Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमधील कंपॅटिबिलिटी मोड बंद करा). यादरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही ही साइट स्टाईल्स आणि जावास्क्रिप्टशिवाय प्रदर्शित करू.
उच्च लोडिंग सामग्री असलेल्या इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचा (NPs) वापर विविध डोस फॉर्ममध्ये वेगवेगळ्या प्रकारे केला जातो. या कामाचा उद्देश क्रायोप्रोटेक्टंट म्हणून मॅनिटॉलसह किंवा त्याशिवाय, इन्सुलिन-लोड केलेल्या चिटोसन नॅनोपार्टिकल्सच्या संरचनेवर फ्रीझ-ड्रायिंग आणि स्प्रे-ड्रायिंग प्रक्रियेच्या परिणामाचे मूल्यांकन करणे आहे. आम्ही या नॅनोपार्टिकल्सना पुन्हा विरघळवून त्यांच्या गुणवत्तेचे मूल्यांकन देखील केले. निर्जलीकरणापूर्वी, चिटोसन/सोडियम ट्रायपॉलिफॉस्फेट/इन्सुलिन क्रॉस-लिंक्ड नॅनोपार्टिकल्सचा कण आकार ३१८ एनएम, पीडीआय ०.१८, एनकॅप्सुलेशन कार्यक्षमता ९९.४% आणि लोडिंग २५.०१% असे अनुकूलित (ऑप्टिमाइझ) केले होते. पुनर्गठन केल्यानंतर, मॅनिटॉलचा वापर न करता फ्रीझ-ड्रायिंग पद्धतीने तयार केलेले नॅनोपार्टिकल्स वगळता, इतर सर्व नॅनोपार्टिकल्सनी त्यांची गोलाकार कण रचना कायम ठेवली. स्प्रेद्वारे निर्जलित केलेल्या मॅनिटॉल-युक्त नॅनोपार्टिकल्सच्या तुलनेत, मॅनिटॉल-मुक्त स्प्रे-ड्राइड नॅनोपार्टिकल्सनी सर्वात लहान सरासरी कण आकार (३७६ एनएम) आणि सर्वाधिक लोडिंग सामग्री (२५.०२%) दर्शविली. वाळवण्याच्या किंवा फ्रीझ-ड्रायिंग तंत्रांद्वारे एनकॅप्सुलेशन दर (९८.७%) आणि PDI (०.२०) प्राप्त झाला. मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे ड्रायिंगद्वारे वाळवलेल्या नॅनोपार्टिकल्समुळे इन्सुलिनचा सर्वात जलद मुक्त होण्याचा दर आणि पेशींद्वारे शोषणाची सर्वाधिक कार्यक्षमता देखील दिसून आली. हे कार्य दर्शवते की पारंपरिक फ्रीझ ड्रायिंग पद्धतींच्या तुलनेत, स्प्रे ड्रायिंगद्वारे क्रायोप्रोटेक्टंट्सच्या गरजेशिवाय इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचे निर्जलीकरण करता येते, ज्यामुळे अधिक लोडिंग क्षमता, कमी ॲडिटिव्हची आवश्यकता आणि कमी परिचालन खर्च असे महत्त्वपूर्ण फायदे मिळतात.
१९२२ मध्ये शोध लागल्यापासून, इन्सुलिन आणि त्याच्या औषधी तयारीने टाईप १ मधुमेह (T1DM) आणि टाईप २ मधुमेह (T2DM) असलेल्या रुग्णांचे प्राण वाचवले आहेत. तथापि, उच्च आण्विक वजनाचे प्रथिन असल्यामुळे, इन्सुलिन सहजपणे एकत्रित होते, प्रोटिओलिटिक एन्झाइम्सद्वारे त्याचे विघटन होते आणि फर्स्ट-पास इफेक्टमुळे ते शरीरातून बाहेर टाकले जाते. टाईप १ मधुमेहाचे निदान झालेल्या लोकांना आयुष्यभर इन्सुलिन इंजेक्शनची आवश्यकता असते. टाईप २ मधुमेहाचे निदान झालेल्या अनेक रुग्णांना देखील दीर्घकाळ इन्सुलिन इंजेक्शनची आवश्यकता असते. दररोजचे इन्सुलिन इंजेक्शन या व्यक्तींसाठी रोजच्या वेदना आणि अस्वस्थतेचा एक गंभीर स्रोत आहे, ज्याचा मानसिक आरोग्यावर नकारात्मक परिणाम होतो. परिणामी, इन्सुलिन देण्याच्या इतर पद्धती, ज्यामुळे कमी त्रास होतो, जसे की तोंडावाटे इन्सुलिन घेणे, यांचा मोठ्या प्रमाणावर अभ्यास केला जात आहे, कारण त्यांच्यामध्ये जगभरातील अंदाजे ५ अब्ज मधुमेही लोकांचे जीवनमान सुधारण्याची क्षमता आहे.
तोंडी इन्सुलिन घेण्याच्या प्रयत्नांमध्ये नॅनोपार्टिकल तंत्रज्ञानाने एक महत्त्वपूर्ण प्रगती घडवून आणली आहे⁴,⁶,⁷. हे तंत्रज्ञान इन्सुलिनला प्रभावीपणे वेष्टित करते आणि शरीराच्या विशिष्ट भागांपर्यंत पोहोचवण्यासाठी त्याला विघटनापासून वाचवते. तथापि, नॅनोपार्टिकल फॉर्म्युलेशन्सच्या वापराला अनेक मर्यादा आहेत, मुख्यत्वे कणांच्या निलंबनाच्या स्थिरतेच्या समस्यांमुळे. साठवणुकीदरम्यान काही प्रमाणात एकत्रीकरण होऊ शकते, ज्यामुळे इन्सुलिन-युक्त नॅनोपार्टिकल्सची जैवउपलब्धता कमी होते⁸. याव्यतिरिक्त, इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सची (NPs) स्थिरता सुनिश्चित करण्यासाठी नॅनोपार्टिकल्स आणि इन्सुलिनच्या पॉलिमर मॅट्रिक्सच्या रासायनिक स्थिरतेचा देखील विचार करणे आवश्यक आहे. सध्या, साठवणुकीदरम्यान होणारे अवांछित बदल रोखून स्थिर NPs तयार करण्यासाठी फ्रीझ-ड्रायिंग तंत्रज्ञान हे सर्वोत्तम मानले जाते⁹.
तथापि, बर्फाच्या स्फटिकांच्या यांत्रिक ताणामुळे नॅनोकणांच्या (NPs) गोलाकार संरचनेवर होणारा परिणाम टाळण्यासाठी, फ्रीझ-ड्रायिंगमध्ये क्रायोप्रोटेक्टंट्स (cryoprotectants) घालणे आवश्यक असते. यामुळे लायोफिलायझेशननंतर इन्सुलिन नॅनोकणांचे लोडिंग लक्षणीयरीत्या कमी होते, कारण क्रायोप्रोटेक्टंट वजनाचा बहुतेक भाग व्यापतो. त्यामुळे, इन्सुलिनची थेरप्युटिक विंडो (therapeutic window) गाठण्यासाठी मोठ्या प्रमाणात कोरड्या नॅनोकणांची आवश्यकता असल्यामुळे, तयार झालेले इन्सुलिन नॅनोकण अनेकदा तोंडी गोळ्या (oral tablets) आणि तोंडी फिल्म्स (oral films) यांसारख्या कोरड्या पावडर फॉर्म्युलेशन्सच्या निर्मितीसाठी अयोग्य ठरतात.
औषधनिर्माण उद्योगात द्रव अवस्थेतून कोरडी पावडर तयार करण्यासाठी स्प्रे ड्रायिंग ही एक सुप्रसिद्ध आणि स्वस्त औद्योगिक-स्तरीय प्रक्रिया आहे¹⁰,¹¹. कण निर्मिती प्रक्रियेवरील नियंत्रणामुळे अनेक जैव-सक्रिय संयुगांचे योग्य एनकॅप्सुलेशन करणे शक्य होते¹²,¹³. शिवाय, तोंडावाटे सेवन करण्यासाठी एनकॅप्सुलेटेड प्रथिने तयार करण्याकरिता हे एक प्रभावी तंत्र बनले आहे. स्प्रे ड्रायिंग दरम्यान, पाणी खूप लवकर बाष्पीभवन होते, ज्यामुळे कणाच्या गाभ्याचे तापमान कमी ठेवण्यास मदत होते¹¹,¹⁴, आणि त्यामुळे उष्णता-संवेदनशील घटकांना एनकॅप्सुलेट करण्यासाठी याचा वापर करणे शक्य होते. स्प्रे ड्रायिंग करण्यापूर्वी, कोटिंग मटेरियलला एनकॅप्सुलेटेड घटक असलेल्या द्रावणासोबत पूर्णपणे एकजीव केले पाहिजे¹¹,¹⁴. फ्रीझ-ड्रायिंगच्या विपरीत, स्प्रे-ड्रायिंगमध्ये एनकॅप्सुलेशनपूर्वी एकजीव केल्याने निर्जलीकरणादरम्यान एनकॅप्सुलेशनची कार्यक्षमता सुधारते. स्प्रे-ड्रायिंग एनकॅप्सुलेशन प्रक्रियेसाठी क्रायोप्रोटेक्टंट्सची आवश्यकता नसल्यामुळे, उच्च लोडिंग सामग्री असलेले कोरडे एनपी (NPs) तयार करण्यासाठी स्प्रे-ड्रायिंगचा वापर केला जाऊ शकतो.
या अभ्यासात आयन जेल पद्धतीचा वापर करून कायटोसॅन आणि सोडियम ट्रायपॉलिफॉस्फेटच्या क्रॉस-लिंकिंगद्वारे इन्सुलिन-युक्त नॅनोकणांच्या (NPs) निर्मितीची माहिती दिली आहे. आयन जेलेशन ही एक अशी तयारीची पद्धत आहे, जी विशिष्ट परिस्थितीत दोन किंवा अधिक आयनिक प्रजातींमधील इलेक्ट्रोस्टॅटिक आंतरक्रियेद्वारे नॅनोकणांची निर्मिती करण्यास अनुमती देते. अनुकूलित कायटोसॅन/सोडियम ट्रायपॉलिफॉस्फेट/इन्सुलिन क्रॉस-लिंक्ड नॅनोकणांचे निर्जलीकरण करण्यासाठी फ्रीझ-ड्रायिंग आणि स्प्रे-ड्रायिंग या दोन्ही तंत्रांचा वापर करण्यात आला. निर्जलीकरणानंतर, त्यांच्या आकारविज्ञानाचे (मॉर्फोलॉजी) SEM द्वारे विश्लेषण करण्यात आले. त्यांच्या पुनर्संयोजन क्षमतेचे मूल्यांकन त्यांच्या आकार वितरण, पृष्ठभागावरील चार्ज, PDI, एनकॅप्सुलेशन कार्यक्षमता आणि लोडिंग सामग्री मोजून करण्यात आले. वेगवेगळ्या निर्जलीकरण पद्धतींनी तयार केलेल्या पुनर्विद्राव्य नॅनोकणांच्या गुणवत्तेचे मूल्यांकन त्यांच्या इन्सुलिन संरक्षण, मुक्त होण्याच्या वर्तनाची आणि पेशींद्वारे शोषण्याच्या कार्यक्षमतेची तुलना करून देखील करण्यात आले.
मिश्र द्रावणाचा pH आणि कायटोसॅन व इन्सुलिनचे प्रमाण हे दोन महत्त्वाचे घटक आहेत जे अंतिम नॅनोकणांच्या (NPs) कण आकारावर आणि एनकॅप्सुलेशन कार्यक्षमतेवर (EE) परिणाम करतात, कारण ते आयनोट्रोपिक जेलेशन प्रक्रियेवर थेट परिणाम करतात. मिश्र द्रावणाचा pH हा कण आकार आणि एनकॅप्सुलेशन कार्यक्षमतेशी अत्यंत सहसंबंधित असल्याचे दिसून आले (आकृती 1a). आकृती 1a मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, जेव्हा pH 4.0 वरून 6.0 पर्यंत वाढला, तेव्हा सरासरी कण आकार (nm) कमी झाला आणि EE लक्षणीयरीत्या वाढली, तर जेव्हा pH 6.5 पर्यंत वाढला, तेव्हा सरासरी कण आकार वाढू लागला आणि EE अपरिवर्तित राहिली. कायटोसॅन आणि इन्सुलिनचे प्रमाण वाढल्यास, सरासरी कण आकार देखील वाढतो. शिवाय, जेव्हा कायटोसॅन/इन्सुलिनचे वस्तुमान प्रमाण 2.5:1 (w/w) पेक्षा जास्त ठेवून नॅनोकण तयार केले गेले, तेव्हा EE मध्ये कोणताही बदल दिसून आला नाही (आकृती 1b). म्हणून, या अभ्यासातील इष्टतम तयारीची परिस्थिती (pH 6.0, कायटोसॅन/इन्सुलिन वस्तुमान प्रमाण 2.5:1) आहे. पुढील अभ्यासासाठी इन्सुलिन-युक्त नॅनोपार्टिकल्स तयार करण्यासाठी वापरण्यात आले. या तयारीच्या परिस्थितीत, इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचा सरासरी कण आकार 318 nm (आकृती 1c) इतका अनुकूलित करण्यात आला, PDI 0.18 होता, एम्बेडिंग कार्यक्षमता 99.4% होती, झेटा पोटेन्शियल 9.8 mV होता आणि इन्सुलिन लोडिंग 25.01% (m/m) होते. ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (TEM) च्या परिणामांवर आधारित, अनुकूलित नॅनोपार्टिकल्स साधारणपणे गोलाकार आणि विलग असून त्यांचा आकार तुलनेने एकसमान होता (आकृती 1d).
इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचे पॅरामीटर ऑप्टिमायझेशन: (a) इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सच्या सरासरी व्यासावर आणि एनकॅप्सुलेशन कार्यक्षमतेवर (EE) pH चा परिणाम (कायटोसॅन आणि इन्सुलिनच्या 5:1 वस्तुमान गुणोत्तराने तयार केलेले); (b) इन्सुलिन NPs च्या सरासरी व्यासावर आणि एनकॅप्सुलेशन कार्यक्षमतेवर (EE) कायटोसॅन आणि इन्सुलिनच्या वस्तुमान गुणोत्तराचा प्रभाव (pH 6 वर तयार केलेले); (c) ऑप्टिमाइझ केलेल्या इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचे कण आकार वितरण; (d) ऑप्टिमाइझ केलेल्या इन्सुलिन NPs चा TEM मायक्रोग्राफ.
हे सर्वज्ञात आहे की कायटोसॅन हा 6.5 pKa असलेला एक कमकुवत पॉलीइलेक्ट्रोलाइट आहे. आम्लधर्मी माध्यमात तो धनप्रभारित असतो कारण त्याचा मुख्य अमिनो गट हायड्रोजन आयनांद्वारे प्रोटोनित होतो¹⁵. त्यामुळे, ऋणप्रभारित मॅक्रोमोलेक्यूल्सना आवेष्टित करण्यासाठी वाहक म्हणून त्याचा अनेकदा वापर केला जातो. या अभ्यासात, 5.3 आयसोइलेक्ट्रिक पॉइंट असलेल्या इन्सुलिनला आवेष्टित करण्यासाठी कायटोसॅनचा वापर करण्यात आला. कायटोसॅनचा वापर कोटिंग मटेरियल म्हणून केला जात असल्याने, त्याचे प्रमाण वाढल्याने, नॅनोपार्टिकल्सच्या बाह्य थराची जाडी त्याच प्रमाणात वाढते, परिणामी कणांचा सरासरी आकार मोठा होतो. याव्यतिरिक्त, कायटोसॅनची उच्च पातळी अधिक इन्सुलिनला आवेष्टित करू शकते. आमच्या बाबतीत, जेव्हा कायटोसॅन आणि इन्सुलिनचे प्रमाण 2.5:1 वर पोहोचले तेव्हा EE सर्वाधिक होता, आणि हे प्रमाण वाढत राहिल्यावर EE मध्ये कोणताही लक्षणीय बदल झाला नाही.
चिटोसान आणि इन्सुलिनच्या गुणोत्तराव्यतिरिक्त, नॅनोकणांच्या (NPs) निर्मितीमध्ये pH ने देखील महत्त्वपूर्ण भूमिका बजावली. गॅन आणि सहकाऱ्यांनी (संदर्भ १७) चिटोसान नॅनोकणांच्या आकारावर pH च्या परिणामाचा अभ्यास केला. त्यांना असे आढळले की pH ६.० पर्यंत पोहोचेपर्यंत कणांच्या आकारात सतत घट होत होती, आणि pH > ६.० असताना कणांच्या आकारात लक्षणीय वाढ दिसून आली, जे आमच्या निरीक्षणांशी सुसंगत आहे. या घटनेचे कारण असे आहे की, pH वाढल्याने इन्सुलिनच्या रेणूवर ऋणात्मक पृष्ठभागीय प्रभार येतो, ज्यामुळे चिटोसान/सोडियम ट्रायपॉलिफॉस्फेट (TPP) कॉम्प्लेक्ससोबत इलेक्ट्रोस्टॅटिक आंतरक्रिया सुलभ होते, परिणामी कणांचा आकार लहान होतो आणि EE (एनर्जी एफिशियन्सी) जास्त असते. तथापि, जेव्हा pH ६.५ वर समायोजित केला गेला, तेव्हा चिटोसानवरील अमिनो गटांचे डीप्रोटोनेशन झाले, ज्यामुळे चिटोसानची घडी पडली. अशाप्रकारे, उच्च pH मुळे अमिनो आयनांचा TPP आणि इन्सुलिनशी संपर्क कमी होतो, परिणामी क्रॉस-लिंकिंग कमी होते, अंतिम सरासरी कणांचा आकार मोठा होतो आणि EE कमी होते.
फ्रीझ-ड्राइड आणि स्प्रे-ड्राइड नॅनोकणांच्या (NPs) आकारशास्त्रीय गुणधर्मांचे विश्लेषण, अधिक चांगल्या निर्जलीकरण आणि पावडर निर्मिती तंत्रांच्या निवडीसाठी मार्गदर्शन करू शकते. निवडलेल्या पद्धतीमुळे औषधाची स्थिरता, कणांचा एकसमान आकार, उच्च औषध भारण आणि मूळ द्रावणात चांगली विद्राव्यता मिळायला हवी. या अभ्यासात, दोन्ही तंत्रांची अधिक चांगल्या प्रकारे तुलना करण्यासाठी, निर्जलीकरणादरम्यान १% मॅनिटॉल असलेले किंवा नसलेले इन्सुलिन नॅनोकण वापरण्यात आले. फ्रीझ-ड्राइंग आणि स्प्रे-ड्राइंगसाठी विविध कोरड्या पावडर फॉर्म्युलेशनमध्ये मॅनिटॉलचा वापर बल्किंग एजंट किंवा क्रायोप्रोटेक्टंट म्हणून केला जातो. मॅनिटॉलशिवाय लायोफिलाइज्ड इन्सुलिन नॅनोकणांसाठी, आकृती २अ मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, स्कॅनिंग इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (SEM) अंतर्गत मोठ्या, अनियमित आणि खडबडीत पृष्ठभागांसह एक अत्यंत सच्छिद्र पावडर संरचना दिसून आली. निर्जलीकरणानंतर पावडरमध्ये काही विलग कण आढळले (आकृती २इ). या परिणामांवरून असे दिसून आले की कोणत्याही क्रायोप्रोटेक्टंटशिवाय फ्रीझ-ड्राइंग दरम्यान बहुतेक नॅनोकणांचे विघटन झाले. १% मॅनिटॉल असलेल्या फ्रीझ-ड्राइड आणि स्प्रे-ड्राइड इन्सुलिन नॅनोकणांसाठी, गुळगुळीत पृष्ठभाग असलेले गोलाकार नॅनोकण दिसून आले (आकृती २इ). २ब,ड,फ,ह). मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड केलेले इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्स गोलाकार राहिले, परंतु त्यांच्या पृष्ठभागावर सुरकुत्या होत्या (आकृती २क). गोलाकार आणि सुरकुत्या असलेल्या पृष्ठभागांवर खालील रिलीज वर्तन आणि सेल्युलर अपटेक चाचण्यांमध्ये अधिक चर्चा केली आहे. वाळलेल्या एनपीच्या दृश्य स्वरूपाच्या आधारावर, मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड केलेले एनपी आणि मॅनिटॉलसह फ्रीझ-ड्राइड व स्प्रे-ड्राइड केलेले एनपी या दोन्हींपासून बारीक एनपी पावडर मिळाली (आकृती २फ,ग,ह). कणांच्या पृष्ठभागांमधील पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ जितके जास्त असेल, तितकी विद्राव्यता जास्त असते आणि त्यामुळे रिलीजचा दरही जास्त असतो.
विविध निर्जलित इन्सुलिन नॅनोकणांचे आकारशास्त्र: (a) मॅनिटॉलशिवाय लायोफिलाइझ्ड इन्सुलिन नॅनोकणांची SEM प्रतिमा; (b) मॅनिटॉलसह लायोफिलाइझ्ड इन्सुलिन नॅनोकणांची SEM प्रतिमा; (c) मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड इन्सुलिन नॅनोकणांची SEM प्रतिमा; (d) मॅनिटॉलसह स्प्रे-ड्राइड इन्सुलिन नॅनोकणांची SEM प्रतिमा; (e) मॅनिटॉलशिवाय लायोफिलाइझ्ड इन्सुलिन नॅनोकणांच्या पावडरची प्रतिमा; (f) मॅनिटॉलसह लायोफिलाइझ्ड इन्सुलिन नॅनोकणांची प्रतिमा; (g) मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड इन्सुलिन नॅनोकणांच्या पावडरची प्रतिमा; (h) मॅनिटॉलसह स्प्रे-ड्राइड इन्सुलिन नॅनोकणांच्या पावडरची प्रतिमा.
फ्रीझ-ड्रायिंग दरम्यान, मॅनिटॉल क्रायोप्रोटेक्टंट म्हणून काम करते, ज्यामुळे NPs अस्फटिकी स्वरूपात राहतात आणि बर्फाच्या स्फटिकांमुळे होणारे नुकसान टाळले जाते¹⁹. याउलट, स्प्रे-ड्रायिंगमध्ये गोठवण्याची पायरी नसते. त्यामुळे या पद्धतीत मॅनिटॉलची आवश्यकता नसते. खरं तर, पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे, मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड NPs पासून अधिक बारीक NPs मिळाले. तथापि, मॅनिटॉल स्प्रे-ड्रायिंग प्रक्रियेत फिलर म्हणून काम करून NPs ना अधिक गोलाकार रचना देऊ शकते²⁰ (आकृती २d), ज्यामुळे अशा एनकॅप्सुलेटेड NPs चे एकसमान रिलीज वर्तन मिळविण्यात मदत होते. याव्यतिरिक्त, हे स्पष्ट आहे की मॅनिटॉल असलेल्या फ्रीझ-ड्राइड आणि स्प्रे-ड्राइड दोन्ही इन्सुलिन NPs मध्ये काही मोठे कण आढळू शकतात (आकृती २b,d), जे एनकॅप्सुलेटेड इन्सुलिनसह कणांच्या गाभ्यामध्ये मॅनिटॉलच्या संचयनामुळे असू शकते. कायटोसॅनचा थर. हे लक्षात घेणे महत्त्वाचे आहे की या अभ्यासात, निर्जलीकरणानंतर गोलाकार रचना अबाधित राहावी यासाठी, मॅनिटॉल आणि कायटोसॅनचे प्रमाण ५:१ ठेवण्यात आले आहे, जेणेकरून मोठ्या प्रमाणात फिलर असूनही वाळलेल्या एनपीजचा (NPs) कण आकार वाढू शकेल.
फूरियर ट्रान्सफॉर्म इन्फ्रारेड अटिन्युएटेड टोटल रिफ्लेक्शन (FTIR-ATR) स्पेक्ट्रोस्कोपीने मुक्त इन्सुलिन, चिटोसान, TPP आणि इन्सुलिन यांच्या भौतिक मिश्रणाचे वैशिष्ट्यीकरण केले. सर्व निर्जलित नॅनोकणांचे (NPs) वैशिष्ट्यीकरण FTIR-ATR स्पेक्ट्रोस्कोपी वापरून केले गेले. विशेष म्हणजे, मॅनिटॉलसह फ्रीझ-ड्राइड केलेल्या एनकॅप्सुलेटेड नॅनोकणांमध्ये आणि मॅनिटॉलसह व मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड केलेल्या नॅनोकणांमध्ये 1641, 1543 आणि 1412 cm-1 तीव्रतेचे बँड आढळून आले (आकृती 3). पूर्वी नोंदवल्याप्रमाणे, सामर्थ्यातील ही वाढ चिटोसान, TPP आणि इन्सुलिन यांच्यातील क्रॉस-लिंकिंगशी संबंधित होती. चिटोसान आणि इन्सुलिन यांच्यातील आंतरक्रियेच्या तपासणीत असे दिसून आले की, इन्सुलिन-लोडेड चिटोसान नॅनोकणांच्या FTIR स्पेक्ट्रामध्ये, चिटोसानचा बँड इन्सुलिनच्या बँडवर आच्छादित झाला, ज्यामुळे कार्बोनिल (1641 cm-1) आणि अमाइन (1543 cm-1) बँडची तीव्रता वाढली. TPP चे ट्रायपॉलिफॉस्फेट गट चिटोसानमधील अमोनियम गटांशी जोडलेले असतात, ज्यामुळे एक बँड तयार होतो. १४१२ सेमी-१.
मुक्त इन्सुलिन, चिटोसान, चिटोसान/टीपीपी/इन्सुलिनचे भौतिक मिश्रण आणि वेगवेगळ्या पद्धतींनी निर्जलित केलेल्या एनपीचे एफटीआयआर-एटीआर स्पेक्ट्रा.
शिवाय, हे परिणाम SEM मध्ये दर्शविलेल्या परिणामांशी सुसंगत आहेत, ज्यावरून असे दिसून आले की मॅनिटॉलसह फवारणी आणि फ्रीझ-ड्रायिंग दोन्ही केल्यावर एनकॅप्सुलेटेड NPs अखंड राहिले, परंतु मॅनिटॉलच्या अनुपस्थितीत, केवळ स्प्रे-ड्रायिंगमुळे एनकॅप्सुलेटेड कण तयार झाले. याउलट, मॅनिटॉलशिवाय फ्रीझ-ड्राय केलेल्या NPs चे FTIR-ATR स्पेक्ट्रल परिणाम चिटोसान, TPP आणि इन्सुलिनच्या भौतिक मिश्रणासारखेच होते. हा परिणाम सूचित करतो की मॅनिटॉलशिवाय फ्रीझ-ड्राय केलेल्या NPs मध्ये चिटोसान, TPP आणि इन्सुलिनमधील क्रॉस-लिंक्स आता अस्तित्वात नाहीत. क्रायोप्रोटेक्टंटशिवाय फ्रीझ-ड्रायिंग दरम्यान NPs ची रचना नष्ट झाली, जे SEM परिणामांमध्ये (आकृती 2a) पाहिले जाऊ शकते. डिहायड्रेटेड इन्सुलिन NPs च्या मॉर्फोलॉजी आणि FTIR परिणामांवर आधारित, पुनर्रचना प्रयोगांसाठी केवळ लायोफिलाइज्ड, स्प्रे-ड्राय केलेले आणि मॅनिटॉल-मुक्त NPs वापरले गेले, कारण मॅनिटॉल-मुक्त NPs चे विघटन होते. निर्जलीकरण. चर्चा करा.
दीर्घकालीन साठवणूक आणि इतर फॉर्म्युलेशन्समध्ये पुनर्प्रक्रियेसाठी निर्जलीकरणाचा वापर केला जातो. साठवणुकीनंतर कोरड्या नॅनोकणांची (NPs) पुनर्रचना करण्याची क्षमता, टॅब्लेट आणि फिल्म्ससारख्या विविध फॉर्म्युलेशन्समध्ये त्यांच्या वापरासाठी महत्त्वपूर्ण आहे. आमच्या लक्षात आले की, मॅनिटॉलच्या अनुपस्थितीत स्प्रे-ड्राइड इन्सुलिन नॅनोकणांचा सरासरी कण आकार पुनर्रचनेनंतर केवळ किंचित वाढला. याउलट, मॅनिटॉलसह स्प्रे-ड्राइड आणि फ्रीझ-ड्राइड इन्सुलिन नॅनोकणांचा कण आकार लक्षणीयरीत्या वाढला (तक्ता १). या अभ्यासात सर्व नॅनोकणांच्या पुनर्संयोजनानंतर PDI आणि EE मध्ये लक्षणीय बदल झाला नाही (p > 0.05) (तक्ता १). या परिणामावरून असे दिसून येते की, पुन्हा विरघळल्यानंतर बहुतेक कण शाबूत राहिले. तथापि, मॅनिटॉलच्या समावेशामुळे लायोफिलाइज्ड आणि स्प्रे-ड्राइड मॅनिटॉल नॅनोकणांमधील इन्सुलिनचे प्रमाण मोठ्या प्रमाणात कमी झाले (तक्ता १). याउलट, मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड केलेल्या नॅनोकणांमधील इन्सुलिनचे प्रमाण पूर्वीसारखेच राहिले (तक्ता १).
हे सर्वज्ञात आहे की औषध वितरणाच्या उद्देशाने वापरल्यास नॅनोकणांचे लोडिंग महत्त्वपूर्ण असते. कमी लोडिंग असलेल्या नॅनोकणांसाठी, उपचारात्मक मर्यादा गाठण्याकरिता खूप मोठ्या प्रमाणात पदार्थाची आवश्यकता असते. तथापि, अशा उच्च नॅनोकण सांद्रतेच्या उच्च चिकटपणामुळे तोंडावाटे औषध घेणे आणि इंजेक्शनद्वारे औषध तयार करणे यात अनुक्रमे गैरसोय आणि अडचण निर्माण होते 22. याव्यतिरिक्त, इन्सुलिन नॅनोकणांचा वापर गोळ्या आणि चिकट बायोफिल्म बनवण्यासाठी देखील केला जाऊ शकतो 23, 24, ज्यासाठी कमी लोडिंग स्तरावर मोठ्या प्रमाणात नॅनोकणांचा वापर आवश्यक असतो, परिणामी मोठ्या गोळ्या आणि जाड बायोफिल्म तयार होतात जे तोंडावाटे घेण्यासाठी योग्य नसतात. म्हणून, उच्च इन्सुलिन भार असलेले निर्जलीकृत नॅनोकण अत्यंत इष्ट आहेत. आमचे निष्कर्ष सूचित करतात की मॅनिटॉल-मुक्त स्प्रे-ड्राइड नॅनोकणांचा उच्च इन्सुलिन भार या पर्यायी वितरण पद्धतींसाठी अनेक आकर्षक फायदे देऊ शकतो.
सर्व निर्जलित नॅनोकण (NPs) तीन महिन्यांसाठी रेफ्रिजरेटरमध्ये ठेवण्यात आले. SEM परिणामांवरून असे दिसून आले की, तीन महिन्यांच्या साठवणुकीदरम्यान सर्व निर्जलित नॅनोकणांच्या आकारात लक्षणीय बदल झाला नाही (आकृती ४). पाण्यात पुनर्गठन केल्यानंतर, सर्व नॅनोकणांनी EE मध्ये किंचित घट दर्शविली आणि तीन महिन्यांच्या साठवणुकीच्या कालावधीत अंदाजे थोड्या प्रमाणात (~५%) इन्सुलिन मुक्त केले (तक्ता २). तथापि, सर्व नॅनोकणांचा सरासरी आकार वाढला. मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड केलेल्या नॅनोकणांचा आकार ५२५ nm पर्यंत वाढला, तर मॅनिटॉलसह स्प्रे-ड्राइड आणि फ्रीझ-ड्राइड केलेल्या नॅनोकणांचा आकार अनुक्रमे ८७२ आणि ९२१ nm पर्यंत वाढला (तक्ता २).
तीन महिने साठवलेल्या वेगवेगळ्या निर्जलीकृत इन्सुलिन एनपीचे आकारशास्त्र: (a) मॅनिटॉलसह लायोफिलाइज्ड इन्सुलिन एनपीची एसईएम प्रतिमा; (b) मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सची एसईएम प्रतिमा; (c) मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड इन्सुलिन एनपीच्या एसईएम प्रतिमा.
शिवाय, मॅनिटॉलसह स्प्रे-ड्राइड आणि फ्रीझ-ड्राइड केलेल्या पुनर्रचित इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्समध्ये अवक्षेप दिसून आले (आकृती S2). हे मोठे कण पाण्यात योग्यरित्या निलंबित न झाल्यामुळे होऊ शकते. वरील सर्व परिणाम हे दर्शवतात की स्प्रे-ड्राइंग तंत्र इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सना निर्जलीकरणापासून वाचवू शकते आणि कोणत्याही फिलर्स किंवा क्रायोप्रोटेक्टंट्सशिवाय इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचे उच्च लोडिंग मिळवता येते.
निर्जलीकरणानंतर एन्झायमॅटिक पचनाविरुद्ध नॅनोकणांची (NPs) संरक्षक क्षमता दर्शवण्यासाठी, पेप्सिन, ट्रिप्सिन आणि α-कायमोट्रिप्सिनच्या साहाय्याने pH = 2.5 माध्यमात इन्सुलिन धारणा तपासण्यात आली. निर्जलित नॅनोकणांच्या इन्सुलिन धारणेची तुलना नव्याने तयार केलेल्या नॅनोकणांशी करण्यात आली आणि मुक्त इन्सुलिनचा नकारात्मक नियंत्रण म्हणून वापर करण्यात आला. या अभ्यासात, तिन्ही एन्झायमॅटिक उपचारांमध्ये मुक्त इन्सुलिनने 4 तासांच्या आत जलद गतीने इन्सुलिनचे उच्चाटन दर्शवले (आकृती 5a–c). याउलट, मॅनिटॉलसह फ्रीझ-ड्राइड केलेल्या नॅनोकणांची आणि मॅनिटॉलसह किंवा त्याशिवाय स्प्रे-ड्राइड केलेल्या नॅनोकणांची इन्सुलिन उच्चाटन चाचणी दर्शवते की या नॅनोकणांनी एन्झायमॅटिक पचनाविरुद्ध लक्षणीयरीत्या जास्त संरक्षण दिले, जे नव्याने तयार केलेल्या इन्सुलिन नॅनोकणांसारखेच होते (आकृती 1.5a-c). पेप्सिन, ट्रिप्सिन आणि α-कायमोट्रिप्सिनमधील नॅनोकणांच्या मदतीने, अनुक्रमे 50%, 60% आणि 75% पेक्षा जास्त इन्सुलिन 4 तासांच्या आत संरक्षित केले जाऊ शकले (आकृती 1.5a-c). 5a–c). या इन्सुलिन-संरक्षक क्षमतेमुळे रक्तप्रवाहात इन्सुलिनचे शोषण वाढण्याची शक्यता वाढू शकते25. या परिणामांनुसार असे दिसून येते की मॅनिटॉलसह किंवा मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्रायिंग आणि मॅनिटॉलसह फ्रीझ-ड्रायिंग केल्याने निर्जलीकरणानंतर NPs ची इन्सुलिन-संरक्षक क्षमता टिकवून ठेवता येते.
निर्जलित इन्सुलिन एनपीचे संरक्षण आणि मुक्त होण्याची वर्तणूक: (अ) पेप्सिन द्रावणात इन्सुलिनचे संरक्षण; (ब) ट्रिप्सिन द्रावणात इन्सुलिनचे संरक्षण; (क) α-कायमोट्रिप्सिन द्रावणाद्वारे इन्सुलिनचे संरक्षण; (ड) pH = 2.5 द्रावणात निर्जलित एनपीची मुक्त होण्याची वर्तणूक; (इ) pH = 6.6 द्रावणात निर्जलित एनपीची मुक्त होण्याची वर्तणूक; (फ) pH = 7.0 द्रावणात निर्जलित एनपीची मुक्त होण्याची वर्तणूक.
इन्सुलिन प्रतिरोधकतेवर इन्सुलिनचा होणारा परिणाम तपासण्यासाठी, नव्याने तयार केलेले आणि पुनर्गठित केलेले कोरडे इन्सुलिन नॅनोकण (NPs) पोट, ग्रहणी आणि लहान आतड्याच्या वरच्या भागातील pH वातावरणाचे अनुकरण करत, 37 °C तापमानावर विविध बफरमध्ये (pH = 2.5, 6.6, 7.0) उबवण्यात आले. वेगवेगळ्या वातावरणातील मुक्त होण्याची वर्तणूक. जठरांत्र मार्गाचा एक भाग. pH = २.५ वर, इन्सुलिन-युक्त NPs आणि पुन्हा विरघळलेल्या कोरड्या इन्सुलिन NPs ने पहिल्या एका तासात सुरुवातीला वेगाने मुक्तता दर्शविली, त्यानंतर पुढील ५ तासांमध्ये हळू हळू मुक्तता झाली (आकृती ५d). सुरुवातीला होणारी ही जलद मुक्तता बहुधा कणांच्या अंतर्गत संरचनेत पूर्णपणे स्थिर न झालेल्या प्रथिन रेणूंच्या पृष्ठभागावरील जलद विलगनाचा परिणाम आहे. pH = ६.५ वर, इन्सुलिन-युक्त NPs आणि पुनर्रचित कोरड्या इन्सुलिन NPs ने ६ तासांपर्यंत सहज आणि हळू मुक्तता दर्शविली, कारण चाचणी द्रावणाचा pH हा NPs-तयार केलेल्या द्रावणाच्या pH सारखाच होता (आकृती ५e). pH = ७ वर, NPs अस्थिर होते आणि पहिल्या दोन तासांत जवळजवळ पूर्णपणे विघटित झाले (आकृती ५f). याचे कारण असे की उच्च pH वर चिटोसनचे विप्रोटनीकरण होते, ज्यामुळे पॉलिमर नेटवर्क कमी घट्ट होते आणि युक्त इन्सुलिनची मुक्तता होते.
शिवाय, मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड केलेल्या इन्सुलिन एनपींनी इतर डिहायड्रेटेड एनपींच्या तुलनेत जलद रिलीज प्रोफाइल दर्शविले (आकृती 5d–f). पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे, मॅनिटॉलशिवाय वाळवलेल्या पुनर्रचित इन्सुलिन एनपींचा कण आकार सर्वात लहान होता. लहान कण मोठे पृष्ठभाग क्षेत्र प्रदान करतात, त्यामुळे बहुतेक संबंधित औषध कणाच्या पृष्ठभागावर किंवा जवळ असते, परिणामी औषध जलद गतीने रिलीज होते²⁶.
एमटीटी अ‍ॅसेद्वारे एनपीच्या सायटोटॉक्सिसिटीचा अभ्यास करण्यात आला. आकृती एस४ मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, ५०-५०० μg/ml या सांद्रतेवर सर्व निर्जलित एनपींचा पेशींच्या जिवंतपणावर कोणताही लक्षणीय परिणाम दिसून आला नाही, यावरून असे सूचित होते की उपचारात्मक मर्यादा गाठण्यासाठी सर्व निर्जलित एनपी सुरक्षितपणे वापरले जाऊ शकतात.
यकृत हा मुख्य अवयव आहे ज्याद्वारे इन्सुलिन आपली शारीरिक कार्ये पार पाडते. HepG2 पेशी ही मानवी हेपॅटोमा पेशींची एक श्रेणी आहे जी सामान्यतः इन विट्रो हेपॅटोसाइट अपटेक मॉडेल म्हणून वापरली जाते. येथे, फ्रीज-ड्रायिंग आणि स्प्रे-ड्रायिंग पद्धती वापरून निर्जलित केलेल्या NPs च्या पेशीय ग्रहणाचे मूल्यांकन करण्यासाठी HepG2 पेशी वापरल्या गेल्या. 25 μg/mL च्या सांद्रतेमध्ये मुक्त FITC इन्सुलिन, नव्याने तयार केलेले FITC इन्सुलिन-युक्त NPs आणि समान इन्सुलिन सांद्रतेमध्ये निर्जलित केलेले FITC इन्सुलिन-युक्त NPs यांच्यासोबत अनेक तास उष्मायन केल्यानंतर, फ्लो सायटोमेट्री आणि व्हिजन वापरून कॉन्फोकल लेझर स्कॅनिंगद्वारे पेशीय ग्रहणाचे मूल्यांकन केले गेले. परिमाणात्मक मायक्रोस्कोपी (CLSM) निरीक्षणे करण्यात आली. मॅनिटॉलशिवाय लायोफिलाइज्ड NPs निर्जलीकरणादरम्यान नष्ट झाले आणि या चाचणीत त्यांचे मूल्यांकन केले गेले नाही. नव्याने तयार केलेले इन्सुलिन-युक्त NPs, मॅनिटॉलसह लायोफिलाइज्ड NPs, आणि मॅनिटॉलसह व त्याशिवाय स्प्रे-ड्राइड NPs (आकृती 6a) यांची आंतरपेशीय फ्लुरोसेन्स तीव्रता अनुक्रमे 4.3, 2.6, 100 μg/mL, 100 μg/mL होती. अनुक्रमे मुक्त FITC-इन्सुलिन गटापेक्षा २.४ आणि ४.१ पट जास्त (आकृती ६ब). हे परिणाम सूचित करतात की, मुख्यत्वे अभ्यासात तयार केलेल्या इन्सुलिन-युक्त नॅनोकणांच्या लहान आकारामुळे, आवेष्टित इन्सुलिन मुक्त इन्सुलिनपेक्षा पेशींमध्ये शोषले जाण्यास अधिक प्रभावी आहे.
ताज्या तयार केलेल्या NPs आणि निर्जलित NPs सह 4 तास उष्मायन केल्यानंतर HepG2 पेशींद्वारे ग्रहण: (a) HepG2 पेशींद्वारे FITC-इन्सुलिन ग्रहणाचे वितरण. (b) फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे विश्लेषण केलेल्या फ्लुरोसेन्स तीव्रतेची भूमितीय सरासरी (n = 3), *मुक्त इन्सुलिनच्या तुलनेत P < 0.05.
त्याचप्रमाणे, CLSM प्रतिमांवरून असे दिसून आले की, नव्याने तयार केलेल्या FITC-इन्सुलिन-युक्त NPs आणि FITC-इन्सुलिन-युक्त स्प्रे-ड्राइड NPs (मॅनिटॉलशिवाय) यांची FITC प्रतिदीप्ती तीव्रता इतर नमुन्यांपेक्षा खूपच जास्त होती (आकृती 6a). शिवाय, मॅनिटॉलच्या समावेशामुळे, द्रावणाच्या वाढलेल्या स्निग्धतेमुळे पेशींद्वारे होणाऱ्या शोषणाला प्रतिकार वाढला, परिणामी इन्सुलिन प्रसारात घट झाली. या निष्कर्षांवरून असे सूचित होते की, मॅनिटॉल-मुक्त स्प्रे-ड्राइड NPs ने सर्वाधिक पेशी शोषण कार्यक्षमता दर्शविली, कारण पुन्हा विरघळल्यानंतर त्यांचा कण आकार फ्रीझ-ड्राइड NPs पेक्षा लहान होता.
कायटोसॅन (सरासरी आण्विक वजन १०० केडीए, ७५-८५% डीअ‍ॅसिटिलेटेड) सिग्मा-अल्ड्रिच (ओकविले, ओंटारियो, कॅनडा) येथून खरेदी करण्यात आले. सोडियम ट्रायपॉलिफॉस्फेट (टीपीपी) व्हीडब्ल्यूआर (रॅडनॉर, पेनसिल्व्हेनिया, यूएसए) येथून खरेदी करण्यात आले. या अभ्यासात वापरलेले रिकॉम्बिनंट मानवी इन्सुलिन फिशर सायंटिफिक (वॉल्थम, एमए, यूएसए) येथून घेण्यात आले. फ्लुरोसीन आयसोथायोसायनेट (एफआयटीसी)-लेबल केलेले मानवी इन्सुलिन आणि ४′,६-डायअ‍ॅमिडिनो-२-फेनिलइंडोल डायहायड्रोक्लोराइड (डीएपीआय) सिग्मा-अल्ड्रिच (ओकविले, ओंटारियो, कॅनडा) येथून खरेदी करण्यात आले. हेपजी२ सेल लाइन एटीसीसी (मनासास, व्हर्जिनिया, यूएसए) येथून मिळवण्यात आली. इतर सर्व अभिकर्मक विश्लेषणात्मक किंवा क्रोमॅटोग्राफिक दर्जाचे होते.
०.१% ऍसिटिक ऍसिड असलेल्या दुहेरी ऊर्ध्वपातित पाण्यात (DD वॉटर) विरघळवून १ मिग्रॅ/मिली सीएस द्रावण तयार करा. टीपीपी आणि इन्सुलिनची १ मिग्रॅ/मिली द्रावणे अनुक्रमे डीडी वॉटर आणि ०.१% ऍसिटिक ऍसिडमध्ये विरघळवून तयार करा. प्री-इमल्शन पॉलीट्रॉन PCU-2-110 हाय-स्पीड होमोजिनायझर (ब्रिंकमन इंड. वेस्टबरी, एनवाय, यूएसए) वापरून तयार करण्यात आले. तयारीची प्रक्रिया खालीलप्रमाणे आहे: सर्वप्रथम, ४ मिली इन्सुलिन द्रावणामध्ये २ मिली टीपीपी द्रावण टाकले जाते आणि हे मिश्रण ३० मिनिटे ढवळून पूर्णपणे मिसळले जाते. त्यानंतर, हे मिश्र द्रावण हाय-स्पीड स्टिरिंग (१०,००० आरपीएम) चालू असताना सिरिंजद्वारे थेंब-थेंब करून सीएस द्रावणात टाकले जाते. ही मिश्रणे बर्फाच्या बाथमध्ये ३० मिनिटांसाठी हाय-स्पीड स्टिरिंग (१५,००० आरपीएम) चालू ठेवून ठेवली जातात आणि क्रॉस-लिंक्ड इन्सुलिन एनपी मिळवण्यासाठी त्यांचे पीएच एका विशिष्ट पातळीवर समायोजित केले जाते. इन्सुलिनच्या कणांचा आकार आणखी एकजीव करण्यासाठी आणि कमी करण्यासाठी. एनपींना, प्रोब-प्रकारच्या सोनिकेटरचा (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germany) वापर करून बर्फाच्या बाथमध्ये अतिरिक्त 30 मिनिटे सोनिकेट केले गेले.
इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्स (NPs) 25°C तापमानावर DD पाण्यात विरघळवून, लाइटसायझर 500 (अँटोन पार, ग्राझ, ऑस्ट्रिया) वापरून डायनॅमिक लाइट स्कॅटरिंग (DLS) मापनाद्वारे Z-सरासरी व्यास, पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स (PDI) आणि झेटा पोटेन्शिअलसाठी तपासले गेले. आकारविज्ञान आणि आकार वितरण हिताची H7600 ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (TEM) (हिताची, टोक्यो, जपान) द्वारे वैशिष्ट्यीकृत केले गेले आणि त्यानंतर हिताची इमेजिंग सॉफ्टवेअर (हिताची, टोक्यो, जपान) वापरून प्रतिमांचे विश्लेषण केले गेले. इन्सुलिन NPs ची एनकॅप्सुलेशन कार्यक्षमता (EE) आणि लोडिंग क्षमता (LC) तपासण्यासाठी, NPs 100 kDa च्या आण्विक वजन कट-ऑफ असलेल्या अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबमध्ये पिपेट केले गेले आणि 30 मिनिटांसाठी 500 xg वर सेंट्रीफ्यूज केले गेले. गाळलेल्या द्रवातील एनकॅप्सुलेशन न झालेल्या इन्सुलिनचे प्रमाण क्वाटरनरी पंप असलेल्या एजिलेंट 1100 सिरीज HPLC प्रणाली (एजिलेंट, सांता क्लारा, कॅलिफोर्निया, यूएसए) वापरून मोजले गेले. ऑटो सॅम्पलर, कॉलम हीटर आणि DAD डिटेक्टर. इन्सुलिनचे विश्लेषण C18 कॉलम (झोरबॅक्स, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, एजिलेंट, यूएसए) द्वारे केले गेले आणि 214 nm वर शोधले गेले. मोबाइल फेज ॲसिटोनायट्राइल आणि पाणी होते, ज्यात 0.1% TFA होते, ग्रेडियंट गुणोत्तर 10/90 ते 100/0 होते आणि ते 10 मिनिटांसाठी चालवले गेले. मोबाइल फेज 1.0 ml/min च्या प्रवाह दराने पंप केले गेले. कॉलमचे तापमान 20 °C वर सेट केले गेले. समीकरण (1) आणि समीकरण (2) वापरून EE आणि LC ची टक्केवारी काढा.
इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्स (NPs) ऑप्टिमाइझ करण्यासाठी २.० ते ४.० पर्यंतच्या विविध CS/इन्सुलिन गुणोत्तरांची चाचणी घेण्यात आली. तयार करण्याच्या प्रक्रियेदरम्यान CS द्रावणाचे वेगवेगळे प्रमाण टाकण्यात आले, तर इन्सुलिन/TPP मिश्रण स्थिर ठेवण्यात आले. सर्व द्रावणे (इन्सुलिन, TPP आणि CS) टाकल्यानंतर मिश्रणाचा pH काळजीपूर्वक नियंत्रित करून, ४.० ते ६.५ च्या pH श्रेणीमध्ये इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्स तयार करण्यात आले. इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सची निर्मिती ऑप्टिमाइझ करण्यासाठी, वेगवेगळ्या pH मूल्यांवर आणि CS/इन्सुलिन वस्तुमान गुणोत्तरांवर इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सच्या EE आणि कणांच्या आकाराचे मूल्यांकन करण्यात आले.
ऑप्टिमाइझ केलेले इन्सुलिन एनपी ॲल्युमिनियम कंटेनरवर ठेवण्यात आले आणि काही टेपने घट्ट केलेल्या टिश्यूने झाकण्यात आले. त्यानंतर, स्क्रू लावलेले कंटेनर ट्रे ड्रायरने सुसज्ज असलेल्या लॅबकॉन्को फ्रीझोन फ्रीझ ड्रायरमध्ये (लॅबकॉन्को, कॅन्सस सिटी, एमओ, यूएसए) ठेवण्यात आले. कोरडे इन्सुलिन एनपी मिळवण्यासाठी, २४ तासांपैकी पहिल्या २ तासांसाठी तापमान आणि व्हॅक्यूम दाब -१०°C, ०.३५० टॉर आणि उर्वरित २२ तासांसाठी ०°C आणि ०.१२० टॉरवर सेट करण्यात आले.
कॅप्सूलमध्ये बंद केलेले इन्सुलिन तयार करण्यासाठी बुची मिनी स्प्रे ड्रायर बी-२९० (बुची, फ्लाविल, स्वित्झर्लंड) वापरण्यात आला. निवडलेले वाळवण्याचे मापदंड होते: तापमान १०० °C, फीड फ्लो ३ लिटर/मिनिट आणि गॅस फ्लो ४ लिटर/मिनिट.
निर्जलीकरणापूर्वी आणि नंतरच्या इन्सुलिन नॅनोकणांचे (NPs) एफटीआयआर-एटीआर स्पेक्ट्रोस्कोपी वापरून वैशिष्ट्यीकरण करण्यात आले. निर्जलित नॅनोकण तसेच मुक्त इन्सुलिन आणि कायटोसॅन यांचे विश्लेषण युनिव्हर्सल एटीआर सॅम्पलिंग ॲक्सेसरी (पर्किनएल्मर, वॉल्थम, मॅसॅच्युसेट्स, यूएसए) असलेल्या स्पेक्ट्रम 100 एफटीआयआर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (पर्किनएल्मर, वॉल्थम, मॅसॅच्युसेट्स, यूएसए) वापरून करण्यात आले. 4000-600 cm2 च्या वारंवारता श्रेणीमध्ये 4 cm2 च्या रिझोल्यूशनवर 16 स्कॅनमधून सिग्नलची सरासरी मिळवण्यात आली.
हेलिओस नॅनोलॅब 650 फोकस्ड आयन बीम-स्कॅनिंग इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (FIB-SEM) (FEI, हिल्सबोरो, ओरेगॉन, USA) द्वारे घेतलेल्या फ्रीझ-ड्राइड आणि स्प्रे-ड्राइड इन्सुलिन एनपीच्या एसईएम प्रतिमांद्वारे कोरड्या इन्सुलिन एनपीच्या आकारविज्ञानाचे मूल्यांकन करण्यात आले. वापरलेले मुख्य पॅरामीटर व्होल्टेज 5 keV आणि करंट 30 mA होते.
सर्व निर्जलित इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्स (NPs) डीडी पाण्यात पुन्हा विरघळवण्यात आले. निर्जलीकरणानंतर त्यांची गुणवत्ता तपासण्यासाठी, पूर्वी नमूद केलेल्या त्याच पद्धतीचा वापर करून कणांचा आकार, PDI, EE आणि LC यांची पुन्हा चाचणी घेण्यात आली. दीर्घकाळ साठवणुकीनंतर नॅनोपार्टिकल्सच्या गुणधर्मांची चाचणी करून निर्जल इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सची स्थिरता देखील मोजण्यात आली. या अभ्यासात, निर्जलीकरणानंतर सर्व नॅनोपार्टिकल्स तीन महिन्यांसाठी रेफ्रिजरेटरमध्ये साठवण्यात आले. तीन महिन्यांच्या साठवणुकीनंतर, नॅनोपार्टिकल्सचा आकार, PDI, EE आणि LC यांची तपासणी करण्यात आली.
निर्जलीकरणानंतर नॅनोकणांचे (NPs) संरक्षण करण्यामध्ये इन्सुलिनची परिणामकारकता तपासण्यासाठी, ५ मिली पुनर्रचित नॅनोकण (NPs) ४५ मिली कृत्रिम जठर द्रव (पीएच १.२, १% पेप्सिन असलेले), आतड्यांतील द्रव (पीएच ६.८, १% ट्रायप्सिन असलेले) किंवा कायमोट्रायप्सिन द्रावण (१०० ग्रॅम/मिली, फॉस्फेट बफरमध्ये, पीएच ७.८) असलेल्या द्रावणात विरघळवण्यात आले. त्यांना ३७°C तापमानावर १०० आरपीएम (rpm) च्या ढवळण्याच्या गतीने उबवण्यात आले. वेगवेगळ्या वेळी द्रावणाचे ५०० μL नमुने गोळा करण्यात आले आणि एचपीएलसी (HPLC) द्वारे इन्सुलिनची सांद्रता निश्चित करण्यात आली.
ताज्या तयार केलेल्या आणि निर्जलित इन्सुलिन नॅनोकणांच्या (NPs) इन विट्रो विमोचन वर्तणुकीची चाचणी डायलिसिस बॅग पद्धतीद्वारे करण्यात आली (आण्विक वजन कट-ऑफ 100 kDa, स्पेक्ट्रा पोर इंक.). अनुक्रमे पोट, ग्रहणी आणि लहान आतड्याच्या वरच्या भागातील pH वातावरणाचे अनुकरण करण्यासाठी, ताज्या तयार केलेल्या आणि पुनर्रचित केलेल्या कोरड्या नॅनोकणांना pH 2.5, pH 6.6, आणि pH 7.0 (0.1 M फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन, PBS) असलेल्या द्रवांमध्ये डायलिसिस करण्यात आले. सर्व नमुने 37 °C तापमानावर 200 rpm वेगाने सतत हलवत ठेवून इनक्युबेट करण्यात आले. 5 mL डायलिसिस बॅगमधील द्रव खालील वेळी बाहेर काढा: 0.5, 1, 2, 3, 4, आणि 6 तास, आणि ताबडतोब ताज्या डायलिसेटने ते पुन्हा भरा. द्रवातील इन्सुलिनच्या दूषिततेचे विश्लेषण HPLC द्वारे करण्यात आले, आणि नॅनोकणांमध्ये बंदिस्त असलेल्या एकूण इन्सुलिनच्या तुलनेत मुक्त झालेल्या इन्सुलिनच्या प्रमाणावरून नॅनोकणांमधून इन्सुलिन विमोचनाचा दर मोजण्यात आला (समीकरण). ३).
मानवी यकृताच्या कर्करोगाच्या पेशींची श्रेणी HepG2 पेशी 60 मिमी व्यासाच्या डिशमध्ये डल्बेकोज मॉडिफाइड ईगल्स मीडियम (DMEM) वापरून वाढवण्यात आल्या, ज्यात 10% फीटल बोवाइन सीरम, 100 IU/mL पेनिसिलीन आणि 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमायसिन होते²⁹. कल्चर 37°C, 95% सापेक्ष आर्द्रता आणि 5% CO2 मध्ये ठेवण्यात आले. अपटेक चाचण्यांसाठी, HepG2 पेशी 8-वेल नंक लॅब-टेक चेंबर स्लाइड सिस्टमवर (थर्मो फिशर, न्यूयॉर्क, यूएसए) 1 × 10⁵ पेशी/मिली या घनतेने पेरण्यात आल्या. सायटोटॉक्सिसिटी चाचण्यांसाठी, त्या 96-वेल प्लेट्समध्ये (कॉर्निंग, न्यूयॉर्क, यूएसए) 5 × 10⁴ पेशी/मिली या घनतेने पेरण्यात आल्या.
ताज्या तयार केलेल्या आणि निर्जलित केलेल्या इन्सुलिन एनपीजच्या (NPs) सायटोटॉक्सिसिटीचे मूल्यांकन करण्यासाठी एमटीटी (MTT) चाचणीचा वापर करण्यात आला. हेपजी२ (HepG2) पेशी ९६-वेल प्लेट्समध्ये ५ × १०⁴ पेशी/मिली या घनतेने पेरण्यात आल्या आणि चाचणीपूर्वी ७ दिवस संवर्धित करण्यात आल्या. इन्सुलिन एनपीज कल्चर माध्यमात विविध सांद्रतांमध्ये (५० ते ५०० μg/मिली) विरल करण्यात आले आणि नंतर पेशींना देण्यात आले. २४ तासांच्या इनक्यूबेशननंतर, पेशी पीबीएसने (PBS) ३ वेळा धुतल्या गेल्या आणि ०.५ मिलीग्राम/मिली एमटीटी असलेल्या माध्यमात अतिरिक्त ४ तासांसाठी इनक्यूबेट करण्यात आल्या. सायटोटॉक्सिसिटीचे मूल्यांकन टेकान इन्फिनाइट एम२०० प्रो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर प्लेट रीडर (टेकान, मॅनेडॉर्फ, स्वित्झर्लंड) वापरून ५७० एनएमवर पिवळ्या टेट्राझोलियम एमटीटीचे जांभळ्या फॉर्माझॅनमध्ये होणारे एन्झायमॅटिक रिडक्शन मोजून करण्यात आले.
नॅनोकणांच्या (NPs) पेशींद्वारे शोषण्याच्या कार्यक्षमतेची चाचणी कॉन्फोकल लेझर स्कॅनिंग मायक्रोस्कोपी आणि फ्लो सायटोमेट्री विश्लेषणाद्वारे करण्यात आली. नंक लॅब-टेक चेंबर स्लाइड सिस्टीमच्या प्रत्येक वेलमध्ये मुक्त FITC-इन्सुलिन, FITC-इन्सुलिन-युक्त नॅनोकण आणि त्याच सांद्रतेमध्ये पुनर्रचित २५ μg/mL निर्जलित FITC-इन्सुलिन नॅनोकणांवर प्रक्रिया करून ४ तास उबवण्यात आले. पेशी पीबीएसने ३ वेळा धुतल्या गेल्या आणि ४% पॅराफॉर्मल्डिहाइडने स्थिर केल्या गेल्या. केंद्रकांना ४′,६-डायअमिडिनो-२-फेनिलइंडोल (DAPI) ने रंगवले गेले. इन्सुलिनचे स्थानिकीकरण ऑलिंपस FV1000 लेझर स्कॅनिंग/टू-फोटॉन कॉन्फोकल मायक्रोस्कोप (ऑलिंपस, शिंजुकू सिटी, टोक्यो, जपान) वापरून पाहिले गेले. फ्लो सायटोमेट्री विश्लेषणासाठी, १० μg/mL मुक्त FITC-इन्सुलिन, FITC-इन्सुलिन-युक्त नॅनोकण आणि पुनर्विद्राव्य निर्जलित नॅनोकणांच्या त्याच सांद्रतेचा वापर करण्यात आला. HepG2 पेशी पेरलेल्या 96-वेल प्लेट्समध्ये FITC-इन्सुलिन NPs टाकण्यात आले आणि 4 तास उबवण्यात आले. 4 तासांच्या उबवणुकीनंतर, पेशी काढून FBS ने 3 वेळा धुतल्या गेल्या. प्रत्येक नमुन्यातील 5 × 104 पेशींचे विश्लेषण BD LSR II फ्लो सायटोमीटर (BD, फ्रँकलिन लेक्स, न्यू जर्सी, युनायटेड स्टेट्स) द्वारे करण्यात आले.
सर्व मूल्ये सरासरी ± मानक विचलन म्हणून व्यक्त केली आहेत. सर्व गटांमधील तुलना IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, New York, USA) द्वारे वन-वे ANOVA किंवा टी-टेस्ट वापरून तपासण्यात आली आणि p < 0.05 हे सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण मानले गेले.
हा अभ्यास बल्किंग एजंट्स किंवा क्रायोप्रोटेक्टंट्स वापरणाऱ्या मानक फ्रीझ-ड्रायिंग पद्धतींच्या तुलनेत, स्प्रे-ड्रायिंगची लवचिकता आणि क्रॉस-लिंक्ड चिटोसन/टीपीपी/इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचे निर्जलीकरण करण्याची क्षमता दर्शवतो, ज्यामुळे त्यांचे अधिक चांगल्या प्रकारे पुनर्गठन होते आणि भार क्षमताही वाढते. ऑप्टिमाइझ केलेल्या इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचा सरासरी कण आकार ३१८ एनएम आणि एनकॅप्सुलेशन कार्यक्षमता ९९.४% आढळली. निर्जलीकरणानंतरच्या एसईएम (SEM) आणि एफटीआयआर (FTIR) परिणामांनुसार, गोलाकार रचना केवळ मॅनिटॉलसह आणि मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड केलेल्या आणि मॅनिटॉलसह लायोफिलाइज्ड केलेल्या एनपीमध्येच टिकून राहिली, परंतु मॅनिटॉलशिवाय लायोफिलाइज्ड केलेले एनपी निर्जलीकरणादरम्यान विघटित झाले. पुनर्गठन क्षमता चाचणीमध्ये, मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड केलेल्या इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचा सरासरी कण आकार सर्वात लहान आणि पुनर्गठनानंतर भार क्षमता सर्वाधिक होती. या सर्व निर्जलित एनपींच्या विमोचन वर्तनावरून असे दिसून आले की ते pH = २.५ आणि pH = ७ च्या द्रावणांमध्ये वेगाने विमोचित झाले आणि pH = ६.५ च्या द्रावणात खूप स्थिर होते. इतर पुनर्विमोचित पदार्थांच्या तुलनेत... निर्जलित नॅनोकणांपैकी, मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राइड केलेल्या नॅनोकणांनी सर्वात जलद विमोचन दर्शवले. हा परिणाम पेशी शोषण चाचणीमध्ये दिसून आलेल्या निष्कर्षांशी सुसंगत आहे, कारण मॅनिटॉलच्या अनुपस्थितीत स्प्रे-ड्राइड केलेल्या नॅनोकणांनी ताज्या तयार केलेल्या नॅनोकणांची पेशी शोषण कार्यक्षमता जवळजवळ पूर्णपणे टिकवून ठेवली. हे परिणाम सूचित करतात की मॅनिटॉल-मुक्त स्प्रे-ड्राइंगद्वारे तयार केलेले कोरडे इन्सुलिन नॅनोकण हे तोंडी गोळ्या किंवा जैव-चिकट फिल्म्स यांसारख्या इतर निर्जल औषध स्वरूपांमध्ये पुढील प्रक्रियेसाठी सर्वात योग्य आहेत.
बौद्धिक मालमत्तेच्या समस्यांमुळे, सद्य अभ्यासादरम्यान तयार केलेला आणि/किंवा विश्लेषण केलेला डेटासेट सार्वजनिकरित्या उपलब्ध नाही, परंतु वाजवी विनंतीनुसार तो संबंधित लेखकांकडून मिळू शकतो.
कागन, ए. टाईप २ मधुमेह: सामाजिक आणि वैज्ञानिक उगम, वैद्यकीय गुंतागुंत आणि रुग्ण व इतरांवरील परिणाम. (मॅकफार्लेन, २००९).
सिंग, एपी, गुओ, वाय., सिंग, ए., झी, डब्ल्यू. आणि जियांग, पी. इन्सुलिन एनकॅप्सुलेशनचा विकास: तोंडी सेवन आता शक्य आहे का? जे. फार्मसी.बायो-फार्मसी.रिझर्व्हॉयर.1, 74–92 (2019).
वोंग, सीवाय, अल-सलामी, एच. आणि दास, सीआर मधुमेहाच्या उपचारासाठी तोंडी इन्सुलिन-युक्त लिपोसोम वितरण प्रणालीमधील अलीकडील प्रगती. विश्लेषण. जे. फार्मसी. 549, 201–217 (2018).