर्डिंग करण्यापूर्वी तुकडे पूर्ववत करता यावेत म्हणून ते 20 ते 30 मिनिटे साठवून ठेवा.
रेकॉर्डिंग. सर्व रेकॉर्डिंगसाठी, एका स्थिर रेकॉर्डिंग चेंबर आणि २०x वॉटर इमर्शन ऑब्जेक्टिव्ह लेन्स (सायंटिफिका) ने सुसज्ज असलेल्या मायक्रोस्कोप स्टेजचा वापर करण्यात आला. संभाव्य पर्किंजे पेशींची ओळख (i) शरीराचा आकार, (ii) सेरेबेलमचे शारीरिक स्थान, आणि (iii) फ्लोरोसेंट mtYFP रिपोर्टर जीनची अभिव्यक्ती यांवरून पटवण्यात आली. ५ ते ११ मेगाओहम टोकाचा प्रतिरोध असलेली पॅच पिपेट, बोरोसिलिकेट ग्लास कॅपिलरी (GB150-10, ०.८६ मिमी×१.५ मिमी×१०० मिमी, सायन्स प्रॉडक्ट्स, हॉफाइम, जर्मनी) आणि हॉरिझॉन्टल पिपेट इन्स्ट्रुमेंट्स (P-1000, सटर, नोव्हाटो, सीए) द्वारे बाहेर ओढली जाते. सर्व रेकॉर्डिंग ELC-03XS npi पॅच क्लॅम्प अँप्लिफायर (npi इलेक्ट्रॉनिक GmbH, टॅम, जर्मनी) द्वारे करण्यात आले, जे सिग्नल (आवृत्ती ६.०, केंब्रिज इलेक्ट्रॉनिक, केंब्रिज, यूके) सॉफ्टवेअरद्वारे नियंत्रित होते. प्रयोगाचे रेकॉर्डिंग १२.५ kHz च्या सॅम्पलिंग दराने करण्यात आले. सिग्नलला अनुक्रमे १.३ आणि १० kHz च्या कटऑफ फ्रिक्वेन्सी असलेल्या दोन शॉर्ट-पास बेसेल फिल्टर्सद्वारे फिल्टर केले जाते. अँम्प्लिफायर वापरणाऱ्या कॉम्पेन्सेशन सर्किटद्वारे मेम्ब्रेन आणि पिपेटच्या कपॅसिटन्सची भरपाई केली जाते. सर्व प्रयोग ओर्का-फ्लॅश ४.० कॅमेऱ्याच्या (हामामात्सु, गेर्डेन, जर्मनी) नियंत्रणाखाली करण्यात आले, जो होकावो सॉफ्टवेअर (आवृत्ती २.८, हामामात्सु, गेर्डेन, जर्मनी) द्वारे नियंत्रित होता.
नियमित संपूर्ण-पेशी संरचना आणि विश्लेषण. रेकॉर्डिंग करण्याच्या अगदी आधी, पिपेटमध्ये खालील पदार्थ असलेले अंतर्गत द्रावण भरा: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM पोटॅशियम ग्लुकोनेट, 10.0 mM हेपेस, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM ग्वानोसिन ट्रायफॉस्फेट (GTP) (Na) आणि 10.0 mM क्रिएटिनिन फॉस्फेट. हे द्रावण pH 7.25 वर समायोजित केले होते आणि परासरणी दाब 290 mOsm (सुक्रोज) होता. पडदा फाडण्यासाठी 0 pA चे बल लावल्यानंतर लगेचच, विश्राम पडदा विभवाचे (resting membrane potential) मापन केले गेले. -40, -30, -20, आणि -10 pA चे हायपरपोलराइज्ड प्रवाह लावून इनपुट रेझिस्टन्सचे मापन केले जाते. व्होल्टेज प्रतिसादाचे परिमाण मोजा आणि इनपुट रेझिस्टन्सची गणना करण्यासाठी ओहमच्या नियमाचा वापर करा. व्होल्टेज क्लॅम्पमध्ये ५ मिनिटांसाठी स्वयंस्फूर्त क्रियाकलाप नोंदवला गेला, आणि इगोर प्रो (आवृत्ती ३२ ७.०१, वेव्हमेट्रिक्स, लेक ओस्वेगो, ओरेगॉन, यूएसए) मध्ये एका अर्ध-स्वयंचलित ओळख स्क्रिप्टचा वापर करून sPSC ओळखला आणि मोजला गेला. बॅटरीला वेगवेगळ्या पोटेन्शिअल्सवर (-११० mV पासून सुरू) क्लॅम्प करून आणि व्होल्टेज ५ mV च्या टप्प्यांमध्ये वाढवून IV वक्र आणि स्थिर-स्थिती प्रवाह मोजले जातात. डीपोलरायझिंग प्रवाह लागू करून AP च्या निर्मितीची चाचणी केली गेली. डीपोलरायझिंग प्रवाहाचा पल्स लागू करताना सेलला -७० mV वर क्लॅम्प करा. प्रत्येक रेकॉर्डिंग युनिटची स्टेप साईज स्वतंत्रपणे समायोजित करा (१० ते ६० pA). सर्वाधिक AP वारंवारता निर्माण करणाऱ्या पल्स स्पाइक्सची मॅन्युअली गणना करून कमाल AP वारंवारतेची गणना करा. एक किंवा अधिक APs प्रथम ट्रिगर करणाऱ्या डीपोलरायझेशन पल्सच्या दुसऱ्या डेरिव्हेटिव्हचा वापर करून AP थ्रेशोल्डचे विश्लेषण केले जाते.
परफोरेटेड पॅचची रचना आणि विश्लेषण. प्रमाणित प्रोटोकॉल वापरून परफोरेटेड पॅच रेकॉर्डिंग करा. एटीपी- आणि जीटीपी-मुक्त पिपेट वापरा, ज्यामध्ये खालील घटक नसतील: 128 mM ग्लुकोनेट K, 10 mM KCl, 10 mM हेपेस, 0.1 mM EGTA आणि 2 mM MgCl2, आणि pH 7.2 वर समायोजित करा (KOH वापरून). पेशीपटलाची अनियंत्रित पारगम्यता टाळण्यासाठी इंट्रासेल्युलर द्रावणातून एटीपी आणि जीटीपी वगळले जातात. परफोरेटेड पॅचची नोंद घेण्यासाठी पॅच पिपेटमध्ये अँफोटेरिसिन असलेले अंतर्गत द्रावण (अंदाजे 200 ते 250 μg/ml; G4888, सिग्मा-अल्ड्रिच) भरले जाते. अँफोटेरिसिन डायमिथाइल सल्फॉक्साइडमध्ये विरघळवले होते (अंतिम सांद्रता: 0.1 ते 0.3%; DMSO; D8418, सिग्मा-अल्ड्रिच). वापरलेल्या DMSO च्या सांद्रतेचा अभ्यास केलेल्या न्यूरॉन्सवर कोणताही महत्त्वपूर्ण परिणाम झाला नाही. पंचिंग प्रक्रियेदरम्यान, चॅनल रेझिस्टन्स (Ra) चे सतत निरीक्षण केले गेले आणि Ra व AP ची अॅम्प्लिट्यूड स्थिर झाल्यावर (२०-४० मिनिटांनी) प्रयोग सुरू करण्यात आला. स्वयंस्फूर्त क्रियाकलाप व्होल्टेज आणि/किंवा करंट क्लॅम्पमध्ये २ ते ५ मिनिटांसाठी मोजला जातो. डेटाचे विश्लेषण इगोर प्रो (आवृत्ती ७.०५.२, वेव्हमेट्रिक्स, यूएसए), एक्सेल (आवृत्ती २०१०, मायक्रोसॉफ्ट कॉर्पोरेशन, रेडमंड, यूएसए) आणि ग्राफपॅड प्रिझम (आवृत्ती ८.१.२, ग्राफपॅड सॉफ्टवेअर इंक., ला जोला, सीए, युनायटेड स्टेट्स) वापरून केले गेले. स्वयंस्फूर्त APs ओळखण्यासाठी, इगोरप्रोचे न्यूरोमॅटिक v3.0c प्लग-इन वापरले जाते. प्रत्येक रेकॉर्डसाठी स्वतंत्रपणे समायोजित केलेल्या दिलेल्या थ्रेशोल्डचा वापर करून APs स्वयंचलितपणे ओळखले जातात. स्पाइक इंटरव्हलचा वापर करून, कमाल इन्स्टंटेनियस स्पाइक फ्रिक्वेन्सी आणि सरासरी स्पाइक फ्रिक्वेन्सीसह स्पाइक फ्रिक्वेन्सी निश्चित केली जाते.
पीएन विलगीकरण. पूर्वी प्रकाशित केलेल्या प्रोटोकॉलमध्ये बदल करून, एका विशिष्ट टप्प्यावर उंदराच्या सेरेबेलममधून पीएन शुद्ध केले गेले (58). थोडक्यात, सेरेबेलमचे विच्छेदन करून बर्फासारख्या थंड डिसोसिएशन माध्यमात [HBSS Ca2+ आणि Mg2+ शिवाय, 20 mM ग्लुकोज, पेनिसिलीन (50 U/ml) आणि स्ट्रेप्टोमायसिन (0.05 mg/ml) सह] बारीक तुकडे केले गेले, आणि नंतर पॅपेनमध्ये माध्यमाचे पचन केले गेले [HBSS, 1-सिस्टीन·HCl (1 mg/ml), पॅपेन (16 U/ml) आणि डीऑक्सीरिबोन्यूक्लिएज I (DNase I; 0.1 mg/ml) सह]. 30°C वर 30 मिनिटांसाठी प्रक्रिया केली. प्रथम, एन्झायमॅटिक पचन टाळण्यासाठी ऊतींना खोलीच्या तापमानावर अंड्याच्या श्लेष्मा (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) आणि DNase (0.1 mg/ml) असलेल्या HBSS माध्यमात धुवा, आणि नंतर 20 mM ग्लुकोज असलेल्या HBSS माध्यमात हळुवारपणे दळून, पेनिसिलीन (50 U/ml), स्ट्रेप्टोमायसिन (0.05 mg/ml) आणि DNase (0.1 mg/ml) वापरून एकल पेशी वेगळ्या करा. परिणामी मिळालेले पेशींचे निलंबन 70μm पेशी गाळणीतून गाळण्यात आले, नंतर पेशींना केंद्रापसारण (1110 rpm, 5 मिनिटे, 4°C) करून गोळा करण्यात आले आणि वर्गीकरण माध्यमात [HBSS, 20 mM ग्लुकोज, 20% भ्रूण गोवंश सीरम, पेनिसिलीन (50 U/ml) आणि स्ट्रेप्टोमायसिन (0.05 mg/ml) सह] पुन्हा निलंबित करण्यात आले; प्रोपिडियम आयोडाइड वापरून पेशींची जीवनक्षमता तपासा आणि पेशींची घनता 1×10⁶ ते 2×10⁶ पेशी/मिली पर्यंत समायोजित करा. फ्लो सायटोमेट्री करण्यापूर्वी, हे द्रावण 50 μm च्या पेशी गाळणीतून गाळण्यात आले.
फ्लो सायटोमीटर. FACSAria III मशीन (BD बायोसायन्सेस) आणि FACSDiva सॉफ्टवेअर (BD बायोसायन्सेस, आवृत्ती 8.0.1) वापरून 4°C तापमानावर पेशींचे वर्गीकरण (सेल सॉर्टिंग) करण्यात आले. पेशींचे निलंबन (सेल सस्पेंशन) 100 μm नोजल वापरून 20 psi दाबाखाली ~2800 इव्हेंट्स/सेकंद या दराने वर्गीकृत (सॉर्ट) करण्यात आले. पारंपारिक गेटिंग निकष (पेशींचा आकार, बायमोडल डिस्क्रिमिनेशन आणि स्कॅटरिंग वैशिष्ट्ये) PN ला इतर पेशी प्रकारांपासून अचूकपणे वेगळे करण्याची खात्री देऊ शकत नसल्यामुळे, mitoYFP+ ​​आणि नियंत्रण mitoYFP − उंदरांमधील YFP तीव्रता आणि ऑटोफ्लुरोसेन्सच्या थेट तुलनेच्या आधारावर गेटिंग स्ट्रॅटेजी निश्चित केली जाते. नमुन्यावर 488 nm लेझर लाइनने किरणोत्सर्ग करून YFP उत्तेजित केले जाते आणि 530/30 nm बँड पास फिल्टर वापरून सिग्नल शोधला जातो. mitoYFP+ ​​उंदरांमध्ये, न्यूरॉनल बॉडी आणि ॲक्सॉनचे तुकडे वेगळे ओळखण्यासाठी Rosa26-mitoYFP रिपोर्टर जीनच्या सापेक्ष शक्तीचा देखील वापर केला जातो. मृत पेशी वगळण्यासाठी 7-AAD ला 561 nm पिवळ्या लेसरने उत्तेजित केले जाते आणि 675/20 nm बँडपास फिल्टरने शोधले जाते. त्याच वेळी ॲस्ट्रोसाइट्स वेगळे करण्यासाठी, पेशी निलंबनाला ACSA-2-APC ने रंगवले गेले, त्यानंतर नमुन्यावर 640 nm लेसर लाइनने किरणोत्सर्ग केला गेला आणि सिग्नल शोधण्यासाठी 660/20 nm बँडपास फिल्टर वापरला गेला.
गोळा केलेल्या पेशींना सेंट्रीफ्युगेशनद्वारे (१११० आरपीएम, ५ मिनिटे, ४°से) पेलेट बनवून वापरापर्यंत -८०°से तापमानावर साठवून ठेवण्यात आले. प्रक्रियेतील तफावत कमी करण्यासाठी Mfn2cKO उंदीर आणि त्यांच्या पिलांचे वर्गीकरण एकाच दिवशी केले जाते. FACS डेटाचे सादरीकरण आणि विश्लेषण फ्लोजो सॉफ्टवेअर (फ्लोजो एलएलसी, ॲशलँड, ओरेगॉन, यूएसए) वापरून केले गेले.
वर नमूद केल्याप्रमाणे (59), नंतरच्या mtDNA प्रमाणीकरणासाठी वेगळ्या केलेल्या न्यूरॉन्समधून DNA वेगळे करण्यासाठी रिअल-टाइम PCR चा वापर केला जातो. सुरुवातीला, वेगवेगळ्या संख्येच्या पेशींवर qPCR चालवून रेषीयता आणि थ्रेशोल्ड संवेदनशीलता तपासण्यात आली. थोडक्यात, 50 mM ट्रिस-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% ट्विन 20 आणि प्रोटीनेज K (200 ng/ml) असलेल्या लायसिस बफरमध्ये 300 PN गोळा करा आणि 55°C वर 120 मिनिटे उबवा. प्रोटीनेज K चे पूर्णपणे निष्क्रियीकरण सुनिश्चित करण्यासाठी पेशींना पुढे 95°C वर 10 मिनिटे उबवण्यात आले. mt-Nd1 साठी विशिष्ट असलेल्या TaqMan प्रोबचा (थर्मो फिशर) वापर करून, 7900HT रिअल-टाइम PCR प्रणालीमध्ये (थर्मो फिशर सायंटिफिक) सेमी-क्वांटिटेटिव्ह PCR द्वारे mtDNA मोजण्यात आले. सायन्स, कॅटलॉग क्रमांक Mm04225274_s1), mt-Nd6 (थर्मो फिशर सायंटिफिक, कॅटलॉग क्रमांक AIVI3E8) आणि 18S (थर्मो फिशर सायंटिफिक, कॅटलॉग क्रमांक Hs99999901_s1) जनुके.
प्रोटिओम नमुना तयार करणे. लायसिस बफरमध्ये [6 M ग्वानिडिन क्लोराईड, 10 mM ट्रिस(2-कार्बोक्सीइथिल) फॉस्फिन हायड्रोक्लोराईड, 10 mM क्लोरोएसिटामाइड आणि 100 mM ट्रिस-HCl मध्ये गोठवलेल्या न्यूरॉन पेलेट्सचे विघटन करण्यासाठी] द्रावण 95°C वर 10 मिनिटे गरम करून आणि सोनिकेट करून, बायोरप्टर (डायजेनोड) वर 10 मिनिटांसाठी (30 सेकंद पल्स / 30 सेकंद पॉज कालावधी) प्रक्रिया केली. नमुना 20 mM ट्रिस-HCl (pH 8.0) मध्ये 1:10 प्रमाणात विरल केला, 300 ng ट्रायप्सिन गोल्ड (प्रोमेगा) सोबत मिसळला आणि पूर्ण पचन होण्यासाठी 37°C वर रात्रभर इनक्युबेट केला. दुसऱ्या दिवशी, नमुना 20,000 g वर 20 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केला. सुपरनॅटंट 0.1% फॉर्मिक ऍसिडने विरल केला आणि द्रावणातील क्षार स्वतः तयार केलेल्या स्टेजटिप्सने काढून टाकले. नमुना स्पीडव्हॅक उपकरणामध्ये (एपेनडॉर्फ कॉन्सेंट्रेटर प्लस ५३०५) ४५°C तापमानावर सुकवण्यात आला, आणि नंतर पेप्टाइड ०.१% फॉर्मिक ॲसिडमध्ये निलंबित करण्यात आला. सर्व नमुने एकाच व्यक्तीद्वारे एकाच वेळी तयार करण्यात आले. ॲस्ट्रोसाइट नमुन्यांचे विश्लेषण करण्यासाठी, ४ μg क्षारविरहित पेप्टाइड्सना टँडम मास टॅग (TMT10plex, कॅटलॉग क्रमांक ९०११०, थर्मो फिशर सायंटिफिक) ने १:२० या पेप्टाइड ते TMT अभिकर्मक गुणोत्तराने लेबल करण्यात आले. TMT लेबलिंगसाठी, ०.८ mg TMT अभिकर्मक ७० μl निर्जल ACN मध्ये पुन्हा निलंबित करण्यात आला, आणि सुकवलेला पेप्टाइड ९ μl ०.१ M TEAB (ट्रायइथिलअमोनियम बायकार्बोनेट) मध्ये पुनर्गठित करण्यात आला, ज्यामध्ये ACN मधील ७ μl TMT अभिकर्मक टाकण्यात आला. सांद्रता ४३.७५% होती. ६० मिनिटांच्या इनक्युबेशननंतर, २ μl ५% हायड्रॉक्सिलॅमिन वापरून अभिक्रिया थांबवण्यात आली. लेबल केलेले पेप्टाइड्स गोळा करून, वाळवून, २०० μl ०.१% फॉर्मिक ॲसिड (FA) मध्ये पुन्हा विरघळवण्यात आले, त्याचे दोन भाग करण्यात आले आणि नंतर स्व-निर्मित स्टेजटिप्स वापरून त्यातील क्षार काढून टाकण्यात आले. अल्टिमेट ३००० अल्ट्रा हाय परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफ (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph) वापरून, दोन अर्ध्या भागांपैकी एकाचे १३०Å१.७μm C18 कणांनी भरलेल्या १ मिमी x १५० मिमी ॲक्विटी क्रोमॅटोग्राफिक कॉलमवर (वॉटर्स, कॅटलॉग क्र. SKU: १८६००६९३५. थर्मो फिशर सायंटिफिक) फ्रॅक्शनेशन करण्यात आले. ३०μl/मिनिटच्या प्रवाह दराने पेप्टाइड्स वेगळे करा, ८५ मिनिटांसाठी १% ते ५०% बफर B मध्ये ९६ मिनिटांच्या टप्प्याटप्प्याच्या ग्रेडियंटसह वेगळे करा, ३ मिनिटांसाठी ५०% ते ९५% बफर B मध्ये, नंतर ८ मिनिटांसाठी ९५% बफर B मध्ये; बफर A हे ५% ACN आणि १० mM अमोनियम बायकार्बोनेट (ABC) आहे, आणि बफर B हे ८०% ACN आणि १० mM ABC आहे. दर ३ मिनिटांनी फ्रॅक्शन्स गोळा करा आणि त्यांना दोन गटांमध्ये (१ + १७, २ + १८, इत्यादी) एकत्र करा आणि व्हॅक्यूम सेंट्रीफ्यूजमध्ये वाळवा.
एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण. मास स्पेक्ट्रोमेट्रीसाठी, पेप्टाइड्स (क्रमांक r119.aq) हे 1.9 μm रेप्रोसिल-प्यूर 120 C18-AQ माध्यम (डॉ. माईश, मॅट) असलेल्या 25 सेमी, 75 μm आतील व्यासाच्या पिकोफ्रिट ॲनालिटिकल कॉलमवर (नवीन ऑब्जेक्टिव्ह लेन्स, पार्ट क्रमांक PF7508250) वेगळे करण्यात आले. यासाठी इझी-एनएलसी 1200 (थर्मो फिशर सायंटिफिक, जर्मनी) वापरण्यात आले. कॉलमचे तापमान 50°C वर ठेवण्यात आले होते. बफर A आणि B हे अनुक्रमे पाण्यातील 0.1% फॉर्मिक ॲसिड आणि 80% ACN मधील 0.1% फॉर्मिक ॲसिड आहेत. पेप्टाइड्स 65 मिनिटांसाठी 6% ते 31% बफर B पर्यंत आणि 5 मिनिटांसाठी 31% ते 50% बफर B पर्यंत 200 nl/min च्या स्टेपवाइज ग्रेडियंटने वेगळे करण्यात आले. विलगित पेप्टाइड्सचे विश्लेषण ऑर्बिट्रॅप फ्युजन मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर सायंटिफिक) वर करण्यात आले. पेप्टाइड प्रीकर्सरचे m/z मापन 350 ते 1500 m/z च्या श्रेणीमध्ये 120,000 च्या रिझोल्यूशनसह केले जाते. 27% नॉर्मलाइज्ड कोलिजन एनर्जी वापरून, 2 ते 6 चार्ज स्टेट असलेला सर्वात मजबूत प्रीकर्सर हाय एनर्जी सी ट्रॅप डिसोसिएशन (HCD) क्लीव्हेजसाठी निवडला जातो. सायकल टाइम 1 सेकंदावर सेट केला जातो. पेप्टाइड फ्रॅगमेंटचे m/z मूल्य आयन ट्रॅपमध्ये 5×104 च्या सर्वात लहान AGC टार्गेट आणि 86 ms च्या कमाल इंजेक्शन टाइमचा वापर करून मोजले गेले. फ्रॅगमेंटेशननंतर, प्रीकर्सरला 45 सेकंदांसाठी डायनॅमिक एक्सक्लूजन लिस्टवर ठेवण्यात आले. TMT-लेबल केलेले पेप्टाइड्स 50 सेमी, 75 μm ॲक्लेम पेपमॅप कॉलमवर (थर्मो फिशर सायंटिफिक, कॅटलॉग क्रमांक 164942) वेगळे केले गेले आणि मायग्रेशन स्पेक्ट्राचे विश्लेषण ऑर्बिट्रॅप ल्युमोस ट्रायब्रिड मास स्पेक्ट्रोमीटरवर (थर्मो फिशर सायंटिफिक) केले गेले. हे स्पेक्ट्रोमीटर हाय-फिल्ड असिमेट्रिक वेव्हफॉर्म आयन्स (FAIMS) उपकरणाने (थर्मो फिशर सायंटिफिक) सुसज्ज असून ते −50 आणि −70 V या दोन कॉम्पेन्सेशन व्होल्टेजवर चालते. TMT रिपोर्ट आयन सिग्नल मोजण्यासाठी सिंक्रोनायझेशन प्रीकर्सरवर आधारित निवडलेले MS3 वापरले जाते. पेप्टाइडचे विलगीकरण EASY-nLC 1200 वर केले गेले, ज्यामध्ये 90% लिनियर ग्रेडियंट इल्युशन वापरले गेले आणि बफरची सांद्रता 6% ते 31% होती; बफर A मध्ये 0.1% FA होते आणि बफर B मध्ये 0.1% FA आणि 80% ACN होते. ॲनालिटिकल कॉलम 50°C तापमानावर चालवला जातो. FAIMS कॉम्पेन्सेशन व्होल्टेजनुसार मूळ फाईल विभाजित करण्यासाठी फ्रीस्टाईल (आवृत्ती 1.6, थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरा.
प्रथिनांची ओळख आणि परिमाणीकरण. एकात्मिक अँड्रोमेडा शोध इंजिन वापरून, मूळ डेटाचे विश्लेषण मॅक्सक्वांट आवृत्ती 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) वापरून करण्यात आले. एक्वेरिया व्हिक्टोरियापासून मिळवलेल्या क्रे रिकॉम्बिनेज आणि YFP अनुक्रमांव्यतिरिक्त, पेप्टाइड फ्रॅगमेंट स्पेक्ट्रामध्ये माऊस रेफरन्स प्रोटिओमच्या (प्रोटिओम आयडी UP000000589, मे 2017 मध्ये युनिप्रॉटवरून डाउनलोड केलेले) कॅनोनिकल अनुक्रम आणि आयसोफॉर्म अनुक्रमांचा शोध घेण्यात आला. मेथिओनाइन ऑक्सिडेशन आणि प्रथिन एन-टर्मिनल ॲसिटिलेशन हे परिवर्तनीय बदल म्हणून सेट केले गेले; सिस्टीन कार्बामॉयल मेथिलेशन हे स्थिर बदल म्हणून सेट केले गेले. पचन पॅरामीटर्स "विशिष्टता" आणि "ट्रिप्सिन/पी" वर सेट केले आहेत. प्रथिनांच्या ओळखीसाठी वापरल्या जाणाऱ्या पेप्टाइड्स आणि रेझर पेप्टाइड्सची किमान संख्या 1 आहे; अद्वितीय पेप्टाइड्सची किमान संख्या 0 आहे. पेप्टाइड मॅप जुळवणीच्या परिस्थितीत, प्रथिन ओळख दर 0.01 होता. “सेकंड पेप्टाइड” पर्याय सक्षम केला आहे. वेगवेगळ्या मूळ फाइल्समधील यशस्वी ओळख हस्तांतरित करण्यासाठी “मॅच बिटवीन रन्स” पर्याय वापरा. ​​लेबल-फ्री क्वांटिफिकेशन (LFQ) साठी LFQ किमान गुणोत्तर गणना 1 वापरा (60). LFQ तीव्रता प्रत्येक वेळी किमान एका जीनोटाइप गटामध्ये किमान दोन वैध मूल्यांसाठी फिल्टर केली जाते आणि .0.3 रुंदीच्या सामान्य वितरणातून .1.8 खाली जाऊन एक्सट्रापोलेट केली जाते. LFQ परिणामांचे विश्लेषण करण्यासाठी पर्सियस कम्प्युटिंग प्लॅटफॉर्म (https://maxquant.net/perseus/) आणि R (https://r-project.org/) वापरा. ​​भिन्न अभिव्यक्ती विश्लेषणासाठी लिम्मा सॉफ्टवेअर पॅकेजमधील टू-वे मॉडरेट टी टेस्ट वापरली गेली (61). ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally आणि pheatmap वापरून अन्वेषणात्मक डेटा विश्लेषण केले जाते. TMT-आधारित प्रोटिओमिक्स डेटाचे विश्लेषण मॅक्सक्वांट आवृत्ती 1.6.10.43 वापरून केले गेले. युनिप्रॉटच्या मानवी प्रोटिओमिक्स डेटाबेसमधून कच्चा प्रोटिओमिक्स डेटा शोधा, जो सप्टेंबर २०१८ मध्ये डाउनलोड केला होता. या विश्लेषणामध्ये उत्पादकाने प्रदान केलेला आयसोटोप शुद्धता सुधारणा घटक समाविष्ट आहे. विभेदक अभिव्यक्ती विश्लेषणासाठी R मध्ये limma वापरा. ​​मूळ डेटा, डेटाबेस शोध परिणाम, आणि डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह व परिणाम हे सर्व PXD019690 या डेटा सेट आयडेंटिफायरसह PRIDE पार्टनर रिपॉझिटरीद्वारे प्रोटिओमएक्सचेंज अलायन्समध्ये संग्रहित आहेत.
कार्यात्मक एनोटेशन्स विश्लेषणाला समृद्ध करतात. ८ आठवड्यांच्या डेटा सेटमधील कार्यात्मक एनोटेशन संज्ञांची समृद्धी निश्चित करण्यासाठी इंजिन्युइटी पाथवे ॲनालिसिस (QIAGEN) टूलचा वापर करण्यात आला (आकृती १). थोडक्यात, LC-MS/MS (टँडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री) डेटा विश्लेषणातून मिळालेली परिमाणात्मक प्रथिन सूची खालील फिल्टर निकषांसह वापरली जाते: 'मूस ​​मस्क्युलस' ही प्रजाती आणि पार्श्वभूमी म्हणून निवडली आहे, आणि श्रेणीसाठी बेंजामिनीद्वारे समायोजित केलेले P मूल्य ०.०५ किंवा त्यापेक्षा कमी असल्यास ते महत्त्वपूर्ण मानले जाते. या आलेखासाठी, समायोजित P मूल्यावर आधारित प्रत्येक क्लस्टरमधील शीर्ष पाच अतिरिक्त श्रेणी दर्शविल्या आहेत. बेंजामिनी, क्रीगर आणि येकुटिएली यांच्या दोन-टप्प्यांच्या लिनियर बूस्ट प्रोग्रामचा (Q = ५%) वापर करून, मल्टिपल टी-टेस्टद्वारे प्रत्येक श्रेणीमध्ये ओळखल्या गेलेल्या महत्त्वाच्या उमेदवारांवर टाइम-कोर्स प्रथिन अभिव्यक्ती विश्लेषण केले जाते आणि प्रत्येक ओळीचे स्वतंत्रपणे विश्लेषण केले जाते. सुसंगत SD (प्रमाणित विचलन) स्वीकारण्याची आवश्यकता नाही.
या अभ्यासाच्या निकालांची प्रकाशित डेटाबेसशी तुलना करण्यासाठी आणि आकृती 1 मध्ये वेन आकृती तयार करण्यासाठी, आम्ही परिमाणात्मक प्रथिन सूचीला मायटोकार्टा 2.0 एनोटेशन्स (24) सह एकत्रित केले. आकृती तयार करण्यासाठी ड्रॉ वेन डायग्राम (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) हे ऑनलाइन साधन वापरा.
प्रोटिओमिक्स विश्लेषणासाठी वापरलेल्या सांख्यिकीय कार्यपद्धतींबद्दल सविस्तर माहितीसाठी, कृपया 'साहित्य आणि पद्धती' (Materials and Methods) मधील संबंधित विभाग पहा. इतर सर्व प्रयोगांसाठी, सविस्तर माहिती संबंधित स्पष्टीकरणात (legend) आढळेल. अन्यथा नमूद केल्याशिवाय, सर्व डेटा सरासरी ± SEM (mean ± SEM) म्हणून व्यक्त केला आहे, आणि सर्व सांख्यिकीय विश्लेषणे GraphPad Prism 8.1.2 सॉफ्टवेअर वापरून केली गेली.
या लेखासाठीच्या पूरक सामग्रीकरिता, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 येथे पहा.
हा एक मुक्त प्रवेश लेख आहे जो क्रिएटिव्ह कॉमन्स ॲट्रिब्युशन-नॉन-कमर्शियल लायसन्सच्या अटींनुसार वितरित केला जातो, जो कोणत्याही माध्यमात वापर, वितरण आणि पुनरुत्पादनास परवानगी देतो, जोपर्यंत अंतिम वापर व्यावसायिक फायद्यासाठी नाही आणि मूळ काम अचूक आहे हे गृहीत धरले जाते. संदर्भ.
टीप: आम्ही तुम्हाला तुमचा ईमेल पत्ता देण्यास फक्त यासाठी सांगतो, जेणेकरून तुम्ही ज्या व्यक्तीची या पेजवर शिफारस कराल, त्या व्यक्तीला हे कळावे की तुम्ही त्यांना हा ईमेल दाखवू इच्छिता आणि तो स्पॅम नाही. आम्ही कोणताही ईमेल पत्ता नोंदवून घेणार नाही.
तुम्ही अभ्यागत आहात की नाही हे तपासण्यासाठी आणि स्वयंचलित स्पॅम सबमिशन रोखण्यासाठी या प्रश्नाचा वापर केला जातो.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. लार्सन
अकार्यक्षम चेतापेशींच्या प्रोटिओमिक्स विश्लेषणातून असे दिसून आले की चेतापेशींचा ऱ्हास रोखण्यासाठी चयापचय कार्यक्रम सक्रिय होतात.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. लार्सन
अकार्यक्षम चेतापेशींच्या प्रोटिओमिक्स विश्लेषणातून असे दिसून आले की चेतापेशींचा ऱ्हास रोखण्यासाठी चयापचय कार्यक्रम सक्रिय होतात.
©2020 अमेरिकन असोसिएशन फॉर द ॲडव्हान्समेंट ऑफ सायन्स. सर्व हक्क राखीव. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef आणि COUNTER चे भागीदार आहे. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.