Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अपडेटेड ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड बंद करा). दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि जावास्क्रिप्टशिवाय साइट प्रदर्शित करू.
उच्च लोडिंग सामग्री असलेल्या इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्स (NPs) चे वेगवेगळ्या डोस स्वरूपात वेगवेगळे उपयोग आढळले आहेत. या कामाचा उद्देश फ्रीझ-ड्रायिंग आणि स्प्रे-ड्रायिंग प्रक्रियेचा इन्सुलिन-लोडेड चिटोसन नॅनोपार्टिकल्सच्या संरचनेवर होणाऱ्या परिणामाचे मूल्यांकन करणे आहे, मॅनिटोलसह किंवा त्याशिवाय क्रायोप्रोटेक्टंट म्हणून. आम्ही या नॅनोपार्टिकल्सची गुणवत्ता पुन्हा विरघळवून देखील मूल्यांकन केली. डिहायड्रेशनपूर्वी, चिटोसन/सोडियम ट्रायपॉलीफॉस्फेट/इन्सुलिन क्रॉस-लिंक्ड नॅनोपार्टिकल्सचा कण आकार 318 nm पर्यंत ऑप्टिमाइझ करण्यात आला होता, PDI 0.18 होता, एन्कॅप्सुलेशन कार्यक्षमता 99.4% होती आणि लोडिंग 25.01% होते. पुनर्रचना केल्यानंतर, मॅनिटोलचा वापर न करता फ्रीझ-ड्रायिंग पद्धतीने उत्पादित केलेले वगळता सर्व नॅनोपार्टिकल्सनी त्यांची गोलाकार कण रचना राखली. कोणत्याही स्प्रेद्वारे डिहायड्रेट केलेल्या मॅनिटोल-युक्त नॅनोपार्टिकल्सच्या तुलनेत, मॅनिटोल-मुक्त स्प्रे-ड्राय नॅनोपार्टिकल्सने सर्वात लहान सरासरी कण आकार (376 nm) आणि समान एन्कॅप्सुलेशन दरासह सर्वाधिक लोडिंग सामग्री (25.02%) देखील दर्शविली. (९८.७%) आणि पीडीआय (०.२०) सुकवणे किंवा फ्रीझ-सुकवणे तंत्रांद्वारे. मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे सुकवून वाळवलेल्या नॅनोपार्टिकल्समुळे इन्सुलिनचे सर्वात जलद प्रकाशन आणि सेल्युलर अपटेकची सर्वोच्च कार्यक्षमता देखील झाली. या कामातून असे दिसून आले आहे की पारंपारिक फ्रीझ सुकवण्याच्या पद्धतींच्या तुलनेत स्प्रे सुकवणे क्रायोप्रोटेक्टंट्सची आवश्यकता न घेता इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचे निर्जलीकरण करू शकते, ज्यामुळे जास्त लोडिंग क्षमता निर्माण होते, अॅडिटीव्ह आवश्यकता कमी होतात आणि ऑपरेटिंग खर्चात लक्षणीय फायदा होतो.
१९२२ मध्ये शोध लागल्यापासून, इन्सुलिन आणि त्याच्या औषधी तयारींनी टाइप १ मधुमेह (T1DM) आणि टाइप २ मधुमेह (T1DM) असलेल्या रुग्णांचे जीव वाचवले आहेत. तथापि, उच्च आण्विक वजन प्रथिने म्हणून त्याच्या गुणधर्मांमुळे, इन्सुलिन सहजपणे एकत्रित केले जाते, प्रोटीओलाइटिक एन्झाईम्सद्वारे तोडले जाते आणि प्रथम-पास परिणामाद्वारे काढून टाकले जाते. टाइप १ मधुमेहाचे निदान झालेल्या लोकांना आयुष्यभर इन्सुलिन इंजेक्शनची आवश्यकता असते. टाइप २ मधुमेहाचे सुरुवातीला निदान झालेल्या अनेक रुग्णांना दीर्घकालीन इन्सुलिन इंजेक्शनची देखील आवश्यकता असते. दररोज इन्सुलिन इंजेक्शन या व्यक्तींसाठी दररोज वेदना आणि अस्वस्थतेचे एक गंभीर स्रोत आहेत, ज्याचा मानसिक आरोग्यावर नकारात्मक परिणाम होतो. परिणामी, तोंडी इन्सुलिन प्रशासनासारख्या कमी अस्वस्थता निर्माण करणाऱ्या इन्सुलिन प्रशासनाच्या इतर प्रकारांचा मोठ्या प्रमाणावर अभ्यास केला जात आहे5 कारण त्यांच्याकडे जगभरात मधुमेह असलेल्या सुमारे ५ अब्ज लोकांच्या जीवनाची गुणवत्ता पुनर्संचयित करण्याची क्षमता आहे.
नॅनोपार्टिकल तंत्रज्ञानाने तोंडावाटे इन्सुलिन घेण्याच्या प्रयत्नांमध्ये लक्षणीय प्रगती केली आहे4,6,7. एक तंत्रज्ञान जे विशिष्ट शरीराच्या ठिकाणी लक्ष्यित वितरणासाठी इन्सुलिनला प्रभावीपणे कॅप्स्युलेट करते आणि क्षय होण्यापासून संरक्षण करते. तथापि, नॅनोपार्टिकल फॉर्म्युलेशनच्या वापराला अनेक मर्यादा आहेत, मुख्यतः कण निलंबनाच्या स्थिरतेच्या समस्यांमुळे. स्टोरेज दरम्यान काही एकत्रीकरण होऊ शकते, ज्यामुळे इन्सुलिन-लोडेड नॅनोपार्टिकल्सची जैवउपलब्धता कमी होते8. याव्यतिरिक्त, इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्स (NPs) ची स्थिरता सुनिश्चित करण्यासाठी नॅनोपार्टिकल्स आणि इन्सुलिनच्या पॉलिमर मॅट्रिक्सची रासायनिक स्थिरता देखील विचारात घेतली पाहिजे. सध्या, स्टोरेज दरम्यान अवांछित बदल रोखताना स्थिर NPs तयार करण्यासाठी फ्रीझ-ड्रायिंग तंत्रज्ञान हे सुवर्ण मानक आहे9.
तथापि, फ्रीझ-ड्रायिंगमध्ये क्रायोप्रोटेक्टंट्सची भर घालणे आवश्यक आहे जेणेकरून बर्फाच्या क्रिस्टल्सच्या यांत्रिक ताणामुळे एनपीजच्या गोलाकार रचनेवर परिणाम होऊ नये. यामुळे लायोफिलायझेशननंतर इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचे भार लक्षणीयरीत्या कमी होते, कारण क्रायोप्रोटेक्टंट बहुतेक वजन गुणोत्तर व्यापतो. म्हणूनच, उत्पादित इन्सुलिन एनपीज बहुतेकदा तोंडी गोळ्या आणि तोंडी फिल्म्ससारख्या कोरड्या पावडर फॉर्म्युलेशनच्या निर्मितीसाठी अयोग्य असल्याचे आढळून येते, कारण इन्सुलिनची उपचारात्मक विंडो साध्य करण्यासाठी मोठ्या प्रमाणात कोरड्या नॅनोपार्टिकल्सची आवश्यकता असते.
स्प्रे ड्रायिंग ही औषध उद्योगात द्रव टप्प्यांपासून कोरड्या पावडर तयार करण्यासाठी एक सुप्रसिद्ध आणि स्वस्त औद्योगिक-प्रमाणात प्रक्रिया आहे10,11. कण निर्मिती प्रक्रियेवर नियंत्रण ठेवल्याने अनेक जैव-सक्रिय संयुगे 12, 13 चे योग्य एन्कॅप्सुलेशन करता येते. शिवाय, तोंडी प्रशासनासाठी एन्कॅप्सुलेटेड प्रथिने तयार करण्यासाठी हे एक प्रभावी तंत्र बनले आहे. स्प्रे ड्रायिंग दरम्यान, पाणी खूप लवकर बाष्पीभवन होते, जे कण कोरचे तापमान कमी ठेवण्यास मदत करते11,14, ज्यामुळे उष्णता-संवेदनशील घटक एन्कॅप्सुलेट करण्यासाठी त्याचा वापर सक्षम होतो. स्प्रे ड्रायिंग करण्यापूर्वी, कोटिंग मटेरियल एन्कॅप्सुलेटेड घटक असलेल्या द्रावणासह पूर्णपणे एकरूप केले पाहिजे11,14. फ्रीज-ड्रायिंगच्या विपरीत, स्प्रे-ड्रायिंगमध्ये एन्कॅप्सुलेशनपूर्वी एकरूपीकरण केल्याने डिहायड्रेशन दरम्यान एन्कॅप्सुलेशन कार्यक्षमता सुधारते. स्प्रे-ड्रायिंग एन्कॅप्सुलेशन प्रक्रियेला क्रायोप्रोटेक्टंट्सची आवश्यकता नसल्यामुळे, स्प्रे-ड्रायिंगचा वापर उच्च लोडिंग सामग्रीसह वाळलेल्या एनपी तयार करण्यासाठी केला जाऊ शकतो.
या अभ्यासात आयन जेल पद्धतीने चिटोसन आणि सोडियम ट्रायपॉलीफॉस्फेटच्या क्रॉस-लिंकिंगद्वारे इन्सुलिन-लोडेड एनपीचे उत्पादन नोंदवले गेले आहे. आयन जेलेशन ही एक तयारी पद्धत आहे जी विशिष्ट परिस्थितीत दोन किंवा अधिक आयनिक प्रजातींमधील इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादाद्वारे नॅनोपार्टिकल्सचे उत्पादन करण्यास अनुमती देते. ऑप्टिमाइज्ड चिटोसन/सोडियम ट्रायपॉलीफॉस्फेट/इन्सुलिन क्रॉस-लिंक्ड नॅनोपार्टिकल्सचे निर्जलीकरण करण्यासाठी फ्रीझ-ड्रायिंग आणि स्प्रे-ड्रायिंग दोन्ही तंत्रे वापरली गेली. निर्जलीकरणानंतर, त्यांच्या आकारविज्ञानाचे विश्लेषण SEM द्वारे केले गेले. त्यांच्या आकारवितरण, पृष्ठभागाचा चार्ज, PDI, एन्कॅप्सुलेशन कार्यक्षमता आणि लोडिंग सामग्री मोजून त्यांच्या पुनर्संयोजन क्षमतेचे मूल्यांकन केले गेले. वेगवेगळ्या निर्जलीकरण पद्धतींद्वारे उत्पादित रिसोल्युबिलाइज्ड नॅनोपार्टिकल्सची गुणवत्ता देखील त्यांच्या इन्सुलिन संरक्षण, रिलीज वर्तन आणि सेल्युलर अपटेक कार्यक्षमतेची तुलना करून मूल्यांकन केली गेली.
मिश्रित द्रावणाचा pH आणि chitosan आणि इन्सुलिनचे गुणोत्तर हे दोन महत्त्वाचे घटक आहेत जे अंतिम NPs च्या कण आकार आणि एन्कॅप्सुलेशन कार्यक्षमता (EE) वर परिणाम करतात, कारण ते थेट आयनोट्रॉपिक जेलेशन प्रक्रियेवर परिणाम करतात. मिश्रित द्रावणाचा pH कण आकार आणि एन्कॅप्सुलेशन कार्यक्षमता (आकृती 1a) शी अत्यंत संबंधित असल्याचे दिसून आले. आकृती 1a मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, pH 4.0 वरून 6.0 पर्यंत वाढल्याने, सरासरी कण आकार (nm) कमी झाला आणि EE लक्षणीयरीत्या वाढला, तर pH 6.5 पर्यंत वाढल्याने, सरासरी कण आकार वाढू लागला आणि EE अपरिवर्तित राहिला. chitosan आणि इन्सुलिनचे गुणोत्तर वाढत असताना, सरासरी कण आकार देखील वाढतो. शिवाय, 2.5:1 (w/w) पेक्षा जास्त chitosan/insulin च्या वस्तुमान गुणोत्तरावर नॅनोपार्टिकल्स तयार केले गेले तेव्हा EE मध्ये कोणताही बदल दिसून आला नाही (आकृती 1b). म्हणून, या अभ्यासात इष्टतम तयारी परिस्थिती (pH 6.0, chitosan/insulin वस्तुमान गुणोत्तर) पुढील अभ्यासासाठी इन्सुलिन-भारित नॅनोपार्टिकल्स तयार करण्यासाठी 2.5:1) वापरले गेले. या तयारी स्थितीत, इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचा सरासरी कण आकार 318 nm (आकृती 1c) पर्यंत ऑप्टिमाइझ करण्यात आला, PDI 0.18 होता, एम्बेडिंग कार्यक्षमता 99.4% होती, झेटा क्षमता 9.8 mv होती आणि इन्सुलिन लोडिंग 25.01% (m/m) होते. ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (TEM) निकालांवर आधारित, ऑप्टिमाइझ केलेले नॅनोपार्टिकल्स अंदाजे गोलाकार आणि तुलनेने एकसमान आकाराचे वेगळे होते (आकृती 1d).
इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचे पॅरामीटर ऑप्टिमायझेशन: (अ) इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सच्या सरासरी व्यास आणि एन्कॅप्सुलेशन कार्यक्षमता (EE) वर pH चा प्रभाव (कायटोसन आणि इन्सुलिनच्या 5:1 वस्तुमान गुणोत्तरावर तयार केलेला); (ब) चिटोसन आणि इन्सुलिन NPs च्या सरासरी व्यास आणि एन्कॅप्सुलेशन कार्यक्षमता (EE) वर इन्सुलिनच्या द्रव्यमान गुणोत्तराचा प्रभाव (pH 6 वर तयार केलेला); (क) ऑप्टिमाइज्ड इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचे कण आकार वितरण; (ड) ऑप्टिमाइज्ड इन्सुलिन NPs चा TEM मायक्रोग्राफ.
हे सर्वज्ञात आहे की चिटोसन हे एक कमकुवत पॉलीइलेक्ट्रोलाइट आहे ज्याचे pKa 6.5 आहे. ते आम्लीय माध्यमात सकारात्मक चार्ज केलेले असते कारण त्याचा मुख्य अमीनो गट हायड्रोजन आयन 15 द्वारे प्रोटोनेटेड असतो. म्हणून, ते बहुतेकदा नकारात्मक चार्ज केलेल्या मॅक्रोमोलेक्यूल्सना कॅप्सूल करण्यासाठी वाहक म्हणून वापरले जाते. या अभ्यासात, चिटोसनचा वापर 5.3 च्या आयसोइलेक्ट्रिक पॉइंटसह इन्सुलिन कॅप्सूल करण्यासाठी केला गेला. चिटोसनचा वापर कोटिंग मटेरियल म्हणून केला जात असल्याने, त्याच्या प्रमाणात वाढ झाल्याने, नॅनोपार्टिकल्सच्या बाह्य थराची जाडी अनुक्रमे वाढते, परिणामी सरासरी कण आकार मोठा होतो. याव्यतिरिक्त, चिटोसनची उच्च पातळी अधिक इन्सुलिन कॅप्सूल करू शकते. आमच्या बाबतीत, चिटोसन आणि इन्सुलिनचे गुणोत्तर 2.5:1 पर्यंत पोहोचले तेव्हा EE सर्वाधिक होते आणि जेव्हा गुणोत्तर वाढत राहिले तेव्हा EE मध्ये कोणताही महत्त्वपूर्ण बदल झाला नाही.
चिटोसन आणि इन्सुलिनच्या गुणोत्तराव्यतिरिक्त, एनपी तयार करण्यात पीएचने देखील महत्त्वपूर्ण भूमिका बजावली. गॅन आणि इतर १७ यांनी चिटोसन नॅनोपार्टिकल्सच्या कण आकारावर पीएचच्या परिणामाचा अभ्यास केला. त्यांना पीएच ६.० पर्यंत पोहोचेपर्यंत कण आकारात सतत घट दिसून आली आणि पीएच > ६.० वर कण आकारात लक्षणीय वाढ दिसून आली, जी आमच्या निरीक्षणांशी सुसंगत आहे. ही घटना या वस्तुस्थितीमुळे आहे की वाढत्या पीएचसह, इन्सुलिन रेणू नकारात्मक पृष्ठभाग चार्ज प्राप्त करतो, अशा प्रकारे, चिटोसन/सोडियम ट्रायपॉलीफॉस्फेट (टीपीपी) कॉम्प्लेक्ससह इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादांना अनुकूल बनवतो, परिणामी लहान कण आकार आणि उच्च ईई होतो. तथापि, जेव्हा पीएच ६.५ वर समायोजित केला गेला तेव्हा, चिटोसनवरील अमीनो गट डीप्रोटोनेट झाले, परिणामी चिटोसन फोल्डिंग झाले. अशाप्रकारे, उच्च पीएचमुळे टीपीपी आणि इन्सुलिनमध्ये अमीनो आयनचे कमी प्रदर्शन होते, परिणामी क्रॉस-लिंकिंग कमी होते, अंतिम सरासरी कण आकार मोठा होतो आणि ईई कमी होतो.
फ्रीज-ड्राईड आणि स्प्रे-ड्राईड एनपीच्या आकारशास्त्रीय गुणधर्मांचे विश्लेषण केल्यास चांगले डिहायड्रेशन आणि पावडर निर्मिती तंत्रांची निवड करता येते. पसंतीची पद्धत औषध स्थिरता, एकसमान कण आकार, उच्च औषध लोडिंग आणि मूळ द्रावणात चांगली विद्राव्यता प्रदान करेल. या अभ्यासात, दोन्ही तंत्रांची चांगली तुलना करण्यासाठी, डिहायड्रेशन दरम्यान 1% मॅनिटॉलसह किंवा त्याशिवाय इन्सुलिन एनपी वापरण्यात आले. फ्रीज ड्राईंग आणि स्प्रे ड्राईंगसाठी विविध ड्राई पावडर फॉर्म्युलेशनमध्ये मॅनिटॉलचा वापर बल्किंग एजंट किंवा क्रायोप्रोटेक्टंट म्हणून केला जातो. आकृती 2a मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, मॅनिटॉलशिवाय लायोफिलाइज्ड इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्ससाठी, स्कॅनिंग इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (SEM) अंतर्गत मोठ्या, अनियमित आणि खडबडीत पृष्ठभागांसह एक अत्यंत सच्छिद्र पावडर रचना आढळून आली. डिहायड्रेशननंतर पावडरमध्ये काही डिस्क्रिट कण आढळून आले (आकृती 2e). या निकालांवरून असे दिसून आले की बहुतेक एनपी कोणत्याही क्रायोप्रोटेक्टंटशिवाय फ्रीज-ड्राईंग दरम्यान विघटित झाले होते. फ्रीज-ड्राईड आणि स्प्रे-ड्राईड इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्ससाठी 1% मॅनिटॉल असलेले, गुळगुळीत पृष्ठभागांसह गोलाकार नॅनोपार्टिकल्स आढळून आले (आकृती). 2b,d,f,h). मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-वाळलेले इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्स गोलाकार राहिले परंतु पृष्ठभागावर सुरकुत्या पडल्या (आकृती 2c). गोलाकार आणि सुरकुत्या पडलेल्या पृष्ठभागांची चर्चा खाली रिलीज वर्तन आणि सेल्युलर अपटेक चाचण्यांमध्ये केली आहे. वाळलेल्या NPs च्या दृश्यमान स्वरूपावर आधारित, मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-वाळलेले NPs आणि फ्रीझ-वाळलेले NPs आणि मॅनिटॉलसह स्प्रे-वाळलेले NPs दोन्ही बारीक NPs पावडर मिळाले (आकृती 2f,g,h). कण पृष्ठभागांमधील पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ जितके मोठे असेल तितकी विद्राव्यता जास्त असेल आणि म्हणून रिलीज दर जास्त असेल.
वेगवेगळ्या डिहायड्रेटेड इन्सुलिन NPs चे आकारशास्त्र: (a) मॅनिटोलशिवाय लायोफिलाइज्ड इन्सुलिन NPs ची SEM प्रतिमा; (b) मॅनिटोलसह लायोफिलाइज्ड इन्सुलिन NPs ची SEM प्रतिमा; (c) मॅनिटोलशिवाय स्प्रे-ड्राइड इन्सुलिन NPs ची SEM प्रतिमा; (d) मॅनिटोलसह स्प्रे-ड्राइड इन्सुलिन NPs ची SEM प्रतिमा; (e) मॅनिटोलशिवाय लायोफिलाइज्ड इन्सुलिन NPs पावडरची प्रतिमा; (f) मॅनिटोलसह लायोफिलाइज्ड इन्सुलिन NPs ची प्रतिमा; (g) मॅनिटोलशिवाय स्प्रे-ड्राइड इन्सुलिन NPs पावडरची प्रतिमा; (h) मॅनिटोलसह स्प्रे-ड्राइड इन्सुलिन NPs पावडरची प्रतिमा.
फ्रीझ-ड्रायिंग दरम्यान, मॅनिटॉल क्रायोप्रोटेक्टंट म्हणून काम करते, एनपींना अनाकार स्वरूपात ठेवते आणि बर्फाच्या क्रिस्टल्समुळे होणारे नुकसान टाळते. याउलट, स्प्रे ड्रायिंग दरम्यान कोणतेही गोठवण्याचे पाऊल नसते. म्हणून या पद्धतीत मॅनिटॉलची आवश्यकता नाही. खरं तर, मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-वाळलेल्या एनपींनी पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे बारीक एनपी दिले. तथापि, मॅनिटॉल अजूनही स्प्रे-वाळवण्याच्या प्रक्रियेत फिलर म्हणून काम करू शकते जेणेकरून एनपींना अधिक गोलाकार रचना मिळेल20 (आकृती 2d), जे अशा एन्कॅप्स्युलेटेड एनपींचे एकसमान रिलीज वर्तन मिळविण्यास मदत करते. याव्यतिरिक्त, हे स्पष्ट आहे की फ्रीझ-वाळलेल्या आणि स्प्रे-वाळलेल्या इन्सुलिन एनपीमध्ये काही मोठे कण आढळू शकतात ज्यामध्ये मॅनिटॉल (आकृती 2b,d) असते, जे एन्कॅप्स्युलेटेड इन्सुलिनसह कण कोरमध्ये मॅनिटॉल जमा झाल्यामुळे असू शकते. चिटोसन थर. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की या अभ्यासात, निर्जलीकरणानंतर गोलाकार रचना अबाधित राहावी यासाठी, मॅनिटॉल आणि चिटोसनचे प्रमाण 5:1 ठेवण्यात आले आहे, जेणेकरून मोठ्या प्रमाणात फिलर वाळलेल्या एनपीच्या कण आकारात वाढ करू शकेल.
फूरियर ट्रान्सफॉर्म इन्फ्रारेड अ‍ॅटेन्युएटेड टोटल रिफ्लेक्शन (FTIR-ATR) स्पेक्ट्रोस्कोपीमध्ये फ्री इन्सुलिन, चिटोसन, चिटोसन, TPP आणि इन्सुलिनचे भौतिक मिश्रण दर्शविले गेले. सर्व डिहायड्रेटेड NPs चे वैशिष्ट्य FTIR-ATR स्पेक्ट्रोस्कोपी वापरून केले गेले. उल्लेखनीय म्हणजे, १६४१, १५४३ आणि १४१२ सेमी-१ ची बँड तीव्रता मॅनिटॉलने फ्रीज-ड्राईड केलेल्या एनपीमध्ये आणि मॅनिटॉलने आणि त्याशिवाय स्प्रे-ड्राईड केलेल्या एनपीमध्ये (आकृती ३) दिसून आली. पूर्वी नोंदवल्याप्रमाणे, ताकदीतील ही वाढ चिटोसन, TPP आणि इन्सुलिनमधील क्रॉस-लिंकिंगशी संबंधित होती. चिटोसन आणि इन्सुलिनमधील परस्परसंवादाच्या तपासणीत असे दिसून आले की इन्सुलिन-लोडेड चिटोसन नॅनोपार्टिकल्सच्या FTIR स्पेक्ट्रामध्ये, चिटोसन बँड इन्सुलिनच्या ओव्हरलॅप झाला, ज्यामुळे कार्बोनिल तीव्रता (१६४१ सेमी-१) आणि अमाइन (१५४३ सेमी-१) पट्ट्यामध्ये वाढ झाली. TPP चे ट्रायपॉलीफॉस्फेट गट जोडलेले आहेत चिटोसॅनमधील अमोनियम गट, १४१२ सेमी-१ वर एक पट्टा तयार करतात.
वेगवेगळ्या पद्धतींनी निर्जलीकरण केलेले मुक्त इन्सुलिन, चिटोसन, चिटोसन/टीपीपी/इन्सुलिनचे भौतिक मिश्रण आणि एनपीचे एफटीआयआर-एटीआर स्पेक्ट्रा.
शिवाय, हे निकाल SEM मध्ये दर्शविलेल्या निकालांशी सुसंगत आहेत, ज्यावरून असे दिसून आले की मॅनिटॉलने फवारणी केली आणि फ्रीज-वाळवली तेव्हा एन्कॅप्स्युलेटेड NPs अबाधित राहिले, परंतु मॅनिटॉलच्या अनुपस्थितीत, फक्त स्प्रे-वाळवल्याने एन्कॅप्स्युलेटेड कण तयार झाले. याउलट, मॅनिटॉलशिवाय फ्रीज-वाळवलेल्या NPs चे FTIR-ATR स्पेक्ट्रल निकाल चिटोसन, TPP आणि इन्सुलिनच्या भौतिक मिश्रणासारखेच होते. हा निकाल दर्शवितो की चिटोसन, TPP आणि इन्सुलिनमधील क्रॉस-लिंक्स आता मॅनिटॉलशिवाय फ्रीज-वाळवलेल्या NPs मध्ये उपस्थित नाहीत. क्रायोप्रोटेक्टंटशिवाय फ्रीज-वाळवताना NPs ची रचना नष्ट झाली, जी SEM निकालांमध्ये दिसून येते (आकृती 2a). डिहायड्रेटेड इन्सुलिन NPs च्या आकारविज्ञान आणि FTIR निकालांवर आधारित, पुनर्रचना प्रयोगांसाठी आणि मॅनिटॉल-मुक्त NPs साठी फक्त लायोफिलाइज्ड, स्प्रे-वाळवलेल्या आणि मॅनिटॉल-मुक्त NPs वापरले गेले कारण मॅनिटॉल-मुक्त NPs चे विघटन दरम्यान निर्जलीकरण. चर्चा करा.
डिहायड्रेशनचा वापर दीर्घकालीन साठवणूक आणि इतर फॉर्म्युलेशनमध्ये पुनर्प्रक्रिया करण्यासाठी केला जातो. गोळ्या आणि फिल्म्ससारख्या वेगवेगळ्या फॉर्म्युलेशनमध्ये वापरण्यासाठी स्टोरेजनंतर कोरड्या NPs ची पुनर्रचना करण्याची क्षमता महत्त्वाची आहे. आम्हाला आढळले की मॅनिटॉल नसताना स्प्रे-वाळलेल्या इन्सुलिन NPs चा सरासरी कण आकार पुनर्रचनानंतर थोडासा वाढला. दुसरीकडे, मॅनिटॉलसह स्प्रे-वाळलेल्या आणि फ्रीझ-वाळलेल्या इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचा कण आकार लक्षणीयरीत्या वाढला (तक्ता 1). या अभ्यासात (तक्ता 1) सर्व NPs च्या पुनर्संयोजनानंतर PDI आणि EE मध्ये लक्षणीय बदल झाले नाहीत (p > 0.05). हा निकाल दर्शवितो की पुनर्वितरणानंतर बहुतेक कण अबाधित राहिले. तथापि, मॅनिटॉल जोडल्याने लायोफिलाइज्ड आणि स्प्रे-वाळलेल्या मॅनिटॉल नॅनोपार्टिकल्सचे इन्सुलिन लोडिंग मोठ्या प्रमाणात कमी झाले (तक्ता 1). याउलट, मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-वाळलेल्या NPs ची इन्सुलिन लोड सामग्री पूर्वीसारखीच राहिली (तक्ता 1).
औषध वितरणासाठी वापरताना नॅनोपार्टिकल्सचे लोडिंग अत्यंत महत्त्वाचे असते हे सर्वज्ञात आहे. कमी लोडिंग असलेल्या NPs साठी, उपचारात्मक उंबरठ्यापर्यंत पोहोचण्यासाठी खूप मोठ्या प्रमाणात सामग्रीची आवश्यकता असते. तथापि, अशा उच्च NP सांद्रतांच्या उच्च स्निग्धतेमुळे अनुक्रमे तोंडी प्रशासन आणि इंजेक्शन करण्यायोग्य फॉर्म्युलेशनमध्ये गैरसोय आणि अडचण येते 22. याव्यतिरिक्त, इंसुलिन NPs चा वापर गोळ्या आणि चिकट बायोफिल्म्स 23, 24 बनवण्यासाठी देखील केला जाऊ शकतो, ज्यासाठी कमी लोडिंग पातळीवर मोठ्या प्रमाणात NPs वापरण्याची आवश्यकता असते, परिणामी मोठ्या गोळ्या आणि जाड बायोफिल्म्स तयार होतात जे तोंडी वापरासाठी योग्य नाहीत. म्हणून, उच्च इन्सुलिन भार असलेले डिहायड्रेटेड NPs अत्यंत इष्ट आहेत. आमचे निकाल सूचित करतात की मॅनिटॉल-मुक्त स्प्रे-वाळलेल्या NPs चे उच्च इन्सुलिन भार या पर्यायी वितरण पद्धतींसाठी अनेक आकर्षक फायदे देऊ शकतात.
सर्व डिहायड्रेटेड एनपी तीन महिन्यांसाठी रेफ्रिजरेटरमध्ये ठेवण्यात आले होते. एसईएम निकालांवरून असे दिसून आले की तीन महिन्यांच्या साठवणुकीदरम्यान सर्व डिहायड्रेटेड एनपींचे आकारविज्ञान लक्षणीयरीत्या बदलले नाही (आकृती 4). पाण्यात पुनर्रचना केल्यानंतर, सर्व एनपींनी तीन महिन्यांच्या साठवणुकीच्या कालावधीत ईईमध्ये थोडीशी घट दर्शविली आणि अंदाजे थोड्या प्रमाणात (~5%) इन्सुलिन सोडले (तक्ता 2). तथापि, सर्व नॅनोपार्टिकल्सचा सरासरी कण आकार वाढला. मॅनिटोलशिवाय स्प्रे-वाळलेल्या एनपीचा कण आकार 525 एनएम पर्यंत वाढला, तर मॅनिटोलसह स्प्रे-वाळलेल्या आणि फ्रीज-वाळलेल्या एनपीचा कण आकार अनुक्रमे 872 आणि 921 एनएम पर्यंत वाढला (तक्ता 2).
तीन महिन्यांसाठी साठवलेल्या वेगवेगळ्या डिहायड्रेटेड इन्सुलिन एनपीचे आकारशास्त्र: (अ) मॅनिटॉलसह लायोफिलाइज्ड इन्सुलिन एनपीची एसईएम प्रतिमा; (ब) मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राईड इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सची एसईएम प्रतिमा; (क) स्प्रे-ड्राईड इन्सुलिन एनपीच्या मॅनिटॉलशिवाय एसईएम प्रतिमा.
शिवाय, मॅनिटॉल आणि फ्रीज-ड्रायसह स्प्रे-वाळलेल्या पुनर्रचित इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्समध्ये अवक्षेपण दिसून आले (आकृती S2). हे मोठे कण पाण्यात योग्यरित्या लटकत नसल्यामुळे होऊ शकते. वरील सर्व निकालांवरून असे दिसून येते की स्प्रे ड्रायिंग तंत्र इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सना डिहायड्रेशनपासून वाचवू शकते आणि इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचे उच्च भार कोणत्याही फिलर किंवा क्रायोप्रोटेक्टंट्सशिवाय मिळवता येतात.
डिहायड्रेशननंतर एंजाइमॅटिक पचनापासून NPs ची संरक्षणात्मक क्षमता प्रदर्शित करण्यासाठी pH = 2.5 माध्यमात पेप्सिन, ट्रिप्सिन आणि α-कायमोट्रिप्सिनसह इन्सुलिन धारणा चाचणी करण्यात आली. डिहायड्रेटेड NPs च्या इन्सुलिन धारणाची तुलना ताज्या तयार केलेल्या NPs शी करण्यात आली आणि नकारात्मक नियंत्रण म्हणून मुक्त इन्सुलिनचा वापर करण्यात आला. या अभ्यासात, तिन्ही एंजाइमॅटिक उपचारांमध्ये 4 तासांच्या आत मुक्त इन्सुलिन जलद इन्सुलिन निर्मूलन दर्शविले (आकृती 5a-c). याउलट, मॅनिटोलसह फ्रीझ-ड्राय केलेल्या NPs आणि मॅनिटोलसह किंवा त्याशिवाय स्प्रे-ड्राय केलेल्या NPs च्या इन्सुलिन निर्मूलन चाचणीने एन्झाइमॅटिक पचनापासून या NPs चे लक्षणीयरीत्या जास्त संरक्षण दर्शविले, जे ताज्या तयार केलेल्या इन्सुलिन NPs सारखेच होते (आकृती 1).5a-c). पेप्सिन, ट्रिप्सिन आणि α-कायमोट्रिप्सिनमधील नॅनोपार्टिकल्सच्या मदतीने, अनुक्रमे 50%, 60% आणि 75% पेक्षा जास्त इन्सुलिन 4 तासांच्या आत संरक्षित केले जाऊ शकते (आकृती 1). ५अ–क). या इन्सुलिन-संरक्षणात्मक क्षमतेमुळे रक्तप्रवाहात इन्सुलिनचे शोषण वाढण्याची शक्यता वाढू शकते. हे निकाल असे सूचित करतात की मॅनिटॉलसह किंवा त्याशिवाय स्प्रे ड्रायिंग आणि मॅनिटॉलसह फ्रीज-ड्रायिंग केल्याने डिहायड्रेशननंतर एनपीची इन्सुलिन-संरक्षणात्मक क्षमता टिकवून ठेवता येते.
डिहायड्रेटेड इन्सुलिन एनपीचे संरक्षण आणि सोडण्याचे वर्तन: (अ) पेप्सिन द्रावणात इन्सुलिनचे संरक्षण; (ब) ट्रिप्सिन द्रावणात इन्सुलिनचे संरक्षण; (क) α-कायमोट्रिप्सिन द्रावणाद्वारे इन्सुलिनचे संरक्षण; (ड) पीएच = 2.5 द्रावणात डिहायड्रेटेड एनपीचे सोडण्याचे वर्तन; (इ) पीएच = 6.6 द्रावणात डिहायड्रेटेड एनपीचे सोडण्याचे वर्तन; (फ) पीएच = 7.0 द्रावणात डिहायड्रेटेड एनपीचे सोडण्याचे वर्तन.
इन्सुलिनचा इन्सुलिन प्रतिकारावर होणारा परिणाम तपासण्यासाठी, पोट, ग्रहणी आणि वरच्या लहान आतड्याच्या pH वातावरणाचे अनुकरण करून, ताजे तयार केलेले आणि पुनर्रचित कोरडे इन्सुलिन NPs विविध बफरमध्ये (pH = 2.5, 6.6, 7.0) 37 °C वर उबवले गेले. वेगवेगळ्या वातावरणात सोडण्याचे वर्तन. गॅस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रॅक्टचा तुकडा. pH = 2.5 वर, इन्सुलिन-लोडेड NPs आणि रिसोल्युबिलाइज्ड ड्राय इन्सुलिन NPs मध्ये पहिल्या एका तासात प्रारंभिक स्फोट रिलीज दिसून आला, त्यानंतर पुढील 5 तासांत हळूहळू रिलीज झाला (आकृती 5d). सुरुवातीला हे जलद रिलीज बहुधा कणाच्या अंतर्गत संरचनेत पूर्णपणे स्थिर नसलेल्या प्रथिने रेणूंच्या जलद पृष्ठभागावरील अवशोषणाचा परिणाम आहे. pH = 6.5 वर, इन्सुलिन-लोडेड NPs आणि पुनर्गठित ड्राय इन्सुलिन NPs मध्ये 6 तासांपेक्षा जास्त काळ गुळगुळीत आणि मंद रिलीज दिसून आले, कारण चाचणी द्रावणाचा pH NPs-तयार द्रावणासारखाच होता (आकृती 5e). pH = 7 वर, NPs अस्थिर होते आणि पहिल्या दोन तासांत जवळजवळ पूर्णपणे विघटित होते (आकृती 5f). कारण चिटोसनचे डिप्रोटोनेशन जास्त pH वर होते, ज्यामुळे कमी कॉम्पॅक्ट पॉलिमर नेटवर्क आणि लोड केलेले इन्सुलिन सोडले जाते.
शिवाय, मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-वाळलेल्या इन्सुलिन एनपीजमध्ये इतर डिहायड्रेटेड एनपीजपेक्षा जलद रिलीज प्रोफाइल दिसून आले (आकृती 5d–f). आधी वर्णन केल्याप्रमाणे, मॅनिटॉलशिवाय वाळलेल्या पुनर्रचित इन्सुलिन एनपीजमध्ये सर्वात लहान कण आकार दिसून आला. लहान कण मोठे पृष्ठभाग क्षेत्र प्रदान करतात, म्हणून बहुतेक संबंधित औषध कण पृष्ठभागाच्या जवळ किंवा जवळ असेल, परिणामी जलद औषध रिलीज होईल26.
MTT परख वापरून NPs ची सायटोटॉक्सिसिटी तपासण्यात आली. आकृती S4 मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, सर्व डिहायड्रेटेड NPs चा 50-500 μg/ml च्या सांद्रतेवर पेशींच्या व्यवहार्यतेवर कोणताही महत्त्वपूर्ण परिणाम होत नाही असे आढळून आले, जे सूचित करते की सर्व डिहायड्रेटेड NPs चा उपचारात्मक विंडोपर्यंत पोहोचण्यासाठी सुरक्षितपणे वापर केला जाऊ शकतो.
यकृत हा मुख्य अवयव आहे ज्याद्वारे इन्सुलिन त्याचे शारीरिक कार्य करते. HepG2 पेशी ही मानवी हेपेटोमा पेशी रेषा आहे जी सामान्यतः इन विट्रो हेपेटोसाइट अपटेक मॉडेल म्हणून वापरली जाते. येथे, फ्रीझ-ड्रायिंग आणि स्प्रे-ड्रायिंग पद्धती वापरून डिहायड्रेटेड NPs च्या सेल्युलर अपटेकचे मूल्यांकन करण्यासाठी HepG2 पेशींचा वापर केला गेला. 25 μg/mL च्या एकाग्रतेवर मोफत FITC इन्सुलिनसह अनेक तासांच्या उष्मायनानंतर फ्लो सायटोमेट्री आणि व्हिजन वापरून कॉन्फोकल लेसर स्कॅनिंगद्वारे सेल्युलर अपटेक, ताजे तयार केलेले FITC इन्सुलिन-लोडेड NPs आणि समान इन्सुलिन सांद्रतेवर डिहायड्रेटेड FITC इन्सुलिन-लोडेड NPs क्वांटिटेटिव्ह मायक्रोस्कोपी (CLSM) निरीक्षणे केली गेली. डिहायड्रेशन दरम्यान मॅनिटोलशिवाय लायोफिलाइज्ड NPs नष्ट झाले आणि या चाचणीत त्यांचे मूल्यांकन केले गेले नाही. मॅनिटोलसह आणि मॅनिटोलशिवाय ताज्या तयार केलेल्या इन्सुलिन-लोडेड NPs, मॅनिटोलसह लायोफिलाइज्ड NPs आणि स्प्रे-ड्रायड NPs (आकृती 6a) ची इंट्रासेल्युलर फ्लोरोसेन्स तीव्रता 4.3, 2.6 होती, अनुक्रमे, मुक्त इन्सुलिनपेक्षा 2.4 आणि 4.1 पट जास्त. FITC-इंसुलिन गट (आकृती 6b). हे निकाल सूचित करतात की एन्कॅप्स्युलेटेड इन्सुलिन हे मुक्त इन्सुलिनपेक्षा सेल्युलर शोषणात अधिक शक्तिशाली आहे, मुख्यतः अभ्यासात तयार केलेल्या इन्सुलिन-लोडेड नॅनोपार्टिकल्सच्या लहान आकारामुळे.
नव्याने तयार केलेल्या NPs आणि डिहायड्रेटेड NPs सह 4 तासांच्या उष्मायनानंतर HepG2 पेशींचे अपटेक: (a) HepG2 पेशींद्वारे FITC-इंसुलिन अपटेकचे वितरण. (b) फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे विश्लेषण केलेले फ्लोरोसेन्स तीव्रतेचे भौमितिक सरासरी (n = 3), *P < 0.05 मुक्त इन्सुलिनच्या तुलनेत.
त्याचप्रमाणे, CLSM प्रतिमांमधून असे दिसून आले की ताज्या तयार केलेल्या FITC-इंसुलिन-लोडेड NPs आणि FITC-इंसुलिन-लोडेड स्प्रे-ड्राइड NPs (मॅनिटॉलशिवाय) ची FITC फ्लोरोसेन्स तीव्रता इतर नमुन्यांपेक्षा खूपच मजबूत होती (आकृती 6a). शिवाय, मॅनिटॉल जोडल्याने, द्रावणाची उच्च स्निग्धता सेल्युलर अपटेकला प्रतिकार वाढवते, परिणामी इन्सुलिन प्रसार कमी होतो. हे निकाल सूचित करतात की मॅनिटॉल-मुक्त स्प्रे-ड्राइड NPs ने सर्वाधिक सेल्युलर अपटेक कार्यक्षमता प्रदर्शित केली कारण त्यांचे कण आकार पुन्हा विरघळल्यानंतर फ्रीज-ड्राइड NPs पेक्षा लहान होते.
चिटोसन (सरासरी आण्विक वजन १०० केडीए, ७५-८५% डीएसिटाइलेटेड) सिग्मा-अल्ड्रिच (ओकव्हिल, ओंटारियो, कॅनडा) कडून खरेदी केले गेले. सोडियम ट्रायपॉलीफॉस्फेट (टीपीपी) व्हीडब्ल्यूआर (रॅडनॉर, पेनसिल्व्हेनिया, यूएसए) कडून खरेदी केले गेले. या अभ्यासात वापरलेले रीकॉम्बीनंट मानवी इन्सुलिन फिशर सायंटिफिक (वॉल्थम, एमए, यूएसए) कडून होते. फ्लोरेसिन आयसोथियोसायनेट (एफआयटीसी)-लेबल केलेले मानवी इन्सुलिन आणि ४′,६-डायमिडिनो-२-फेनिलिंडोल डायहाइड्रोक्लोराइड (डीएपीआय) सिग्मा-अल्ड्रिच (ओकव्हिल, ओंटारियो, कॅनडा) कडून खरेदी केले गेले. हेपजी२ सेल लाइन एटीसीसी (मानसस, व्हर्जिनिया, यूएसए) कडून मिळवली गेली. इतर सर्व अभिकर्मक विश्लेषणात्मक किंवा क्रोमॅटोग्राफिक ग्रेड होते.
१ मिलीग्राम/मिली सीएस सोल्यूशन डबल डिस्टिल्ड वॉटर (डीडी वॉटर) मध्ये विरघळवून तयार करा ज्यामध्ये ०.१% एसिटिक अॅसिड असते. टीपीपी आणि इन्सुलिनचे १ मिलीग्राम/मिली द्रावण अनुक्रमे डीडी पाण्यात आणि ०.१% एसिटिक अॅसिडमध्ये विरघळवून तयार करा. प्री-इमल्शन पॉलीट्रॉन पीसीयू-२-११० हाय स्पीड होमोजनायझर (ब्रिंकमन इंडस्ट्रीज वेस्टबरी, न्यू यॉर्क, यूएसए) वापरून तयार केले गेले. तयार करण्याची प्रक्रिया खालीलप्रमाणे आहे: प्रथम, ४ मिली इन्सुलिन सोल्यूशनमध्ये २ मिली टीपीपी सोल्यूशन जोडले जाते आणि मिश्रण ३० मिनिटांसाठी ढवळले जाते आणि पूर्णपणे मिसळले जाते. त्यानंतर, मिश्रित सोल्यूशन हाय-स्पीड स्टिरिंग (१०,००० आरपीएम) अंतर्गत सिरिंजद्वारे सीएस सोल्यूशनमध्ये ड्रॉपवाइज जोडले गेले. मिश्रणे ३० मिनिटांसाठी बर्फाच्या बाथमध्ये हाय-स्पीड स्टिरिंग (१५,००० आरपीएम) अंतर्गत ठेवण्यात आली आणि क्रॉस-लिंक्ड इन्सुलिन एनपी मिळविण्यासाठी त्यांना एका विशिष्ट पीएचमध्ये समायोजित केले गेले. इन्सुलिनचा कण आकार आणखी एकसंध करण्यासाठी आणि कमी करण्यासाठी एनपी, त्यांना प्रोब-प्रकारच्या सोनिकेटर (यूपी २००एसटी, हिल्सचर अल्ट्रासोनिक्स, टेल्टो, जर्मनी) वापरून बर्फाच्या बाथमध्ये अतिरिक्त ३० मिनिटांसाठी सोनिकेट केले गेले.
इन्सुलिन एनपीएसची चाचणी डायनॅमिक लाइट स्कॅटरिंग (डीएलएस) मोजमाप वापरून लाइटिसायझर ५०० (अँटोन पार, ग्राझ, ऑस्ट्रिया) वापरून २५°C तापमानावर डीडी पाण्यात पातळ करून झेड-सरासरी व्यास, पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स (पीडीआय) आणि झेटा पोटेंशियलसाठी करण्यात आली. हिताची एच७६०० ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (टीईएम) (हिताची, टोकियो, जपान) द्वारे मॉर्फोलॉजी आणि आकार वितरणाचे वैशिष्ट्यीकृत केले गेले आणि त्यानंतर हिताची इमेजिंग सॉफ्टवेअर (हिताची, टोकियो, जपान) वापरून प्रतिमांचे विश्लेषण केले गेले. इन्सुलिन एनपीएसची एन्कॅप्सुलेशन कार्यक्षमता (ईई) आणि लोडिंग क्षमता (एलसी) चे मूल्यांकन करण्यासाठी, एनपीएस १०० केडीएच्या आण्विक वजन कट-ऑफसह अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबमध्ये पाईपेट केले गेले आणि ३० मिनिटांसाठी ५०० xg वर सेंट्रीफ्यूज केले गेले. फिल्टरेटमधील अनएनकॅप्स्युलेटेड इन्सुलिनचे प्रमाण एजिलेंट ११०० सिरीज एचपीएलसी सिस्टम (एजिलेंट, सांता क्लारा, कॅलिफोर्निया, यूएसए) वापरून केले गेले ज्यामध्ये एक क्वाटरनरी पंप, ऑटोसॅम्पलर, कॉलम हीटर आणि डीएडी डिटेक्टर. इन्सुलिनचे विश्लेषण C18 कॉलम (झोरबॅक्स, 3.5 μm, 4.6 मिमी × 150 मिमी, एजिलेंट, यूएसए) द्वारे केले गेले आणि ते 214 एनएम वर आढळले. मोबाईल फेज एसीटोनिट्राइल आणि पाणी होते, ज्यामध्ये 0.1% TFA होते, ग्रेडियंट रेशो 10/90 ते 100/0 पर्यंत होते आणि 10 मिनिटे चालले. मोबाईल फेज 1.0 मिली/मिनिटाच्या प्रवाह दराने पंप केला गेला. कॉलम तापमान 20 °C वर सेट केले गेले. समीकरणे वापरून EE आणि LC च्या टक्केवारीची गणना करा.(1) आणि समीकरण (2).
इन्सुलिन एनपी ऑप्टिमाइझ करण्यासाठी २.० ते ४.० पर्यंतचे विविध सीएस/इन्सुलिन गुणोत्तर तपासण्यात आले. तयारी दरम्यान वेगवेगळ्या प्रमाणात सीएस द्रावण जोडले गेले, तर इन्सुलिन/टीपीपी मिश्रण स्थिर ठेवले गेले. सर्व द्रावण (इन्सुलिन, टीपीपी आणि सीएस) जोडल्यानंतर मिश्रणाचा पीएच काळजीपूर्वक नियंत्रित करून इन्सुलिन एनपी ४.० ते ६.५ च्या पीएच श्रेणीत तयार केले गेले. इन्सुलिन एनपीची निर्मिती ऑप्टिमाइझ करण्यासाठी इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सच्या ईई आणि कण आकाराचे मूल्यांकन वेगवेगळ्या पीएच मूल्यांवर आणि सीएस/इन्सुलिन वस्तुमान गुणोत्तरांवर केले गेले.
ऑप्टिमाइज्ड इन्सुलिन एनपी अॅल्युमिनियम कंटेनरवर ठेवण्यात आले आणि काही टेपने घट्ट केलेल्या टिश्यूने झाकण्यात आले. त्यानंतर, स्क्रू केलेले कंटेनर ट्रे ड्रायरने सुसज्ज असलेल्या लॅबकोन्को फ्रीझोन फ्रीझ ड्रायर (लॅबकोन्को, कॅन्सस सिटी, एमओ, यूएसए) मध्ये ठेवण्यात आले. कोरडे इन्सुलिन एनपी मिळविण्यासाठी तापमान आणि व्हॅक्यूम प्रेशर -१० °C, पहिल्या २ तासांसाठी ०.३५० टॉर आणि २४ तासांपैकी उर्वरित २२ तासांसाठी ० °C आणि ०.१२० टॉर वर सेट करण्यात आले.
बुची मिनी स्प्रे ड्रायर बी-२९० (बुची, फ्लॉविल, स्वित्झर्लंड) चा वापर एन्कॅप्स्युलेटेड इन्सुलिन तयार करण्यासाठी करण्यात आला. निवडलेले कोरडे करण्याचे पॅरामीटर्स होते: तापमान १०० डिग्री सेल्सिअस, फीड फ्लो ३ लिटर/मिनिट आणि गॅस फ्लो ४ लिटर/मिनिट.
डिहायड्रेशनपूर्वी आणि नंतर इन्सुलिन एनपीचे विश्लेषण एफटीआयआर-एटीआर स्पेक्ट्रोस्कोपी वापरून करण्यात आले. डिहायड्रेटेड नॅनोपार्टिकल्स तसेच फ्री इन्सुलिन आणि चिटोसनचे विश्लेषण स्पेक्ट्रम १०० एफटीआयआर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (पर्किनएल्मर, वॉल्थम, मॅसॅच्युसेट्स, यूएसए) वापरून करण्यात आले, ज्यामध्ये युनिव्हर्सल एटीआर सॅम्पलिंग अॅक्सेसरी (पर्किनएल्मर, वॉल्थम, मॅसॅच्युसेट्स, यूएसए) सुसज्ज होते. ४०००-६०० सेमी२ च्या फ्रिक्वेन्सी रेंजमध्ये ४ सेमी२ च्या रिझोल्यूशनवर १६ स्कॅनमधून सिग्नल सरासरी मिळवण्यात आली.
हेलिओस नॅनोलॅब 650 फोकस्ड आयन बीम-स्कॅनिंग इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (FIB-SEM) (FEI, हिल्सबोरो, ओरेगॉन, यूएसए) द्वारे कॅप्चर केलेल्या फ्रीज-ड्राय आणि स्प्रे-ड्राय इन्सुलिन NPs च्या SEM प्रतिमांद्वारे ड्राय इन्सुलिन NPs चे आकारशास्त्र मूल्यांकन केले गेले. वापरलेले मुख्य पॅरामीटर व्होल्टेज 5 keV आणि करंट 30 mA होते.
सर्व डिहायड्रेटेड इन्सुलिन एनपी डीडी पाण्यात पुन्हा विरघळवण्यात आले. डिहायड्रेशननंतर त्यांची गुणवत्ता तपासण्यासाठी आधी नमूद केलेल्या त्याच पद्धतीचा वापर करून कण आकार, पीडीआय, ईई आणि एलसीची पुन्हा चाचणी करण्यात आली. दीर्घकाळ साठवणुकीनंतर एनपीच्या गुणधर्मांची चाचणी करून एनहायड्रोइन्सुलिन एनपीची स्थिरता देखील मोजण्यात आली. या अभ्यासात, डिहायड्रेशननंतर सर्व एनपी तीन महिन्यांसाठी रेफ्रिजरेटरमध्ये साठवण्यात आले. तीन महिन्यांच्या साठवणुकीनंतर, एनपीची मॉर्फोलॉजिकल कण आकार, पीडीआय, ईई आणि एलसीसाठी चाचणी करण्यात आली.
निर्जलीकरणानंतर एनपीचे संरक्षण करण्यासाठी इन्सुलिनची प्रभावीता मूल्यांकन करण्यासाठी, ४५ मिली असलेल्या सिम्युलेटेड गॅस्ट्रिक फ्लुइड (पीएच १.२, १% पेप्सिन असलेले), आतड्यांसंबंधी फ्लुइड (पीएच ६.८, १% ट्रिप्सिन असलेले) किंवा कायमोट्रिप्सिन द्रावण (१०० ग्रॅम/मिली, फॉस्फेट बफरमध्ये, पीएच ७.८) मध्ये ५ मिली पुनर्गठित एनपी विरघळवा. त्यांना १०० आरपीएमच्या गतिमान गतीसह ३७°C वर उष्मायन केले गेले. वेगवेगळ्या वेळी ५०० μL द्रावण गोळा केले गेले आणि एचपीएलसीद्वारे इन्सुलिनची एकाग्रता निश्चित केली गेली.
डायलिसिस बॅग पद्धतीद्वारे ताज्या तयार केलेल्या आणि डिहायड्रेटेड इन्सुलिन एनपीजच्या इन विट्रो रिलीज वर्तनाची चाचणी घेण्यात आली (आण्विक वजन कट-ऑफ 100 केडीए, स्पेक्ट्रा पोर इंक.). पोट, ड्युओडेनम आणि वरच्या लहान आतड्याच्या पीएच वातावरणाचे अनुकरण करण्यासाठी ताज्या तयार केलेल्या आणि पुनर्रचित कोरड्या एनपीजना अनुक्रमे पीएच 2.5, पीएच 6.6 आणि पीएच 7.0 (0.1 एम फॉस्फेट-बफर्ड सलाईन, पीबीएस) वर द्रवपदार्थांमध्ये डायलायझ केले गेले. सर्व नमुने 200 आरपीएमवर सतत हलवून 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात उष्मायन केले गेले. खालील वेळी 5 एमएल डायलिसिस बॅगच्या बाहेर द्रवपदार्थ एस्पिरेट करा: 0.5, 1, 2, 3, 4 आणि 6 तास, आणि ताज्या डायलिसेटने त्वरित व्हॉल्यूम पुन्हा भरा. एचपीएलसी द्वारे द्रवपदार्थातील इन्सुलिन दूषिततेचे विश्लेषण केले गेले आणि नॅनोपार्टिकल्समधून इन्सुलिन सोडण्याचा दर नॅनोपार्टिकल्समध्ये कॅप्स्युलेट केलेल्या एकूण इन्सुलिनच्या प्रमाणात सोडण्यात आला (समीकरण 3).
मानवी हेपेटोसेल्युलर कार्सिनोमा सेल लाइन HepG2 पेशी ६० मिमी व्यासाच्या डिशमध्ये डल्बेकोच्या मॉडिफाइड ईगलच्या माध्यम (DMEM) वापरून वाढवल्या गेल्या ज्यामध्ये १०% फेटल बोवाइन सीरम, १०० IU/mL पेनिसिलिन आणि १०० μg/mL स्ट्रेप्टोमायसिन होते. संस्कृती ३७°C, ९५% सापेक्ष आर्द्रता आणि ५% CO2 वर राखण्यात आल्या. अपटेक अॅसेजसाठी, HepG2 पेशींना ८-वेल नंक लॅब-टेक चेंबर स्लाईड सिस्टमवर (थर्मो फिशर, NY, USA) १ × १०५ पेशी/मिली वर सीड करण्यात आले. सायटोटॉक्सिसिटी अॅसेजसाठी, त्यांना ५ × १०४ पेशी/मिली घनतेवर ९६-वेल प्लेट्समध्ये (कॉर्निंग, NY, USA) सीड करण्यात आले.
ताज्या तयार केलेल्या आणि निर्जलित इन्सुलिन NPs30 च्या सायटोटॉक्सिसिटीचे मूल्यांकन करण्यासाठी MTT परख वापरली गेली. HepG2 पेशींना 5 × 104 पेशी/mL च्या घनतेवर 96-वेल प्लेट्समध्ये सीड केले गेले आणि चाचणीपूर्वी 7 दिवसांसाठी कल्चर केले गेले. इन्सुलिन NPs कल्चर माध्यमात विविध सांद्रता (50 ते 500 μg/mL) पर्यंत पातळ केले गेले आणि नंतर पेशींना दिले गेले. 24 तासांच्या उष्मायनानंतर, पेशी PBS ने 3 वेळा धुतल्या गेल्या आणि 0.5 mg/ml MTT असलेल्या माध्यमाने अतिरिक्त 4 तासांसाठी उष्मायन केले गेले. Tecan infinite M200 pro spectrophotometre plate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland) वापरून 570 nm वर पिवळ्या टेट्राझोलियम MTT ते जांभळ्या फॉर्माझनचे एंजाइमॅटिक घट मोजून सायटोटॉक्सिसिटीचे मूल्यांकन केले गेले.
कॉन्फोकल लेसर स्कॅनिंग मायक्रोस्कोपी आणि फ्लो सायटोमेट्री विश्लेषणाद्वारे NPs च्या सेल्युलर अपटेक कार्यक्षमतेची चाचणी घेण्यात आली. Nunc Lab-Tek चेंबर स्लाईड सिस्टमच्या प्रत्येक विहिरीवर मोफत FITC-इंसुलिन, FITC-इंसुलिन-लोडेड NPs सह उपचार केले गेले आणि त्याच एकाग्रतेवर 25 μg/mL डिहायड्रेटेड FITC-इंसुलिन NPs ची पुनर्रचना केली गेली आणि 4 तासांसाठी इनक्युबेट केले गेले. पेशी PBS ने 3 वेळा धुतल्या गेल्या आणि 4% पॅराफॉर्मल्डिहाइडने निश्चित केल्या गेल्या. न्यूक्ली 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (DAPI) ने रंगवल्या गेल्या. ऑलिंपस FV1000 लेसर स्कॅनिंग/टू-फोटॉन कॉन्फोकल मायक्रोस्कोप (ऑलिंपस, शिंजुकू सिटी, टोकियो, जपान) वापरून इन्सुलिन स्थानिकीकरण पाहिले गेले. फ्लो सायटोमेट्री विश्लेषणासाठी, 10 μg/mL फ्री FITC-इंसुलिन, FITC-इंसुलिन-लोडेड NPs आणि रिसोल्युबिलाइज्ड डिहायड्रेटेड FITC-इंसुलिन NPs ची समान सांद्रता जोडली गेली. ९६-वेल प्लेट्समध्ये HepG2 पेशींनी सीड केले आणि ४ तास उष्मायन केले. ४ तास उष्मायनानंतर, पेशी काढून टाकल्या गेल्या आणि FBS ने ३ वेळा धुतल्या गेल्या. BD LSR II फ्लो सायटोमीटर (BD, फ्रँकलिन लेक्स, न्यू जर्सी, युनायटेड स्टेट्स) द्वारे प्रति नमुना ५ × १०४ पेशींचे विश्लेषण केले गेले.
सर्व मूल्ये सरासरी ± मानक विचलन म्हणून व्यक्त केली जातात. सर्व गटांमधील तुलनांचे मूल्यांकन एकतर्फी ANOVA किंवा IBM SPSS स्टॅटिस्टिक्स 26 फॉर मॅक (IBM, Endicott, New York, USA) द्वारे t-टेस्ट वापरून केले गेले आणि p < 0.05 सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण मानले गेले.
हा अभ्यास बल्किंग एजंट्स किंवा क्रायोप्रोटेक्टंट्स क्षमता आणि उच्च भार क्षमता वापरून मानक फ्रीझ-ड्रायिंग पद्धतींच्या तुलनेत चांगल्या पुनर्रचनासह क्रॉस-लिंक्ड चिटोसन/टीपीपी/इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सचे निर्जलीकरण करण्यासाठी स्प्रे ड्रायिंगची लवचिकता आणि क्षमता दर्शवितो. ऑप्टिमाइझ केलेल्या इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सने सरासरी कण आकार 318 एनएम आणि 99.4% एन्कॅप्सुलेशन कार्यक्षमता दिली. निर्जलीकरणानंतर एसईएम आणि एफटीआयआर निकालांनी दर्शविले की गोलाकार रचना केवळ स्प्रे-वाळलेल्या एनपीमध्ये मॅनिटोलसह आणि त्याशिवाय आणि मॅनिटोलसह लायोफिलाइज्डमध्ये राखली गेली होती, परंतु मॅनिटोलशिवाय लायोफिलाइज्ड एनपी डिहायड्रेशन दरम्यान विघटित झाले होते. पुनर्रचना क्षमता चाचणीमध्ये, मॅनिटोलशिवाय स्प्रे-वाळलेल्या इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्सने सर्वात लहान सरासरी कण आकार आणि पुनर्रचनावर सर्वाधिक भार दर्शविला. या सर्व निर्जलित एनपीच्या रिलीज वर्तनातून असे दिसून आले की ते पीएच = 2.5 आणि पीएच = 7 च्या द्रावणात वेगाने सोडले गेले आणि पीएच = 6.5 च्या द्रावणात खूप स्थिर होते. इतर पुनर्विरघळलेल्या निर्जलित एनपीच्या तुलनेत, एनपी मॅनिटॉलशिवाय स्प्रे-ड्राईडने सर्वात जलद रिलीज दाखवले. हा निकाल सेल्युलर अपटेक परखात आढळलेल्या निकालाशी सुसंगत आहे, कारण मॅनिटॉलच्या अनुपस्थितीत स्प्रे-ड्राईड एनपीने ताज्या तयार केलेल्या एनपीची सेल्युलर अपटेक कार्यक्षमता जवळजवळ पूर्णपणे राखली. हे निकाल सूचित करतात की मॅनिटॉल-मुक्त स्प्रे ड्राईंगद्वारे तयार केलेले ड्राय इन्सुलिन नॅनोपार्टिकल्स तोंडी गोळ्या किंवा बायोअॅडेसिव्ह फिल्म्ससारख्या इतर निर्जल डोस फॉर्ममध्ये पुढील प्रक्रियेसाठी सर्वात योग्य आहेत.
बौद्धिक संपदा समस्यांमुळे, सध्याच्या अभ्यासादरम्यान तयार केलेले आणि/किंवा विश्लेषण केलेले डेटासेट सार्वजनिकरित्या उपलब्ध नाहीत, परंतु वाजवी विनंतीनुसार संबंधित लेखकांकडून उपलब्ध आहेत.
कागन, ए. टाइप २ मधुमेह: सामाजिक आणि वैज्ञानिक उत्पत्ती, वैद्यकीय गुंतागुंत आणि रुग्ण आणि इतरांसाठी परिणाम. (मॅकफार्लेन, २००९).
सिंग, एपी, गुओ, वाय., सिंग, ए., झी, डब्ल्यू. आणि जियांग, पी. इन्सुलिन एन्कॅप्सुलेशनचा विकास: तोंडी प्रशासन आता शक्य आहे का? जे. फार्मसी.बायो-फार्मसी.रिझर्वोइर.१, ७४–९२ (२०१९).
वोंग, सीवाय, अल-सलामी, एच. आणि दास, सीआर मधुमेहाच्या उपचारांसाठी तोंडी इन्सुलिन-लोडेड लिपोसोम डिलिव्हरी सिस्टममध्ये अलीकडील प्रगती. इंटरप्रिटेशन.जे. फार्मसी.५४९, २०१–२१७ (२०१८).