Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम परिणामांसाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही तुमच्या ब्राउझरची नवीन आवृत्ती वापरावी (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमधील कॉम्पॅटिबिलिटी मोड अक्षम करावा). दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही ही साइट स्टायलिंग किंवा जावास्क्रिप्टशिवाय दाखवत आहोत.
ऑटिझम स्पेक्ट्रम डिसऑर्डरसारख्या न्यूरोडेव्हलपमेंटल डिसऑर्डरमध्ये मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनच्या भूमिकेचा अभ्यास करण्यासाठी प्रोपिओनिक अॅसिड (PPA) वापरले जाते. PPA मायटोकाँड्रियल बायोजेनेसिस, मेटाबॉलिझम आणि टर्नओव्हरमध्ये व्यत्यय आणते हे ज्ञात आहे. तथापि, या यंत्रणांच्या जटिल कालिक स्वरूपामुळे, मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्स, फिशन आणि फ्यूजनवर PPA चे होणारे परिणाम समस्याप्रधान राहतात. येथे, आम्ही न्यूरॉनसारख्या SH-SY5Y पेशींमध्ये PPA मायटोकाँड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर, मॉर्फोलॉजी आणि डायनॅमिक्सवर कसा परिणाम करते हे तपासण्यासाठी पूरक परिमाणात्मक इमेजिंग तंत्रांचा वापर करतो. PPA (5 mM) मुळे मायटोकाँड्रियल क्षेत्रफळ (p < 0.01), फेरेट व्यास आणि परिघ (p < 0.05), आणि क्षेत्रफळ 2 (p < 0.01) मध्ये लक्षणीय घट झाली. मायटोकाँड्रियल इव्हेंट लोकेटर विश्लेषणाने फिशन आणि फ्यूजन घटनांमध्ये लक्षणीय वाढ (p < 0.05) दर्शविली, ज्यामुळे तणावाच्या परिस्थितीत मायटोकाँड्रियल नेटवर्कची अखंडता टिकून राहिली. याव्यतिरिक्त, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) आणि OPA1 (p < 0.05) यांची mRNA अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या कमी झाली होती. हे तणावाच्या परिस्थितीत कार्य टिकवून ठेवण्यासाठी मायटोकाँड्रियल आकारविज्ञान, जीवोत्पत्ती आणि गतिशीलतेच्या पुनर्रचनेचे स्पष्टीकरण देते. आमचा डेटा मायटोकाँड्रियल गतिशीलतेवर PPA च्या परिणामांबद्दल नवीन अंतर्दृष्टी प्रदान करतो आणि मायटोकाँड्रियल तणाव प्रतिसादांमध्ये सामील असलेल्या जटिल नियामक यंत्रणांचा अभ्यास करण्यासाठी इमेजिंग तंत्रांची उपयुक्तता अधोरेखित करतो.
ऊर्जा उत्पादन आणि जैवसंश्लेषणातील त्यांच्या नेहमीच्या भूमिकांच्या पलीकडे, मायटोकाँड्रिया विविध पेशीय कार्यांमध्ये अविभाज्य सहभागी असतात. मायटोकाँड्रियल चयापचय हे कॅल्शियम सिग्नलिंग, चयापचय आणि रेडॉक्स होमियोस्टॅसिस, दाहक सिग्नलिंग, एपिजेनेटिक बदल, पेशींची वाढ, विभेदन आणि नियोजित पेशी मृत्यू¹ यांचे प्रमुख नियामक आहे. विशेषतः, मायटोकाँड्रियल चयापचय न्यूरॉनच्या विकासासाठी, अस्तित्वासाठी आणि कार्यासाठी महत्त्वपूर्ण आहे आणि न्यूरोपॅथॉलॉजीच्या विविध प्रकटीकरणांमध्ये त्याचा व्यापकपणे संबंध जोडला जातो²,³,⁴.
गेल्या दशकात, चयापचय स्थिती ही चेतापेशींची निर्मिती, विभेदन, परिपक्वता आणि लवचिकता यांचा एक केंद्रीय नियामक म्हणून उदयास आली आहे5,6. अलीकडे, मायटोकाँड्रियल आकारविज्ञान आणि गतिशीलता हे मायटोसिसचे विशेष महत्त्वाचे घटक बनले आहेत; ही एक गतिशील प्रक्रिया आहे जी पेशींमध्ये निरोगी मायटोकाँड्रियाचा साठा टिकवून ठेवते. मायटोकाँड्रियल गतिशीलतेचे नियमन मायटोकाँड्रियल जीवोत्पत्ती आणि जैवऊर्जेपासून ते मायटोकाँड्रियल विखंडन, संलयन, वहन आणि निर्मूलनापर्यंतच्या जटिल, परस्परावलंबी मार्गांद्वारे केले जाते7,8. यापैकी कोणत्याही एकात्मिक यंत्रणेत व्यत्यय आल्यास निरोगी मायटोकाँड्रियल जाळ्यांची देखभाल करणे कठीण होते आणि चेतासंस्थेच्या विकासावर त्याचे गंभीर कार्यात्मक परिणाम होतात9,10. खरे तर, ऑटिझम स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर (ASD) सह अनेक मानसिक, चेतासंस्थेच्या ऱ्हासजन्य आणि चेतासंस्थेच्या विकासाशी संबंधित विकारांमध्ये मायटोकाँड्रियल गतिशीलतेतील अनियमितता दिसून येते11,12.
ऑटिझम स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर (ASD) हा एक विषम न्यूरोडेव्हलपमेंटल डिसऑर्डर आहे, ज्याची अनुवांशिक आणि एपिजेनेटिक रचना गुंतागुंतीची आहे. ASD ची आनुवंशिकता निर्विवाद आहे, परंतु त्यामागील आण्विक कारणमीमांसा अद्याप पूर्णपणे समजलेली नाही. प्रीक्लिनिकल मॉडेल्स, क्लिनिकल अभ्यास आणि मल्टी-ओमिक्स आण्विक डेटासेटमधून जमा होणारा डेटा ASD मध्ये मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनचे वाढते पुरावे देत आहे¹³,¹⁴. आम्ही पूर्वी ASD असलेल्या रुग्णांच्या गटात जीनोम-व्यापी डीएनए मेथिलेशन स्क्रीन केली होती आणि मायटोकाँड्रियल चयापचय मार्गांवर एकत्रित झालेले भिन्न मेथिलेटेड जनुके ओळखले होते¹⁵. त्यानंतर आम्ही मायटोकाँड्रियल बायोजेनेसिस आणि डायनॅमिक्सच्या केंद्रीय नियामकांच्या भिन्न मेथिलेशनची नोंद केली, जे ASD मध्ये वाढलेल्या mtDNA कॉपी संख्ये आणि बदललेल्या मूत्र चयापचय प्रोफाइलशी संबंधित होते¹⁶. आमचा डेटा वाढता पुरावा देतो की मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्स आणि होमियोस्टॅसिस ASD च्या पॅथोफिजियोलॉजीमध्ये मध्यवर्ती भूमिका बजावतात. म्हणून, मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्स, मॉर्फोलॉजी आणि कार्य यांच्यातील संबंधांची यांत्रिक समज सुधारणे हे दुय्यम मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनने वैशिष्ट्यीकृत न्यूरोलॉजिकल रोगांवरील चालू संशोधनाचे एक प्रमुख उद्दिष्ट आहे.
मायटोकाँड्रियल ताण प्रतिसादांमध्ये विशिष्ट जनुकांच्या भूमिकेचा अभ्यास करण्यासाठी आण्विक तंत्रांचा अनेकदा वापर केला जातो. तथापि, मायटोटिक नियंत्रण यंत्रणांच्या बहुआयामी आणि तात्कालिक स्वरूपामुळे हा दृष्टिकोन मर्यादित असू शकतो. शिवाय, मायटोकाँड्रियल जनुकांची भिन्न अभिव्यक्ती ही कार्यात्मक बदलांचे एक अप्रत्यक्ष सूचक आहे, विशेषतः कारण सामान्यतः केवळ मर्यादित संख्येतील जनुकांचे विश्लेषण केले जाते. म्हणून, मायटोकाँड्रियल कार्य आणि जैवऊर्जेचा अभ्यास करण्यासाठी अधिक थेट पद्धती प्रस्तावित केल्या गेल्या आहेत¹⁷. मायटोकाँड्रियल आकारविज्ञान हे मायटोकाँड्रियल गतिशीलतेशी जवळून संबंधित आहे. मायटोकाँड्रियल आकार, जोडणी आणि रचना ऊर्जा उत्पादन आणि मायटोकाँड्रियल व पेशींच्या अस्तित्वासाठी महत्त्वपूर्ण आहेत⁵,¹⁸. शिवाय, मायटोसिसचे विविध घटक मायटोकाँड्रियल आकारविज्ञानातील बदलांवर लक्ष केंद्रित करतात, जे मायटोकाँड्रियल बिघाडाचे उपयुक्त अंतिम बिंदू म्हणून काम करू शकतात आणि त्यानंतरच्या यांत्रिक अभ्यासासाठी आधार प्रदान करू शकतात.
ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (TEM) वापरून मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजी थेट पाहिली जाऊ शकते, ज्यामुळे पेशींच्या अल्ट्रास्ट्रक्चरचा तपशीलवार अभ्यास करता येतो. TEM पेशींच्या समूहांमधील केवळ जीन ट्रान्सक्रिप्शन, प्रोटीन एक्सप्रेशन किंवा मायटोकाँड्रियल कार्यात्मक पॅरामीटर्सवर अवलंबून न राहता, वैयक्तिक मायटोकाँड्रियाच्या रिझोल्यूशनवर मायटोकाँड्रियल क्रिस्टीची मॉर्फोलॉजी, आकार आणि रचना थेट दृश्यमान करते¹⁷,¹⁹,²⁰. याव्यतिरिक्त, TEM मायटोकाँड्रिया आणि एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम व ऑटोफॅगोसोम्ससारख्या इतर ऑर्गेनेल्समधील आंतरक्रियांचा अभ्यास सुलभ करते, जे मायटोकाँड्रियल कार्य आणि होमियोस्टॅसिसमध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावतात²¹,²². त्यामुळे, विशिष्ट मार्ग किंवा जनुकांवर लक्ष केंद्रित करण्यापूर्वी मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनचा अभ्यास करण्यासाठी TEM हा एक चांगला प्रारंभ बिंदू ठरतो. न्यूरोपॅथॉलॉजीमध्ये मायटोकाँड्रियल कार्याचे महत्त्व वाढत असल्याने, इन विट्रो न्यूरॉनल मॉडेल्समध्ये मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजी आणि डायनॅमिक्सचा थेट आणि संख्यात्मक अभ्यास करण्याची स्पष्ट गरज आहे.
या लेखात, आम्ही ऑटिझम स्पेक्ट्रम डिसऑर्डरमधील मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनच्या न्यूरॉनल मॉडेलमध्ये मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्सचे परीक्षण करतो. आम्ही पूर्वी ASD15 मध्ये प्रोपिओनाइल-कोए कार्बोक्सिलेज बीटा (PCCB) च्या भिन्न मेथिलेशनची नोंद केली होती, जे मायटोकाँड्रियल प्रोपिओनाइल-कोए कार्बोक्सिलेज एन्झाइम PCC चा एक सबयुनिट आहे. PCC च्या नियमनातील बिघाडामुळे प्रोपिओनाइल डेरिव्हेटिव्ह्जचा विषारी संचय होतो, ज्यामध्ये प्रोपिओनिक ऍसिड (PPA)23,24,25 चा समावेश आहे, हे ज्ञात आहे. PPA मुळे इन विवो (in vivo) मध्ये न्यूरॉनल चयापचय विस्कळीत होतो आणि वर्तनात बदल होतो, असे दिसून आले आहे आणि ASD26,27,28 मध्ये सामील असलेल्या न्यूरोडेव्हलपमेंटल यंत्रणांचा अभ्यास करण्यासाठी हे एक प्रस्थापित प्राणी मॉडेल आहे. याव्यतिरिक्त, PPA मुळे इन व्हिट्रो (in vitro) मध्ये मायटोकाँड्रियल मेम्ब्रेन पोटेन्शियल, बायोजेनेसिस आणि श्वसन विस्कळीत होते, असे नोंदवले गेले आहे आणि न्यूरॉन्समधील मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनचे मॉडेल बनवण्यासाठी याचा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला गेला आहे29,30. तथापि, PPA-प्रेरित मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनचा मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजी आणि डायनॅमिक्सवर होणारा परिणाम अद्याप पूर्णपणे समजलेला नाही.
या अभ्यासात SH-SY5Y पेशींमधील मायटोकाँड्रियल आकार, गतिशीलता आणि कार्यावर PPA च्या परिणामांचे परिमाणीकरण करण्यासाठी पूरक इमेजिंग तंत्रांचा वापर केला आहे. सर्वप्रथम, आम्ही मायटोकाँड्रियल आकार आणि अल्ट्रास्ट्रक्चरमधील बदल पाहण्यासाठी एक TEM पद्धत विकसित केली¹⁷,³¹,³². मायटोकाँड्रियाच्या गतिशील स्वरूपामुळे³³, आम्ही PPA तणावाखाली विखंडन आणि संलयन घटनांमधील संतुलन, मायटोकाँड्रियल संख्या आणि आकारमानातील बदलांचे परिमाणीकरण करण्यासाठी मायटोकाँड्रियल इव्हेंट लोकलायझर (MEL) विश्लेषणाचा देखील वापर केला. शेवटी, आम्ही तपासले की मायटोकाँड्रियल आकार आणि गतिशीलता यांचा संबंध जीवोत्पत्ती, विखंडन आणि संलयन प्रक्रियेत सामील असलेल्या जनुकांच्या अभिव्यक्तीतील बदलांशी आहे की नाही. एकत्रितपणे, आमचा डेटा मायटोकाँड्रियल गतिशीलतेचे नियमन करणाऱ्या यंत्रणांची गुंतागुंत स्पष्ट करण्यामधील आव्हान दर्शवतो. आम्ही SH-SY5Y पेशींमधील मायटोसिसचा एक मोजता येण्याजोगा एकत्रित अंतिम बिंदू म्हणून मायटोकाँड्रियल आकाराचा अभ्यास करण्यासाठी TEM च्या उपयुक्ततेवर प्रकाश टाकतो. याव्यतिरिक्त, आम्ही हे अधोरेखित करतो की जेव्हा TEM डेटा चयापचय तणावाच्या प्रतिसादात गतिशील घटना टिपणाऱ्या इमेजिंग तंत्रांसोबत एकत्रित केला जातो, तेव्हा तो सर्वात समृद्ध माहिती प्रदान करतो. न्यूरॉनल पेशींच्या मायटोसिसला आधार देणाऱ्या आण्विक नियामक यंत्रणांचे अधिक सखोल विश्लेषण केल्यास, चेतासंस्थेतील मायटोकाँड्रियल घटक आणि न्यूरोडीजनरेटिव्ह रोगांविषयी महत्त्वपूर्ण अंतर्दृष्टी मिळू शकते.
मायटोकाँड्रियल ताण निर्माण करण्यासाठी, SH-SY5Y पेशींना 3 mM आणि 5 mM सोडियम प्रोपिओनेट (NaP) वापरून PPA ने उपचारित करण्यात आले. TEM पूर्वी, नमुन्यांवर उच्च-दाब गोठवण आणि गोठवण वापरून क्रायोजेनिक नमुना तयारी प्रक्रिया करण्यात आली (आकृती 1a). आम्ही तीन जैविक प्रतिकृतींमध्ये मायटोकाँड्रियल समूहांचे आठ आकारिक मापदंड मोजण्यासाठी एक स्वयंचलित मायटोकाँड्रियल प्रतिमा विश्लेषण पाइपलाइन विकसित केली. आम्हाला आढळले की PPA उपचाराने चार मापदंडांमध्ये लक्षणीय बदल झाला: क्षेत्रफळ 2, परिमिती आणि फेरेट व्यास (आकृती 1b–e). 3 mM आणि 5 mM PPA उपचाराने क्षेत्रफळ 2 लक्षणीयरीत्या कमी झाले (अनुक्रमे p = 0.0183 आणि p = 0.002) (आकृती 1b), तर क्षेत्रफळ (p = 0.003), परिमिती (p = 0.0106) आणि फेरेट व्यास हे सर्व लक्षणीयरीत्या कमी झाले. नियंत्रण गटाच्या तुलनेत 5 mM उपचार गटामध्ये लक्षणीय घट (p = 0.0172) दिसून आली (आकृती 1c–e). क्षेत्रफळ आणि परिघामध्ये झालेल्या लक्षणीय घटीवरून असे दिसून आले की, ५ mM PPA ने उपचार केलेल्या पेशींमध्ये मायटोकाँड्रिया लहान आणि अधिक गोलाकार होते, आणि हे मायटोकाँड्रिया नियंत्रण पेशींमधील मायटोकाँड्रियापेक्षा कमी लांबट होते. हे फेरेट व्यासातील लक्षणीय घटीशी देखील सुसंगत आहे, जो कणांच्या कडांमधील सर्वात मोठ्या अंतरातील घट दर्शवणारा एक स्वतंत्र मापदंड आहे. क्रिस्टीच्या अतिसूक्ष्म संरचनेत बदल दिसून आले: PPA च्या ताणाच्या प्रभावाखाली क्रिस्टी कमी ठळक झाल्या (आकृती १अ, पॅनेल ब). तथापि, सर्व प्रतिमांमध्ये क्रिस्टीची अतिसूक्ष्म संरचना स्पष्टपणे दिसत नव्हती, त्यामुळे या बदलांचे संख्यात्मक विश्लेषण केले गेले नाही. हा TEM डेटा तीन संभाव्य परिस्थिती दर्शवू शकतो: (१) PPA विखंडन वाढवते किंवा संलयन रोखते, ज्यामुळे अस्तित्वात असलेले मायटोकाँड्रिया आकाराने लहान होतात; (२) वाढलेली जीवोत्पत्ती नवीन, लहान मायटोकाँड्रिया तयार करते किंवा (३) दोन्ही यंत्रणा एकाच वेळी प्रेरित करते. जरी या परिस्थितींमध्ये TEM द्वारे फरक करता येत नसला तरी, लक्षणीय आकारिक बदल PPA च्या ताणाखाली मायटोकाँड्रियल होमियोस्टॅसिस आणि गतिशीलतेमधील बदल दर्शवतात. त्यानंतर, या गतिशीलतेचे आणि त्यामागील संभाव्य यंत्रणांचे अधिक सखोल वर्णन करण्यासाठी आम्ही अतिरिक्त मापदंडांचा अभ्यास केला.
प्रोपिओनिक ॲसिड (PPA) मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजीमध्ये बदल घडवते. (a) प्रातिनिधिक ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (TEM) प्रतिमा, ज्या दर्शवतात की वाढत्या PPA उपचाराने मायटोकाँड्रियलचा आकार कमी होतो आणि मायटोकाँड्रिया लहान व अधिक गोलाकार होतात; अनुक्रमे 0 mM (अनुपचारित), 3 mM आणि 5 mM. लाल बाण मायटोकाँड्रिया दर्शवतात. (b–e) 24 तास PPA ने उपचार केलेल्या SH-SY5Y पेशी TEM साठी तयार केल्या गेल्या आणि परिणामांचे विश्लेषण Fiji/ImageJ वापरून केले गेले. आठपैकी चार पॅरामीटर्सनी नियंत्रण (अनुपचारित, 0 mM PPA) आणि उपचार केलेल्या (3 mM आणि 5 mM PPA) पेशींमध्ये लक्षणीय फरक दर्शवला. (b) प्रदेश 2, (c) क्षेत्रफळ, (d) परिमिती, (e) फेरेट व्यास. लक्षणीय फरक (p < 0.05) निश्चित करण्यासाठी एक-मार्गी विचलन विश्लेषण (नियंत्रण विरुद्ध उपचार) आणि डनेटची बहुविध तुलना चाचणी वापरली गेली. डेटा पॉइंट्स प्रत्येक वैयक्तिक पेशीसाठी सरासरी मायटोकाँड्रियल मूल्य दर्शवतात आणि एरर बार सरासरी ± SEM दर्शवतात. दर्शविलेला डेटा n = 3, प्रत्येक प्रतिकृतीमध्ये किमान 24 पेशी दर्शवतो; एकूण 266 प्रतिमांचे विश्लेषण केले गेले; * p < 0.05 दर्शवते, ** p < 0.01 दर्शवते.
PPA ला मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्स कसा प्रतिसाद देतात याचे अधिक वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी, आम्ही टेट्रामेथिलरोडामाइन इथाइल एस्टर (TMRE) ने मायटोकाँड्रियाला रंगवले आणि ३ व ५ mM PPA मध्ये २४ तासांनंतर मायटोकाँड्रियाचे स्थान निश्चित करण्यासाठी व त्यांचे प्रमाण मोजण्यासाठी टाइम-लॅप्स मायक्रोस्कोपी आणि MEL विश्लेषणाचा वापर केला. विखंडन आणि संलयन घटनांवर प्रक्रिया. (आकृती २अ). MEL विश्लेषणानंतर, मायटोकाँड्रियल संरचनांची संख्या आणि त्यांचे सरासरी आकारमान मोजण्यासाठी मायटोकाँड्रियाचे पुढील विश्लेषण करण्यात आले. नियंत्रणाच्या तुलनेत 5 mM वर विखंडन [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] आणि संलयन [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] घटनांमध्ये लक्षणीय वाढ झाली होती (आकृती 3b). माइटोकॉन्ड्रियाची संख्या 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] आणि 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] या दोन्ही ठिकाणी लक्षणीयरीत्या वाढली (आकृती 3c), तर प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियल संरचनेचे सरासरी आकारमान अपरिवर्तित राहिले (आकृती 3c). 3d). एकत्रितपणे पाहता, यावरून असे सूचित होते की मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्सचे पुनर्रचना ही एक भरपाईकारक प्रतिक्रिया म्हणून काम करते, जी मायटोकाँड्रियल नेटवर्कची अखंडता यशस्वीपणे टिकवून ठेवते. ३ mM ​​PPA वर फिशन घटनांच्या संख्येत झालेली वाढ असे सूचित करते की मायटोकाँड्रियल संख्येत झालेली वाढ अंशतः मायटोकाँड्रियल फिशनमुळे आहे, परंतु सरासरी मायटोकाँड्रियल आकारमान मूलतः अपरिवर्तित राहत असल्याने, एक अतिरिक्त भरपाईकारक प्रतिक्रिया म्हणून बायोजेनेसिसला नाकारता येत नाही. तथापि, ही माहिती TEM द्वारे निरीक्षण केलेल्या लहान, गोलाकार मायटोकाँड्रियल संरचनांशी सुसंगत आहे आणि PPA मुळे प्रेरित झालेल्या मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्समधील महत्त्वपूर्ण बदल देखील दर्शवते.
प्रोपिओनिक ॲसिड (PPA) नेटवर्कची अखंडता टिकवून ठेवण्यासाठी गतिशील मायटोकाँड्रियल रिमॉडेलिंगला प्रेरित करते. SH-SY5Y पेशी कल्चर केल्या गेल्या, त्यांना 24 तासांसाठी 3 आणि 5 mM PPA ने उपचारित केले गेले आणि TMRE व होचस्ट 33342 ने रंगवून त्यानंतर MEL विश्लेषण केले गेले. (a) प्रत्येक स्थितीसाठी वेळ 2 (t2) वरील रंगीत आणि बायनरीकृत कमाल तीव्रता प्रोजेक्शन दर्शविणाऱ्या प्रातिनिधिक टाइम-लॅप्स मायक्रोस्कोपी प्रतिमा. प्रत्येक बायनरी प्रतिमेमध्ये दर्शविलेले निवडक प्रदेश तीन वेगवेगळ्या टाइम फ्रेम्सवर (t1-t3) वर्धित करून 3D मध्ये प्रदर्शित केले आहेत, जेणेकरून वेळेनुसार होणारी गतिशीलता स्पष्ट होईल; फ्यूजन घटना हिरव्या रंगात हायलाइट केल्या आहेत; फिशन घटना हिरव्या रंगात हायलाइट केल्या आहेत. लाल रंगात दर्शविल्या आहेत. (b) प्रत्येक स्थितीनुसार गतिशील घटनांची सरासरी संख्या. (c) प्रति पेशी मायटोकाँड्रियल संरचनांची सरासरी संख्या. (d) प्रति पेशी प्रत्येक मायटोकाँड्रियल संरचनेचे सरासरी आकारमान (µm3). दर्शविलेला डेटा प्रत्येक उपचार गटातील n = 15 पेशींचा प्रातिनिधिक आहे. दर्शविलेले एरर बार सरासरी ± SEM दर्शवतात, स्केल बार = 10 μm, * p < 0.05.
प्रोपिओनिक ॲसिड (PPA) मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्सशी संबंधित जनुकांच्या ट्रान्सक्रिप्शनल सप्रेशनला कारणीभूत ठरते. SH-SY5Y पेशींना 24 तासांसाठी 3 आणि 5 mM PPA ने उपचारित करण्यात आले. RT-qPCR वापरून रिलेटिव्ह जीन क्वांटिफिकेशन करण्यात आले आणि B2M शी नॉर्मलाइझ करण्यात आले. मायटोकाँड्रियल बायोजेनेसिस जनुके (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 आणि (d) NFE2L2. मायटोकाँड्रियल फ्यूजन आणि फिशन जनुके (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 आणि (i) DRP1. महत्त्वपूर्ण फरक (p < 0.05) वन-वे ANOVA (कंट्रोल विरुद्ध ट्रीटमेंट) आणि डनेटच्या मल्टिपल कम्पेरिझन टेस्टचा वापर करून तपासले गेले: * p < 0.05 दर्शवते, ** p < 0.01 दर्शवते, आणि **** p < 0.0001 दर्शवते. बार सरासरी अभिव्यक्ती ± SEM दर्शवतात. दर्शविलेला डेटा n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), आणि n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) जैविक प्रतिकृती दर्शवतो.
TEM आणि MEL विश्लेषणातून मिळालेला डेटा एकत्रितपणे असे दर्शवतो की PPA मायटोकाँड्रियल आकारविज्ञान आणि गतिशीलतेमध्ये बदल घडवते. तथापि, ही इमेजिंग तंत्रे या प्रक्रियांना चालना देणाऱ्या मूळ यंत्रणांबद्दल सखोल माहिती देत ​​नाहीत. म्हणून, आम्ही PPA उपचाराच्या प्रतिसादात मायटोकाँड्रियल गतिशीलता, जीवोत्पत्ती आणि मायटोसिसच्या नऊ प्रमुख नियामकांच्या mRNA अभिव्यक्तीचे परीक्षण केले. आम्ही 3 mM आणि 5 mM PPA सह 24 तासांच्या उपचारानंतर सेल मायलोमा ऑन्कोजीन (cMYC), न्यूक्लियर रेस्पिरेटरी फॅक्टर (NRF1), मायटोकाँड्रियल ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर 1 (TFAM), NFE2-लाइक ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर BZIP (NFE2L2), गॅस्ट्रिन-लाइक प्रोटीन 2 (STOML2), ऑप्टिक नर्व्ह ॲट्रोफी 1 (OPA1), मायटोफ्युसिन 1 (MFN1), मायटोफ्युसिन 2 (MFN2) आणि डायनॅमिन-रिलेटेड प्रोटीन 1 (DRP1) यांचे प्रमाण निश्चित केले. आम्ही ३ mM ​​(अनुक्रमे p = ०.००५३, p = ०.०४१५ आणि p < ०.०००१) आणि ५ mM (p = ०.००३१, p = ०.०२३३, p < ०.०००१) PPA उपचारांचे निरीक्षण केले. (आकृती ३अ–क). mRNA अभिव्यक्तीमधील घट मात्रेवर अवलंबून होती: ३ mM ​​वर cMYC, NRF1 आणि TFAM ची अभिव्यक्ती अनुक्रमे ५.७, २.६ आणि १.९ पटीने, आणि ५ mM वर ११.२, ३ आणि २.२ पटीने कमी झाली. याउलट, केंद्रीय रेडॉक्स जीवोत्पत्ती जनुक NFE2L2 मध्ये PPA च्या कोणत्याही सांद्रतेवर कोणताही बदल झाला नाही, जरी अभिव्यक्ती कमी होण्याचा असाच मात्रेवर अवलंबून असलेला कल दिसून आला (आकृती ३ड).
आम्ही विखंडन आणि संलयनाच्या नियमनामध्ये सामील असलेल्या शास्त्रीय जनुकांच्या अभिव्यक्तीचे देखील परीक्षण केले. STOML2 हे संलयन, मायटोफॅगी आणि जीवोत्पत्तीमध्ये सामील असल्याचे मानले जाते, आणि 3 mM (2.4-पट बदल) आणि 5 mM (2.8-पट बदल) PPA मुळे त्याची अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या कमी झाली (p < 0.0001) (आकृती 1. 3d). त्याचप्रमाणे, OPA1 संलयन जनुकाची अभिव्यक्ती 3 mM (1.6-पट बदल) आणि 5 mM (1.9-पट बदल) PPA वर कमी झाली (अनुक्रमे p = 0.006 आणि p = 0.0024) (आकृती 3f). तथापि, आम्हाला 24-तासांच्या PPA तणावाखाली संलयन जनुके MFN1, MFN2 किंवा विखंडन जनुके DRP1 यांच्या अभिव्यक्तीमध्ये लक्षणीय फरक आढळले नाहीत (आकृती 3g–i). याव्यतिरिक्त, आम्हाला असे आढळले की चार फ्यूजन आणि फिशन प्रथिनांची (OPA1, MFN1, MFN2 आणि DRP1) पातळी त्याच परिस्थितीत बदलली नाही (आकृती ४अ-ड). हे लक्षात घेणे महत्त्वाचे आहे की ही माहिती एका विशिष्ट वेळेची आहे आणि PPA तणावाच्या सुरुवातीच्या टप्प्यात प्रथिनांच्या अभिव्यक्ती किंवा क्रियाशीलतेच्या पातळीतील बदल कदाचित दर्शवत नाही. तथापि, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 आणि OPA1 यांच्या अभिव्यक्तीमधील लक्षणीय घट मायटोकाँड्रियल चयापचय, जीवोत्पत्ती आणि गतिशीलतेच्या महत्त्वपूर्ण ट्रान्सक्रिप्शनल नियमन-बाह्यतेचे संकेत देते. याव्यतिरिक्त, ही माहिती मायटोकाँड्रियल कार्यातील अंतिम-स्थितीतील बदलांचा थेट अभ्यास करण्यासाठी इमेजिंग तंत्रांची उपयुक्तता अधोरेखित करते.
प्रोपिओनिक ॲसिड (PPA) उपचारानंतर फ्यूजन आणि फिशन फॅक्टर प्रथिनांच्या पातळीत बदल झाला नाही. SH-SY5Y पेशींना २४ तासांसाठी ३ आणि ५ mM PPA ने उपचारित करण्यात आले. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषणाद्वारे प्रथिनांच्या पातळीचे परिमाणीकरण करण्यात आले आणि अभिव्यक्तीची पातळी एकूण प्रथिनांच्या तुलनेत सामान्यीकृत करण्यात आली. सरासरी प्रथिन अभिव्यक्ती आणि लक्ष्य व एकूण प्रथिनांचे प्रातिनिधिक वेस्टर्न ब्लॉट्स दर्शविले आहेत. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. बार्स सरासरी ± SEM दर्शवतात आणि दर्शविलेला डेटा n = ३ जैविक प्रतिकृतींचे प्रातिनिधिक आहे. एक-मार्गी विचलन विश्लेषण आणि डनेटच्या चाचणीचा वापर करून अनेक तुलना (p < 0.05) करण्यात आल्या. मूळ जेल आणि ब्लॉट आकृती S1 मध्ये दर्शविले आहेत.
मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शन हे चयापचय, हृदय व रक्तवाहिन्या आणि स्नायूंच्या आजारांपासून ते मज्जासंस्थेच्या आजारांपर्यंतच्या बहुप्रणाली रोगांशी संबंधित आहे¹,¹⁰. अनेक न्यूरोडीजनरेटिव्ह आणि न्यूरोडीजनरेटिव्ह रोग मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनशी संबंधित आहेत, जे मेंदूच्या जीवनकाळात या ऑर्गेनेल्सचे महत्त्व अधोरेखित करतात. या रोगांमध्ये पार्किन्सन्स रोग, अल्झायमर रोग आणि ASD³,⁴,¹⁸ यांचा समावेश आहे. तथापि, या रोगांचा अभ्यास करण्यासाठी मेंदूच्या ऊती मिळवणे कठीण आहे, विशेषतः यंत्रणात्मक स्तरावर, ज्यामुळे सेल्युलर मॉडेल सिस्टीम हा एक आवश्यक पर्याय बनतो. या अभ्यासात, आम्ही PPA-उपचारित SH-SY5Y पेशी वापरून एक सेल्युलर मॉडेल सिस्टीम वापरतो, जी मज्जासंस्थेच्या आजारांमध्ये, विशेषतः ऑटिझम स्पेक्ट्रम डिसऑर्डरमध्ये, दिसून येणाऱ्या मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनची पुनरावृत्ती करते. न्यूरॉन्समधील मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्सचा अभ्यास करण्यासाठी हे PPA मॉडेल वापरल्याने ASD च्या कारणमीमांसेबद्दल अंतर्दृष्टी मिळू शकते.
मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजीमधील बदल पाहण्यासाठी आम्ही TEM वापरण्याच्या शक्यतेचा शोध घेतला. हे लक्षात घेणे महत्त्वाचे आहे की त्याची परिणामकारकता वाढवण्यासाठी TEM चा वापर योग्यरित्या करणे आवश्यक आहे. क्रायो-नमुन्यांच्या तयारीमुळे पेशीय घटकांना एकाच वेळी स्थिर करून आणि आर्टिफॅक्ट्सची निर्मिती कमी करून न्यूरॉनल संरचनांचे अधिक चांगले जतन करणे शक्य होते³⁴. याच्याशी सुसंगत, आम्ही पाहिले की न्यूरॉनसारख्या SH-SY5Y पेशींमध्ये अखंड सबसेल्युलर ऑर्गेनेल्स आणि लांबट मायटोकाँड्रिया होते (आकृती 1a). हे न्यूरॉनल पेशी मॉडेल्समध्ये मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजीचा अभ्यास करण्यासाठी क्रायोजेनिक तयारी तंत्रांची उपयुक्तता अधोरेखित करते. जरी TEM डेटाच्या वस्तुनिष्ठ विश्लेषणासाठी परिमाणात्मक मोजमाप महत्त्वपूर्ण असले तरी, मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजिकल बदलांची पुष्टी करण्यासाठी कोणते विशिष्ट पॅरामीटर्स मोजले पाहिजेत यावर अजूनही एकमत नाही. मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजीचे परिमाणात्मक परीक्षण करणाऱ्या मोठ्या संख्येने केलेल्या अभ्यासांवर¹⁷,³¹,³² आधारित, आम्ही एक स्वयंचलित मायटोकाँड्रियल प्रतिमा विश्लेषण पाइपलाइन विकसित केली आहे जी आठ मॉर्फोलॉजिकल पॅरामीटर्स मोजते, ते म्हणजे: क्षेत्रफळ, क्षेत्रफळ², आस्पेक्ट रेशो, परिमिती, वर्तुळाकारपणा, डिग्री, फेरेट व्यास आणि गोलाकारपणा.
त्यांपैकी, PPA ने क्षेत्रफळ २, परिमिती आणि फेरेट व्यास लक्षणीयरीत्या कमी केले (आकृती १b–e). यावरून असे दिसून आले की मायटोकाँड्रिया लहान आणि अधिक गोलाकार झाले, जे PPA30-प्रेरित मायटोकाँड्रियल ताणाच्या ७२ तासांनंतर मायटोकाँड्रियल क्षेत्रफळात घट दर्शविणाऱ्या पूर्वीच्या अभ्यासांशी सुसंगत आहे. ही आकारिक वैशिष्ट्ये मायटोकाँड्रियल विखंडन दर्शवू शकतात, जी मायटोफॅगी35,36,37 द्वारे त्यांच्या विघटनास चालना देण्यासाठी मायटोकाँड्रियल नेटवर्कमधून खराब झालेले घटक वेगळे करण्याची एक आवश्यक प्रक्रिया आहे. दुसरीकडे, मायटोकाँड्रियलच्या सरासरी आकारात झालेली घट वाढलेल्या जैव-उत्पत्तीशी संबंधित असू शकते, ज्यामुळे लहान नवजात मायटोकाँड्रिया तयार होतात. वाढलेले विखंडन किंवा जैव-उत्पत्ती हे मायटोकाँड्रियल ताणाविरुद्ध मायटोसिस टिकवून ठेवण्यासाठी एक भरपाईकारक प्रतिसाद दर्शवते. तथापि, मायटोकाँड्रियल वाढीतील घट, बिघडलेले संलयन किंवा इतर परिस्थिती नाकारता येत नाहीत.
जरी TEM द्वारे तयार केलेल्या उच्च-रिझोल्यूशन प्रतिमांमुळे वैयक्तिक मायटोकाँड्रियाच्या स्तरावर आकारिक वैशिष्ट्ये निश्चित करता येतात, तरीही ही पद्धत एका विशिष्ट क्षणी द्विमितीय स्नॅपशॉट तयार करते. चयापचय ताणाला मिळणाऱ्या गतिशील प्रतिसादांचा अभ्यास करण्यासाठी, आम्ही TMRE ने मायटोकाँड्रियाला रंगवले आणि MEL विश्लेषणासह टाइम-लॅप्स मायक्रोस्कोपीचा वापर केला, ज्यामुळे कालांतराने मायटोकाँड्रियल नेटवर्कमधील बदलांचे उच्च-थ्रूपुट 3D व्हिज्युअलायझेशन शक्य होते33,38. PPA ताणाखाली मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्समध्ये सूक्ष्म परंतु लक्षणीय बदल आम्ही पाहिले (आकृती २). ३ mM ​​वर, विखंडन घटनांची संख्या लक्षणीयरीत्या वाढली, तर संलयन घटना नियंत्रणाप्रमाणेच राहिल्या. ५ mM PPA वर विखंडन आणि संलयन दोन्ही घटनांच्या संख्येत वाढ दिसून आली, परंतु हे बदल अंदाजे समानुपाती होते, जे सूचित करते की उच्च सांद्रतेवर विखंडन आणि संलयन गतीशास्त्र समतोल साधते (आकृती २b). ३ आणि ५ mM PPA दोन्हीवर सरासरी मायटोकाँड्रियल आकारमान अपरिवर्तित राहिले, जे दर्शवते की मायटोकाँड्रियल नेटवर्कची अखंडता जपली गेली होती (आकृती २d). हे गतिशील मायटोकाँड्रियल नेटवर्कची, नेटवर्कचे विखंडन न करता सौम्य चयापचय ताणाला प्रतिसाद देऊन होमियोस्टॅसिस प्रभावीपणे राखण्याची क्षमता दर्शवते. ३ mM ​​PPA असताना, विखंडनातील वाढ नवीन समतोलाकडे संक्रमण घडवून आणण्यासाठी पुरेशी असते, परंतु PPA च्या उच्च सांद्रतेमुळे निर्माण होणाऱ्या ताणाला प्रतिसाद म्हणून अधिक सखोल गतिज पुनर्रचनेची आवश्यकता असते.
PPA च्या दोन्ही ताण सांद्रतांवर मायटोकाँड्रियाची संख्या वाढली, परंतु सरासरी मायटोकाँड्रियल आकारमानात लक्षणीय बदल झाला नाही (आकृती २c). हे वाढलेल्या जैव-उत्पत्तीमुळे किंवा वाढलेल्या विभाजनामुळे असू शकते; तथापि, सरासरी मायटोकाँड्रियल आकारमानात लक्षणीय घट न झाल्यामुळे, जैवसंश्लेषण वाढण्याची अधिक शक्यता आहे. तथापि, आकृती २ मधील डेटा दोन भरपाई यंत्रणांच्या अस्तित्वाला समर्थन देतो: विखंडन घटनांच्या संख्येत वाढ, जी मायटोकाँड्रियल विखंडनाच्या अपरेग्युलेशनशी सुसंगत आहे, आणि घटनांच्या संख्येत वाढ, जी मायटोकाँड्रियल जैव-उत्पत्तीशी सुसंगत आहे. सरतेशेवटी, सौम्य ताणासाठीची गतिशील भरपाई ही विखंडन, संलयन, जैव-उत्पत्ती आणि मायटोफॅगी यांचा समावेश असलेल्या एकाच वेळी होणाऱ्या प्रक्रियांनी बनलेली असू शकते. जरी पूर्वीच्या लेखकांनी दाखवले आहे की PPA मायटोसिस३०,३९ आणि मायटोफॅगी२९ वाढवते, तरी आम्ही PPA च्या प्रतिसादात मायटोकाँड्रियल विखंडन आणि संलयन गतिशीलतेच्या पुनर्रचनेचा पुरावा सादर करतो. हा डेटा TEM द्वारे निरीक्षण केलेल्या आकारिक बदलांची पुष्टी करतो आणि PPA-प्रेरित मायटोकाँड्रियल बिघाडाशी संबंधित यंत्रणांबद्दल अधिक अंतर्दृष्टी प्रदान करतो.
कारण TEM किंवा MEL विश्लेषणाने निरीक्षित आकारिक बदलांमागील जनुकीय नियामक यंत्रणांचा थेट पुरावा दिला नाही, म्हणून आम्ही मायटोकाँड्रियल चयापचय, जीवोत्पत्ती आणि गतिशीलतेमध्ये सामील असलेल्या जनुकांच्या RNA अभिव्यक्तीचे परीक्षण केले. cMYC प्रोटो-ऑन्कोजीन हा एक ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर आहे जो मायटोकाँड्रिया, ग्लायकोलिसिस, अमिनो आम्ल आणि फॅटी आम्ल चयापचयाच्या नियमनात सामील असतो40. याव्यतिरिक्त, cMYC हे NRF1 आणि TFAM41 सह, मायटोकाँड्रियल ट्रान्सक्रिप्शन, ट्रान्सलेशन आणि कॉम्प्लेक्स असेंब्लीमध्ये सामील असलेल्या सुमारे 600 मायटोकाँड्रियल जनुकांच्या अभिव्यक्तीचे नियमन करते असे ज्ञात आहे. NRF1 आणि TFAM हे मायटोसिसचे दोन केंद्रीय नियामक आहेत, जे mtDNA प्रतिकृती सक्रिय करण्यासाठी PGC-1α च्या खालील टप्प्यावर कार्य करतात. हा मार्ग cAMP आणि AMPK सिग्नलिंगद्वारे सक्रिय होतो आणि ऊर्जा खर्च व चयापचय तणावासाठी संवेदनशील असतो. PPA चे परिणाम ऑक्सिडेटिव्ह तणावामुळे होत आहेत का हे निर्धारित करण्यासाठी आम्ही मायटोकाँड्रियल जीवोत्पत्तीचा रेडॉक्स नियामक असलेल्या NFE2L2 चे देखील परीक्षण केले.
जरी NFE2L2 ची अभिव्यक्ती अपरिवर्तित राहिली असली तरी, 3 mM आणि 5 mM PPA सह 24 तासांच्या उपचारानंतर आम्हाला cMYC, NRF1 आणि TFAM च्या अभिव्यक्तीमध्ये डोस-आधारित सातत्यपूर्ण घट आढळली (आकृती 3a–c). cMYC अभिव्यक्तीचे डाउनरेग्युलेशन हे मायटोकाँड्रियल ताणाला प्रतिसाद म्हणून पूर्वी नोंदवले गेले आहे42, आणि याउलट, cMYC अभिव्यक्तीचे डाउनरेग्युलेशन मायटोकाँड्रियल चयापचय, नेटवर्क कनेक्टिव्हिटी आणि पडदा ध्रुवीकरणाचे पुनर्रचना करून मायटोकाँड्रियल बिघाडास कारणीभूत ठरू शकते43. विशेष म्हणजे, cMYC हे मायटोकाँड्रियल विखंडन आणि संलयनाच्या नियमनात देखील सामील आहे42,43 आणि पेशी विभाजनादरम्यान DRP1 फॉस्फोरिलेशन आणि मायटोकाँड्रियल स्थानिकीकरण वाढवण्यासाठी ओळखले जाते44, तसेच न्यूरॉनल स्टेम पेशींमध्ये मायटोकाँड्रियल आकारिक पुनर्रचनेत मध्यस्थी करते45. खरंच, cMYC-कमतरता असलेल्या फायब्रोब्लास्ट्समध्ये मायटोकाँड्रियलचा आकार कमी झालेला दिसतो, जो PPA43 ताणामुळे होणाऱ्या बदलांशी सुसंगत आहे. हा डेटा cMYC आणि मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्समधील एक मनोरंजक परंतु अद्याप अस्पष्ट संबंध स्पष्ट करतो, जो PPA ताणामुळे होणाऱ्या पुनर्रचनेच्या भविष्यातील अभ्यासासाठी एक मनोरंजक लक्ष्य प्रदान करतो.
NRF1 आणि TFAM मधील घट ही cMYC च्या एका महत्त्वाच्या ट्रान्सक्रिप्शनल ॲक्टिव्हेटरच्या भूमिकेशी सुसंगत आहे. ही माहिती मानवी कोलन कर्करोगाच्या पेशींवरील पूर्वीच्या अभ्यासांशी देखील सुसंगत आहे, ज्यात असे दिसून आले की PPA मुळे २२ तासांनी NRF1 mRNA अभिव्यक्ती कमी झाली, जी ATP च्या कमतरतेशी आणि ROS46 च्या वाढीशी संबंधित होती. या लेखकांनी असेही नोंदवले की TFAM अभिव्यक्ती ८.५ तासांनी वाढली, परंतु २२ तासांनी ती मूळ पातळीवर परत आली. याउलट, किम आणि सहकाऱ्यांनी (२०१९) दाखवले की SH-SY5Y पेशींमध्ये ४ तासांच्या PPA तणावानंतर TFAM mRNA अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या कमी झाली होती; तथापि, ७२ तासांनंतर, TFAM प्रथिनांची अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या वाढली आणि mtDNA प्रतींची संख्या लक्षणीयरीत्या वाढली. अशाप्रकारे, २४ तासांनंतर आम्ही पाहिलेली मायटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस जनुकांच्या संख्येत झालेली घट ही शक्यता नाकारत नाही की मायटोकॉन्ड्रियाच्या संख्येत झालेली वाढ ही सुरुवातीच्या टप्प्यांवर बायोजेनेसिसच्या सक्रियतेशी संबंधित आहे. मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की, PPA मुळे SH-SY5Y पेशींमध्ये ४ तास ३० मिनिटांनी PGC-1α mRNA आणि प्रथिने लक्षणीयरीत्या वाढतात, तर प्रोपिओनिक ॲसिडमुळे वासराच्या यकृत पेशींमध्ये १२ तास ३९ मिनिटांनी PGC-1α द्वारे मायटोकाँड्रियल बायोजेनेसिस वाढतो. विशेष म्हणजे, PGC-1α हा केवळ NRF1 आणि TFAM चा थेट ट्रान्सक्रिप्शनल नियामक नाही, तर तो फिशन आणि फ्यूजनचे नियमन करून MFN2 आणि DRP1 च्या कार्याचे नियमन करतो असेही दिसून आले आहे47. एकत्रितपणे पाहता, हे PPA मुळे प्रेरित झालेल्या मायटोकाँड्रियल भरपाई प्रतिसादांचे नियमन करणाऱ्या यंत्रणांमधील घनिष्ठ संबंध अधोरेखित करते. शिवाय, आमचा डेटा PPA च्या ताणाखाली बायोजेनेसिस आणि चयापचयाच्या ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनातील लक्षणीय अनियमितता दर्शवतो.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 आणि DRP1 ही जनुके मायटोकाँड्रियल विखंडन, संलयन आणि गतिशीलतेच्या मुख्य नियामकांपैकी आहेत37,48,49. मायटोकाँड्रियल गतिशीलतेमध्ये इतरही अनेक जनुके सामील आहेत, तथापि, STOML2, OPA1 आणि MFN2 हे पूर्वी ASD गटांमध्ये भिन्नपणे मिथाइलेटेड असल्याचे आढळले आहे,16 आणि अनेक स्वतंत्र अभ्यासांनी मायटोकाँड्रियल तणावाच्या प्रतिसादात या ट्रान्सक्रिप्शन घटकांमध्ये बदल झाल्याचे नोंदवले आहे50,51. 52. 3 mM आणि 5 mM PPA उपचाराने OPA1 आणि STOML2 या दोन्हींची अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या कमी झाली (आकृती 3e, f). OPA1 हे MFN1 आणि 2 सोबत थेट आंतरक्रियेद्वारे मायटोकाँड्रियल संलयनाच्या शास्त्रीय नियामकांपैकी एक आहे आणि क्रिस्टी रिमॉडेलिंग व मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजीमध्ये भूमिका बजावते53. मायटोकाँड्रियल गतिशीलतेमध्ये STOML2 ची नेमकी भूमिका अस्पष्ट आहे, परंतु पुरावे सूचित करतात की ते मायटोकाँड्रियल संलयन, जीवोत्पत्ती आणि मायटोफॅगीमध्ये भूमिका बजावते.
STOML2 हे मायटोकाँड्रियल रेस्पिरेटरी कपलिंग आणि रेस्पिरेटरी चेन कॉम्प्लेक्सच्या निर्मितीमध्ये सहभागी असते54,55 आणि कर्करोगाच्या पेशींची चयापचय वैशिष्ट्ये मोठ्या प्रमाणात बदलत असल्याचे दिसून आले आहे56. अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की STOML2 हे BAN आणि कार्डिओलिपिन यांच्याशी संवाद साधून मायटोकाँड्रियल मेम्ब्रेन पोटेन्शियल आणि बायोजेनेसिसला प्रोत्साहन देते55, 57, 58. याव्यतिरिक्त, स्वतंत्र अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की STOML2 आणि PINK1 यांच्यातील संवाद मायटोफॅगीचे नियमन करतो59,60. विशेष म्हणजे, STOML2 हे MFN2 शी थेट संवाद साधून त्याला स्थिर करते आणि OPA1 च्या ऱ्हासासाठी जबाबदार असलेल्या प्रोटीएजला रोखून लांब OPA1 आयसोफॉर्म्सना स्थिर करण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावते53,61,62. PPA अभिक्रियांमध्ये दिसून आलेली STOML2 अभिव्यक्तीतील घट या फ्यूजन प्रथिनांना युबिक्विटिन- आणि प्रोटीसोम-अवलंबित मार्गांद्वारे ऱ्हासासाठी अधिक संवेदनशील बनवू शकते48. जरी PPA ला दिलेल्या गतिशील प्रतिसादात STOML2 आणि OPA1 ची नेमकी भूमिका अस्पष्ट असली तरी, या फ्यूजन जनुकांच्या कमी झालेल्या अभिव्यक्तीमुळे (आकृती 3) फिशन आणि फ्यूजनमधील संतुलन बिघडू शकते आणि त्यामुळे माइटोकॉन्ड्रियाचा आकार कमी होऊ शकतो (आकृती 3). 1).
दुसरीकडे, २४ तासांनंतर OPA1 प्रथिनाची अभिव्यक्ती अपरिवर्तित राहिली, तर PPA उपचारांनंतर MFN1, MFN2 किंवा DRP1 च्या mRNA आणि प्रथिनांच्या पातळीत लक्षणीय बदल झाला नाही (आकृती ३g-i, आकृती ४). यावरून असे सूचित होऊ शकते की मायटोकाँड्रियल फ्यूजन आणि फिशनमध्ये सामील असलेल्या या घटकांच्या नियमनात कोणतेही बदल होत नाहीत. तथापि, हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की या चारही जनुकांचे नियमन पोस्टट्रान्सक्रिप्टोनल मॉडिफिकेशन्स (PTMs) द्वारे देखील केले जाते, जे प्रथिनांच्या कार्यावर नियंत्रण ठेवतात. OPA1 मध्ये आठ पर्यायी स्प्लिस व्हेरिएंट्स आहेत जे मायटोकाँड्रियामध्ये प्रोटिओलिटिकली कापले जाऊन दोन भिन्न आयसोफॉर्म्स तयार करतात 63. लांब आणि लहान आयसोफॉर्म्समधील संतुलन शेवटी मायटोकाँड्रियल फ्यूजन आणि मायटोकाँड्रियल नेटवर्कच्या देखभालीमध्ये OPA1 ची भूमिका ठरवते64. DRP1 चे कार्य कॅल्शियम/कॅल्मोड्युलिन-डिपेंडेंट प्रोटीन कायनेज II (CaMKII) फॉस्फोरायलेशनद्वारे नियंत्रित केले जाते, तर DRP1 चे डिग्रेडेशन युबिक्विटिनेशन आणि SUMOylation द्वारे नियंत्रित केले जाते65. शेवटी, DRP1 आणि MFN1/2 दोन्ही GTPases आहेत, त्यामुळे मायटोकाँड्रियामधील GTP उत्पादनाच्या दरामुळे त्यांच्या कार्यावर परिणाम होऊ शकतो 66. म्हणून, जरी या प्रथिनांची अभिव्यक्ती स्थिर राहिली तरी, हे प्रथिनांचे कार्य किंवा स्थानिकीकरण अपरिवर्तित असल्याचे दर्शवत नाही 67,68. खरे तर, विद्यमान PTM प्रथिन संच अनेकदा तीव्र ताण प्रतिसादांना मध्यस्थी करण्यासाठी जबाबदार असलेल्या संरक्षणाची पहिली फळी म्हणून काम करतात. आमच्या मॉडेलमध्ये मध्यम चयापचय ताणाच्या उपस्थितीत, अशी शक्यता आहे की PTM, mRNA किंवा प्रथिन स्तरावर या जनुकांच्या अतिरिक्त सक्रियतेची आवश्यकता न भासता, मायटोकाँड्रियल अखंडता पुरेशी पुनर्संचयित करण्यासाठी फ्यूजन आणि फिशन प्रथिनांच्या वाढीव कार्याला प्रोत्साहन देते.
एकत्रितपणे पाहता, वरील डेटा मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजीचे गुंतागुंतीचे आणि वेळेवर अवलंबून असलेले नियमन आणि या यंत्रणा स्पष्ट करण्यातील आव्हाने अधोरेखित करतो. जीन अभिव्यक्तीचा अभ्यास करण्यासाठी, सर्वप्रथम पाथवेमधील विशिष्ट लक्ष्य जीन्स ओळखणे आवश्यक आहे. तथापि, आमचा डेटा दर्शवितो की एकाच पाथवेमधील जीन्स एकाच ताणाला सारख्याच प्रकारे प्रतिसाद देत नाहीत. खरं तर, मागील अभ्यासांनी दाखवले आहे की एकाच पाथवेमधील भिन्न जीन्स वेगवेगळे तात्कालिक प्रतिसाद प्रोफाइल दर्शवू शकतात30,46. याव्यतिरिक्त, अशा गुंतागुंतीच्या पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल यंत्रणा आहेत ज्या ट्रान्सक्रिप्शन आणि जीन कार्यांमधील संबंधात व्यत्यय आणतात. प्रोटिओमिक अभ्यास PTMs आणि प्रथिन कार्यांच्या परिणामाबद्दल अंतर्दृष्टी प्रदान करू शकतात, परंतु त्यात कमी-थ्रूपुट पद्धती, उच्च सिग्नल-टू-नॉइज रेशो आणि खराब रिझोल्यूशन यांसारखी आव्हाने देखील आहेत.
या संदर्भात, TEM आणि MEL वापरून मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजीचा अभ्यास करणे, मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्स आणि कार्य यांच्यातील संबंध आणि त्याचा रोगावर कसा प्रभाव पडतो याबद्दलच्या मूलभूत प्रश्नांची उत्तरे देण्याची मोठी क्षमता बाळगते. सर्वात महत्त्वाचे म्हणजे, TEM हे मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शन आणि डायनॅमिक्सचा एक एकत्रित अंतिम बिंदू म्हणून मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजी मोजण्यासाठी एक थेट पद्धत प्रदान करते51. MEL देखील त्रिमितीय पेशीय वातावरणात फिशन आणि फ्यूजन घटनांचे व्हिज्युअलायझेशन करण्यासाठी एक थेट पद्धत प्रदान करते, ज्यामुळे जीन एक्सप्रेशनमध्ये बदल नसतानाही डायनॅमिक मायटोकाँड्रियल रिमॉडेलिंगचे प्रमाणीकरण करणे शक्य होते33. येथे आम्ही दुय्यम मायटोकाँड्रियल रोगांमध्ये मायटोकाँड्रियल इमेजिंग तंत्रांची उपयुक्तता अधोरेखित करतो. या रोगांचे वैशिष्ट्य म्हणजे तीव्र मायटोकाँड्रियल नुकसानीऐवजी मायटोकाँड्रियल नेटवर्कच्या सूक्ष्म रिमॉडेलिंगद्वारे दर्शविला जाणारा दीर्घकालीन सौम्य चयापचय ताण. तथापि, दीर्घकालीन ताणाखाली मायटोसिस टिकवून ठेवण्यासाठी आवश्यक असलेल्या मायटोकाँड्रियल भरपाईचे गंभीर कार्यात्मक परिणाम होतात. न्यूरोसायन्सच्या संदर्भात, या भरपाई यंत्रणांची अधिक चांगली समज मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनशी संबंधित प्लीओट्रॉपिक न्यूरोपॅथॉलॉजीबद्दल महत्त्वाची माहिती देऊ शकते.
सरतेशेवटी, आमचा डेटा न्यूरॉनल मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्स नियंत्रित करणाऱ्या जीन एक्सप्रेशन, प्रोटीन मॉडिफिकेशन्स आणि प्रोटीन ॲक्टिव्हिटी यांच्यातील गुंतागुंतीच्या आंतरक्रियांचे कार्यात्मक परिणाम समजून घेण्यासाठी इमेजिंग तंत्रांची उपयुक्तता अधोरेखित करतो. ASD च्या मायटोकाँड्रियल घटकाची सखोल माहिती मिळवण्यासाठी आम्ही न्यूरॉनल सेल मॉडेलमध्ये मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शनचे मॉडेलिंग करण्यासाठी PPA चा वापर केला. PPA ने उपचार केलेल्या SH-SY5Y पेशींमध्ये मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजीमध्ये बदल दिसून आले: मायटोकाँड्रिया लहान आणि गोलाकार झाले, आणि TEM द्वारे निरीक्षण केल्यावर क्रिस्टी अस्पष्ट दिसत होत्या. MEL विश्लेषण दर्शवते की सौम्य मेटाबोलिक स्ट्रेसला प्रतिसाद म्हणून मायटोकाँड्रियल नेटवर्क टिकवून ठेवण्यासाठी फिशन आणि फ्युजन घटनांमध्ये वाढ होण्यासोबतच हे बदल घडतात. शिवाय, PPA मायटोकाँड्रियल मेटाबोलिझम आणि होमियोस्टॅसिसच्या ट्रान्सक्रिप्शनल रेग्युलेशनमध्ये लक्षणीय व्यत्यय आणते. आम्ही cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, आणि OPA1 यांना PPA स्ट्रेसमुळे विस्कळीत होणारे प्रमुख मायटोकाँड्रियल रेग्युलेटर्स म्हणून ओळखले, जे PPA-प्रेरित मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजी आणि कार्यातील बदलांमध्ये मध्यस्थी करण्याची भूमिका बजावू शकतात. जीन एक्सप्रेशन आणि प्रोटीन ॲक्टिव्हिटी, लोकलायझेशन आणि पोस्ट-ट्रान्सलेशनल मॉडिफिकेशन्समधील PPA-प्रेरित तात्कालिक बदलांचे अधिक चांगल्या प्रकारे वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी भविष्यातील अभ्यासांची आवश्यकता आहे. आमचा डेटा मायटोकाँड्रियल ताण प्रतिसादात मध्यस्थी करणाऱ्या नियामक यंत्रणांची गुंतागुंत आणि परस्परावलंबित्व अधोरेखित करतो आणि अधिक लक्ष्यित यांत्रिक अभ्यासांसाठी TEM व इतर इमेजिंग तंत्रांची उपयुक्तता दर्शवतो.
SH-SY5Y सेल लाइन (ECACC, 94030304-1VL) सिग्मा-अल्ड्रिचकडून खरेदी करण्यात आली. SH-SY5Y पेशी 37 °C, 5% CO2 तापमानावर, 25 cm2 फ्लास्कमध्ये डल्बेकोच्या सुधारित ईगल माध्यम/F-12 पोषक मिश्रण (DMEM/F-12) आणि एल-ग्लुटामाइन (SC09411, सायन्ससेल) मध्ये वाढवण्यात आल्या. या फ्लास्कमध्ये 20% फीटल बोवाइन सीरम (FBS) (10493106, थर्मोफिशर सायंटिफिक) आणि 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (P4333-20ML, सिग्मा-अल्ड्रिच) पूरक म्हणून देण्यात आले. ०.०५% ट्रायप्सिन-ईडीटीए (१५४०००५४, थर्मोफिशर सायंटिफिक) वापरून पेशींचे ८०% एकत्रीकरणापर्यंत उपसंवर्धन करण्यात आले, ३०० g वर सेंट्रीफ्यूज केले गेले आणि अंदाजे ७ × १०⁵ पेशी/मिली घनतेने प्लेटवर पसरवले गेले. सर्व प्रयोग पॅसेज १९-२२ मधील अविभेदित SH-SY5Y पेशींवर करण्यात आले. पीपीए हे NaP स्वरूपात दिले जाते. NaP पावडर (CAS क्रमांक १३७-४०-६, रासायनिक सूत्र C₃H₅NaO₂, P५४३६-१००G, सिग्मा-अल्ड्रिच) कोमट मिलीक्यू पाण्यात १ M सांद्रतेपर्यंत विरघळवा आणि ४ °C तापमानावर साठवा. उपचाराच्या दिवशी, हे द्रावण १ M पीपीए वापरून सीरम-मुक्त माध्यमात (एल-ग्लुटामाइनसह DMEM/F-१२) ३ mM ​​आणि ५ mM पीपीए पर्यंत विरल करा. सर्व प्रयोगांसाठी उपचार सांद्रता PPA शिवाय (0 mM, नियंत्रण), 3 mM, आणि 5 mM PPA होत्या. प्रयोग किमान तीन जैविक प्रतिकृतींमध्ये केले गेले.
SH-SY5Y पेशी 25 cm⁻³ फ्लास्कमध्ये 5.5 × 10⁵ पेशी/ml या दराने पेरण्यात आल्या आणि 24 तास वाढवण्यात आल्या. 24 तासांच्या इनक्यूबेशनपूर्वी फ्लास्कमध्ये PPA उपचार टाकण्यात आला. सामान्य सस्तन प्राण्यांच्या ऊतींच्या सबकल्चर प्रोटोकॉलनुसार (वर वर्णन केल्याप्रमाणे) पेशींचे गोळे (सेल पेलेट्स) गोळा करा. पेशींचा गोळा 100 µl 2.5% ग्लुटाराल्डिहाइड, 1× PBS मध्ये पुन्हा विरघळवा आणि प्रक्रियेपर्यंत 4 °C तापमानावर साठवा. पेशींचा गोळा तयार करण्यासाठी आणि 2.5% ग्लुटाराल्डिहाइड, 1× PBS द्रावण काढून टाकण्यासाठी SH-SY5Y पेशींना थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले. गाळ डिस्टिल्ड वॉटरमध्ये तयार केलेल्या 4% ॲगारोज जेलमध्ये पुन्हा विरघळवा (ॲगारोज आणि गाळाच्या प्रमाणाचे गुणोत्तर 1:1 आहे). ॲगारोजचे तुकडे सपाट प्लेट्सवरील ग्रिडवर ठेवण्यात आले आणि उच्च-दाब गोठवण्यापूर्वी त्यांना 1-हेक्साडेसीनचा लेप देण्यात आला. नमुने 100% कोरड्या ॲसिटोनमध्ये -90°C तापमानावर 24 तासांसाठी गोठवण्यात आले. नंतर तापमान -80°C पर्यंत वाढवण्यात आले आणि 1% ऑस्मियम टेट्रॉक्साइड आणि 0.1% ग्लुटाराल्डिहाइडचे द्रावण टाकण्यात आले. नमुने 24 तासांसाठी -80°C तापमानावर ठेवण्यात आले. यानंतर, तापमान अनेक दिवसांमध्ये हळूहळू खोलीच्या तापमानापर्यंत वाढवण्यात आले: -80°C पासून -50°C पर्यंत 24 तासांसाठी, -30°C पर्यंत 24 तासांसाठी, -10°C पर्यंत 24 तासांसाठी आणि शेवटी खोलीच्या तापमानापर्यंत.
क्रायोजेनिक तयारीनंतर, नमुन्यांमध्ये रेझिन भरण्यात आले आणि लायका रायशर्ट अल्ट्राकटएस अल्ट्रामिक्रोतोम (लायका मायक्रोसिस्टम्स) वापरून अतिसूक्ष्म छेद (∼१०० एनएम) तयार करण्यात आले. या छेदांना २% युरॅनिल ॲसिटेट आणि लेड सायट्रेटने रंगवण्यात आले. नमुन्यांचे निरीक्षण २०० केव्ही (लॅब६ ट्रान्समीटर) वर चालणाऱ्या एफईआय टेक्नाई २० ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (थर्मोफिशर (पूर्वीचे एफईआय), आइंडहोवेन, नेदरलँड्स) आणि ट्रिडियम एनर्जी फिल्टरने सुसज्ज असलेल्या गॅटन सीसीडी कॅमेरा (गॅटन, यूके) वापरून करण्यात आले.
प्रत्येक तांत्रिक प्रतिकृतीमध्ये, किमान २४ एकल पेशी प्रतिमा मिळवल्या गेल्या, ज्यामुळे एकूण २६६ प्रतिमा झाल्या. सर्व प्रतिमांचे विश्लेषण 'रिजन ऑफ इंटरेस्ट (ROI) मॅक्रो' आणि 'माइटोकॉन्ड्रिया मॅक्रो' वापरून केले गेले. माइटोकॉन्ड्रिया मॅक्रो प्रकाशित पद्धतींवर आधारित आहे¹⁷,³¹,³² आणि तो फिजी/इमेजजे६९ मध्ये टीईएम प्रतिमांच्या अर्ध-स्वयंचलित बॅच प्रक्रियेस अनुमती देतो. थोडक्यात: प्रतिमा उलटी केली जाते आणि रोलिंग बॉल बॅकग्राउंड सबट्रॅक्शन (६० पिक्सेल त्रिज्या), एफएफटी बँडपास फिल्टर (अनुक्रमे ६० आणि ८ पिक्सेलची वरची आणि खालची मर्यादा वापरून) आणि ५% च्या ओरिएंटेशन टॉलरन्ससह व्हर्टिकल लाइन सप्रेशन वापरून उलटी केली जाते. प्रक्रिया केलेल्या प्रतिमेला मॅक्सिमम एन्ट्रॉपी अल्गोरिदम वापरून स्वयंचलितपणे थ्रेशोल्ड केले जाते आणि एक बायनरी मास्क तयार केला जातो. मूळ टीईएम प्रतिमांमधील हाताने निवडलेल्या आरओआयशी संबंधित प्रतिमा क्षेत्रे काढली गेली, ज्यात माइटोकॉन्ड्रियाचे वैशिष्ट्य दर्शवले गेले आणि प्लाझ्मा पडदा व इतर उच्च-कॉन्ट्रास्ट क्षेत्रे वगळण्यात आली. प्रत्येक काढलेल्या ROI साठी, 600 पिक्सेलपेक्षा मोठ्या बायनरी कणांचे विश्लेषण केले गेले आणि Fiji/ImageJ च्या अंगभूत मापन फंक्शन्सचा वापर करून कणांचे क्षेत्रफळ, परिमिती, प्रमुख आणि गौण अक्ष, फेरेट व्यास, गोलाकारपणा आणि वर्तुळाकारपणा मोजण्यात आले. मेरिल, फ्लिपो आणि स्ट्रॅक (2017) यांच्या अभ्यासानुसार, या डेटामधून क्षेत्रफळ², कणांचे गुणोत्तर (प्रमुख ते गौण अक्षांचे गुणोत्तर) आणि आकार घटक (FF) यांची गणना करण्यात आली, जिथे FF = परिमिती²/4π x क्षेत्रफळ. पॅरामीट्रिक सूत्राची व्याख्या मेरिल, फ्लिपो आणि स्ट्रॅक (2017) यांच्या अभ्यासात आढळू शकते. नमूद केलेले मॅक्रो GitHub वर उपलब्ध आहेत (डेटा उपलब्धता विवरण पहा). सरासरी, प्रत्येक PPA ट्रीटमेंटसाठी अंदाजे 5,600 कणांचे विश्लेषण केले गेले, ज्यामुळे एकूण अंदाजे 17,000 कण झाले (डेटा दर्शविलेला नाही).
SH-SH5Y पेशींना रात्रभर चिकटून राहण्यासाठी ८-चेंबर कल्चर डिशेसमध्ये (थर्मोफिशर, #१५५४११) ठेवण्यात आले आणि नंतर TMRE १:१००० (थर्मोफिशर, #T६६९) आणि होचस्ट ३३३४२ १:२०० (सिग्मा-अल्ड्रिच, H६०२४) सह इनक्यूबेट करण्यात आले. रंगाई. १० मिनिटांच्या वातावरणात ४०५ एनएम आणि ५६१ एनएम लेझर्स वापरून प्रतिमा मिळवण्यात आल्या, आणि १२ त्यानंतरच्या वेळेच्या टप्प्यांवर इमेज फ्रेम्समध्ये ०.२ μm च्या एझेड स्टेपसह १० इमेज मायक्रोग्राफ्स असलेले झेड-स्टॅक्स म्हणून मूळ प्रतिमा मिळवण्यात आल्या. कार्ल झाईस LSM780 ELYRA PS.1 सुपर-रिझोल्यूशन प्लॅटफॉर्म (कार्ल झाईस, ओबरकोचेन, जर्मनी) वापरून LCI प्लॅन ॲपोक्रोमेट १००x/१.४ ऑइल DIC M27 लेन्सद्वारे प्रतिमा गोळा करण्यात आल्या. फ्यूजन आणि फिशन घटना, मायटोकाँड्रियल संरचनांची सरासरी संख्या आणि प्रति सेल सरासरी मायटोकाँड्रियल व्हॉल्यूम मोजण्यासाठी पूर्वी वर्णन केलेल्या पाइपलाइन आणि इमेजजे प्लगइनचा वापर करून इमेजजे मध्ये प्रतिमांचे विश्लेषण केले गेले33. एमईएल मॅक्रो गिटहबवर उपलब्ध आहेत (डेटा उपलब्धता विवरण पहा).
उपचारापूर्वी २४ तासांसाठी, SH-SY5Y पेशी सहा-वेल प्लेट्समध्ये ०.३ × १०⁶ पेशी/मिली घनतेने वाढवण्यात आल्या. क्विक-आरएनए™ मिनिप्रेप प्रोटोकॉल (ZR R1055, झायमो रिसर्च) वापरून आरएनए काढण्यात आले, ज्यात थोडे बदल करण्यात आले: प्रत्येक वेलमधून नमुना काढण्यापूर्वी त्यात ३०० μl आरएनए लायसिस बफर टाका आणि अंतिम टप्प्यात प्रत्येक नमुन्याचे ३० μl डीएनएज/आरएनएज इल्युशनने लायसिस करा. नॅनोड्रॉप एनडी-१००० यूव्ही-व्हिस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर वापरून सर्व नमुन्यांची संख्या आणि गुणवत्ता तपासण्यात आली. २०० μl आरआयपीए लायसिस बफर वापरून पेशी लायसेट्समधून एकूण प्रथिने मिळवण्यात आली आणि ब्रॅडफोर्ड प्रोटीन एसे⁷⁰ वापरून प्रथिनांची घनता मोजण्यात आली.
उत्पादकाच्या सूचनांनुसार, काही सुधारणांसह, टेट्रो™ सीडीएनए सिंथेसिस किट (BIO-65043, मेरिडियन बायोसायन्स) वापरून सीडीएनए संश्लेषण करण्यात आले. ०.७ ते १ मायक्रोग्रॅम एकूण आरएनए वापरून २०-मायक्रोलिटर अभिक्रियांमध्ये सीडीएनएचे संश्लेषण करण्यात आले. प्रायमर्सची निवड पूर्वी प्रकाशित झालेल्या शोधनिबंध ४२, ७१, ७२, ७३, ७४, ७५, ७६, ७७, ७८ (तक्ता S1) मधून करण्यात आली आणि सोबतचे प्रोब्स इंटिग्रेटेड डीएनए टेक्नॉलॉजीजच्या प्रायमरक्वेस्ट टूलचा वापर करून डिझाइन करण्यात आले. सर्व संबंधित जनुके केंद्रकीय B2M जनुकाच्या तुलनेत सामान्यीकृत करण्यात आली. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC आणि OPA1 यांची जनुकीय अभिव्यक्ती RT-qPCR द्वारे मोजण्यात आली. मास्टर मिक्समध्ये LUNA Taq पॉलिमरेज (M3003L, न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स), १० μM फॉरवर्ड आणि रिव्हर्स प्रायमर्स, cDNA, आणि PCR-ग्रेड पाण्याचा समावेश होता, ज्यामुळे प्रत्येक रिॲक्शनसाठी १० μL चे अंतिम व्हॉल्यूम तयार झाले. विभाजन आणि विखंडन जनुकांचे (DRP1, MFN1/2) एक्सप्रेशन TaqMan मल्टिप्लेक्स ॲसेज वापरून मोजले गेले. Luna युनिव्हर्सल प्रोब qPCR मास्टर मिक्स (M3004S, न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स) निर्मात्याच्या सूचनांनुसार किरकोळ बदलांसह वापरले गेले. मल्टिप्लेक्स RT-qPCR मास्टर मिक्समध्ये 1X LUNA Taq पॉलिमरेज, १० μM फॉरवर्ड आणि रिव्हर्स प्रायमर्स, १० μM प्रोब, cDNA, आणि PCR-ग्रेड पाण्याचा समावेश असतो, ज्यामुळे प्रत्येक रिॲक्शनसाठी २० μL चे अंतिम व्हॉल्यूम तयार होते. RT-qPCR हे रोटर-जीन Q ६-प्लेक्स (QIAGEN RG—सीरियल नंबर: R0618110) वापरून केले गेले. सायकलिंगच्या अटी तक्ता S1 मध्ये दर्शविल्या आहेत. सर्व cDNA नमुन्यांचे तिप्पट प्रवर्धन करण्यात आले आणि दहापट विरलतेच्या मालिकेचा वापर करून एक मानक वक्र तयार करण्यात आला. डेटाची पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करण्यासाठी, सायकल थ्रेशोल्ड स्टँडर्ड डेव्हिएशन (Ct) >0.5 असलेले तिप्पट नमुन्यांमधील आउटलायर्स विश्लेषणातून काढून टाकण्यात आले30,72. 2-ΔΔCt79 पद्धतीचा वापर करून सापेक्ष जीन अभिव्यक्तीची गणना करण्यात आली.
प्रथिनांचे नमुने (६० μg) लॅमली लोडिंग बफरमध्ये २:१ प्रमाणात मिसळले गेले आणि १२% रंगहीन प्रथिन जेलवर (बायो-रॅड #१६१०१८४) चालवले गेले. ट्रान्स-ब्लॉट टर्बो सिस्टीम (#१७०-४१५५, बायो-रॅड) वापरून प्रथिने पीव्हीडीएफ (पॉलीविनायलिडीन फ्लोराइड) मेम्ब्रेनवर (#१७०-८४१५६, बायो-रॅड) हस्तांतरित केली गेली. मेम्ब्रेन ब्लॉक करून योग्य प्राथमिक अँटीबॉडीज (OPA1, MFN1, MFN2, आणि DRP1) (१:१००० प्रमाणात विरल केलेले) सोबत ४८ तासांसाठी इनक्युबेट केले गेले, त्यानंतर दुय्यम अँटीबॉडीज (१:१०,०००) सोबत १ तासासाठी इनक्युबेट केले गेले. त्यानंतर क्लॅरिटी वेस्टर्न ईसीएल सबस्ट्रेट (#१७०-५०६१, बायो-रॅड) वापरून मेम्ब्रेनची प्रतिमा घेतली गेली आणि बायो-रॅड केमीडॉक एमपी सिस्टीम वापरून रेकॉर्ड केली गेली. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषणासाठी इमेजलॅब आवृत्ती ६.१ वापरली गेली. मूळ जेल आणि ब्लॉट आकृती S1 मध्ये दाखवले आहेत. अँटीबॉडीची माहिती तक्ता S2 मध्ये दिली आहे.
डेटा सेट्स किमान तीन स्वतंत्र नमुन्यांची सरासरी आणि सरासरीची मानक त्रुटी (SEM) म्हणून सादर केले आहेत. गॉसियन वितरण आणि समान मानक विचलन गृहीत धरून विश्लेषणास पुढे जाण्यापूर्वी, शॅपिरो-विल्क्स चाचणी वापरून डेटा सेट्सची सामान्यता तपासली गेली (अन्यथा नमूद केल्याशिवाय). सार्थकता (p < 0.05) निश्चित करण्यासाठी फिशरच्या MEL LSD (p < 0.05), एक-मार्गी ANOVA (उपचार विरुद्ध नियंत्रण सरासरी), आणि डनेटच्या बहुविध तुलना चाचणीचा वापर करून डेटा सेटचे विश्लेषण करण्याव्यतिरिक्त. महत्त्वपूर्ण p मूल्ये आलेखात *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 म्हणून दर्शविली आहेत. सर्व सांख्यिकीय विश्लेषणे आणि आलेख GraphPad Prism 9.4.0 वापरून केले आणि तयार केले गेले.
TEM प्रतिमा विश्लेषणासाठीचे फिजी/इमेजजे मॅक्रो गिटहबवर सार्वजनिकरित्या उपलब्ध आहेत: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. मायटोकॉन्ड्रियल इव्हेंट लोकेटर (MEL) मॅक्रो गिटहबवर सार्वजनिकरित्या उपलब्ध आहे: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
मेइलियाना ए., देवी एनएम आणि विजया ए. माइटोकॉन्ड्रिया: चयापचय, होमियोस्टॅसिस, ताण, वृद्धत्व आणि एपिजेनेटिक्सचे मुख्य नियामक. इंडोनेशियन. बायोमेडिकल सायन्स. जे. 13, 221–241 (2021).
बेन-शाचर, डी. स्किझोफ्रेनियामधील बहुआयामी मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शन, कॉम्प्लेक्स I एक संभाव्य पॅथॉलॉजिकल लक्ष्य म्हणून. स्किझोफ्रेनिया. रिसोर्स. 187, 3–10 (2017).
बोस, ए. आणि बील, एमएफ पार्किन्सन रोगातील मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन. जे. न्यूरोकेमिस्ट्री. 139, 216–231 (2016).
शर्मा व्हीके, सिंग टीजी आणि मेहता व्ही. तणावग्रस्त मायटोकाँड्रिया: अल्झायमर रोगातील आक्रमणाचे लक्ष्य. मायटोकाँड्रिया 59, 48–57 (2021).
बेलेंग्वेर पी., डुआर्टे जेएमएन, शूक पीएफ आणि फेरेरा जीके माइटोकॉन्ड्रिया आणि मेंदू: जैवऊर्जाशास्त्र आणि बरेच काही. न्यूरोटॉक्सिन्स. रिसोर्स. 36, 219–238 (2019).
रंगराजू, व्ही. व इतर. प्लीओट्रॉपिक मायटोकॉन्ड्रिया: न्यूरॉनल विकास आणि रोगांवर मायटोकॉन्ड्रियाचा प्रभाव. जे. न्यूरोसायन्स. 39, 8200–8208 (2019).
कार्डानो-रामोस, सी. आणि मोराईस, व्ही.ए. न्यूरॉन्समध्ये माइटोकॉन्ड्रियल जीवोत्पत्ती: कशी आणि कुठे. आंतरराष्ट्रीयता. जे. मोह्र. द सायन्स. 22, 13059 (2021).
यू, आर., लेंडाहल, यू., निस्टर, एम. आणि झाओ, जे. सस्तन प्राण्यांच्या मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्सचे नियमन: संधी आणि आव्हाने. फ्रंट. एंडोक्राइन. (लॉझान) 11, 374 (2020).
खाचो, एम. आणि स्लॅक, आर.एस. न्यूरोजेनेसिसच्या नियमनात माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स: विकसनशील ते प्रौढ मेंदूपर्यंत. डेव्हलपमेंट. डायनॅमिक. 247, 47–53 (2018).