Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीला मर्यादित CSS सपोर्ट आहे. सर्वोत्तम परिणामांसाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही तुमच्या ब्राउझरची नवीन आवृत्ती वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये कंपॅटिबिलिटी मोड अक्षम करा). दरम्यान, सतत सपोर्ट सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही स्टाइलिंग किंवा जावास्क्रिप्टशिवाय साइट दाखवत आहोत.
ऑटिझम स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर सारख्या न्यूरोडेव्हलपमेंटल डिसऑर्डरमध्ये मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनची भूमिका अभ्यासण्यासाठी प्रोपियोनिक अॅसिड (पीपीए) वापरले जाते. पीपीए हे मायटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस, मेटाबोलिझम आणि टर्नओव्हरमध्ये व्यत्यय आणण्यासाठी ओळखले जाते. तथापि, या यंत्रणांच्या जटिल तात्पुरत्या स्वरूपामुळे मायटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स, फिशन आणि फ्यूजनवर पीपीएचे परिणाम समस्याप्रधान राहतात. येथे, न्यूरॉनसारख्या SH-SY5Y पेशींमध्ये पीपीए मायटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर, मॉर्फोलॉजी आणि डायनॅमिक्सवर कसा परिणाम करते हे तपासण्यासाठी आम्ही पूरक परिमाणात्मक इमेजिंग तंत्रांचा वापर करतो. पीपीए (५ मिमी) मुळे मायटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र (पी < ०.०१), फेरेट व्यास आणि परिघ (पी < ०.०५) आणि क्षेत्र २ (पी < ०.०१) मध्ये लक्षणीय घट झाली. माइटोकॉन्ड्रियल इव्हेंट लोकेटर विश्लेषणाने विखंडन आणि फ्यूजन इव्हेंट्समध्ये लक्षणीय वाढ (पी < ०.०५) दर्शविली, ज्यामुळे तणावाच्या परिस्थितीत मायटोकॉन्ड्रियल नेटवर्कची अखंडता राखली गेली. याशिवाय, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) आणि OPA1 (p < 0.05) ची mRNA अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या कमी झाली. 01). हे तणावाच्या परिस्थितीत कार्य राखण्यासाठी माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी, बायोजेनेसिस आणि डायनॅमिक्सचे पुनर्निर्माण दर्शवते. आमचा डेटा माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्सवर PPA च्या परिणामांबद्दल नवीन अंतर्दृष्टी प्रदान करतो आणि माइटोकॉन्ड्रियल ताण प्रतिसादांमध्ये समाविष्ट असलेल्या जटिल नियामक यंत्रणेचा अभ्यास करण्यासाठी इमेजिंग तंत्रांच्या उपयुक्ततेवर प्रकाश टाकतो.
ऊर्जा उत्पादन आणि जैवसंश्लेषणातील त्यांच्या विशिष्ट भूमिकांव्यतिरिक्त, माइटोकॉन्ड्रियल विविध पेशीय कार्यांमध्ये अविभाज्य सहभागी आहेत. माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय हे कॅल्शियम सिग्नलिंग, चयापचय आणि रेडॉक्स होमिओस्टॅसिस, दाहक सिग्नलिंग, एपिजेनेटिक बदल, पेशी प्रसार, भिन्नता आणि प्रोग्राम केलेले पेशी मृत्यु यांचे एक प्रमुख नियामक आहे. विशेषतः, माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय न्यूरोनल विकास, जगणे आणि कार्यासाठी महत्त्वपूर्ण आहे आणि न्यूरोपॅथॉलॉजीच्या विविध अभिव्यक्तींमध्ये मोठ्या प्रमाणात गुंतलेले आहे2,3,4.
गेल्या दशकात, चयापचय स्थिती न्यूरोजेनेसिस, डिफरेंशनेशन, मॅच्युरिटी आणि प्लास्टिसिटीचे केंद्रीय नियामक म्हणून उदयास आली आहे5,6. अलिकडे, मायटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी आणि डायनॅमिक्स हे मायटोसिसचे विशेषतः महत्वाचे घटक बनले आहेत, ही एक गतिमान प्रक्रिया आहे जी पेशींमध्ये निरोगी मायटोकॉन्ड्रियाचा संचय राखते. मायटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स हे माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस आणि बायोएनर्जेटिक्सपासून ते माइटोकॉन्ड्रियल फिशन, फ्यूजन, ट्रान्सपोर्ट आणि क्लिअरन्स7,8 पर्यंतच्या जटिल परस्परावलंबी मार्गांद्वारे नियंत्रित केले जातात. यापैकी कोणत्याही एकात्मिक यंत्रणेचा व्यत्यय निरोगी मायटोकॉन्ड्रियल नेटवर्कच्या देखभालीला अडथळा आणतो आणि न्यूरोडेव्हलपमेंटसाठी त्याचे खोल कार्यात्मक परिणाम होतात9,10. खरंच, ऑटिझम स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर (ASD)11,12 सह अनेक मानसोपचार, न्यूरोडीजनरेटिव्ह आणि न्यूरोडेव्हलपमेंटल विकारांमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्सचे डिसरेग्युलेशन दिसून येते.
ASD हा एक विषम न्यूरोडेव्हलपमेंटल डिसऑर्डर आहे ज्यामध्ये एक जटिल अनुवांशिक आणि एपिजेनेटिक आर्किटेक्चर आहे. ASD ची अनुवांशिकता निर्विवाद आहे, परंतु अंतर्निहित आण्विक एटिओलॉजी अजूनही कमी समजली आहे. प्रीक्लिनिकल मॉडेल्स, क्लिनिकल अभ्यास आणि मल्टी-ओमिक्स आण्विक डेटासेट्समधून जमा होणारा डेटा ASD13,14 मध्ये मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनचे वाढते पुरावे प्रदान करतो. आम्ही यापूर्वी ASD असलेल्या रुग्णांच्या गटात जीनोम-वाइड डीएनए मेथिलेशन स्क्रीन केली आणि मायटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिक मार्गांवर क्लस्टर केलेले विभेदक मिथाइलेटेड जीन्स ओळखले. त्यानंतर आम्ही मायटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस आणि डायनॅमिक्सच्या केंद्रीय नियामकांचे विभेदक मिथाइलेशन नोंदवले, जे ASD16 मध्ये वाढलेल्या mtDNA कॉपी नंबर आणि बदललेल्या मूत्र चयापचय प्रोफाइलशी संबंधित होते. आमचा डेटा वाढत्या पुराव्या प्रदान करतो की मायटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स आणि होमिओस्टॅसिस ASD च्या पॅथोफिजियोलॉजीमध्ये मध्यवर्ती भूमिका बजावतात. म्हणून, मायटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स, मॉर्फोलॉजी आणि फंक्शनमधील संबंधांची यांत्रिक समज सुधारणे हे दुय्यम मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनद्वारे वैशिष्ट्यीकृत न्यूरोलॉजिकल रोगांवरील चालू संशोधनाचे एक प्रमुख ध्येय आहे.
माइटोकॉन्ड्रियल ताण प्रतिसादांमध्ये विशिष्ट जनुकांच्या भूमिकेचा अभ्यास करण्यासाठी आण्विक तंत्रांचा वापर केला जातो. तथापि, माइटोटिक नियंत्रण यंत्रणेच्या बहुआयामी आणि तात्पुरत्या स्वरूपामुळे हा दृष्टिकोन मर्यादित असू शकतो. शिवाय, माइटोकॉन्ड्रियल जनुकांची विभेदक अभिव्यक्ती ही कार्यात्मक बदलांचे अप्रत्यक्ष सूचक आहे, विशेषत: केवळ मर्यादित संख्येतील जनुकांचे विश्लेषण केले जाते. म्हणून, माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन आणि बायोएनर्जेटिक्सचा अभ्यास करण्यासाठी अधिक थेट पद्धती प्रस्तावित केल्या आहेत17. माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्सशी जवळून संबंधित आहे. माइटोकॉन्ड्रियल आकार, कनेक्टिव्हिटी आणि रचना ऊर्जा उत्पादन आणि माइटोकॉन्ड्रियल आणि पेशींच्या अस्तित्वासाठी महत्त्वपूर्ण आहेत5,18. शिवाय, माइटोसिसचे विविध घटक माइटोकॉन्ड्रियल आकारविज्ञानातील बदलांवर लक्ष केंद्रित करतात, जे माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनचे उपयुक्त अंतिम बिंदू म्हणून काम करू शकतात आणि त्यानंतरच्या यांत्रिक अभ्यासांसाठी आधार प्रदान करतात.
ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (TEM) वापरून माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजीचे थेट निरीक्षण केले जाऊ शकते, ज्यामुळे सेल्युलर अल्ट्रास्ट्रक्चरचा तपशीलवार अभ्यास करता येतो. TEM पेशींच्या लोकसंख्येमध्ये केवळ जीन ट्रान्सक्रिप्शन, प्रोटीन एक्सप्रेशन किंवा माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शनल पॅरामीटर्सवर अवलंबून राहण्याऐवजी वैयक्तिक मायटोकॉन्ड्रियलच्या रिझोल्यूशनवर माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टेचे मॉर्फोलॉजी, आकार आणि रचना थेट दृश्यमान करते17,19,20. याव्यतिरिक्त, TEM मायटोकॉन्ड्रियल आणि इतर ऑर्गेनेल्स, जसे की एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम आणि ऑटोफॅगोसोम्स, जे माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन आणि होमिओस्टॅसिसमध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावतात21,22 यांच्यातील परस्परसंवादाचा अभ्यास सुलभ करते. अशाप्रकारे, विशिष्ट मार्गांवर किंवा जनुकांवर लक्ष केंद्रित करण्यापूर्वी माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनचा अभ्यास करण्यासाठी हे TEM ला एक चांगला प्रारंभ बिंदू बनवते. माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन न्यूरोपॅथॉलॉजीसाठी अधिकाधिक संबंधित होत असताना, इन विट्रो न्यूरोनल मॉडेल्समध्ये माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी आणि डायनॅमिक्सचा थेट आणि परिमाणात्मक अभ्यास करण्यास सक्षम असणे स्पष्टपणे आवश्यक आहे.
या लेखात, आम्ही ऑटिझम स्पेक्ट्रम डिसऑर्डरमध्ये मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनच्या न्यूरोनल मॉडेलमध्ये मायटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्सचे परीक्षण करतो. आम्ही यापूर्वी ASD15 मध्ये प्रोपियोनिल-CoA कार्बोक्झिलेझ बीटा (PCCB) चे डिफरेंशियल मेथिलेशन नोंदवले होते, जे मायटोकॉन्ड्रियल प्रोपियोनिल-CoA कार्बोक्झिलेझ एन्झाइम PCC चे सबयुनिट आहे. PCC चे डिसरेग्युलेशन प्रोपियोनिल डेरिव्हेटिव्ह्जचे विषारी संचय होण्यास कारणीभूत असल्याचे ज्ञात आहे, ज्यामध्ये प्रोपियोनिक अॅसिड (PPA)23,24,25 समाविष्ट आहे. PPA ने न्यूरोनल मेटाबोलिझममध्ये व्यत्यय आणला आहे आणि व्हिव्होमध्ये वर्तन बदलले आहे असे दर्शविले गेले आहे आणि ASD26,27,28 मध्ये समाविष्ट असलेल्या न्यूरोडेव्हलपमेंटल मेकॅनिझमचा अभ्यास करण्यासाठी हे एक स्थापित प्राणी मॉडेल आहे. याव्यतिरिक्त, PPA ने इन विट्रोमध्ये मायटोकॉन्ड्रियल मेम्ब्रेन क्षमता, बायोजेनेसिस आणि श्वसनात व्यत्यय आणल्याचे नोंदवले गेले आहे आणि न्यूरॉन्समध्ये मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन मॉडेल करण्यासाठी मोठ्या प्रमाणावर वापरले गेले आहे29,30. तथापि, मायटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी आणि डायनॅमिक्सवर PPA-प्रेरित मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनचा प्रभाव कमी समजला आहे.
हा अभ्यास SH-SY5Y पेशींमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी, डायनॅमिक्स आणि फंक्शनवर PPA चे परिणाम मोजण्यासाठी पूरक इमेजिंग तंत्रांचा वापर करतो. प्रथम, आम्ही माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी आणि अल्ट्रास्ट्रक्चरमधील बदलांची कल्पना करण्यासाठी TEM पद्धत विकसित केली17,31,32. माइटोकॉन्ड्रियलचे गतिमान स्वरूप लक्षात घेता33, आम्ही PPA ताणाखाली विखंडन आणि संलयन घटना, माइटोकॉन्ड्रियल संख्या आणि आकारमान यांच्यातील संतुलनातील बदलांचे प्रमाण मोजण्यासाठी माइटोकॉन्ड्रियल इव्हेंट लोकलायझर (MEL) विश्लेषण देखील वापरले. शेवटी, आम्ही बायोजेनेसिस, विखंडन आणि संलयनात सहभागी असलेल्या जनुकांच्या अभिव्यक्तीतील बदलांशी माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी आणि गतिशीलता संबंधित आहेत का ते तपासले. एकत्रितपणे, आमचा डेटा माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्सचे नियमन करणाऱ्या यंत्रणेची जटिलता स्पष्ट करण्याचे आव्हान स्पष्ट करतो. SH-SY5Y पेशींमध्ये माइटोसिसचा मोजता येण्याजोगा अभिसरण बिंदू म्हणून माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजीचा अभ्यास करण्यात TEM ची उपयुक्तता आम्ही अधोरेखित करतो. याव्यतिरिक्त, आम्ही हे अधोरेखित करतो की चयापचय ताणाच्या प्रतिसादात गतिमान घटना देखील कॅप्चर करणाऱ्या इमेजिंग तंत्रांसह एकत्रित केल्यावर TEM डेटा सर्वात समृद्ध माहिती प्रदान करतो. न्यूरोनल सेल मायटोसिसला समर्थन देणाऱ्या आण्विक नियामक यंत्रणेचे पुढील वर्णन मज्जासंस्थेच्या मायटोकॉन्ड्रियल घटक आणि न्यूरोडीजनरेटिव्ह रोगांबद्दल महत्त्वपूर्ण अंतर्दृष्टी प्रदान करू शकते.
माइटोकॉन्ड्रियल ताण निर्माण करण्यासाठी, SH-SY5Y पेशींवर 3 mM आणि 5 mM सोडियम प्रोपियोनेट (NaP) वापरून PPA ने उपचार केले गेले. TEM पूर्वी, नमुने उच्च-दाब गोठवणे आणि गोठवणे वापरून क्रायोजेनिक नमुना तयारीच्या अधीन होते (आकृती 1a). आम्ही तीन जैविक प्रतिकृतींमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल लोकसंख्येचे आठ आकारशास्त्रीय पॅरामीटर्स मोजण्यासाठी स्वयंचलित माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिमा विश्लेषण पाइपलाइन विकसित केली. आम्हाला आढळले की PPA उपचाराने चार पॅरामीटर्समध्ये लक्षणीय बदल केले आहेत: क्षेत्र 2, क्षेत्र, परिमिती आणि फेरेट व्यास (आकृती 1b–e). क्षेत्र 2 मध्ये 3 mM आणि 5 mM PPA उपचार (अनुक्रमे p = 0.0183 आणि p = 0.002) (आकृती 1b) सह लक्षणीय घट झाली, तर क्षेत्र (p = 0.003), परिमिती (p = 0.0106) आणि फेरेट व्यास हे सर्व लक्षणीयरीत्या कमी झाले आहेत. नियंत्रण गटाच्या तुलनेत 5 mM उपचार गटात (आकृती 1c–e) लक्षणीय घट (p = 0.0172) झाली. क्षेत्रफळ आणि परिघातील लक्षणीय घट दर्शविते की 5 एमएम पीपीएने उपचार केलेल्या पेशींमध्ये लहान, अधिक गोलाकार मायटोकॉन्ड्रिया होते आणि हे मायटोकॉन्ड्रिया नियंत्रण पेशींपेक्षा कमी लांब होते. हे फेरेट व्यासातील लक्षणीय घटशी देखील सुसंगत आहे, एक स्वतंत्र पॅरामीटर जो कणांच्या कडांमधील सर्वात मोठ्या अंतरात घट दर्शवितो. क्रिस्टीच्या अल्ट्रास्ट्रक्चरमध्ये बदल दिसून आले: पीपीए स्ट्रेसच्या प्रभावाखाली क्रिस्टी कमी स्पष्ट झाले (आकृती 1a, पॅनेल बी). तथापि, सर्व प्रतिमा क्रिस्टीच्या अल्ट्रास्ट्रक्चरला स्पष्टपणे प्रतिबिंबित करत नाहीत, म्हणून या बदलांचे परिमाणात्मक विश्लेषण केले गेले नाही. हे टीईएम डेटा तीन संभाव्य परिस्थिती प्रतिबिंबित करू शकतात: (1) पीपीए विखंडन वाढवते किंवा फ्यूजनला प्रतिबंधित करते, ज्यामुळे विद्यमान मायटोकॉन्ड्रिया आकारात आकुंचन पावते; (2) वाढलेले बायोजेनेसिस नवीन, लहान मायटोकॉन्ड्रिया तयार करते किंवा (3) दोन्ही यंत्रणा एकाच वेळी प्रेरित करते. जरी या परिस्थिती टीईएमद्वारे ओळखल्या जाऊ शकत नाहीत, तरी लक्षणीय आकारिकीय बदल पीपीए स्ट्रेस अंतर्गत मायटोकॉन्ड्रियल होमिओस्टॅसिस आणि गतिशीलतेमध्ये बदल दर्शवितात. आम्ही नंतर या गतिशीलता आणि त्यांच्या अंतर्गत असलेल्या संभाव्य यंत्रणांचे अधिक वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी अतिरिक्त पॅरामीटर्सचा शोध घेतला.
प्रोपियोनिक अॅसिड (PPA) मायटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजीची पुनर्बांधणी करते. (a) प्रतिनिधी ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (TEM) प्रतिमा दर्शवितात की वाढत्या PPA उपचाराने मायटोकॉन्ड्रियल आकार कमी होतो आणि मायटोकॉन्ड्रियल लहान आणि अधिक गोलाकार होतो; अनुक्रमे 0 mM (उपचार न केलेले), 3 mM आणि 5 mM. लाल बाण मायटोकॉन्ड्रियल दर्शवितात. (b–e) PPA सह 24 तास उपचार केलेल्या SH-SY5Y पेशी TEM साठी तयार केल्या गेल्या आणि परिणामांचे विश्लेषण Fiji/ImageJ वापरून केले गेले. आठ पॅरामीटर्सपैकी चार पॅरामीटर्समध्ये नियंत्रण (उपचार न केलेले, 0 mM PPA) आणि उपचारित (3 mM आणि 5 mM PPA) पेशींमध्ये लक्षणीय फरक दिसून आला. (b) प्रदेश 2, (c) क्षेत्रफळ, (d) परिमिती, (e) फेरेट व्यास. लक्षणीय फरक निश्चित करण्यासाठी भिन्नता (नियंत्रण विरुद्ध उपचार) आणि डनेटची बहु-तुलना चाचणीचे एकतर्फी विश्लेषण वापरले गेले (p < 0.05). डेटा पॉइंट्स प्रत्येक वैयक्तिक पेशीसाठी सरासरी मायटोकॉन्ड्रियल मूल्य दर्शवतात आणि त्रुटी बार सरासरी ± SEM दर्शवतात. दाखवलेला डेटा n = 3 दर्शवितो, प्रत्येक प्रतिकृतीमध्ये किमान 24 पेशी; एकूण 266 प्रतिमांचे विश्लेषण केले गेले; * p < 0.05 दर्शवितो, ** p < 0.01 दर्शवितो.
माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स पीपीएला कसा प्रतिसाद देतात हे अधिक स्पष्ट करण्यासाठी, आम्ही टेट्रामेथिलरोहोडामाइन इथाइल एस्टर (TMRE) ने मायटोकॉन्ड्रिया रंगवले आणि 3 आणि 5 एमएम पीपीएवर 24 तासांनंतर मायटोकॉन्ड्रियाचे स्थानिकीकरण आणि प्रमाण निश्चित करण्यासाठी टाइम-लॅप्स मायक्रोस्कोपी आणि MEL विश्लेषण वापरले. विखंडन आणि संलयन घटनांवर उपचार. (आकृती 2a). MEL विश्लेषणानंतर, मायटोकॉन्ड्रियल संरचनांची संख्या आणि त्यांचे सरासरी आकारमान मोजण्यासाठी मायटोकॉन्ड्रियाचे पुढील विश्लेषण केले गेले. नियंत्रणाच्या तुलनेत ५ मिमी वर विखंडन [५.६ ± ०.३ (पी < ०.०५))] आणि फ्यूजन [५.४ ± ०.५ (पी < ०.०५)] आणि फ्यूजन [५.४ ± ०.५ (पी < ०.०५)] < ०.०५)] घटनांमध्ये लक्षणीय वाढ झाली, तर ३ [३२.६ ± २.१ (पी < ०.०५)] आणि ५ मिमी [३४.१ ± २.२ (पी < ०.०५)] (आकृती ३c) दोन्हीवर मायटोकॉन्ड्रियाची संख्या लक्षणीयरीत्या वाढली, तर प्रत्येक मायटोकॉन्ड्रियल रचनेचे सरासरी आकारमान अपरिवर्तित राहिले (आकृती ३c). ३d). एकत्रितपणे, हे सूचित करते की माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्सचे पुनर्निर्माण एक भरपाई देणारा प्रतिसाद म्हणून काम करते जो माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्कची अखंडता यशस्वीरित्या राखतो. 3 mM PPA वर विखंडन घटनांच्या संख्येत वाढ सूचित करते की माइटोकॉन्ड्रियल संख्येत वाढ अंशतः माइटोकॉन्ड्रियल फिशनमुळे आहे, परंतु सरासरी माइटोकॉन्ड्रियल व्हॉल्यूम मूलतः अपरिवर्तित राहिल्याने, अतिरिक्त भरपाई देणारा प्रतिसाद म्हणून बायोजेनेसिस नाकारता येत नाही. तथापि, हे डेटा TEM द्वारे निरीक्षण केलेल्या लहान, गोलाकार माइटोकॉन्ड्रियल संरचनांशी सुसंगत आहेत आणि PPA द्वारे प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्समध्ये लक्षणीय बदल देखील दर्शवितात.
प्रोपियोनिक अॅसिड (PPA) नेटवर्क अखंडता राखण्यासाठी डायनॅमिक माइटोकॉन्ड्रियल रीमॉडेलिंगला प्रेरित करते. SH-SY5Y पेशींचे संवर्धन केले गेले, त्यांना 3 आणि 5 mM PPA ने 24 तास उपचार केले गेले आणि TMRE आणि Hoechst 33342 ने रंगवले गेले आणि त्यानंतर MEL विश्लेषण केले गेले. (a) प्रत्येक स्थितीसाठी रंग दर्शविणारी प्रतिनिधी टाइम-लॅप्स मायक्रोस्कोपी प्रतिमा आणि वेळेनुसार 2 (t2) वर बायनराइज्ड कमाल तीव्रता प्रक्षेपण. प्रत्येक बायनरी प्रतिमेमध्ये दर्शविलेले निवडलेले प्रदेश कालांतराने गतिशीलता दर्शविण्याकरिता तीन वेगवेगळ्या टाइम फ्रेम (t1-t3) वर 3D मध्ये वाढवले ​​जातात आणि प्रदर्शित केले जातात; फ्यूजन इव्हेंट्स हिरव्या रंगात हायलाइट केले जातात; विखंडन इव्हेंट्स हिरव्या रंगात हायलाइट केले जातात. लाल रंगात प्रदर्शित केले जातात. (b) प्रत्येक स्थितीत डायनॅमिक इव्हेंट्सची सरासरी संख्या. (c) प्रत्येक पेशीमध्ये मायटोकॉन्ड्रियल स्ट्रक्चर्सची सरासरी संख्या. (d) प्रत्येक पेशीमध्ये प्रत्येक मायटोकॉन्ड्रियल स्ट्रक्चरचे सरासरी व्हॉल्यूम (µm3). दाखवलेला डेटा प्रत्येक उपचार गटातील n = 15 पेशींचे प्रतिनिधित्व करतो. दाखवलेले एरर बार सरासरी ± SEM, स्केल बार = 10 μm, * p < 0.05 दर्शवितात.
प्रोपियोनिक अॅसिड (PPA) मुळे माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्सशी संबंधित जनुकांचे ट्रान्सक्रिप्शनल सप्रेशन होते. SH-SY5Y पेशींवर २४ तासांसाठी ३ आणि ५ mM PPA ने उपचार केले गेले. RT-qPCR वापरून सापेक्ष जनुक परिमाणीकरण केले गेले आणि B2M मध्ये सामान्य केले गेले. माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस जीन्स (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 आणि (d) NFE2L2. माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन आणि फिशन जीन्स (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 आणि (i) DRP1. एकतर्फी ANOVA (नियंत्रण विरुद्ध उपचार) आणि डनेटच्या बहु-तुलना चाचणीचा वापर करून महत्त्वपूर्ण फरक (p < 0.05) तपासले गेले: * p < 0.05 दर्शविते, ** p < 0.01 दर्शविते आणि **** p < 0.0001 दर्शविते. बार सरासरी अभिव्यक्ती ± SEM दर्शवितात. दाखवलेला डेटा n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), आणि n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) जैविक प्रतिकृती दर्शवतो.
TEM आणि MEL विश्लेषणातून मिळालेल्या डेटावरून असे दिसून येते की PPA माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी आणि डायनॅमिक्समध्ये बदल करते. तथापि, या इमेजिंग तंत्रांमुळे या प्रक्रिया चालविणाऱ्या अंतर्निहित यंत्रणांमध्ये अंतर्दृष्टी मिळत नाही. म्हणून आम्ही PPA उपचारांना प्रतिसाद म्हणून माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स, बायोजेनेसिस आणि मायटोसिसच्या नऊ प्रमुख नियामकांच्या mRNA अभिव्यक्तीचे परीक्षण केले. आम्ही सेल मायलोमा ऑन्कोजीन (cMYC), न्यूक्लियर रेस्पिरेटरी फॅक्टर (NRF1), मायटोकॉन्ड्रियल ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर 1 (TFAM), NFE2-सारखे ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर BZIP (NFE2L2), गॅस्ट्रिन-सारखे प्रोटीन 2 (STOML2), ऑप्टिक नर्व्ह अ‍ॅट्रोफी 1 (OPA1), मायटोफ्यूसिन 1 (MFN1), मायटोफ्यूसिन 2 (MFN2) आणि डायनामिन-संबंधित प्रोटीन 1 (DRP1) चे 3 mM आणि 5 mM PPA सह 24 तासांच्या उपचारानंतर प्रमाणित केले. आम्हाला ३ मिमी (p = ०.००५३, p = ०.०४१५ आणि p < ०.०००१, अनुक्रमे) आणि ५ मिमी (p = ०.००३१, p = ०.०२३३, p < ०.०००१) पीपीए उपचार आढळले. (आकृती ३अ–क). एमआरएनए अभिव्यक्तीतील घट डोस-अवलंबित होती: ३ मिमी वर cMYC, NRF1 आणि TFAM ची अभिव्यक्ती अनुक्रमे ५.७, २.६ आणि १.९ पट कमी झाली आणि ५ मिमी वर ११.२, ३ आणि २.२ पट कमी झाली. याउलट, मध्यवर्ती रेडॉक्स बायोजेनेसिस जीन NFE2L2 मध्ये पीपीएच्या कोणत्याही एकाग्रतेत बदल झाला नाही, जरी कमी झालेल्या अभिव्यक्तीचा समान डोस-अवलंबित ट्रेंड दिसून आला (आकृती ३डी).
आम्ही विखंडन आणि संलयनाच्या नियमनात सहभागी असलेल्या शास्त्रीय जनुकांच्या अभिव्यक्तीचे देखील परीक्षण केले. STOML2 हे संलयन, मायटोफॅगी आणि बायोजेनेसिसमध्ये सहभागी असल्याचे मानले जाते आणि त्याची अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या कमी झाली (p < 0.0001) 3 mM (2.4-पट बदल) आणि 5 mM (2.8-पट बदल) PPA (आकृती 1) ने. 3d). त्याचप्रमाणे, OPA1 संलयन जनुक अभिव्यक्ती 3 mM (1.6-पट बदल) आणि 5 mM (1.9-पट बदल) PPA (p = 0.006 आणि p = 0.0024, अनुक्रमे) (आकृती 3f) वर कमी झाली. तथापि, आम्हाला 24-तासांच्या PPA ताणाखाली MFN1, MFN2 किंवा विखंडन जनुक DRP1 च्या अभिव्यक्तीमध्ये लक्षणीय फरक आढळला नाही (आकृती 3g–i). याव्यतिरिक्त, आम्हाला आढळले की चार फ्यूजन आणि फिशन प्रथिनांचे स्तर (OPA1, MFN1, MFN2 आणि DRP1) समान परिस्थितीत बदलले नाहीत (आकृती 4a–d). हे लक्षात घेणे महत्वाचे आहे की हे डेटा वेळेतील एक बिंदू प्रतिबिंबित करतात आणि PPA ताणाच्या सुरुवातीच्या टप्प्यात प्रथिने अभिव्यक्ती किंवा क्रियाकलाप पातळीतील बदल प्रतिबिंबित करू शकत नाहीत. तथापि, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 आणि OPA1 च्या अभिव्यक्तीतील लक्षणीय घट माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिझम, बायोजेनेसिस आणि डायनॅमिक्सचे महत्त्वपूर्ण ट्रान्सक्रिप्शनल डिसरेग्युलेशन दर्शवते. याव्यतिरिक्त, हे डेटा माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शनमधील एंड-स्टेट बदलांचा थेट अभ्यास करण्यासाठी इमेजिंग तंत्रांच्या उपयुक्ततेवर प्रकाश टाकतात.
प्रोपियोनिक अॅसिड (PPA) उपचारानंतर फ्यूजन आणि फिशन फॅक्टर प्रोटीन पातळी बदलली नाही. SH-SY5Y पेशींवर 24 तासांसाठी 3 आणि 5 mM PPA ने उपचार केले गेले. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषणाद्वारे प्रथिन पातळीचे प्रमाण निश्चित केले गेले आणि अभिव्यक्ती पातळी एकूण प्रथिनांपर्यंत सामान्य केली गेली. सरासरी प्रथिन अभिव्यक्ती आणि लक्ष्य आणि एकूण प्रथिनांचे प्रतिनिधित्व करणारे वेस्टर्न ब्लॉट दर्शविले आहेत. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. बार सरासरी ± SEM दर्शवितात आणि दाखवलेला डेटा n = 3 जैविक प्रतिकृतींचे प्रतिनिधित्व करतो. भिन्नतेचे एकतर्फी विश्लेषण आणि डनेटच्या चाचणीचा वापर करून अनेक तुलना (p < 0.05) केल्या गेल्या. मूळ जेल आणि ब्लॉट आकृती S1 मध्ये दर्शविले आहेत.
माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन हे चयापचय, हृदय व रक्तवाहिन्यासंबंधी आणि स्नायूंच्या आजारांपासून ते न्यूरोलॉजिकल रोगांपर्यंतच्या बहुप्रणाली रोगांशी संबंधित आहे1,10. अनेक न्यूरोडीजनरेटिव्ह आणि न्यूरोडीजनरेटिव्ह रोग माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनशी संबंधित आहेत, जे मेंदूच्या संपूर्ण आयुष्यभर या ऑर्गेनेल्सचे महत्त्व अधोरेखित करतात. या आजारांमध्ये पार्किन्सन रोग, अल्झायमर रोग आणि ASD3,4,18 यांचा समावेश आहे. तथापि, या रोगांचा अभ्यास करण्यासाठी मेंदूच्या ऊतींपर्यंत पोहोचणे कठीण आहे, विशेषतः यांत्रिक पातळीवर, ज्यामुळे सेल्युलर मॉडेल सिस्टम एक आवश्यक पर्याय बनतात. या अभ्यासात, आम्ही न्यूरोनल रोगांमध्ये, विशेषतः ऑटिझम स्पेक्ट्रम विकारांमध्ये आढळणाऱ्या माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनची पुनरावृत्ती करण्यासाठी PPA-उपचारित SH-SY5Y पेशी वापरून सेल्युलर मॉडेल सिस्टम वापरतो. न्यूरॉन्समधील माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्सचा अभ्यास करण्यासाठी या PPA मॉडेलचा वापर केल्याने ASD च्या एटिओलॉजीमध्ये अंतर्दृष्टी मिळू शकते.
आम्ही माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजीमधील बदल पाहण्यासाठी TEM वापरण्याची शक्यता शोधली. हे लक्षात ठेवणे महत्त्वाचे आहे की TEM चा वापर त्याची प्रभावीता वाढवण्यासाठी योग्यरित्या केला पाहिजे. क्रायो-नमुने तयार केल्याने एकाच वेळी सेल्युलर घटक निश्चित करून आणि कलाकृतींची निर्मिती कमी करून न्यूरोनल संरचनांचे चांगले जतन करता येते34. याच्याशी सुसंगत, आम्ही निरीक्षण केले की न्यूरॉनसारख्या SH-SY5Y पेशींमध्ये अखंड सबसेल्युलर ऑर्गेनेल्स आणि वाढवलेला माइटोकॉन्ड्रिया (आकृती 1a) होता. हे न्यूरोनल सेल मॉडेल्समध्ये माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजीचा अभ्यास करण्यासाठी क्रायोजेनिक तयारी तंत्रांची उपयुक्तता अधोरेखित करते. TEM डेटाच्या वस्तुनिष्ठ विश्लेषणासाठी परिमाणात्मक मोजमाप महत्त्वाचे असले तरी, माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी बदलांची पुष्टी करण्यासाठी कोणते विशिष्ट पॅरामीटर्स मोजले पाहिजेत यावर अद्याप एकमत नाही. माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी17,31,32 चे परिमाणात्मकपणे परीक्षण केलेल्या मोठ्या संख्येने अभ्यासांवर आधारित, आम्ही एक स्वयंचलित माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिमा विश्लेषण पाइपलाइन विकसित केली जी आठ मॉर्फोलॉजिकल पॅरामीटर्स मोजते, म्हणजे: क्षेत्रफळ, क्षेत्रफळ2, पैलू गुणोत्तर, परिमिती, वर्तुळाकारता, पदवी, फेरेट व्यास. आणि गोलाकारता.
त्यापैकी, PPA ने क्षेत्रफळ 2, क्षेत्रफळ, परिमिती आणि फेरेट व्यास लक्षणीयरीत्या कमी केला (आकृती 1b–e). यावरून असे दिसून आले की मायटोकॉन्ड्रिया लहान आणि अधिक गोलाकार झाला, जो PPA30-प्रेरित मायटोकॉन्ड्रियल ताणाच्या 72 तासांनंतर मायटोकॉन्ड्रियल क्षेत्रात घट दर्शविणाऱ्या मागील अभ्यासांशी सुसंगत आहे. ही आकारिकीय वैशिष्ट्ये मायटोकॉन्ड्रियल विखंडन दर्शवू शकतात, मायटोकॉन्ड्रियल नेटवर्कमधून खराब झालेले घटक वेगळे करण्यासाठी मायटोकॉन्ड्रियल 35,36,37 द्वारे त्यांचे ऱ्हास वाढविण्यासाठी एक आवश्यक प्रक्रिया. दुसरीकडे, सरासरी मायटोकॉन्ड्रियल आकारात घट वाढलेल्या बायोजेनेसिसशी संबंधित असू शकते, ज्यामुळे लहान नवजात मायटोकॉन्ड्रियल तयार होते. वाढलेले विखंडन किंवा बायोजेनेसिस मायटोकॉन्ड्रियल ताणाविरुद्ध मायटोसिस राखण्यासाठी भरपाई देणारी प्रतिक्रिया दर्शवते. तथापि, मायटोकॉन्ड्रियल वाढ कमी होणे, बिघडलेले फ्यूजन किंवा इतर परिस्थिती वगळता येत नाहीत.
जरी TEM द्वारे तयार केलेल्या उच्च-रिझोल्यूशन प्रतिमा वैयक्तिक मायटोकॉन्ड्रियाच्या पातळीवर आकारिकीय वैशिष्ट्यांचे निर्धारण करण्यास अनुमती देतात, तरी ही पद्धत एकाच वेळी द्विमितीय स्नॅपशॉट तयार करते. चयापचय ताणाच्या गतिमान प्रतिसादांचा अभ्यास करण्यासाठी, आम्ही TMRE ने मायटोकॉन्ड्रिया रंगवले आणि MEL विश्लेषणासह टाइम-लॅप्स मायक्रोस्कोपी वापरली, जी कालांतराने मायटोकॉन्ड्रियल नेटवर्कमधील बदलांचे उच्च-थ्रूपुट 3D व्हिज्युअलायझेशन करण्यास अनुमती देते33,38. आम्ही PPA ताणाखाली मायटोकॉन्ड्रियल गतिमानतेमध्ये सूक्ष्म परंतु महत्त्वपूर्ण बदल पाहिले (आकृती 2). 3 mM वर, विखंडन घटनांची संख्या लक्षणीयरीत्या वाढली, तर फ्यूजन घटना नियंत्रणाप्रमाणेच राहिल्या. 5 mM PPA वर विखंडन आणि फ्यूजन घटनांच्या संख्येत वाढ दिसून आली, परंतु हे बदल अंदाजे प्रमाणबद्ध होते, जे सूचित करते की विखंडन आणि फ्यूजन गतिज उच्च सांद्रतेवर समतोल गाठतात (आकृती 2b). सरासरी मायटोकॉन्ड्रियल व्हॉल्यूम 3 आणि 5 mM PPA दोन्हीवर अपरिवर्तित राहिला, जे दर्शवते की मायटोकॉन्ड्रियल नेटवर्कची अखंडता जतन केली गेली आहे (आकृती 2d). हे गतिमान माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क्सची सौम्य चयापचय ताणाला प्रतिसाद देण्याची क्षमता प्रतिबिंबित करते आणि नेटवर्क फ्रॅगमेंटेशन न करता होमिओस्टॅसिस प्रभावीपणे राखते. 3 mM PPA वर, विखंडनात वाढ नवीन समतोलाकडे संक्रमणाला प्रोत्साहन देण्यासाठी पुरेशी आहे, परंतु PPA च्या उच्च सांद्रतेमुळे होणाऱ्या ताणाला प्रतिसाद म्हणून अधिक सखोल गतिज पुनर्बांधणी आवश्यक आहे.
दोन्ही पीपीए स्ट्रेस एकाग्रतेवर मायटोकॉन्ड्रियाची संख्या वाढली, परंतु सरासरी मायटोकॉन्ड्रियल व्हॉल्यूममध्ये लक्षणीय बदल झाला नाही (आकृती 2c). हे वाढलेल्या बायोजेनेसिसमुळे किंवा वाढलेल्या विभाजनामुळे असू शकते; तथापि, सरासरी मायटोकॉन्ड्रियल व्हॉल्यूममध्ये लक्षणीय घट नसताना, बायोसिंथेसिस वाढण्याची शक्यता जास्त आहे. तथापि, आकृती 2 मधील डेटा दोन भरपाई यंत्रणेच्या अस्तित्वाचे समर्थन करतो: मायटोकॉन्ड्रियल फिशनच्या अपरेग्युलेशनशी सुसंगत विखंडन घटनांच्या संख्येत वाढ आणि मायटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिसशी सुसंगत घटनांच्या संख्येत वाढ. शेवटी, सौम्य ताणासाठी गतिमान भरपाईमध्ये विखंडन, संलयन, बायोजेनेसिस आणि मायटोफॅगी यांचा समावेश असू शकतो. जरी मागील लेखकांनी दाखवले आहे की पीपीए मायटोसिस 30,39 आणि मायटोफॅगी 29 वाढवते, आम्ही पीपीएच्या प्रतिसादात मायटोकॉन्ड्रियल फिशन आणि फ्यूजन डायनॅमिक्सच्या पुनर्बांधणीसाठी पुरावे प्रदान करतो. हे डेटा टीईएमने पाहिलेल्या आकारिकीय बदलांची पुष्टी करतात आणि पीपीए-प्रेरित मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनशी संबंधित यंत्रणांमध्ये अधिक अंतर्दृष्टी प्रदान करतात.
TEM किंवा MEL विश्लेषणाने निरीक्षण केलेल्या आकारिकीय बदलांच्या अंतर्गत असलेल्या जनुक नियामक यंत्रणेचा थेट पुरावा दिला नाही, म्हणून आम्ही माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय, जैवउत्पत्ती आणि गतिशीलतेमध्ये सहभागी असलेल्या जनुकांच्या RNA अभिव्यक्तीचे परीक्षण केले. cMYC प्रोटो-ऑन्कोजीन हा मायटोकॉन्ड्रिया, ग्लायकोलिसिस, अमीनो आम्ल आणि फॅटी आम्ल चयापचय40 च्या नियमनात सामील असलेला ट्रान्सक्रिप्शन घटक आहे. याव्यतिरिक्त, cMYC हे मायटोकॉन्ड्रियल ट्रान्सक्रिप्शन, भाषांतर आणि जटिल असेंब्लीमध्ये सामील असलेल्या जवळजवळ 600 मायटोकॉन्ड्रियल जनुकांच्या अभिव्यक्तीचे नियमन करण्यासाठी ओळखले जाते, ज्यामध्ये NRF1 आणि TFAM41 यांचा समावेश आहे. NRF1 आणि TFAM हे मायटोसिसचे दोन केंद्रीय नियामक आहेत, जे mtDNA प्रतिकृती सक्रिय करण्यासाठी PGC-1α च्या डाउनस्ट्रीममध्ये कार्य करतात. हा मार्ग cAMP आणि AMPK सिग्नलिंगद्वारे सक्रिय केला जातो आणि ऊर्जा खर्च आणि चयापचय ताणासाठी संवेदनशील आहे. PPA चे परिणाम ऑक्सिडेटिव्ह ताणाद्वारे मध्यस्थी केले जाऊ शकतात की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी आम्ही मायटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिसचे रेडॉक्स नियामक NFE2L2 देखील तपासले.
जरी NFE2L2 अभिव्यक्ती अपरिवर्तित राहिली असली तरी, 3 mM आणि 5 mM PPA (आकृती 3a-c) सह 24 तासांच्या उपचारानंतर cMYC, NRF1 आणि TFAM च्या अभिव्यक्तीमध्ये सातत्याने डोस-आश्रित घट आढळली. cMYC अभिव्यक्तीचे डाउनरेग्युलेशन पूर्वी माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस42 च्या प्रतिसाद म्हणून नोंदवले गेले आहे आणि उलट, cMYC अभिव्यक्तीचे डाउनरेग्युलेशन माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिझम, नेटवर्क कनेक्टिव्हिटी आणि मेम्ब्रेन ध्रुवीकरण रीमॉडेलिंग करून माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनला कारणीभूत ठरू शकते43. मनोरंजकपणे, cMYC माइटोकॉन्ड्रियल फिशन आणि फ्यूजन42,43 च्या नियमनात देखील सामील आहे आणि पेशी विभाजनादरम्यान DRP1 फॉस्फोरायलेशन आणि माइटोकॉन्ड्रियल स्थानिकीकरण वाढवते44, तसेच न्यूरोनल स्टेम पेशींमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजिकल रीमॉडेलिंग मध्यस्थ करते45. खरंच, cMYC-कमी असलेले फायब्रोब्लास्ट्स PPA43 ताणामुळे होणाऱ्या बदलांशी सुसंगत, कमी झालेले माइटोकॉन्ड्रियल आकार दर्शवितात. हे डेटा cMYC आणि माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्समधील एक मनोरंजक परंतु अद्याप अस्पष्ट संबंध दर्शविते, जे PPA ताण-प्रेरित रीमॉडेलिंगच्या भविष्यातील अभ्यासासाठी एक मनोरंजक लक्ष्य प्रदान करते.
NRF1 आणि TFAM ची घट ही cMYC च्या एका महत्त्वाच्या ट्रान्सक्रिप्शनल अ‍ॅक्टिव्हेटरच्या भूमिकेशी सुसंगत आहे. हे डेटा मानवी कोलन कर्करोग पेशींवरील मागील अभ्यासांशी देखील सुसंगत आहे जे दर्शविते की PPA ने 22 तासांनी NRF1 mRNA अभिव्यक्ती कमी केली, जी ATP कमी होण्याशी संबंधित होती आणि ROS46 वाढली. या लेखकांनी असेही नोंदवले की TFAM अभिव्यक्ती 8.5 तासांनी वाढली परंतु 22 तासांनी बेसलाइन पातळीवर परत आली. याउलट, किम एट अल. (2019) ने दाखवले की SH-SY5Y पेशींमध्ये 4 तासांच्या PPA ताणानंतर TFAM mRNA अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या कमी झाली; तथापि, 72 तासांनंतर, TFAM प्रथिने अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या वाढली आणि mtDNA कॉपी नंबर लक्षणीयरीत्या वाढला. अशाप्रकारे, 24 तासांनंतर आम्ही पाहिलेल्या माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस जीन्सच्या संख्येत घट ही शक्यता वगळत नाही की मायटोकॉन्ड्रियलच्या संख्येत वाढ पूर्वीच्या वेळेच्या बिंदूंवर बायोजेनेसिसच्या सक्रियतेशी संबंधित आहे. मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की PPA 4 तास 30 मिनिटांनी SH-SY5Y पेशींमध्ये PGC-1α mRNA आणि प्रथिने लक्षणीयरीत्या वाढवते, तर प्रोपियोनिक ऍसिड 12 तास 39 मिनिटांनी PGC-1α द्वारे वासराच्या यकृत पेशींमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस वाढवते. मनोरंजक म्हणजे, PGC-1α हे केवळ NRF1 आणि TFAM चे थेट ट्रान्सक्रिप्शनल रेग्युलेटर नाही तर विखंडन आणि फ्यूजन47 चे नियमन करून MFN2 आणि DRP1 च्या क्रियाकलापांचे नियमन देखील दर्शविले गेले आहे. एकत्रितपणे, हे PPA द्वारे प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल भरपाई प्रतिसादांचे नियमन करणाऱ्या यंत्रणेच्या जवळच्या जोडणीवर प्रकाश टाकते. शिवाय, आमचा डेटा PPA ताणाखाली बायोजेनेसिस आणि मेटाबोलिझमच्या ट्रान्सक्रिप्शनल रेग्युलेशनचे महत्त्वपूर्ण डिसरेग्युलेशन प्रतिबिंबित करतो.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 आणि DRP1 जनुके हे माइटोकॉन्ड्रियल फिशन, फ्यूजन आणि डायनॅमिक्सच्या केंद्रीय नियामकांपैकी आहेत37,48,49. माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्समध्ये इतर अनेक जनुके गुंतलेली आहेत, तथापि, STOML2, OPA1 आणि MFN2 पूर्वी ASD गटांमध्ये भिन्नपणे मिथाइल केलेले आढळले आहेत,16 आणि अनेक स्वतंत्र अभ्यासांनी माइटोकॉन्ड्रियल ताण50,51 च्या प्रतिसादात या ट्रान्सक्रिप्शन घटकांमध्ये बदल नोंदवले आहेत. 52. OPA1 आणि STOML2 दोन्हीची अभिव्यक्ती 3 mM आणि 5 mM PPA उपचाराने लक्षणीयरीत्या कमी झाली (आकृती 3e, f). OPA1 हे MFN1 आणि 2 शी थेट संवादाद्वारे माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजनच्या शास्त्रीय नियामकांपैकी एक आहे आणि क्रिस्टे रीमॉडेलिंग आणि माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजीमध्ये भूमिका बजावते53. माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्समध्ये STOML2 ची अचूक भूमिका अस्पष्ट आहे, परंतु पुरावे सूचित करतात की ते माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन, बायोजेनेसिस आणि मायटोफॅगीमध्ये भूमिका बजावते.
STOML2 हे मायटोकॉन्ड्रियल श्वसन जोडणी राखण्यात आणि श्वसन साखळी संकुलांच्या निर्मितीमध्ये सहभागी आहे54,55 आणि कर्करोगाच्या पेशींच्या चयापचय वैशिष्ट्यांमध्ये खोलवर बदल घडवून आणत असल्याचे दिसून आले आहे56. अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की STOML2 BAN आणि कार्डिओलिपिन 55, 57, 58 यांच्याशी संवाद साधून मायटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता आणि जैवजननास प्रोत्साहन देते. याव्यतिरिक्त, स्वतंत्र अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की STOML2 आणि PINK1 मधील परस्परसंवाद मायटोफॅगी नियंत्रित करतो59,60. उल्लेखनीय म्हणजे, STOML2 MFN2 शी थेट संवाद साधतो आणि स्थिर करतो असे नोंदवले गेले आहे आणि OPA1 क्षयीकरणासाठी जबाबदार असलेल्या प्रोटीजला रोखून लांब OPA1 आयसोफॉर्म स्थिर करण्यात देखील महत्त्वाची भूमिका बजावते53,61,62. PPA प्रतिक्रियांमध्ये आढळलेल्या STOML2 अभिव्यक्तीतील घट ही फ्यूजन प्रथिने युबिक्विटिन- आणि प्रोटीसोम-आश्रित मार्गांद्वारे क्षय होण्यास अधिक संवेदनशील बनवू शकते48. जरी PPA ला गतिमान प्रतिसादात STOML2 आणि OPA1 ची नेमकी भूमिका अस्पष्ट असली तरी, या फ्यूजन जनुकांची कमी अभिव्यक्ती (आकृती 3) विखंडन आणि फ्यूजनमधील संतुलन बिघडू शकते आणि माइटोकॉन्ड्रियल आकार कमी होऊ शकते (आकृती 3). 1).
दुसरीकडे, २४ तासांनंतर OPA1 प्रथिने अभिव्यक्ती अपरिवर्तित राहिली, तर PPA उपचारानंतर MFN1, MFN2 किंवा DRP1 चे mRNA आणि प्रथिने पातळी लक्षणीयरीत्या बदलली नाहीत (आकृती 3g-i, आकृती 4). हे सूचित करू शकते की माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन आणि फिशनमध्ये सामील असलेल्या या घटकांच्या नियमनात कोणतेही बदल झाले नाहीत. तथापि, हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की या चारही जनुकांपैकी प्रत्येकाचे नियमन पोस्टट्रान्सक्रिप्शनल मॉडिफिकेशन (PTMs) द्वारे देखील केले जाते जे प्रथिने क्रियाकलाप नियंत्रित करतात. OPA1 मध्ये आठ पर्यायी स्प्लिस प्रकार आहेत जे प्रोटीओलाइटिकली मायटोकॉन्ड्रियामध्ये दोन वेगळे आयसोफॉर्म तयार करण्यासाठी क्लीव्ह केले जातात 63. लांब आणि लहान आयसोफॉर्ममधील संतुलन शेवटी माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन आणि मायटोकॉन्ड्रियल नेटवर्कच्या देखभालीमध्ये OPA1 ची भूमिका निश्चित करते64. DRP1 क्रियाकलाप कॅल्शियम/कॅल्मोड्युलिन-आश्रित प्रोटीन किनेज II (CaMKII) फॉस्फोरायलेशनद्वारे नियंत्रित केला जातो, तर DRP1 क्षय ubiquitination आणि SUMOylation65 द्वारे नियंत्रित केला जातो. शेवटी, DRP1 आणि MFN1/2 दोन्ही GTPases आहेत, त्यामुळे क्रियाकलाप मायटोकॉन्ड्रिया 66 मधील GTP उत्पादनाच्या दराने प्रभावित होऊ शकतो. म्हणून, जरी या प्रथिनांची अभिव्यक्ती स्थिर राहिली तरी, हे अपरिवर्तित प्रथिन क्रियाकलाप किंवा स्थानिकीकरण प्रतिबिंबित करू शकत नाही67,68. खरंच, विद्यमान PTM प्रथिने संग्रह बहुतेकदा तीव्र ताण प्रतिसादांमध्ये मध्यस्थी करण्यासाठी जबाबदार असलेल्या संरक्षणाच्या पहिल्या ओळी म्हणून काम करतात. आमच्या मॉडेलमध्ये मध्यम चयापचय ताणाच्या उपस्थितीत, अशी शक्यता आहे की PTM mRNA किंवा प्रथिने स्तरावर या जनुकांच्या अतिरिक्त सक्रियतेची आवश्यकता न ठेवता माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता पुरेशी पुनर्संचयित करण्यासाठी फ्यूजन आणि फिशन प्रथिनांच्या वाढीव क्रियाकलापांना प्रोत्साहन देते.
एकत्रितपणे, वरील डेटा माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजीच्या जटिल आणि वेळेवर अवलंबून असलेल्या नियमनावर आणि या यंत्रणा स्पष्ट करण्याच्या आव्हानांवर प्रकाश टाकतो. जनुक अभिव्यक्तीचा अभ्यास करण्यासाठी, प्रथम मार्गातील विशिष्ट लक्ष्य जनुके ओळखणे आवश्यक आहे. तथापि, आमच्या डेटावरून असे दिसून येते की एकाच मार्गातील जनुके एकाच ताणाला समान प्रकारे प्रतिसाद देत नाहीत. खरं तर, मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की एकाच मार्गातील वेगवेगळे जनुके वेगवेगळे टेम्पोरल रिस्पॉन्स प्रोफाइल प्रदर्शित करू शकतात30,46. याव्यतिरिक्त, ट्रान्सक्रिप्शन आणि जनुक कार्य यांच्यातील संबंधात व्यत्यय आणणारी जटिल पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल यंत्रणा आहेत. प्रोटिओमिक अभ्यास PTM आणि प्रथिने कार्याच्या प्रभावाची अंतर्दृष्टी प्रदान करू शकतात, परंतु ते कमी-थ्रूपुट पद्धती, उच्च सिग्नल-टू-नॉइज रेशो आणि खराब रिझोल्यूशनसह आव्हाने देखील निर्माण करतात.
या संदर्भात, TEM आणि MEL वापरून माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजीचा अभ्यास केल्याने माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स आणि फंक्शनमधील संबंध आणि रोगावर त्याचा कसा प्रभाव पडतो याबद्दल मूलभूत प्रश्नांची उत्तरे देण्याची मोठी क्षमता आहे. सर्वात महत्त्वाचे म्हणजे, TEM माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन आणि डायनॅमिक्सच्या अभिसरण समाप्तीबिंदू म्हणून माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी मोजण्यासाठी थेट पद्धत प्रदान करते51. MEL त्रिमितीय सेल्युलर वातावरणात विखंडन आणि फ्यूजन घटनांचे दृश्यमान करण्यासाठी थेट पद्धत देखील प्रदान करते, जीन अभिव्यक्तीमध्ये बदल नसतानाही गतिमान माइटोकॉन्ड्रियल रीमॉडेलिंगचे प्रमाणीकरण करण्यास अनुमती देते33. येथे आपण दुय्यम माइटोकॉन्ड्रियल रोगांमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल इमेजिंग तंत्रांची उपयुक्तता अधोरेखित करतो. हे रोग सामान्यत: तीव्र माइटोकॉन्ड्रियल नुकसानाऐवजी माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्कच्या सूक्ष्म रीमॉडेलिंगद्वारे वैशिष्ट्यीकृत दीर्घकालीन सौम्य चयापचय ताण द्वारे दर्शविले जातात. तथापि, दीर्घकालीन ताणाखाली माइटोसिस राखण्यासाठी आवश्यक असलेल्या माइटोकॉन्ड्रियल भरपाईचे खोल कार्यात्मक परिणाम आहेत. न्यूरोसायन्सच्या संदर्भात, या भरपाई यंत्रणेची चांगली समज माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनशी संबंधित प्लीओट्रॉपिक न्यूरोपॅथॉलॉजीबद्दल महत्त्वाची माहिती प्रदान करू शकते.
शेवटी, आमचा डेटा जीन अभिव्यक्ती, प्रथिने बदल आणि न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रियल गतिमानता नियंत्रित करणाऱ्या प्रथिने क्रियाकलापांमधील जटिल परस्परसंवादांचे कार्यात्मक परिणाम समजून घेण्यासाठी इमेजिंग तंत्रांची उपयुक्तता अधोरेखित करतो. ASD च्या माइटोकॉन्ड्रियल घटकाची अंतर्दृष्टी मिळविण्यासाठी आम्ही न्यूरोनल सेल मॉडेलमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन मॉडेल करण्यासाठी PPA चा वापर केला. PPA ने उपचार केलेल्या SH-SY5Y पेशींनी माइटोकॉन्ड्रियल आकारविज्ञानात बदल दर्शविले: मायटोकॉन्ड्रिया लहान आणि गोलाकार झाले आणि TEM द्वारे निरीक्षण केल्यावर क्रिस्टे खराबपणे परिभाषित केले गेले. MEL विश्लेषण दर्शविते की सौम्य चयापचय ताणाच्या प्रतिसादात माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क राखण्यासाठी विखंडन आणि फ्यूजन घटनांमध्ये वाढ झाल्यामुळे हे बदल एकाच वेळी होतात. शिवाय, PPA माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय आणि होमिओस्टॅसिसच्या ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनात लक्षणीयरीत्या व्यत्यय आणते. आम्ही cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 आणि OPA1 ला PPA ताणामुळे व्यत्यय आणलेले प्रमुख माइटोकॉन्ड्रियल नियामक म्हणून ओळखले आणि माइटोकॉन्ड्रियल आकारविज्ञान आणि कार्यामध्ये PPA-प्रेरित बदलांमध्ये मध्यस्थी करण्यात भूमिका बजावू शकतात. जनुक अभिव्यक्ती आणि प्रथिने क्रियाकलाप, स्थानिकीकरण आणि अनुवादोत्तर बदलांमध्ये PPA-प्रेरित तात्पुरत्या बदलांचे अधिक चांगले वर्णन करण्यासाठी भविष्यातील अभ्यास आवश्यक आहेत. आमचा डेटा माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस रिस्पॉन्समध्ये मध्यस्थी करणाऱ्या नियामक यंत्रणेची जटिलता आणि परस्परावलंबन अधोरेखित करतो आणि अधिक लक्ष्यित यांत्रिक अभ्यासांसाठी TEM आणि इतर इमेजिंग तंत्रांची उपयुक्तता दर्शवितो.
SH-SY5Y सेल लाइन (ECACC, 94030304-1VL) सिग्मा-अल्ड्रिचकडून खरेदी करण्यात आली. SH-SY5Y पेशी डल्बेकोच्या सुधारित ईगलच्या मध्यम/F-12 पोषक मिश्रणात (DMEM/F-12) आणि L-ग्लुटामाइन (SC09411, सायनसेल) २५ सेमी२ फ्लास्कमध्ये वाढवल्या गेल्या ज्यावर २०% फेटल बोवाइन सीरम (FBS) (१०४९३१०६, थर्मोफिशर सायंटिफिक) आणि १% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमायसिन (P४३३३-२०एमएल, सिग्मा-अल्ड्रिच) ३७ °C, ५% CO2 तापमानात पूरक होते. पेशींना ०.०५% ट्रिप्सिन-ईडीटीए (१५४०००५४, थर्मोफिशर सायंटिफिक) वापरून ८०% संगमापर्यंत उपसंस्कृत केले गेले, ३०० ग्रॅमवर ​​सेंट्रीफ्यूज केले गेले आणि अंदाजे ७ × १०५ पेशी/मिली घनतेवर प्लेट केले गेले. सर्व प्रयोग १९-२२ पॅसेजमधील अविभाजित SH-SY5Y पेशींवर केले गेले. PPA NaP म्हणून दिले जाते. NaP पावडर (CAS क्रमांक १३७-४०-६, रासायनिक सूत्र C3H5NaO2, P5436-100G, सिग्मा-अल्ड्रिच) कोमट मिलीक्यू पाण्यात १ M च्या एकाग्रतेपर्यंत विरघळवा आणि ४ °C वर साठवा. उपचाराच्या दिवशी, हे द्रावण १ M PPA ते ३ mM ​​आणि ५ mM PPA सह सीरम-मुक्त माध्यमात (DMEM/F-१२ एल-ग्लूटामाइनसह) पातळ करा. सर्व प्रयोगांसाठी उपचार सांद्रता PPA (0 mM, नियंत्रण), 3 mM आणि 5 mM PPA नव्हती. प्रयोग किमान तीन जैविक प्रतिकृतींमध्ये केले गेले.
SH-SY5Y पेशींना 5.5 × 105 पेशी/मिली या दराने 25 सेमी5 फ्लास्कमध्ये बीज देण्यात आले आणि 24 तास वाढवण्यात आले. उष्मायनाच्या 24 तासांपूर्वी फ्लास्कमध्ये PPA उपचार जोडण्यात आले. सामान्य सस्तन प्राण्यांच्या ऊती उपसंस्कृती प्रोटोकॉलचे पालन करून पेशी गोळ्या गोळा करा (वर वर्णन केलेले). पेशी गोळ्या 100 µl 2.5% ग्लुटारल्डिहाइड, 1× PBS मध्ये पुन्हा सस्पेंशन करा आणि प्रक्रिया होईपर्यंत 4 °C वर साठवा. पेशी गोळ्या करण्यासाठी आणि 2.5% ग्लुटारल्डिहाइड, 1× PBS द्रावण काढून टाकण्यासाठी SH-SY5Y पेशींना थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले. डिस्टिल्ड पाण्यात तयार केलेल्या 4% अ‍ॅगारोज जेलमध्ये गाळ पुन्हा सस्पेंशन करा (अ‍ॅगरोज आणि गाळाच्या आकारमानाचे प्रमाण 1:1 आहे). अ‍ॅगारोजचे तुकडे सपाट प्लेट्सवर ग्रिडवर ठेवण्यात आले आणि उच्च-दाब गोठण्यापूर्वी 1-हेक्साडेसीनने लेपित करण्यात आले. नमुने -90°C वर 100% कोरड्या एसीटोनमध्ये 24 तासांसाठी गोठवण्यात आले. त्यानंतर तापमान -८०°C पर्यंत वाढवण्यात आले आणि १% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड आणि ०.१% ग्लुटाराल्डिहाइडचे द्रावण जोडले गेले. नमुने -८०°C वर २४ तासांसाठी साठवण्यात आले. त्यानंतर, तापमान अनेक दिवसांत हळूहळू खोलीच्या तापमानापर्यंत वाढवले ​​गेले: २४ तासांसाठी –८०°C ते –५०°C पर्यंत, २४ तासांसाठी –३०°C पर्यंत, २४ तासांसाठी –१०°C पर्यंत आणि शेवटी खोलीच्या तापमानापर्यंत.
क्रायोजेनिक तयारीनंतर, नमुने रेझिनने भिजवले गेले आणि लेइका रीशर्ट अल्ट्राकटएस अल्ट्रामायक्रोटोम (लेइका मायक्रोसिस्टम्स) वापरून अल्ट्राथिन सेक्शन (~१०० एनएम) बनवले गेले. सेक्शन २% युरेनिल एसीटेट आणि लीड सायट्रेटने रंगवले गेले. २०० केव्ही (लॅब६ ट्रान्समीटर) वर कार्यरत असलेल्या FEI टेक्नाई २० ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (थर्मोफिशर (पूर्वीचे FEI), आइंडहोव्हन, नेदरलँड्स) आणि ट्रायडीम एनर्जी फिल्टरने सुसज्ज असलेल्या गॅटन सीसीडी कॅमेरा (गॅटन, यूके) वापरून नमुने निरीक्षण केले गेले.
प्रत्येक तांत्रिक प्रतिकृतीमध्ये, किमान २४ सिंगल सेल प्रतिमा मिळवण्यात आल्या, एकूण २६६ प्रतिमा. सर्व प्रतिमांचे विश्लेषण रीजन ऑफ इंटरेस्ट (ROI) मॅक्रो आणि माइटोकॉन्ड्रिया मॅक्रो वापरून करण्यात आले. माइटोकॉन्ड्रियल मॅक्रो प्रकाशित पद्धतींवर आधारित आहे17,31,32 आणि फिजी/इमेजजे69 मध्ये TEM प्रतिमांच्या अर्ध-स्वयंचलित बॅच प्रक्रियेस अनुमती देते. थोडक्यात: रोलिंग बॉल बॅकग्राउंड वजाबाकी (60 पिक्सेल त्रिज्या) आणि FFT बँडपास फिल्टर (अनुक्रमे 60 आणि 8 पिक्सेल वरच्या आणि खालच्या सीमा वापरून) आणि 5% च्या ओरिएंटेशन टॉलरन्ससह उभ्या रेषा सप्रेशनचा वापर करून प्रतिमा उलटी आणि उलटी केली जाते. प्रक्रिया केलेली प्रतिमा जास्तीत जास्त एन्ट्रॉपी अल्गोरिथम वापरून स्वयंचलितपणे थ्रेशोल्ड केली जाते आणि बायनरी मास्क तयार केला जातो. कच्च्या TEM प्रतिमांमध्ये मॅन्युअली निवडलेल्या ROI शी संबंधित प्रतिमा क्षेत्रे काढली गेली, ज्यामध्ये मायटोकॉन्ड्रियाचे वैशिष्ट्य आहे आणि प्लाझ्मा मेम्ब्रेन आणि इतर उच्च-कॉन्ट्रास्ट क्षेत्रे वगळली आहेत. प्रत्येक काढलेल्या ROI साठी, 600 पिक्सेलपेक्षा मोठ्या बायनरी कणांचे विश्लेषण केले गेले आणि फिजी/इमेजजेच्या बिल्ट-इन मापन फंक्शन्स वापरून कण क्षेत्र, परिमिती, प्रमुख आणि गौण अक्ष, फेरेट व्यास, गोलाकारपणा आणि वर्तुळाकारता मोजली गेली. Merrill, Flippo, आणि Strack (2017), क्षेत्र 2, कण आस्पेक्ट रेशो (प्रमुख ते गौण अक्ष गुणोत्तर) आणि आकार घटक (FF) या डेटावरून मोजले गेले, जिथे FF = परिमिती 2/4pi x क्षेत्रफळ. पॅरामीट्रिक सूत्राची व्याख्या Merrill, Flippo आणि Strack (2017) मध्ये आढळू शकते. उल्लेख केलेले मॅक्रो GitHub वर उपलब्ध आहेत (डेटा उपलब्धता विधान पहा). सरासरी, प्रति PPA उपचार अंदाजे 5,600 कणांचे विश्लेषण केले गेले, एकूण अंदाजे 17,000 कणांसाठी (डेटा दर्शविला नाही).
SH-SH5Y पेशींना 8-चेंबर कल्चर डिशेसमध्ये (थर्मोफिशर, #155411) ठेवण्यात आले जेणेकरून रात्रभर चिकटता येईल आणि नंतर TMRE 1:1000 (थर्मोफिशर, #T669) आणि Hoechst 33342 1:200 (सिग्मा-अल्ड्रिच, H6024) सह इनक्युबेट केले गेले. रंगाई. 10 मिनिटांच्या वातावरणात 405 nm आणि 561 nm लेसर वापरून प्रतिमा मिळवण्यात आल्या आणि त्यानंतरच्या 12 वेळेच्या बिंदूंवर प्रतिमा फ्रेम्समध्ये 0.2 μm च्या az स्टेपसह 10 प्रतिमा मायक्रोग्राफ असलेले z-स्टॅक म्हणून कच्च्या प्रतिमा मिळवण्यात आल्या. LCI प्लॅन अपोक्रोमेट 100x/1.4 ऑइल DIC M27 लेन्स वापरून कार्ल झीस LSM780 ELYRA PS.1 सुपर-रिझोल्यूशन प्लॅटफॉर्म (कार्ल झीस, ओबरकोचेन, जर्मनी) वापरून प्रतिमा गोळा करण्यात आल्या. इमेजजे मध्ये पूर्वी वर्णन केलेल्या पाइपलाइन आणि इमेजजे प्लगइनचा वापर करून फ्यूजन आणि फिशन इव्हेंट्स, मायटोकॉन्ड्रियल स्ट्रक्चर्सची सरासरी संख्या आणि प्रति सेल सरासरी मायटोकॉन्ड्रियल व्हॉल्यूम मोजण्यासाठी प्रतिमांचे विश्लेषण केले गेले. MEL मॅक्रो GitHub वर उपलब्ध आहेत (डेटा उपलब्धता विधान पहा).
उपचारापूर्वी २४ तासांसाठी SH-SY5Y पेशी सहा-वेल प्लेट्समध्ये ०.३ × १०६ पेशी/मिली घनतेवर वाढवल्या गेल्या. क्विक-आरएनए™ मिनीप्रेप प्रोटोकॉल (ZR R1055, झायमो रिसर्च) वापरून थोड्याशा बदलांसह आरएनए काढला गेला: काढण्यापूर्वी प्रत्येक विहिरीत ३०० μl आरएनए लिसिस बफर घाला आणि अंतिम टप्प्यात ३० μl DNase/RNase एल्युशनसह प्रत्येक नमुना लायझ करा. -मुक्त पाणी. सर्व नमुन्यांचे प्रमाण आणि गुणवत्ता नॅनोड्रॉप ND-१००० UV-Vis स्पेक्ट्रोफोटोमीटर वापरून तपासले गेले. २०० μl RIPA लिसिस बफर वापरून सेल लायसेट्समधून एकूण प्रथिने मिळवली गेली आणि ब्रॅडफोर्ड प्रोटीन अॅसे ७० वापरून प्रथिनांची एकाग्रता मोजली गेली.
उत्पादकाच्या सूचनांनुसार काही सुधारणांसह टेट्रो™ cDNA सिंथेसिस किट (BIO-65043, मेरिडियन बायोसायन्स) वापरून cDNA संश्लेषण करण्यात आले. एकूण RNA च्या 0.7 ते 1 μg वापरून 20-μl अभिक्रियांमध्ये cDNA संश्लेषित करण्यात आले. पूर्वी प्रकाशित पेपर्स 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (टेबल S1) मधून प्राइमर्स निवडले गेले आणि इंटिग्रेटेड DNA टेक्नॉलॉजीजच्या प्राइमर्क्वेस्ट टूलचा वापर करून सोबतचे प्रोब डिझाइन केले गेले. सर्व स्वारस्यपूर्ण जीन्स न्यूक्लियर B2M जीनमध्ये सामान्यीकृत केले गेले. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC आणि OPA1 ची जीन अभिव्यक्ती RT-qPCR द्वारे मोजली गेली. मास्टर मिक्समध्ये LUNA Taq पॉलिमरेज (M3003L, न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स), 10 μM फॉरवर्ड आणि रिव्हर्स प्रायमर, cDNA आणि PCR-ग्रेड पाणी समाविष्ट होते जेणेकरून प्रत्येक अभिक्रियेसाठी 10 μL चे अंतिम व्हॉल्यूम मिळेल. TaqMan मल्टीप्लेक्स असेज वापरून विभाजन आणि विखंडन जनुकांची अभिव्यक्ती (DRP1, MFN1/2) मोजण्यात आली. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स) उत्पादकाच्या सूचनांनुसार किरकोळ बदलांसह वापरण्यात आली. मल्टीप्लेक्स RT-qPCR मास्टर मिक्समध्ये 1X LUNA Taq पॉलिमरेज, 10 μM फॉरवर्ड आणि रिव्हर्स प्रायमर, 10 μM प्रोब, cDNA आणि PCR-ग्रेड पाणी समाविष्ट आहे, ज्यामुळे प्रत्येक अभिक्रियेसाठी अंतिम व्हॉल्यूम 20 μL होते. RT-qPCR रोटर-जीन Q 6-प्लेक्स (QIAGEN RG—सिरीयल नंबर: R0618110) वापरून केले गेले. सायकलिंग परिस्थिती टेबल S1 मध्ये दर्शविल्या आहेत. सर्व cDNA नमुने त्रिकोणी स्वरूपात वाढवले ​​गेले आणि दहापट पातळीकरणांच्या मालिकेचा वापर करून एक मानक वक्र तयार केला गेला. डेटा पुनरुत्पादनक्षमता सुनिश्चित करण्यासाठी सायकल थ्रेशोल्ड मानक विचलन (Ct) > 0.5 असलेल्या त्रिकोणी नमुन्यांमधील बाह्य घटक विश्लेषणातून काढून टाकण्यात आले30,72. 2-ΔΔCt79 पद्धतीचा वापर करून सापेक्ष जनुक अभिव्यक्तीची गणना केली गेली.
प्रथिने नमुने (६० μg) २:१ गुणोत्तराने लेम्ली लोडिंग बफरमध्ये मिसळले गेले आणि १२% रंगहीन प्रोटीन जेल (बायो-रॅड #१६१०१८४) वर चालवले गेले. ट्रान्स-ब्लॉट टर्बो सिस्टम (#१७०-४१५५, बायो-रॅड) वापरून प्रथिने पीव्हीडीएफ (पॉलीव्हिनिलिडीन फ्लोराइड) पडद्यामध्ये (#१७०-८४१५६, बायो-रॅड) हस्तांतरित केली गेली. पडदा ब्लॉक करण्यात आला आणि योग्य प्राथमिक अँटीबॉडीज (OPA1, MFN1, MFN2, आणि DRP1) (१:१००० पातळ) ४८ तासांसाठी इनक्युबेट करण्यात आला, त्यानंतर दुय्यम अँटीबॉडीज (१:१०,०००) सह १ तासासाठी इनक्युबेशन करण्यात आले. त्यानंतर क्लॅरिटी वेस्टर्न ईसीएल सब्सट्रेट (#१७०-५०६१, बायो-रॅड) वापरून पडद्यांची प्रतिमा काढली गेली आणि बायो-रॅड केमीडॉक एमपी सिस्टम वापरून रेकॉर्ड केली गेली. इमेजलॅब आवृत्ती 6.1 ही वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषणासाठी वापरली गेली. मूळ जेल आणि ब्लॉट आकृती S1 मध्ये दाखवले आहेत. अँटीबॉडी माहिती टेबल S2 मध्ये दिली आहे.
डेटा सेट्स किमान तीन स्वतंत्र नमुन्यांमधील सरासरी (SEM) च्या सरासरी आणि मानक त्रुटी म्हणून सादर केले जातात. गॉसियन वितरण आणि समान मानक विचलन गृहीत धरण्यापूर्वी आणि विश्लेषणासह पुढे जाण्यापूर्वी शापिरो-विल्क्स चाचणी (अन्यथा सांगितले नसल्यास) वापरून सामान्यतेसाठी डेटा सेट्सची चाचणी केली गेली. फिशरच्या MEL LSD (p < 0.05), एक-मार्गी ANOVA (उपचार विरुद्ध नियंत्रण सरासरी) आणि डनेटच्या बहु-तुलना चाचणीचा वापर करून डेटा सेटचे विश्लेषण करण्याव्यतिरिक्त महत्त्व निश्चित करण्यासाठी (p < 0.05). आलेखामध्ये महत्त्वपूर्ण p मूल्ये *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 म्हणून दर्शविली आहेत. सर्व सांख्यिकीय विश्लेषणे आणि आलेख ग्राफपॅड प्रिझम 9.4.0 वापरून केले आणि तयार केले गेले.
TEM प्रतिमा विश्लेषणासाठी Fiji/ImageJ मॅक्रो GitHub वर सार्वजनिकरित्या उपलब्ध आहेत: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Mitochondrial Event Locator (MEL) मॅक्रो GitHub वर सार्वजनिकरित्या उपलब्ध आहे: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
मेलियाना ए., देवी एनएम आणि विजया ए. माइटोकॉन्ड्रिया: चयापचय, होमिओस्टॅसिस, ताण, वृद्धत्व आणि एपिजेनेटिक्सचे मास्टर रेग्युलेटर. इंडोनेशियन. बायोमेडिकल सायन्स. जे. १३, २२१–२४१ (२०२१).
बेन-शाचर, डी. स्किझोफ्रेनियामध्ये बहुआयामी मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, संभाव्य पॅथॉलॉजिकल लक्ष्य म्हणून कॉम्प्लेक्स I. स्किझोफ्रेनिया. संसाधन. १८७, ३-१० (२०१७).
बोस, ए. आणि बील, एमएफ पार्किन्सन रोगात माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन. जे. न्यूरोकेमिस्ट्री. १३९, २१६–२३१ (२०१६).
शर्मा व्हीके, सिंग टीजी आणि मेहता व्ही. ताणलेले मायटोकॉन्ड्रिया: अल्झायमर रोगात आक्रमणाचे लक्ष्य. मायटोकॉन्ड्रिया 59, 48–57 (2021).
बेलेंगुअर पी., डुआर्टे जेएमएन, शूक पीएफ आणि फेरेरा जीके माइटोकॉन्ड्रिया आणि मेंदू: बायोएनर्जेटिक्स आणि बरेच काही. न्यूरोटॉक्सिन्स. संसाधन. 36, 219–238 (2019).
रंगराजू, व्ही. आणि इतर. प्लेयोट्रॉपिक मायटोकॉन्ड्रिया: न्यूरोनल विकास आणि रोगावर मायटोकॉन्ड्रियाचा प्रभाव. जे. न्यूरोसायन्स. ३९, ८२००–८२०८ (२०१९).
कार्डानो-रामोस, सी. आणि मोरैस, व्हीए न्यूरॉन्समध्ये माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस: कसे आणि कुठे. आंतरराष्ट्रीयता. जे. मोहर. द सायन्स. २२, १३०५९ (२०२१).
यू, आर., लेंडाहल, यू., निस्टर, एम. आणि झाओ, जे. सस्तन प्राण्यांच्या माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्सचे नियमन: संधी आणि आव्हाने. फ्रंट. एंडोक्राइन. (लॉसने) ११, ३७४ (२०२०).
खाचो, एम. आणि स्लॅक, आरएस. न्यूरोजेनेसिसच्या नियमनात माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स: विकसनशील ते प्रौढ मेंदू. विकास. डायनॅमिक. २४७, ४७–५३ (२०१८).