हा लेख “कडधान्यांची रोगजंतू आणि कीटकांविरुद्धची प्रतिकारशक्ती सुधारणे” या संशोधन विषयाचा भाग आहे, सर्व ५ लेख पहा.
नेक्रोसिस नेक्रोसिस या बुरशीजन्य वनस्पती रोगाचा कारक स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम (लिब.) डी बारी, वेगवेगळ्या यजमान वनस्पतींना संक्रमित करण्यासाठी बहुस्तरीय धोरण वापरतो. हा अभ्यास स्यूडोमोनास स्क्लेरोटिओरममुळे होणाऱ्या पांढऱ्या बुरशीला फेजोलस वल्गारिस एल. वनस्पतीचा आण्विक, शारीरिक आणि जैवरासायनिक प्रतिसाद वाढवण्यासाठी एक पर्यायी व्यवस्थापन धोरण म्हणून डायअमाइन एल-ऑर्निथिनच्या वापराचा प्रस्ताव मांडतो. एल-ऑर्निथिन हे एक नॉन-प्रोटीन अमिनो आम्ल आहे जे इतर अत्यावश्यक अमिनो आम्लांच्या संश्लेषणाला उत्तेजित करते. इन विट्रो प्रयोगांमध्ये असे दिसून आले की एल-ऑर्निथिनने एस. पायरेनोइडोसाच्या मायसेलियल वाढीस डोस-आधारित पद्धतीने लक्षणीयरीत्या प्रतिबंध केला. शिवाय, ते ग्रीनहाऊस परिस्थितीत पांढऱ्या बुरशीची तीव्रता लक्षणीयरीत्या कमी करू शकले. याव्यतिरिक्त, एल-ऑर्निथिनने उपचारित वनस्पतींच्या वाढीस उत्तेजित केले, जे दर्शवते की एल-ऑर्निथिनची चाचणी केलेली सांद्रता उपचारित वनस्पतींसाठी वनस्पती-विषारी नव्हती. याव्यतिरिक्त, एल-ऑर्निथिनने नॉन-एन्झायमॅटिक अँटिऑक्सिडंट्स (एकूण विद्राव्य फिनॉलिक्स आणि फ्लेव्होनॉइड्स) आणि एन्झायमॅटिक अँटिऑक्सिडंट्स (कॅटालेज (CAT), पेरॉक्सिडेज (POX), आणि पॉलीफेनॉल ऑक्सिडेज (PPO)) यांची अभिव्यक्ती वाढवली, आणि तीन अँटिऑक्सिडंट-संबंधित जनुकांची (PvCAT1, PvSOD, आणि PvGR) अभिव्यक्ती वाढवली. शिवाय, इन सिलिको विश्लेषणातून एस. स्क्लेरोटिओरमच्या जीनोममध्ये एका संभाव्य ऑक्झालोॲसिटेट ॲसिटिलहायड्रोलेज (SsOAH) प्रथिनाची उपस्थिती उघड झाली, जे कार्यात्मक विश्लेषण, संरक्षित डोमेन्स आणि टोपोलॉजीच्या बाबतीत ॲस्परजिलस फिजिएन्सिस (AfOAH) आणि पेनिसिलियम प्रजाती (PlOAH) यांच्या ऑक्झालोॲसिटेट ॲसिटिलहायड्रोलेज (SsOAH) प्रथिनांशी अत्यंत साम्यपूर्ण होते. विशेष म्हणजे, पोटॅटो डेक्स्ट्रोज ब्रॉथ (PDB) माध्यमात एल-ऑर्निथिन मिसळल्याने एस. स्क्लेरोटिओरमच्या मायसेलियामधील SsOAH जनुकाची अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या कमी झाली. त्याचप्रमाणे, एल-ऑर्निथिनचा बाह्य वापर केल्याने उपचारित वनस्पतींपासून गोळा केलेल्या बुरशीच्या मायसेलियामधील SsOAH जनुकाची अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या कमी झाली. अखेरीस, एल-ऑर्निथिनच्या वापरामुळे PDB माध्यम आणि संक्रमित पाने या दोन्हीमध्ये ऑक्झॅलिक आम्लाचा स्राव लक्षणीयरीत्या कमी झाला. निष्कर्षतः, एल-ऑर्निथिन रेडॉक्स स्थिती राखण्यात तसेच संक्रमित वनस्पतींचा संरक्षण प्रतिसाद वाढविण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावते. या अभ्यासाचे परिणाम पांढऱ्या बुरशीवर नियंत्रण मिळवण्यासाठी आणि घेवड्याच्या उत्पादनावरील व इतर पिकांवरील तिचा प्रभाव कमी करण्यासाठी नाविन्यपूर्ण, पर्यावरणपूरक पद्धती विकसित करण्यास मदत करू शकतात.
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम (लिब.) डी बारी या मृतोपजीवी बुरशीमुळे होणारा पांढरा बुरशीजन्य रोग हा एक विनाशकारी, उत्पन्न घटवणारा रोग आहे, जो जागतिक स्तरावर घेवड्याच्या (फेसिओलस वल्गारिस एल.) उत्पादनासाठी एक गंभीर धोका निर्माण करतो (बोल्टन इत्यादी, २००६). स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम हा नियंत्रणासाठी सर्वात कठीण मातीजन्य बुरशीजन्य वनस्पती रोगजनकांपैकी एक आहे, ज्याची यजमान वनस्पतींची श्रेणी ६०० पेक्षा जास्त वनस्पती प्रजातींपर्यंत पसरलेली आहे आणि यजमान वनस्पतींच्या उतींना अविशिष्ट पद्धतीने वेगाने नष्ट करण्याची क्षमता त्याच्यात आहे (लिआंग आणि रोलिन्स, २०१८). प्रतिकूल परिस्थितीत, तो त्याच्या जीवनचक्राच्या एका गंभीर टप्प्यातून जातो, ज्यात तो दीर्घकाळ सुप्तावस्थेत राहतो. या अवस्थेत तो मातीत 'स्क्लेरोशिया' नावाच्या काळ्या, कठीण, बियांसारख्या रचनांच्या रूपात किंवा संक्रमित वनस्पतींच्या मायसेलियम किंवा खोडाच्या गाभ्यामध्ये पांढऱ्या, मऊ वाढीच्या रूपात आढळतो (श्वार्ट्झ इत्यादी, २००५). एस. स्क्लेरोटिओरममध्ये स्क्लेरोशिया तयार करण्याची क्षमता असते, ज्यामुळे ते संक्रमित शेतात दीर्घकाळ टिकून राहू शकते आणि रोगाच्या काळातही टिकून राहते (श्वार्ट्झ इत्यादी, २००५). स्क्लेरोशिया पोषक तत्वांनी समृद्ध असतात, जमिनीत दीर्घकाळ टिकून राहू शकतात आणि पुढील संसर्गासाठी प्राथमिक संसर्ग माध्यम म्हणून काम करतात (श्वार्ट्झ इत्यादी, २००५). अनुकूल परिस्थितीत, स्क्लेरोशिया अंकुरित होतात आणि हवेत पसरणारे बीजाणू तयार करतात, जे वनस्पतीच्या जमिनीवरील सर्व भागांना संक्रमित करू शकतात, ज्यात फुले, देठ किंवा शेंगा यांचा समावेश होतो (श्वार्ट्झ इत्यादी, २००५).
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम आपल्या यजमान वनस्पतींना संक्रमित करण्यासाठी एक बहुस्तरीय रणनीती वापरते, ज्यामध्ये स्क्लेरोशियाच्या अंकुरणापासून ते लक्षणे दिसण्यापर्यंतच्या अनेक समन्वित घटनांचा समावेश असतो. सुरुवातीला, एस. स्क्लेरोटिओरम ॲपोथेशिया नावाच्या बुरशीसारख्या रचनांमधून तरंगणारे बीजाणू (ज्यांना ॲस्कोस्पोअर्स म्हणतात) तयार करते, जे हवेत पसरतात आणि संक्रमित वनस्पतींच्या अवशेषांवर अचल स्क्लेरोशियामध्ये विकसित होतात (बोल्टन इत्यादी, २००६). त्यानंतर ही बुरशी वनस्पती पेशीभित्तीचा पीएच नियंत्रित करण्यासाठी, एन्झाइमद्वारे होणारे विघटन आणि ऊतींमध्ये प्रवेश करण्यास प्रोत्साहन देण्यासाठी (हेगेदस आणि रिमर, २००५), आणि यजमान वनस्पतीचा ऑक्सिडेटिव्ह बर्स्ट दाबण्यासाठी ऑक्झॅलिक ॲसिड नावाचा एक रोगकारक घटक स्रवते. ही आम्लीकरण प्रक्रिया वनस्पती पेशीभित्तीला कमकुवत करते, ज्यामुळे बुरशीच्या पेशीभित्ती विघटन करणाऱ्या एन्झाइम्सच्या (CWDEs) सामान्य आणि कार्यक्षम कार्यासाठी अनुकूल वातावरण तयार होते, आणि यामुळे रोगजनकाला भौतिक अडथळा पार करून यजमान ऊतींमध्ये प्रवेश करणे शक्य होते (मर्सियानो इत्यादी, १९८३). एकदा शरीरात शिरल्यावर, एस. स्क्लेरोटिओरम पॉलीगॅलॅक्ट्युरोनेज आणि सेल्युलेज सारखे अनेक CWDEs स्रवते, जे संक्रमित ऊतींमध्ये त्याचा प्रसार सुलभ करतात आणि ऊतींचा नाश (नेक्रोसिस) घडवून आणतात. व्रण आणि हायफल मॅट्सच्या वाढीमुळे पांढऱ्या बुरशीची वैशिष्ट्यपूर्ण लक्षणे दिसू लागतात (हेगेदस आणि रिमर, २००५). दरम्यान, यजमान वनस्पती पॅटर्न रिकग्निशन रिसेप्टर्स (PRRs) द्वारे रोगजनकांशी संबंधित आण्विक नमुने (PAMPs) ओळखतात, ज्यामुळे सिग्नलिंग घटनांची एक मालिका सुरू होते, जी अखेरीस संरक्षण प्रतिसाद सक्रिय करते.
अनेक दशकांच्या रोग नियंत्रण प्रयत्नांनंतरही, रोगजंतूंच्या प्रतिकारशक्ती, जगण्याची क्षमता आणि अनुकूलनक्षमतेमुळे, इतर व्यावसायिक पिकांप्रमाणेच घेवड्याच्या पिकातही पुरेशा रोगप्रतिकारक जननद्रव्याची कमतरता कायम आहे. त्यामुळे रोग व्यवस्थापन अत्यंत आव्हानात्मक आहे आणि त्यासाठी एकात्मिक, बहुआयामी धोरणाची आवश्यकता असते, ज्यामध्ये सांस्कृतिक पद्धती, जैविक नियंत्रण आणि रासायनिक बुरशीनाशके यांचा एकत्रित समावेश असतो (ओ'सुलिव्हन इत्यादी, २०२१). पांढऱ्या बुरशीचे रासायनिक नियंत्रण सर्वात प्रभावी आहे, कारण बुरशीनाशके योग्य वेळी आणि योग्य पद्धतीने वापरल्यास रोगाचा प्रसार प्रभावीपणे नियंत्रित करू शकतात, संसर्गाची तीव्रता कमी करू शकतात आणि उत्पन्नातील घट कमी करू शकतात. तथापि, बुरशीनाशकांचा अतिवापर आणि त्यावर जास्त अवलंबून राहिल्याने एस. स्क्लेरोटिओरमच्या (S. sclerotiorum) रोगप्रतिकारक प्रजातींचा उदय होऊ शकतो आणि त्याचा इतर जीव, जमिनीचे आरोग्य आणि पाण्याच्या गुणवत्तेवर नकारात्मक परिणाम होऊ शकतो (ले कॉइंटे इत्यादी, २०१६; सेरेसिनी इत्यादी, २०२४). त्यामुळे, पर्यावरणास अनुकूल पर्याय शोधणे हे सर्वोच्च प्राधान्य बनले आहे.
पुट्रेसिन, स्पर्मिडिन, स्पर्मिन आणि कॅडाव्हेरिन यांसारखे पॉलीअमाइन्स (PAs) मातीतून पसरणाऱ्या वनस्पती रोगजनकांच्या विरोधात आश्वासक पर्याय म्हणून काम करू शकतात, ज्यामुळे धोकादायक रासायनिक बुरशीनाशकांचा वापर पूर्णपणे किंवा अंशतः कमी होतो (नेहेला इत्यादी, २०२४; यी इत्यादी, २०२४). उच्च वनस्पतींमध्ये, PAs अनेक शारीरिक प्रक्रियांमध्ये सहभागी असतात, ज्यात पेशी विभाजन, विभेदन आणि अजैविक व जैविक ताणांना प्रतिसाद यांचा समावेश होतो (किलिनी आणि नेहेला, २०२०). ते अँटिऑक्सिडंट म्हणून कार्य करू शकतात, प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजाती (ROS) नष्ट करण्यास मदत करतात, रेडॉक्स होमियोस्टॅसिस राखतात (नेहेला आणि किलिनी, २०२३), संरक्षण-संबंधित जनुकांना प्रेरित करतात (रोमेरो इत्यादी, २०१८), विविध चयापचय मार्गांचे नियमन करतात (नेहेला आणि किलिनी, २०२३), अंतर्जात फायटोहॉर्मोन्सचे नियमन करतात (नेहेला आणि किलिनी, २०१९), प्रणालीगत अधिग्रहित प्रतिकारशक्ती (SAR) स्थापित करतात आणि वनस्पती-रोगकारक परस्परसंवादांचे नियमन करतात (नेहेला आणि किलिनी, २०२०; असिजा इत्यादी, २०२२; झेरवोनिएक, २०२२). हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की वनस्पती संरक्षणातील पीएच्या विशिष्ट यंत्रणा आणि भूमिका वनस्पतींच्या प्रजाती, रोगकारक आणि पर्यावरणीय परिस्थितीनुसार बदलतात. वनस्पतींमधील सर्वात मुबलक पीए आवश्यक पॉलीअमाइन एल-ऑर्निथिनपासून जैवसंश्लेषित केला जातो (किलिनी आणि नेहेला, २०२०).
एल-ऑर्निथिन वनस्पतींच्या वाढीमध्ये आणि विकासामध्ये अनेक भूमिका बजावते. उदाहरणार्थ, मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की भातामध्ये (ओरिझा सॅटिवा), ऑर्निथिन नायट्रोजन पुनर्चक्रीकरण (लिऊ इत्यादी, २०१८), भाताचे उत्पन्न, गुणवत्ता आणि सुगंध (लू इत्यादी, २०२०), आणि पाण्याच्या ताणाला प्रतिसाद (यांग इत्यादी, २०००) यांच्याशी संबंधित असू शकते. याव्यतिरिक्त, एल-ऑर्निथिनच्या बाह्य वापरामुळे साखर बीटमध्ये (बीटा वल्गारिस) दुष्काळ सहनशीलता लक्षणीयरीत्या वाढली (हुसेन इत्यादी, २०१९) आणि कांदा (ॲलियम सेपा) (चावुशोग्लू आणि चावुशोग्लू, २०२१) व काजू (ॲनाकार्डियम ऑक्सिडेंटेल) वनस्पतींमधील क्षार ताण कमी झाला (दा रोचा इत्यादी, २०१२). अजैविक ताण संरक्षणातील एल-ऑर्निथिनची संभाव्य भूमिका ही उपचारित वनस्पतींमध्ये प्रोलाइनच्या संचयनात त्याच्या सहभागामुळे असू शकते. उदाहरणार्थ, प्रोलीन चयापचयाशी संबंधित जनुके, जसे की ऑर्निथिन डेल्टा अमिनोट्रान्सफरेज (डेल्टा-ओएटी) आणि प्रोलीन डिहायड्रोजनेज (प्रोडीएच१ आणि प्रोडीएच२) जनुके, निकोटियाना बेंथॅमियाना आणि अ‍ॅराबिडॉप्सिस थॅलियाना या वनस्पतींचे गैर-यजमान स्यूडोमोनास सिरिंगी स्ट्रेन्सपासून संरक्षण करण्यात सहभागी असल्याचे पूर्वी नोंदवले गेले आहे (सेंथिल-कुमार आणि म्हैसूर, २०१२). दुसरीकडे, बुरशीजन्य ऑर्निथिन डिकार्बॉक्सिलेज (ओडीसी) रोगजनकांच्या वाढीसाठी आवश्यक असते (सिंग इत्यादी, २०२०). होस्ट-इंड्युस्ड जीन सायलेन्सिंग (एचआयजीएस) द्वारे फ्युसेरियम ऑक्सिस्पोरम एफ. एसपी. लायकोपरसिकीच्या ओडीसीला लक्ष्य केल्याने टोमॅटोच्या रोपांचा फ्युसेरियम विल्ट रोगाला असलेला प्रतिकार लक्षणीयरीत्या वाढला (सिंग इत्यादी, २०२०). तथापि, वनस्पती रोगजनकांसारख्या जैविक ताणांविरुद्ध बाह्य ऑर्निथिनच्या वापराच्या संभाव्य भूमिकेचा चांगला अभ्यास झालेला नाही. सर्वात महत्त्वाचे म्हणजे, रोगप्रतिकारशक्तीवर ऑर्निथिनचे होणारे परिणाम आणि त्यासंबंधित जैवरासायनिक व शारीरिक घटना यांबद्दलचे संशोधन अजूनही मोठ्या प्रमाणात अज्ञात आहे.
शेंगांच्या पिकांवरील एस. स्क्लेरोटिओरम (S. sclerotiorum) संसर्गाची गुंतागुंत समजून घेणे, प्रभावी नियंत्रण धोरणे विकसित करण्यासाठी महत्त्वाचे आहे. या अभ्यासात, स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम (Sclerotinia sclerotiorum) संसर्गाविरुद्ध शेंगांच्या वनस्पतींची संरक्षण यंत्रणा आणि प्रतिकारशक्ती वाढविण्यात एक प्रमुख घटक म्हणून डायअमाइन एल-ऑर्निथिनच्या (L-ornithine) संभाव्य भूमिकेची ओळख पटवणे, हे आमचे उद्दिष्ट होते. आमची अशी गृहीत कल्पना आहे की, संक्रमित वनस्पतींचा संरक्षण प्रतिसाद वाढवण्याव्यतिरिक्त, एल-ऑर्निथिन रेडॉक्स स्थिती (redox status) राखण्यातही महत्त्वाची भूमिका बजावते. आमचा प्रस्ताव आहे की, एल-ऑर्निथिनचे संभाव्य परिणाम हे एन्झायमॅटिक आणि नॉन-एन्झायमॅटिक अँटिऑक्सिडंट संरक्षण यंत्रणांचे नियमन आणि बुरशीजन्य रोगजनकता/विषाक्तता घटक व संबंधित प्रथिनांमध्ये हस्तक्षेप करण्याशी संबंधित आहेत. एल-ऑर्निथिनची ही दुहेरी कार्यक्षमता, पांढऱ्या बुरशीचा प्रभाव कमी करण्यासाठी आणि या शक्तिशाली बुरशीजन्य रोगजनकाविरुद्ध सामान्य शेंगांच्या पिकांची प्रतिकारशक्ती वाढवण्यासाठी, एका शाश्वत धोरणासाठी त्याला एक आश्वासक उमेदवार बनवते. प्रस्तुत अभ्यासाचे निष्कर्ष पांढऱ्या बुरशीवर नियंत्रण मिळवण्यासाठी आणि शेंगांच्या उत्पादनावरील तिचा प्रभाव कमी करण्यासाठी नाविन्यपूर्ण, पर्यावरणपूरक पद्धती विकसित करण्यास मदत करू शकतात.
या अभ्यासात, सामान्य वाटाण्याच्या गिझा ३ (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) या संवेदनशील व्यावसायिक वाणाचा प्रायोगिक साहित्य म्हणून वापर करण्यात आला. निरोगी बिया इजिप्तमधील कृषी संशोधन केंद्र (ARC), क्षेत्रीय पीक संशोधन संस्था (FCRI) येथील कडधान्य संशोधन विभागाने सदिच्छेने पुरवल्या होत्या. हरितगृह परिस्थितीत (२५ ± २ °C, सापेक्ष आर्द्रता ७५ ± १%, ८ तास प्रकाश/१६ तास अंधार) एस. स्क्लेरोटिओरम-संक्रमित मातीने भरलेल्या प्लास्टिकच्या कुंड्यांमध्ये (आतील व्यास ३५ सेंमी, खोली ५० सेंमी) पाच बिया पेरण्यात आल्या. पेरणीनंतर ७-१० दिवसांनी (DPS), प्रत्येक कुंडीत एकसमान वाढ आणि तीन पूर्ण वाढलेली पाने असलेली फक्त दोन रोपे राहतील अशा प्रकारे रोपांची विरळणी करण्यात आली. सर्व कुंड्यांतील रोपांना दर दोन आठवड्यांनी एकदा पाणी देण्यात आले आणि दिलेल्या वाणासाठी शिफारस केलेल्या दराने दर महिन्याला खत देण्यात आले.
एल-ऑर्निथिनडायअमाइनचे (ज्याला (+)-(S)-2,5-डायअमिनोपेंटानोइक ॲसिड असेही म्हणतात; सिग्मा-अल्ड्रिच, डार्मस्टॅड, जर्मनी) ५०० मिग्रॅ/लिटर सांद्रतेचे द्रावण तयार करण्यासाठी, प्रथम ५० मिग्रॅ १०० मिली निर्जंतुक ऊर्ध्वपातित पाण्यात विरघळवण्यात आले. त्यानंतर हे मूळ द्रावण विरल करून पुढील प्रयोगांमध्ये वापरण्यात आले. थोडक्यात, एल-ऑर्निथिनच्या सांद्रतेच्या सहा श्रेणी (१२.५, २५, ५०, ७५, १००, आणि १२५ मिग्रॅ/लिटर) इन विट्रो पद्धतीने तपासण्यात आल्या. याव्यतिरिक्त, निर्जंतुक ऊर्ध्वपातित पाण्याचा नकारात्मक नियंत्रक (मॉक) म्हणून आणि व्यावसायिक बुरशीनाशक “रिझोलेक्स-टी” ५०% वेटेबल पावडरचा (टोक्लोफॉस-मिथाइल २०% + थिरम ३०%; केझेड-काफ्र एल झायत पेस्टिसाइड्स अँड केमिकल्स कंपनी, काफ्र एल झायत, घरबिया गव्हर्नरेट, इजिप्त) सकारात्मक नियंत्रक म्हणून वापर करण्यात आला. व्यावसायिक बुरशीनाशक “रिझोलेक्स-टी” ची इन विट्रो चाचणी पाच सांद्रतांवर (2, 4, 6, 8 आणि 10 मिग्रॅ/लिटर) करण्यात आली.
व्यावसायिक शेतांमधून पांढऱ्या बुरशीची वैशिष्ट्यपूर्ण लक्षणे (प्रादुर्भावाचे प्रमाण: १०-३०%) दर्शविणाऱ्या घेवड्याच्या देठांचे आणि शेंगांचे नमुने गोळा करण्यात आले. जरी बहुतेक संक्रमित वनस्पती सामग्रीची प्रजाती/प्रकारानुसार (संवेदनशील व्यावसायिक प्रकार गिझा ३) ओळख पटली असली तरी, इतर, विशेषतः स्थानिक बाजारातून मिळवलेल्या, अज्ञात प्रजातीच्या होत्या. गोळा केलेल्या संक्रमित सामग्रीला प्रथम ०.५% सोडियम हायपोक्लोराइट द्रावणाने ३ मिनिटांसाठी पृष्ठभागावर निर्जंतुक करण्यात आले, नंतर निर्जंतुक डिस्टिल्ड पाण्याने अनेक वेळा स्वच्छ धुऊन जास्तीचे पाणी काढण्यासाठी निर्जंतुक फिल्टर पेपरने कोरडे पुसण्यात आले. त्यानंतर संक्रमित अवयवांना मधल्या उतीमधून (निरोगी आणि संक्रमित उतींच्या दरम्यान) लहान तुकड्यांमध्ये कापून, पोटॅटो डेक्स्ट्रोज आगर (PDA) माध्यमावर संवर्धित करण्यात आले आणि स्क्लेरोशिया निर्मितीला चालना देण्यासाठी ५ दिवसांकरिता १२ तास प्रकाश/१२ तास अंधार या चक्रात २५ ± २ °C तापमानावर उबवण्यात आले. मिश्र किंवा दूषित संवर्धनांमधून बुरशीचे आयसोलेट्स शुद्ध करण्यासाठी मायसेलियल टिप पद्धतीचा देखील वापर करण्यात आला. शुद्ध केलेल्या बुरशीच्या आयसोलेटची ओळख प्रथम त्याच्या सांस्कृतिक आकारशास्त्रीय वैशिष्ट्यांच्या आधारे पटवण्यात आली आणि नंतर सूक्ष्मदर्शकीय वैशिष्ट्यांच्या आधारे ते एस. स्क्लेरोटिओरम असल्याची पुष्टी करण्यात आली. शेवटी, कोचच्या गृहितकांची पूर्तता करण्यासाठी, सर्व शुद्ध केलेल्या आयसोलेट्सची रोगजनकतेसाठी संवेदनशील असलेल्या गिझा ३ या सामान्य वाटाण्याच्या जातीवर चाचणी घेण्यात आली.
याव्यतिरिक्त, व्हाईट एट अल., १९९०; बटुरो-सीस्निव्स्का एट अल., २०१७ यांनी वर्णन केल्यानुसार, सर्वात जास्त आक्रमक एस. स्क्लेरोटिओरम आयसोलेटची (आयसोलेट #३) इंटरनल ट्रान्स्क्राइब्ड स्पेसर (ITS) सिक्वेन्सिंगच्या आधारे अधिक पुष्टी करण्यात आली. थोडक्यात, आयसोलेट्सना पोटॅटो डेक्स्ट्रोज ब्रॉथ (PDB) मध्ये कल्चर करून २५ ± २ °C तापमानावर ५-७ दिवसांसाठी इनक्युबेट करण्यात आले. त्यानंतर बुरशीचे मायसेलियम गोळा करून, चीजक्लॉथमधून गाळून, निर्जंतुक पाण्याने दोनदा धुऊन, आणि निर्जंतुक फिल्टर पेपरने वाळवण्यात आले. क्विक-डीएनए™ फंगल/बॅक्टेरियल मिनिप्रेप किट (कुरामाए-इझिओका, १९९७; अतालाह एट अल., २०२२, २०२४) वापरून जीनोमिक डीएनए वेगळा करण्यात आला. त्यानंतर, विशिष्ट प्रायमर जोडी ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; अपेक्षित आकार: ५४० bp) वापरून ITS rDNA क्षेत्राचे प्रवर्धन करण्यात आले (बटुरो-सीस्निव्स्का इत्यादी, २०१७). शुद्ध केलेले PCR उत्पादने सिक्वेन्सिंगसाठी सादर करण्यात आली (बीजिंग आओके डिंगशेंग बायोटेक्नॉलॉजी कं, लि.). सँगर सिक्वेन्सिंग पद्धतीचा वापर करून ITS rDNA सिक्वेन्सचे द्विदिशीय सिक्वेन्सिंग करण्यात आले. त्यानंतर, एकत्रित केलेल्या क्वेरी सिक्वेन्सची तुलना BLASTn सॉफ्टवेअर वापरून जेनबँक आणि नॅशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नॉलॉजी इन्फॉर्मेशन (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) येथील नवीनतम डेटाशी करण्यात आली. मॉलिक्युलर इव्होल्युशनरी जेनेटिक्स ॲनालिसिस पॅकेज (MEGA-11; आवृत्ती 11) (कुमार इत्यादी, 2024) मधील ClustalW वापरून, क्वेरी सिक्वेन्सची तुलना NCBI GenBank मधील नवीनतम डेटामधून (पूरक सारणी S1) मिळवलेल्या इतर 20 S. sclerotiorum स्ट्रेन्स/आयसोलेट्सशी करण्यात आली. मॅक्सिमम लाइकलीहुड पद्धत आणि जनरल टाइम-रिव्हर्सिबल न्यूक्लिओटाइड सबस्टिट्यूशन मॉडेल (नेई आणि कुमार, 2000) वापरून उत्क्रांतीविषयक विश्लेषण करण्यात आले. सर्वाधिक लॉग-लाइकलीहुड असलेले ट्री दाखवले आहे. ह्युरिस्टिक शोधासाठीचे प्रारंभिक ट्री, नेबर-जॉइनिंग (NJ) ट्री (कुमार इत्यादी, 2024) आणि मॅक्सिमम पार्सिमनी (MP) ट्री यांपैकी उच्च लॉग-लाइकलीहुड असलेले ट्री निवडून निवडले जाते. जनरल टाइम-रिव्हर्सिबल मॉडेल (नेई आणि कुमार, 2000) वापरून गणना केलेल्या पेअरवाइज डिस्टन्स मॅट्रिक्सचा वापर करून NJ ट्री तयार करण्यात आले.
एल-ऑर्निथिन आणि जीवाणूनाशक “रिझोलेक्स-टी” यांची जीवाणूविरोधी क्रियाशीलता इन विट्रो पद्धतीने अगर डिफ्यूजन पद्धतीने निश्चित करण्यात आली. पद्धत: एल-ऑर्निथिनच्या स्टॉक सोल्यूशनची (५०० मिग्रॅ/लिटर) योग्य मात्रा घेऊन, ती १० मिली पीडीए पोषक माध्यमात पूर्णपणे मिसळून अनुक्रमे १२.५, २५, ५०, ७५, १०० आणि १२५ मिग्रॅ/लिटर या अंतिम सांद्रतेची द्रावणे तयार करण्यात आली. बुरशीनाशक “रिझोलेक्स-टी”च्या पाच सांद्रता (२, ४, ६, ८ आणि १० मिग्रॅ/लिटर) आणि निर्जंतुक डिस्टिल्ड वॉटरचा नियंत्रण म्हणून वापर करण्यात आला. माध्यम घट्ट झाल्यावर, स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम कल्चरचा ४ मिमी व्यासाचा ताजा मायसेलियल प्लग पेट्री डिशच्या मध्यभागी स्थानांतरित करण्यात आला आणि मायसेलियमने संपूर्ण नियंत्रण पेट्री डिश व्यापेपर्यंत २५±२°C तापमानावर त्याचे कल्चर करण्यात आले, त्यानंतर बुरशीच्या वाढीची नोंद घेण्यात आली. समीकरण १ वापरून एस. स्क्लेरोटिओरमच्या त्रिज्यीय वाढीच्या प्रतिबंधाची टक्केवारी काढा:
हा प्रयोग दोनदा पुनरावृत्त करण्यात आला, ज्यामध्ये प्रत्येक नियंत्रण/प्रायोगिक गटासाठी सहा जैविक प्रतिकृती आणि प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीसाठी पाच कुंड्या (प्रत्येकी दोन रोपे) वापरण्यात आल्या. प्रायोगिक निष्कर्षांची अचूकता, विश्वसनीयता आणि पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करण्यासाठी प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीचे दोनदा विश्लेषण करण्यात आले (दोन तांत्रिक प्रतिकृती). याव्यतिरिक्त, अर्ध-अधिकतम निरोधात्मक सांद्रता (IC50) आणि IC99 (प्रेंटिस, १९७६) यांची गणना करण्यासाठी प्रोबिट रिग्रेशन विश्लेषणाचा वापर करण्यात आला.
हरितगृह परिस्थितीत एल-ऑर्निथिनची क्षमता तपासण्यासाठी, दोन सलग कुंडी प्रयोग आयोजित करण्यात आले. थोडक्यात, कुंड्या निर्जंतुक केलेल्या चिकणमाती-वाळूच्या मातीने (३:१) भरल्या गेल्या आणि त्यात एस. स्क्लेरोटिओरमच्या ताज्या तयार केलेल्या कल्चरचे इनोक्युलेशन करण्यात आले. प्रथम, एस. स्क्लेरोटिओरमचा सर्वात आक्रमक आयसोलेट (आयसोलेट #३) कल्चर करण्यासाठी, त्याचे एक स्क्लेरोशियम अर्धे कापून, ते पीडीएवर पालथे ठेवून, मायसेलियल वाढीस चालना देण्यासाठी २५°C तापमानात सतत अंधारात (२४ तास) ४ दिवस इनक्युबेट करण्यात आले. त्यानंतर, त्याच्या पुढच्या कडेवरून ५ मिमी व्यासाचे चार अगर प्लग घेण्यात आले आणि त्यात गहू व तांदळाच्या कोंड्याच्या (१:१, v/v) १०० ग्रॅम निर्जंतुक मिश्रणाचे इनोक्युलेशन करण्यात आले. स्क्लेरोशिया निर्मितीस चालना देण्यासाठी सर्व फ्लास्क २५ ± २ °C तापमानात १२ तास प्रकाश/१२ तास अंधार या चक्रात ५ दिवस इनक्युबेट करण्यात आले. माती घालण्यापूर्वी एकजीवता सुनिश्चित करण्यासाठी सर्व फ्लास्कमधील सामग्री पूर्णपणे मिसळण्यात आली. त्यानंतर, रोगजनकांची सांद्रता स्थिर राहील याची खात्री करण्यासाठी प्रत्येक कुंडीत १०० ग्रॅम वसाहत करणारे कोंड्याचे मिश्रण घालण्यात आले. बुरशीची वाढ सक्रिय करण्यासाठी संरोपित कुंड्यांना पाणी देण्यात आले आणि ७ दिवसांसाठी हरितगृहाच्या परिस्थितीत ठेवण्यात आले.
त्यानंतर प्रत्येक कुंडीत गिझा ३ जातीच्या पाच बिया पेरण्यात आल्या. एल-ऑर्निथिन आणि रायझोलेक्स-टी या बुरशीनाशकाने प्रक्रिया केलेल्या कुंड्यांसाठी, निर्जंतुक केलेल्या बिया प्रथम दोन तासांसाठी त्या दोन संयुगांच्या जलीय द्रावणात भिजवण्यात आल्या, ज्याची अंतिम IC99 सांद्रता अनुक्रमे सुमारे २५० मिग्रॅ/लिटर आणि ५० मिग्रॅ/लिटर होती, आणि नंतर पेरणीपूर्वी एक तासासाठी हवेत वाळवण्यात आल्या. दुसरीकडे, नकारात्मक नियंत्रण म्हणून बिया निर्जंतुक डिस्टिल्ड वॉटरमध्ये भिजवण्यात आल्या. १० दिवसांनंतर, पहिल्यांदा पाणी देण्यापूर्वी, रोपे विरळ करण्यात आली, जेणेकरून प्रत्येक कुंडीत फक्त दोन सुबक रोपे राहतील. याव्यतिरिक्त, एस. स्क्लेरोटिओरमचा संसर्ग सुनिश्चित करण्यासाठी, विकासाच्या त्याच टप्प्यावर (१० दिवस) असलेल्या घेवड्याच्या रोपांचे देठ निर्जंतुक स्कॅल्पेलने दोन वेगवेगळ्या ठिकाणी कापण्यात आले आणि प्रत्येक जखमेत अंदाजे ०.५ ग्रॅम वसाहत करणारे कोंड्याचे मिश्रण ठेवण्यात आले, त्यानंतर सर्व संक्रमित रोपांमध्ये संसर्ग आणि रोगाच्या विकासाला चालना देण्यासाठी उच्च आर्द्रता ठेवण्यात आली. नियंत्रण वनस्पतींनाही त्याचप्रमाणे जखम करण्यात आली आणि जखमेमध्ये समान प्रमाणात (०.५ ग्रॅम) निर्जंतुक, वसाहतविरहित कोंड्याचे मिश्रण ठेवण्यात आले व रोगाच्या विकासासाठी आवश्यक वातावरणाचे अनुकरण करण्यासाठी आणि उपचार गटांमध्ये सुसंगतता सुनिश्चित करण्यासाठी ते उच्च आर्द्रतेखाली ठेवण्यात आले.
उपचार पद्धत: घेवड्याच्या रोपांना एल-ऑर्निथिन (२५० मिग्रॅ/लिटर) च्या जलीय द्रावणाचे किंवा रायझोलेक्स-टी (५० मिग्रॅ/लिटर) या बुरशीनाशकाचे ५०० मिली द्रावण मातीला सिंचनाद्वारे देण्यात आले, त्यानंतर हा उपचार १० दिवसांच्या अंतराने तीन वेळा पुनरावृत्त करण्यात आला. प्लेसिबो-उपचारित नियंत्रकांना ५०० मिली निर्जंतुक ऊर्ध्वपातित पाण्याने सिंचन करण्यात आले. सर्व उपचार हरितगृह परिस्थितीत (२५ ± २°से, ७५ ± १% सापेक्ष आर्द्रता, आणि ८ तास प्रकाश/१६ तास अंधार असा प्रकाश-काळ) करण्यात आले. सर्व कुंड्यांना दर पंधरा दिवसांनी पाणी दिले जात असे आणि विशिष्ट वाणाच्या शिफारशींनुसार व उत्पादकाच्या सूचनांनुसार, पानांवर फवारणी करून ३-४ ग्रॅम/लिटर या सांद्रतेमध्ये संतुलित एनपीके खत (२०-२०-२०, ३.६% गंधक आणि टीई सूक्ष्मघटकांसह; झैन सीड्स, इजिप्त) दर महिन्याला दिले जात असे. अन्यथा नमूद केल्याशिवाय, उपचारांनंतर ७२ तासांनी (hpt) प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमधून पूर्णपणे विस्तारलेली परिपक्व पाने (वरच्या बाजूने दुसरे आणि तिसरे पान) गोळा केली गेली, एकजीव केली गेली, एकत्र केली गेली आणि पुढील विश्लेषणांसाठी -८० °C तापमानावर साठवली गेली. या विश्लेषणांमध्ये ऑक्सिडेटिव्ह स्ट्रेस निर्देशकांचे इन सिटू हिस्टोकेमिकल स्थानिकीकरण, लिपिड पेरोक्सिडेशन, एन्झायमॅटिक आणि नॉन-एन्झायमॅटिक अँटिऑक्सिडंट्स आणि जीन अभिव्यक्ती यांचा समावेश होता, परंतु ते एवढ्यापुरतेच मर्यादित नव्हते.
पांढऱ्या बुरशीच्या संसर्गाची तीव्रता, पेरणीनंतर २१ दिवसांनी (dpi) साप्ताहिकरित्या, १-९ च्या स्केलचा वापर करून मोजण्यात आली (पूरक सारणी S2). हे स्केल पेटझोल्ड आणि डिक्सन स्केल (१९९६) वर आधारित होते, ज्यामध्ये टेरान एट अल. (२००६) यांनी बदल केले होते. थोडक्यात, पेरणीच्या ठिकाणी आणि आंतरपर्वांवर व्रणांच्या प्रगतीचा मागोवा घेण्यासाठी, घेवड्याच्या रोपांची खोडे आणि फांद्यांची तपासणी करण्यात आली. त्यानंतर, व्रणाचे पेरणीच्या ठिकाणापासून खोड किंवा फांदीवरील सर्वात दूरच्या बिंदूपर्यंतचे अंतर मोजण्यात आले आणि व्रणाच्या स्थानानुसार १-९ गुण देण्यात आले, जिथे (१) म्हणजे पेरणीच्या ठिकाणाजवळ कोणताही दृश्यमान संसर्ग नाही आणि (२-९) म्हणजे व्रणाच्या आकारात हळूहळू वाढ आणि पेऱ्यांवर/आंतरपर्वांवर त्याची प्रगती (पूरक सारणी S2). त्यानंतर, पांढऱ्या बुरशीच्या संसर्गाची तीव्रता सूत्र २ वापरून टक्केवारीत रूपांतरित करण्यात आली:
याव्यतिरिक्त, रोग प्रगती वक्राखालील क्षेत्र (AUDPC) ची गणना (शेनर आणि फिनी, १९७७) या सूत्राचा वापर करून करण्यात आली, जे अलीकडेच समीकरण ३ वापरून सामान्य वाटाण्याच्या पांढऱ्या कुजव्यासाठी (चौहान इत्यादी, २०२०) अनुकूलित केले गेले आहे:
येथे Yi = वेळ ti वरील रोगाची तीव्रता, Yi+1 = पुढील वेळ ti+1 वरील रोगाची तीव्रता, ti = पहिल्या मोजणीची वेळ (दिवसांमध्ये), ti+1 = पुढील मोजणीची वेळ (दिवसांमध्ये), n = एकूण वेळ बिंदू किंवा निरीक्षण बिंदूंची संख्या. सर्व जैविक प्रतिकृतींमध्ये २१ दिवसांसाठी, वनस्पतीची उंची (सेमी), प्रति वनस्पती फांद्यांची संख्या आणि प्रति वनस्पती पानांची संख्या यासह घेवड्याच्या वनस्पतींच्या वाढीच्या मापदंडांची साप्ताहिक नोंद केली गेली.
प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमध्ये, उपचारानंतर ४५ व्या दिवशी (शेवटच्या उपचारानंतर १५ दिवसांनी) पानांचे नमुने (वरच्या बाजूने दुसरे आणि तिसरे पूर्ण विकसित पान) गोळा करण्यात आले. प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमध्ये पाच कुंड्या होत्या (प्रत्येक कुंडीत दोन रोपे). प्रकाशसंश्लेषक रंगद्रव्ये (क्लोरोफिल ए, क्लोरोफिल बी आणि कॅरोटीनॉइड्स) काढण्यासाठी, अंधारात ४°C तापमानावर ८०% ॲसिटोन वापरून सुमारे ५०० मिग्रॅ कुस्करलेल्या उतींचा वापर करण्यात आला. २४ तासांनंतर, नमुने सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले आणि (लिश्टेंथेलर, १९८७) यांच्या पद्धतीनुसार, तीन वेगवेगळ्या तरंगलांबींवर (A470, A646 आणि A663 nm) शोषणक्षमता मोजून, UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाझू कॉर्पोरेशन, जपान) वापरून रंगमापन पद्धतीने क्लोरोफिल ए, क्लोरोफिल बी आणि कॅरोटीनॉइड्सचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी सुपरनॅटंट गोळा करण्यात आला. शेवटी, लिक्टेनथेलर (1987) यांनी वर्णन केलेल्या खालील सूत्र 4-6 वापरून प्रकाशसंश्लेषक रंगद्रव्यांचे प्रमाण मोजले गेले.
उपचारानंतर ७२ तासांनी (hpt), हायड्रोजन पेरॉक्साइड (H2O2) आणि सुपरऑक्साइड ॲनायन (O2•−) यांच्या इन सिटू हिस्टोकेमिकल स्थानिकीकरणासाठी प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमधून पाने (वरच्या बाजूने दुसरे आणि तिसरे पूर्ण विकसित पान) गोळा करण्यात आली. प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमध्ये पाच कुंड्या होत्या (प्रत्येक कुंडीत दोन रोपे). पद्धतीची अचूकता, विश्वसनीयता आणि पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करण्यासाठी प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीचे दोनदा (दोन तांत्रिक प्रतिकृती) विश्लेषण करण्यात आले. रोमेरो-पुएर्टास इत्यादी (२००४) आणि ॲडम इत्यादी (१९८९) यांनी वर्णन केलेल्या पद्धतींमध्ये किरकोळ बदल करून, H2O2 आणि O2•− यांचे निर्धारण अनुक्रमे ०.१% ३,३′-डायमिनोबेंझिडिन (DAB; सिग्मा-अल्ड्रिच, डार्मस्टॅड, जर्मनी) किंवा नायट्रोब्यू टेट्राझोलियम (NBT; सिग्मा-अल्ड्रिच, डार्मस्टॅड, जर्मनी) वापरून करण्यात आले. H2O2 चे जागेवरच हिस्टोकेमिकल स्थानिकीकरण करण्यासाठी, पत्रकांना १० mM ट्रिस बफर (pH ७.८) मध्ये ०.१% DAB ने व्हॅक्यूम इन्फिल्ट्रेट केले गेले आणि नंतर खोलीच्या तापमानावर ६० मिनिटांसाठी प्रकाशात ठेवले गेले. पत्रकांना ४:१ (v/v) इथेनॉल:क्लोरोफॉर्म (अल-गोम्होरिया फार्मास्युटिकल्स अँड मेडिकल सप्लाइज, कैरो, इजिप्त) मधील ०.१५% (v/v) TCA मध्ये ब्लीच केले गेले आणि नंतर ती गडद होईपर्यंत प्रकाशात ठेवली गेली. त्याचप्रमाणे, O2•− चे जागेवरच हिस्टोकेमिकल स्थानिकीकरण करण्यासाठी, व्हॉल्व्हना ०.१ w/v % HBT असलेल्या १० mM पोटॅशियम फॉस्फेट बफर (pH ७.८) ने व्हॅक्यूम इन्फिल्ट्रेट केले गेले. पत्रकांना खोलीच्या तापमानावर २० मिनिटांसाठी प्रकाशात ठेवले गेले, नंतर वर सांगितल्याप्रमाणे ब्लीच केले गेले आणि नंतर गडद निळे/जांभळे ठिपके दिसेपर्यंत प्रकाशात ठेवले गेले. परिणामी तपकिरी (H2O2 सूचक म्हणून) किंवा निळ्या-जांभळ्या (O2•− सूचक म्हणून) रंगाची तीव्रता इमेजजे (http://fiji.sc; 7 मार्च 2024 रोजी पाहिले) या इमेज प्रोसेसिंग पॅकेजच्या फिजी आवृत्तीचा वापर करून तपासण्यात आली.
मालोंडियलडीहाइड (MDA; लिपिड पेरोक्सिडेशनचा मार्कर म्हणून) डू आणि ब्रॅमलेज (१९९२) यांच्या पद्धतीत किंचित सुधारणा करून निश्चित करण्यात आले. प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमधील पाने (वरच्या बाजूने दुसरे आणि तिसरे पूर्ण विकसित पान) उपचारांनंतर ७२ तासांनी (hpt) गोळा करण्यात आली. प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमध्ये पाच कुंड्यांचा समावेश होता (प्रत्येक कुंडीत दोन रोपे). पद्धतीची अचूकता, विश्वसनीयता आणि पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करण्यासाठी प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीचे दोनदा (दोन तांत्रिक प्रतिकृती) विश्लेषण करण्यात आले. थोडक्यात, ०.०१% ब्युटाईलेटेड हायड्रॉक्सिटोल्युइन (BHT; सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, एमओ, यूएसए) असलेल्या २०% ट्रायक्लोरोएसेटिक ऍसिड (TCA; मिलिपोरसिग्मा, बर्लिंग्टन, एमए, यूएसए) सह MDA निष्कर्षणासाठी ०.५ ग्रॅम दळलेल्या पानांच्या ऊतींचा वापर करण्यात आला. नंतर सुपरनॅटंटमधील MDA चे प्रमाण UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाझू कॉर्पोरेशन, जपान) वापरून 532 आणि 600 nm वर शोषण मोजून रंगमापकाने निर्धारित केले गेले आणि नंतर nmol g−1 FW मध्ये व्यक्त केले गेले.
नॉन-एन्झायमॅटिक आणि एन्झायमॅटिक अँटिऑक्सिडंट्सच्या मूल्यांकनासाठी, उपचारांनंतर ७२ तासांनी (hpt) प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमधून पाने (वरच्या बाजूने दुसरे आणि तिसरे पूर्ण विकसित पान) गोळा करण्यात आली. प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमध्ये पाच कुंड्या होत्या (प्रत्येक कुंडीत दोन रोपे). प्रत्येक जैविक नमुन्याचे दोनदा विश्लेषण करण्यात आले (दोन तांत्रिक नमुने). दोन पाने द्रव नायट्रोजनमध्ये दळून एन्झायमॅटिक आणि नॉन-एन्झायमॅटिक अँटिऑक्सिडंट्स, एकूण अमिनो आम्ल, प्रोलाइनचे प्रमाण, जनुकीय अभिव्यक्ती आणि ऑक्झॅलेटचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी थेट वापरण्यात आली.
काहकोनेन आणि सहकाऱ्यांनी (१९९९) वर्णन केलेल्या पद्धतीत थोडे बदल करून, फोलिन-सिओकाल्टेउ अभिकर्मक (सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, एमओ, यूएसए) वापरून एकूण विद्राव्य फिनॉलिक्सचे प्रमाण निश्चित करण्यात आले. थोडक्यात, सुमारे ०.१ ग्रॅम एकजीव केलेल्या पानांच्या ऊतींचा अर्क २० मिली ८०% मिथेनॉलमध्ये २४ तास अंधारात काढण्यात आला आणि केंद्रापसारणानंतर वरचा द्रव गोळा करण्यात आला. नमुन्याच्या अर्काचे ०.१ मिली, ०.५ मिली फोलिन-सिओकाल्टेउ अभिकर्मक (१०%) मध्ये मिसळले, ३० सेकंद हलवले आणि ५ मिनिटे अंधारात ठेवले. त्यानंतर प्रत्येक नळीत ०.५ मिली २०% सोडियम कार्बोनेट द्रावण (Na2CO3; अल-गोम्होरिया फार्मास्युटिकल्स अँड मेडिकल सप्लाइज कंपनी, कैरो, इजिप्त) टाकले, ते पूर्णपणे मिसळले आणि खोलीच्या तापमानावर अंधारात १ तास उबवले. उष्मायनानंतर, UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाझू कॉर्पोरेशन, जपान) वापरून अभिक्रिया मिश्रणाचे शोषण 765 nm वर मोजण्यात आले. नमुना अर्कातील एकूण विद्राव्य फिनॉल्सची सांद्रता गॅलिक ॲसिड कॅलिब्रेशन कर्व्ह (फिशर सायंटिफिक, हॅम्पटन, एनएच, यूएसए) वापरून निर्धारित करण्यात आली आणि ती प्रति ग्रॅम ताज्या वजनानुसार मिलिग्रॅम गॅलिक ॲसिड समतुल्य (mg GAE g-1 fresh weight) म्हणून व्यक्त करण्यात आली.
एकूण विद्राव्य फ्लेव्होनॉइडचे प्रमाण जेरिडेन एट अल. (2006) यांच्या पद्धतीत किंचित सुधारणा करून निश्चित करण्यात आले. थोडक्यात, वरील मिथेनॉल अर्काचे 0.3 मिली, 5% ॲल्युमिनियम क्लोराईड द्रावणाच्या (AlCl3; फिशर सायंटिफिक, हॅम्पटन, एनएच, यूएसए) 0.3 मिलीमध्ये मिसळले, ते जोरदारपणे ढवळले आणि नंतर खोलीच्या तापमानावर 5 मिनिटे ठेवले. त्यानंतर, 10% पोटॅशियम ॲसिटेट द्रावणाचे (अल-गोम्होरिया फार्मास्युटिकल्स अँड मेडिकल सप्लाइज, कैरो, इजिप्त) 0.3 मिली त्यात टाकून, ते पूर्णपणे मिसळले आणि खोलीच्या तापमानावर अंधारात 30 मिनिटे ठेवले. ठेवल्यानंतर, UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाझू कॉर्पोरेशन, जपान) वापरून अभिक्रिया मिश्रणाची 430 nm वर शोषकता मोजण्यात आली. नमुना अर्कांमध्ये एकूण विद्राव्य फ्लेव्होनॉइड्सची सांद्रता रुटीन कॅलिब्रेशन वक्र (TCI अमेरिका, पोर्टलँड, ओआर, यूएसए) वापरून निर्धारित केली गेली आणि नंतर प्रति ग्रॅम ताज्या वजनात मिलिग्रॅम रुटीन समतुल्य (mg RE g-1 fresh weight) म्हणून व्यक्त केली गेली.
घेवड्याच्या पानांमधील एकूण मुक्त अमिनो आम्लाचे प्रमाण, योकोयामा आणि हिरामत्सु (२००३) यांनी प्रस्तावित केलेल्या आणि सन इत्यादी (२००६) यांनी सुधारित केलेल्या पद्धतीवर आधारित, एका सुधारित निन्हिड्रीन अभिकर्मकाचा (थर्मो सायंटिफिक केमिकल्स, वॉल्थम, एमए, यूएसए) वापर करून निश्चित करण्यात आले. थोडक्यात, ०.१ ग्रॅम दळलेल्या उतींचे pH ५.४ बफरने निष्कर्षण करण्यात आले, आणि २०० μL सुपरनॅटंटची २०० μL निन्हिड्रीन (२%) आणि २०० μL पायरीडीन (१०%; स्पेक्ट्रम केमिकल, न्यू ब्रन्सविक, एनजे, यूएसए) सोबत अभिक्रिया घडवून आणण्यात आली. हे मिश्रण ३० मिनिटांसाठी उकळत्या पाण्याच्या बाथमध्ये ठेवण्यात आले, नंतर थंड करून UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाझू कॉर्पोरेशन, जपान) वापरून ५८० nm वर मोजण्यात आले. दुसरीकडे, प्रोलाइनचे प्रमाण बेट्स पद्धतीनुसार (बेट्स इत्यादी, १९७३) निश्चित करण्यात आले. प्रोलाइनचे निष्कर्षण ३% सल्फोसॅलिसिलिक ॲसिड (थर्मो सायंटिफिक केमिकल्स, वॉल्थम, एमए, यूएसए) वापरून करण्यात आले आणि सेंट्रीफ्युगेशननंतर, ०.५ मिली सुपरनॅटंटमध्ये १ मिली ग्लेशियल ॲसिटिक ॲसिड (फिशर सायंटिफिक, हॅम्पटन, एनएच, यूएसए) आणि निन्हिड्रीन रिएजंट मिसळण्यात आले. हे मिश्रण ९०°C तापमानावर ४५ मिनिटांसाठी इनक्युबेट करून, थंड करण्यात आले आणि वर नमूद केलेल्या त्याच स्पेक्ट्रोफोटोमीटरचा वापर करून ५२० एनएमवर मोजण्यात आले. पानांच्या अर्कातील एकूण मुक्त अमिनो ॲसिड आणि प्रोलाइन यांचे निर्धारण अनुक्रमे ग्लायसीन आणि प्रोलाइन कॅलिब्रेशन कर्व्ह (सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, एमओ, यूएसए) वापरून करण्यात आले आणि ते मिलीग्रॅम/ग्रॅम ताज्या वजनात व्यक्त करण्यात आले.
अँटिऑक्सिडेंट एन्झाइम्सची एन्झायमॅटिक क्रियाशीलता निश्चित करण्यासाठी, अंदाजे 500 मिलीग्राम एकजीव केलेल्या ऊतींचे 3 मिली 50 mM ट्रिस बफर (pH 7.8) मध्ये 1 mM EDTA-Na2 (सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, MO, USA) आणि 7.5% पॉलीविनाइलपायरोलिडोन (PVP; सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, MO, USA) वापरून निष्कर्षण करण्यात आले, रेफ्रिजरेशन (4 °C) अंतर्गत 20 मिनिटांसाठी 10,000 × g वर सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले आणि सुपरनॅटंट (कच्चा एन्झाइम अर्क) गोळा करण्यात आला (एल-नागर एट अल., 2023; उस्मान एट अल., 2023). त्यानंतर, एईबी (१९८४) यांच्या पद्धतीत किंचित सुधारणा करून (एल-नागर इत्यादी, २०२३; उस्मान इत्यादी, २०२३) कॅटलेज (CAT) ची विकर क्रियाशीलता निश्चित करण्यासाठी, त्याची अभिक्रिया २ मिली ०.१ M सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच ६.५; सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, एमओ, यूएसए) आणि १०० μl २६९ mM H2O2 द्रावणासोबत करण्यात आली. ग्वायकोल-डिपेंडेंट पेरॉक्सिडेज (POX) विकर क्रियाशीलता हॅरॅक इत्यादी (२००९) यांच्या पद्धतीचा वापर करून निश्चित करण्यात आली. (२००८) मध्ये किरकोळ बदल करून (एल-नागर आणि इतर, २०२३; उस्मान आणि इतर, २०२३) आणि २.२ मिली १०० एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच ६.०), १०० मायक्रोलिटर ग्वायकोल (टीसीआय केमिकल्स, पोर्टलँड, ओआर, यूएसए) आणि १०० मायक्रोलिटर १२ एमएम एच२ओ२ यांच्यासोबत अभिक्रिया झाल्यानंतर पॉलीफेनॉल ऑक्सिडेस (पीपीओ) ची एन्झाइमॅटिक क्रियाशीलता निश्चित करण्यात आली. ही पद्धत (एल-नागर आणि इतर, २०२३; उस्मान आणि इतर, २०२३) मधून किंचित सुधारित केली गेली होती. ०.१ एम फॉस्फेट बफर (पीएच ६.०) मध्ये ताज्या तयार केलेल्या ३ मिली कॅटेकोल द्रावणासोबत (थर्मो सायंटिफिक केमिकल्स, वॉल्थम, एमए, यूएसए) (०.०१ एम) अभिक्रिया झाल्यानंतर ही चाचणी करण्यात आली. UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाझू, जपान) वापरून 3 मिनिटांसाठी दर 30 सेकंदांनी, 240 nm (A240) वर H2O2 च्या विघटनाचे निरीक्षण करून CAT क्रियाकलाप मोजला गेला, 436 nm (A436) वर शोषण वाढीचे निरीक्षण करून POX क्रियाकलाप मोजला गेला आणि 495 nm (A495) वर शोषण चढउतार नोंदवून PPO क्रियाकलाप मोजला गेला.
शेवटच्या उपचारानंतर ७२ तासांनी, घेवड्याच्या पानांमध्ये (वरच्या बाजूने दुसरे आणि तिसरे पूर्ण विकसित पान) पेरॉक्सिसोमल कॅटलेज (PvCAT1; जेनबँक ॲक्सेशन क्र. KF033307.1), सुपरऑक्साइड डिसम्युटेज (PvSOD; जेनबँक ॲक्सेशन क्र. XM_068639556.1), आणि ग्लुटाथिओन रिडक्टेज (PvGR; जेनबँक ॲक्सेशन क्र. KY195009.1) या तीन अँटिऑक्सिडेंट-संबंधित जनुकांच्या ट्रान्सक्रिप्ट पातळी शोधण्यासाठी रिअल-टाइम आरटी-पीसीआरचा वापर करण्यात आला. थोडक्यात, उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार सिम्पली पी टोटल आरएनए एक्सट्रॅक्शन किट (कॅट. क्र. BSC52S1; बायोफ्लक्स, बायोरी टेक्नॉलॉजी, चीन) वापरून आरएनए वेगळा करण्यात आला. त्यानंतर, उत्पादकाच्या सूचनांनुसार टॉप स्क्रिप्ट™ सीडीएनए सिंथेसिस किट वापरून सीडीएनए संश्लेषित करण्यात आला. वरील तीन जनुकांच्या प्रायमर सिक्वेन्स पूरक सारणी S3 मध्ये सूचीबद्ध आहेत. PvActin-3 (GenBank प्रवेश क्रमांक: XM_068616709.1) हे हाऊसकीपिंग जीन म्हणून वापरले गेले आणि 2-ΔΔCT पद्धतीचा वापर करून सापेक्ष जीन अभिव्यक्तीची गणना केली गेली (लिव्हॅक आणि श्मिटगेन, २००१). जैविक ताण (सामान्य कडधान्ये आणि अँथ्रॅकनोज बुरशी Colletotrichum lindemuthianum यांच्यातील विसंगत आंतरक्रिया) आणि अजैविक ताण (दुष्काळ, क्षारता, कमी तापमान) अंतर्गत अॅक्टिनची स्थिरता दर्शविली गेली (बोर्जेस इत्यादी, २०१२).
आम्ही सुरुवातीला प्रोटीन-प्रोटीन BLAST टूल (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) वापरून S. sclerotiorum मधील ऑक्सॅलोॲसिटेट ॲसिटिलहायड्रोलेज (OAH) प्रथिनांचे जीनोम-व्यापी इन सिलिको विश्लेषण केले. थोडक्यात, S. sclerotiorum (taxide: 5180) मधील समरूप प्रथिनाचे मॅपिंग करण्यासाठी आम्ही Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank accession number XP_040799428.1; 342 amino acids) आणि Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank accession number XP_056833920.1; 316 amino acids) मधील OAH चा क्वेरी सिक्वेन्स म्हणून वापर केला. नॅशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नॉलॉजी इन्फॉर्मेशन (NCBI) च्या वेबसाइट http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ वरील GenBank मध्ये सर्वात अलीकडे उपलब्ध असलेल्या S. sclerotiorum जीनोम डेटा विरुद्ध BLASTp केले गेले.
याव्यतिरिक्त, S. sclerotiorum मधील अंदाजित OAH जनुक (SsOAH) आणि A. fijiensis CBS 313.89 मधील AfOAH व P. lagena मधील PlOAH यांचे उत्क्रांती विश्लेषण आणि फायलोजेनेटिक ट्री हे MEGA11 (Tamura et al., 2021) मध्ये मॅक्सिमम लाइकलीहुड पद्धत आणि JTT मॅट्रिक्स-आधारित मॉडेल (Jones et al., 1992) वापरून अनुमानित करण्यात आले. फायलोजेनेटिक ट्रीला, कन्स्ट्रेंट-बेस्ड अलाइनमेंट टूल (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007) वापरून, S. sclerotiorum मधील सर्व अंदाजित OAH जनुकांच्या (SsOAH) आणि क्वेरी सिक्वेन्सच्या प्रोटीन सिक्वेन्सच्या मल्टिपल अलाइनमेंट विश्लेषणासोबत एकत्रित करण्यात आले. याव्यतिरिक्त, S. sclerotiorum मधील SsOAH चे सर्वोत्तम जुळणारे अमिनो आम्ल अनुक्रम ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) वापरून क्वेरी अनुक्रमांसह (AfOAH आणि PlOAH) (Larkin et al., 2007) संरेखित केले गेले आणि संरेखनातील संरक्षित प्रदेश ESPript टूल (आवृत्ती 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) वापरून दृश्यमान केले गेले.
शिवाय, इंटरप्रो टूल (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (ब्लम एट अल., २०२१) वापरून एस. स्क्लेरोटिओरम एसओएएचच्या अंदाजित कार्यात्मक प्रतिनिधी डोमेन आणि संरक्षित स्थळांचे वेगवेगळ्या कुटुंबांमध्ये परस्परसंवादीपणे वर्गीकरण करण्यात आले. शेवटी, प्रोटीन होमोलॉजी/ॲनालॉजी रेकग्निशन इंजिन (फायर२ सर्व्हर आवृत्ती २.०; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (केली एट अल., २०१५) वापरून अंदाजित एस. स्क्लेरोटिओरम एसओएएचचे त्रिमितीय (3D) संरचना मॉडेलिंग करण्यात आले आणि स्विस-मॉडेल सर्व्हर (https://swissmodel.expasy.org/) (बायसिनी एट अल., २०१४) वापरून त्याची पडताळणी करण्यात आली. अंदाजित त्रिमितीय संरचना (PDB स्वरूप) UCSF-Chimera पॅकेज (आवृत्ती 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004) वापरून परस्परसंवादीपणे दृश्यमान केल्या गेल्या.
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरमच्या मायसेलियामधील ऑक्सॅलोॲसिटेट ॲसिटिलहायड्रोलेज (SsOAH; जेनबँक ॲक्सेशन क्रमांक: XM_001590428.1) चे ट्रान्सक्रिप्शनल स्तर निश्चित करण्यासाठी क्वांटिटेटिव्ह रिअल-टाइम फ्लुरोसेन्स पीसीआरचा वापर करण्यात आला. थोडक्यात, मायसेलियाच्या वाढीस चालना देण्यासाठी, एस. स्क्लेरोटिओरम PDB असलेल्या एका फ्लास्कमध्ये इनोक्युलेट करून एका शेकिंग इनक्यूबेटरमध्ये (मॉडेल: I2400, न्यू ब्रन्सविक सायंटिफिक कं., एडिसन, एनजे, यूएसए) २५ ± २ °C तापमानावर १५० rpm वेगाने २४ तास आणि सतत अंधारात (२४ तास) ठेवण्यात आले. त्यानंतर, पेशींवर एल-ऑर्निथिन आणि बुरशीनाशक रायझोलेक्स-टी यांची अंतिम IC50 सांद्रतेवर (अनुक्रमे अंदाजे ४० आणि ३.२ मिग्रॅ/लिटर) प्रक्रिया करण्यात आली आणि नंतर त्याच परिस्थितीत आणखी २४ तास संवर्धित करण्यात आले. उष्मायनानंतर, कल्चरला ५ मिनिटांसाठी २५०० आरपीएमवर सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले आणि जीन एक्सप्रेशन विश्लेषणासाठी सुपरनॅटंट (बुरशीचे मायसेलियम) गोळा करण्यात आले. त्याचप्रमाणे, संसर्गानंतर ०, २४, ४८, ७२, ९६ आणि १२० तासांनी, संसर्ग झालेल्या उतींच्या पृष्ठभागावर पांढरी बुरशी आणि कापसासारखे मायसेलियम तयार झालेल्या संसर्गित वनस्पतींमधून बुरशीचे मायसेलियम गोळा करण्यात आले. बुरशीच्या मायसेलियममधून आरएनए काढण्यात आले आणि नंतर वर वर्णन केल्याप्रमाणे सीडीएनए संश्लेषित करण्यात आले. SsOAH साठी प्रायमर सिक्वेन्सेस पूरक सारणी S3 मध्ये सूचीबद्ध आहेत. SsActin (GenBank ॲक्सेशन क्रमांक: XM_001589919.1) हे हाउसकीपिंग जीन म्हणून वापरण्यात आले, आणि २-ΔΔCT पद्धत (लिव्हॅक आणि श्मिटगेन, २००१) वापरून सापेक्ष जीन एक्सप्रेशनची गणना करण्यात आली.
शू आणि झांग (2000) यांच्या पद्धतीत थोडे बदल करून, पोटॅटो डेक्स्ट्रोज ब्रॉथ (PDB) आणि स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम (Sclerotinia sclerotiorum) या बुरशीजन्य रोगकारक असलेल्या वनस्पतींच्या नमुन्यांमध्ये ऑक्सॅलिक ॲसिडचे निर्धारण करण्यात आले. थोडक्यात, एस. स्क्लेरोटिओरमचे आयसोलेट्स PDB असलेल्या फ्लास्कमध्ये टाकण्यात आले आणि नंतर मायसेलियल वाढीस चालना देण्यासाठी त्यांना सतत अंधारात (24 तास) 25 ± 2 °C तापमानावर 150 rpm वेगाने हलणाऱ्या इनक्यूबेटरमध्ये (मॉडेल I2400, न्यू ब्रन्सविक सायंटिफिक कं., एडिसन, एनजे, यूएसए) 3-5 दिवसांसाठी संवर्धित करण्यात आले. इनक्यूबेशननंतर, बुरशीचे कल्चर प्रथम व्हॉटमन #1 फिल्टर पेपरमधून गाळण्यात आले आणि नंतर उर्वरित मायसेलियम काढून टाकण्यासाठी 5 मिनिटांसाठी 2500 rpm वेगाने सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले. सुपरनॅटंट गोळा करून ऑक्सॅलेटच्या पुढील परिमाणात्मक निर्धारणासाठी 4°C तापमानावर साठवण्यात आले. वनस्पतींचे नमुने तयार करण्यासाठी, सुमारे ०.१ ग्रॅम वनस्पती ऊतींचे तुकडे डिस्टिल्ड वॉटरने (प्रत्येक वेळी २ मिली) तीन वेळा काढण्यात आले. त्यानंतर हे नमुने २५०० आरपीएमवर ५ मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले, आणि त्यातील वरचा द्रव (सुपरनॅटंट) व्हॉटमन क्र. १ फिल्टर पेपरमधून कोरडा गाळून पुढील विश्लेषणासाठी गोळा करण्यात आला.
ऑक्झॅलिक ॲसिडच्या परिमाणात्मक विश्लेषणासाठी, अभिक्रिया मिश्रण एका काचेच्या बूच लावलेल्या नळीमध्ये खालील क्रमाने तयार करण्यात आले: ०.२ मिली नमुना (किंवा PDB कल्चर फिल्ट्रेट किंवा ऑक्झॅलिक ॲसिड मानक द्रावण), ०.११ मिली ब्रोमोफेनॉल ब्लू (BPB, १ mM; फिशर केमिकल, पिट्सबर्ग, PA, USA), ०.१९८ मिली १ M सल्फ्यूरिक ॲसिड (H2SO4; अल-गोम्होरिया फार्मास्युटिकल्स अँड मेडिकल सप्लाइज, कैरो, इजिप्त) आणि ०.१७६ मिली १०० mM पोटॅशियम डायक्रोमेट (K2Cr2O7; TCI केमिकल्स, पोर्टलँड, OR, USA). त्यानंतर हे द्रावण डिस्टिल्ड वॉटरने ४.८ मिलीपर्यंत विरल करून, जोरदारपणे मिसळले गेले आणि ताबडतोब ६० °C पाण्याच्या बाथमध्ये ठेवले गेले. १० मिनिटांनंतर, ०.५ मिली सोडियम हायड्रॉक्साइड द्रावण (NaOH; ०.७५ M) टाकून अभिक्रिया थांबवण्यात आली. अभिक्रिया मिश्रणाचे शोषण (A600) ६०० nm वर UV-160 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाझू कॉर्पोरेशन, जपान) वापरून मोजण्यात आले. कल्चर फिल्ट्रेट्स आणि वनस्पती नमुन्यांच्या प्रमाणीकरणासाठी अनुक्रमे PDB आणि डिस्टिल्ड वॉटर नियंत्रक म्हणून वापरण्यात आले. कल्चर फिल्ट्रेट्समधील ऑक्झॅलिक ॲसिडची सांद्रता, जी PDB माध्यमाच्या प्रति मिलिलिटर मायक्रोग्रॅम ऑक्झॅलिक ॲसिड (μg.mL−1) मध्ये व्यक्त केली आहे, आणि पानांच्या अर्कातील सांद्रता, जी ताज्या वजनाच्या प्रति ग्रॅम मायक्रोग्रॅम ऑक्झॅलिक ॲसिड (μg.g−1 FW) मध्ये व्यक्त केली आहे, ती ऑक्झॅलिक ॲसिड कॅलिब्रेशन कर्व्ह (थर्मो फिशर सायंटिफिक केमिकल्स, वॉल्थम, एमए, यूएसए) वापरून निश्चित करण्यात आली.
संपूर्ण अभ्यासादरम्यान, अन्यथा नमूद केल्याशिवाय, सर्व प्रयोग पूर्णपणे यादृच्छिक रचनेत (CRD) तयार केले गेले होते, ज्यात प्रत्येक उपचारासाठी सहा जैविक प्रतिकृती आणि प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीसाठी पाच कुंड्या (प्रत्येक कुंडीत दोन रोपे) होत्या. जैविक प्रतिकृतींचे विश्लेषण दोनदा (दोन तांत्रिक प्रतिकृती) केले गेले. तांत्रिक प्रतिकृतींचा वापर त्याच प्रयोगाची पुनरुत्पादकता तपासण्यासाठी केला गेला, परंतु खोट्या प्रतिकृती टाळण्यासाठी सांख्यिकीय विश्लेषणात त्यांचा वापर केला गेला नाही. डेटाचे सांख्यिकीय विश्लेषण विचलन विश्लेषण (ANOVA) वापरून केले गेले, त्यानंतर ट्युकी-क्रेमर प्रामाणिकपणे महत्त्वपूर्ण फरक (HSD) चाचणी (p ≤ 0.05) केली गेली. इन विट्रो प्रयोगांसाठी, IC50 आणि IC99 मूल्यांची गणना प्रोबिट मॉडेल वापरून केली गेली आणि 95% विश्वासार्हता अंतराल मोजले गेले.
इजिप्तमधील एल घाबिया गव्हर्नरेटमधील वेगवेगळ्या सोयाबीन शेतांमधून एकूण चार आयसोलेट्स (विलग केलेले नमुने) गोळा करण्यात आले. PDA माध्यमावर, सर्व आयसोलेट्सनी क्रीम रंगाचे पांढरे मायसेलियम तयार केले, जे लवकरच कापसासारखे पांढरे (आकृती 1A) आणि नंतर स्क्लेरोशियम अवस्थेत बेज किंवा तपकिरी रंगाचे झाले. स्क्लेरोशिया सामान्यतः दाट, काळे, गोलाकार किंवा अनियमित आकाराचे, 5.2 ते 7.7 मिमी लांब आणि 3.4 ते 5.3 मिमी व्यासाचे असतात (आकृती 1B). 25 ± 2 °C तापमानावर 10-12 दिवसांच्या इनक्युबेशननंतर चारही आयसोलेट्सनी कल्चर माध्यमाच्या कडेला स्क्लेरोशियाची एक सीमांत रचना विकसित केली असली तरी (आकृती 1A), त्यांच्यामध्ये प्रति प्लेट स्क्लेरोशियाची संख्या लक्षणीयरीत्या भिन्न होती (P < 0.001), ज्यामध्ये आयसोलेट 3 मध्ये स्क्लेरोशियाची संख्या सर्वाधिक होती (प्रति प्लेट 32.33 ± 1.53 स्क्लेरोशिया; आकृती 1C). त्याचप्रमाणे, आयसोलेट #3 ने PDB मध्ये इतर आयसोलेट्सपेक्षा जास्त ऑक्झॅलिक ॲसिड तयार केले (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; आकृती 1D). आयसोलेट #3 ने स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम या वनस्पती रोगकारक बुरशीची वैशिष्ट्यपूर्ण आकारिक आणि सूक्ष्मदर्शी गुणधर्म दर्शविले. उदाहरणार्थ, PDA वर, आयसोलेट #3 च्या वसाहती वेगाने वाढल्या, त्या मलईदार पांढऱ्या (आकृती 1A), उलट्या बाजूने बेज किंवा फिकट सॅल्मन पिवळसर-तपकिरी रंगाच्या होत्या आणि 9 सेमी व्यासाच्या प्लेटचा पृष्ठभाग पूर्णपणे व्यापण्यासाठी त्यांना 25 ± 2°C तापमानात 6-7 दिवस लागले. वरील आकारिक आणि सूक्ष्मदर्शी गुणधर्मांच्या आधारावर, आयसोलेट #3 ची ओळख स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम म्हणून पटली.
आकृती १. सामान्य कडधान्य पिकांमधील एस. स्क्लेरोटिओरम आयसोलेट्सची वैशिष्ट्ये आणि रोगजनकता. (अ) पीडीए माध्यमावर चार एस. स्क्लेरोटिओरम आयसोलेट्सची मायसेलियल वाढ, (ब) चार एस. स्क्लेरोटिओरम आयसोलेट्सचे स्क्लेरोशिया, (क) स्क्लेरोशियाची संख्या (प्रति प्लेट), (ड) पीडीबी माध्यमावर ऑक्झॅलिक ॲसिडचा स्राव (μg.mL−1), आणि (इ) ग्रीनहाऊस परिस्थितीत संवेदनशील व्यावसायिक कडधान्य वाण 'गिझा ३' वरील चार एस. स्क्लेरोटिओरम आयसोलेट्सच्या रोगाची तीव्रता (%). मूल्ये पाच जैविक प्रतिकृतींचे (n = 5) सरासरी ± एसडी दर्शवतात. भिन्न अक्षरे उपचारांमधील सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण फरक (p < 0.05) दर्शवतात. (फ–ह) आयसोलेट #३ सह इनोक्युलेशननंतर १० दिवसांनी (dpi), अनुक्रमे जमिनीवरील खोडांवर आणि शेंगांवर पांढऱ्या बुरशीची वैशिष्ट्यपूर्ण लक्षणे दिसली. (I) मॅक्सिमम लाइकलीहुड पद्धतीचा वापर करून एस. स्क्लेरोटिओरम आयसोलेट #3 च्या इंटरनल ट्रान्स्क्राइब्ड स्पेसर (ITS) क्षेत्राचे उत्क्रांतीविषयक विश्लेषण करण्यात आले आणि नॅशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नॉलॉजी इन्फॉर्मेशन (NCBI) डेटाबेस (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) मधून मिळवलेल्या 20 संदर्भ आयसोलेट्स/स्ट्रेन्सशी त्याची तुलना करण्यात आली. क्लस्टरिंग रेषांच्या वरील संख्या क्षेत्राचे कव्हरेज (%) दर्शवतात आणि क्लस्टरिंग रेषांच्या खालील संख्या शाखेची लांबी दर्शवतात.
शिवाय, रोगजनकतेची पुष्टी करण्यासाठी, प्राप्त केलेले चार एस. स्क्लेरोटिओरम आयसोलेट्स (विलग केलेले नमुने) ग्रीनहाऊस परिस्थितीत संवेदनशील व्यावसायिक घेवड्याच्या 'गिझा ३' या जातीवर संक्रमित करण्यात आले, जे कोचच्या गृहितकांशी सुसंगत आहे (आकृती १इ). जरी प्राप्त केलेले सर्व बुरशीजन्य आयसोलेट्स रोगजनक होते आणि हिरव्या घेवड्याच्या (जाती गिझा ३) रोपांना संक्रमित करू शकत होते, ज्यामुळे संसर्गानंतर १० दिवसांनी (डीपीआय) जमिनीवरील सर्व भागांवर (आकृती १एफ), विशेषतः खोडांवर (आकृती १जी) आणि शेंगांवर (आकृती १एच) पांढऱ्या बुरशीची वैशिष्ट्यपूर्ण लक्षणे दिसून आली, तरी दोन स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये आयसोलेट ३ हा सर्वात आक्रमक आयसोलेट ठरला. घेवड्याच्या रोपांवर आयसोलेट ३ मुळे रोगाची तीव्रता (%) सर्वाधिक होती (अनुक्रमे संसर्गानंतर ७, १४ आणि २१ दिवसांनी २४.० ± ४.०, ५८.० ± २.० आणि ७६.७ ± ३.१; आकृती १एफ).
सर्वात आक्रमक एस. स्क्लेरोटिओरम आयसोलेट #3 ची ओळख इंटरनल ट्रान्स्क्राइब्ड स्पेसर (ITS) सिक्वेन्सिंगच्या आधारे अधिक निश्चित करण्यात आली (आकृती 1I). आयसोलेट #3 आणि 20 संदर्भ आयसोलेट्स/स्ट्रेन्स यांच्यातील फायलोजेनेटिक विश्लेषणाने त्यांच्यामध्ये उच्च समानता (>99%) दर्शविली. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की एस. स्क्लेरोटिओरम आयसोलेट #3 (533 bp) मध्ये सुक्या वाटाण्याच्या बियांमधून वेगळे केलेल्या अमेरिकन एस. स्क्लेरोटिओरम आयसोलेट LPM36 (GenBank ॲक्सेशन क्रमांक MK896659.1; 540 bp) आणि व्हायलेट (Matthiola incana) खोड कुजण्यास कारणीभूत असलेल्या चायनीज एस. स्क्लेरोटिओरम आयसोलेट YKY211 (GenBank ॲक्सेशन क्रमांक OR206374.1; 548 bp) यांच्याशी उच्च समानता आहे, जे सर्व डेंड्रोग्रामच्या शीर्षस्थानी स्वतंत्रपणे गटबद्ध केलेले आहेत (आकृती 1I). नवीन अनुक्रम NCBI डेटाबेसमध्ये जमा करण्यात आला आहे आणि त्याला “स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम – आयसोलेट YN-25” (GenBank ॲक्सेशन क्रमांक PV202792) असे नाव देण्यात आले आहे. असे दिसून येते की आयसोलेट ३ हा सर्वात जास्त आक्रमक आयसोलेट आहे; त्यामुळे, पुढील सर्व प्रयोगांमध्ये अभ्यासासाठी याच आयसोलेटची निवड करण्यात आली.
डायअमाइन एल-ऑर्निथिन (सिग्मा-अल्ड्रिच, डार्मस्टॅड, जर्मनी) च्या वेगवेगळ्या सांद्रतांवर (१२.५, २५, ५०, ७५, १०० आणि १२५ मिग्रॅ/लिटर) एस. स्क्लेरोटिओरम आयसोलेट ३ विरुद्धची प्रतिजैविक क्रियाशीलता इन विट्रो तपासण्यात आली. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की एल-ऑर्निथिनने प्रतिजैविक प्रभाव दर्शवला आणि डोस-आधारित पद्धतीने एस. स्क्लेरोटिओरम हायफीची त्रिज्यीय वाढ हळूहळू रोखली (आकृती २अ, ब). तपासलेल्या सर्वोच्च सांद्रतेवर (१२५ मिग्रॅ/लिटर), एल-ऑर्निथिनने मायसेलियल वाढ रोखण्याचा सर्वाधिक दर (९९.६२ ± ०.२७%; आकृती २ब) दर्शवला, जो व्यावसायिक बुरशीनाशक रिझोलेक्स-टी (रोखण्याचा दर ९९.४५ ± ०.३९%; आकृती २क) च्या तपासलेल्या सर्वोच्च सांद्रतेवरील (१० मिग्रॅ/लिटर) दराच्या समतुल्य होता, जे समान परिणामकारकता दर्शवते.
आकृती २. स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम विरुद्ध एल-ऑर्निथिनची इन विट्रो जीवाणूविरोधी क्रियाशीलता. (अ) एस. स्क्लेरोटिओरम विरुद्ध एल-ऑर्निथिनच्या विविध सांद्रतांच्या जीवाणूविरोधी क्रियाशीलतेची व्यावसायिक बुरशीनाशक रायझोलेक्स-टी (१० मिग्रॅ/लिटर) सोबत तुलना. (ब, क) अनुक्रमे एल-ऑर्निथिनच्या (१२.५, २५, ५०, ७५, १०० आणि १२५ मिग्रॅ/लिटर) किंवा रायझोलेक्स-टीच्या (२, ४, ६, ८ आणि १० मिग्रॅ/लिटर) विविध सांद्रतांनी उपचार केल्यानंतर एस. स्क्लेरोटिओरमच्या मायसेलियल वाढीचा प्रतिबंध दर (%). मूल्ये पाच जैविक प्रतिकृतींचे (n = ५) सरासरी ± प्रमाण विचलन (SD) दर्शवतात. भिन्न अक्षरे उपचारांमधील सांख्यिकीय फरक (p < ०.०५) दर्शवतात. (ड, इ) अनुक्रमे एल-ऑर्निथिन आणि व्यावसायिक बुरशीनाशक रायझोलेक्स-टी यांचे प्रोबिट मॉडेल रिग्रेशन विश्लेषण. प्रोबिट मॉडेल रिग्रेशन रेषा भरीव निळ्या रेषेने दर्शविली आहे, आणि विश्वासार्हता मध्यांतर (95%) तुटक लाल रेषेने दर्शविले आहे.
याव्यतिरिक्त, प्रोबिट रिग्रेशन विश्लेषण केले गेले आणि संबंधित आलेख तक्ता 1 आणि आकृत्या 2D,E मध्ये दर्शविले आहेत. थोडक्यात, एल-ऑर्निथिनच्या स्वीकार्य स्लोप मूल्याने (y = 2.92x − 4.67) आणि संबंधित महत्त्वपूर्ण सांख्यिकीने (कॉक्स आणि स्नेल R2 = 0.3709, नेगेलकेर्क R2 = 0.4998 आणि p < 0.0001; आकृती 2D) व्यावसायिक बुरशीनाशक रिझोलेक्स-टीच्या तुलनेत (y = 1.96x − 0.99, कॉक्स आणि स्नेल R2 = 0.1242, नेगेलकेर्क R2 = 0.1708 आणि p < 0.0001) (तक्ता 1) एस. स्क्लेरोटिओरम विरुद्ध वर्धित बुरशीनाशक क्रिया दर्शविली.
तक्ता १. एस. स्क्लेरोटिओरम विरुद्ध एल-ऑर्निथिन आणि व्यावसायिक बुरशीनाशक “रिझोलेक्स-टी” यांच्या अर्ध-अधिकतम प्रतिबंधक सांद्रता (IC50) आणि IC99 (mg/l) च्या किमती.
एकंदरीत, उपचार न केलेल्या एस. स्क्लेरोटिओरम-संक्रमित वनस्पतींच्या (नियंत्रण; आकृती 3A) तुलनेत, एल-ऑर्निथिन (250 मिग्रॅ/लिटर) ने उपचार केलेल्या सामान्य वाटाण्याच्या वनस्पतींवरील पांढऱ्या बुरशीचा विकास आणि तीव्रता लक्षणीयरीत्या कमी केली. थोडक्यात, जरी उपचार न केलेल्या संक्रमित नियंत्रण वनस्पतींमधील रोगाची तीव्रता हळूहळू वाढत गेली (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, आणि 92.33 ± 3.06%), तरी एल-ऑर्निथिनने संपूर्ण प्रयोगादरम्यान रोगाची तीव्रता (%) लक्षणीयरीत्या कमी केली (उपचारानंतर अनुक्रमे 7, 14 आणि 21 दिवसांनी 8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, आणि 26.36 ± 3.07) (आकृती 3A). त्याचप्रमाणे, जेव्हा एस. स्क्लेरोटिओरम-संक्रमित घेवड्याच्या रोपांवर २५० मिग्रॅ/लि एल-ऑर्निथिनने उपचार केले गेले, तेव्हा रोग प्रगती वक्राखालील क्षेत्र (AUDPC) उपचार न केलेल्या नियंत्रणातील १२७४.३३ ± ३३.१३ वरून २८१.०३ ± ७.९५ पर्यंत कमी झाले, जे सकारात्मक नियंत्रण ५० मिग्रॅ/लि रायझोलेक्स-टी बुरशीनाशकाच्या (१८३.६१ ± ७.७१; आकृती ३बी) तुलनेत किंचित कमी होते. दुसऱ्या प्रयोगातही हाच कल दिसून आला.
आकृती ३. हरितगृह परिस्थितीत स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरममुळे होणाऱ्या घेवड्याच्या पांढऱ्या कुजव्या रोगाच्या विकासावर एल-ऑर्निथिनच्या बाह्य वापराचा परिणाम. (अ) २५० मिग्रॅ/लि एल-ऑर्निथिनने उपचार केल्यानंतर घेवड्याच्या पांढऱ्या बुरशीच्या रोगाचा प्रगती वक्र. (ब) एल-ऑर्निथिनने उपचार केल्यानंतर घेवड्याच्या पांढऱ्या बुरशीच्या रोगाचा प्रगती वक्राखालील क्षेत्र (AUDPC). मूल्ये पाच जैविक प्रतिकृतींची सरासरी ± प्रमाण विचलन (n = 5) दर्शवतात. भिन्न अक्षरे उपचारांमधील सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण फरक (p < 0.05) दर्शवतात.
250 mg/L एल-ऑर्निथिनच्या बाह्य वापरामुळे 42 दिवसांनंतर वनस्पतीची उंची (आकृती 4A), प्रति वनस्पती फांद्यांची संख्या (आकृती 4B) आणि प्रति वनस्पती पानांची संख्या (आकृती 4C) हळूहळू वाढली. अभ्यासलेल्या सर्व पोषणविषयक मापदंडांवर व्यावसायिक बुरशीनाशक रायझोलेक्स-टी (50 mg/L) चा सर्वात मोठा परिणाम दिसून आला, तर उपचार न केलेल्या नियंत्रणांच्या तुलनेत 250 mg/L एल-ऑर्निथिनच्या बाह्य वापराचा दुसरा सर्वात मोठा परिणाम दिसून आला (आकृती 4A–C). दुसरीकडे, एल-ऑर्निथिन उपचाराचा प्रकाशसंश्लेषक रंगद्रव्ये क्लोरोफिल ए (आकृती ४डी) आणि क्लोरोफिल बी (आकृती ४ई) यांच्या प्रमाणावर कोणताही लक्षणीय परिणाम झाला नाही, परंतु नकारात्मक नियंत्रण (०.४४ ± ०.०२ मिग्रॅ/ग्रॅम ताजे वजन) आणि सकारात्मक नियंत्रण (०.४६ ± ०.०२ मिग्रॅ/ग्रॅम ताजे वजन; आकृती ४एफ) यांच्या तुलनेत एकूण कॅरोटीनॉइडचे प्रमाण (०.५६ ± ०.०३ मिग्रॅ/ग्रॅम ताजे वजन) किंचित वाढले. एकंदरीत, हे परिणाम सूचित करतात की एल-ऑर्निथिन उपचारित कडधान्यांसाठी वनस्पती-विषारी नाही आणि उलट त्यांच्या वाढीस चालना देऊ शकते.
आकृती ४. हरितगृह परिस्थितीत स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरमने संक्रमित घेवड्याच्या पानांच्या वाढीची वैशिष्ट्ये आणि प्रकाशसंश्लेषक रंगद्रव्यांवर बाह्य एल-ऑर्निथिनच्या वापराचा परिणाम. (अ) वनस्पतीची उंची (सेमी), (ब) प्रति वनस्पती फांद्यांची संख्या, (क) प्रति वनस्पती पानांची संख्या, (ड) क्लोरोफिल 'अ' चे प्रमाण (मिग्रॅ ग्रॅम-१ ताजे वजन), (इ) क्लोरोफिल 'ब' चे प्रमाण (मिग्रॅ ग्रॅम-१ ताजे वजन), (फ) एकूण कॅरोटीनॉइडचे प्रमाण (मिग्रॅ ग्रॅम-१ ताजे वजन). मूल्ये पाच जैविक प्रतिकृतींची सरासरी ± प्रमाण विचलन (n = 5) आहेत. भिन्न अक्षरे उपचारांमधील सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण फरक दर्शवतात (p < 0.05).
प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजाती (ROS; हायड्रोजन पेरॉक्साइड [H2O2] म्हणून व्यक्त) आणि मुक्त रॅडिकल्स (सुपरऑक्साइड ॲनायन [O2•−] म्हणून व्यक्त) यांच्या इन सिटू हिस्टोकेमिकल स्थानिकीकरणावरून असे दिसून आले की, एल-ऑर्निथिनच्या (250 mg/L) बाह्य वापरामुळे, उपचार न केलेल्या संक्रमित वनस्पती (अनुक्रमे 173.31 ± 12.06 आणि 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) आणि 50 mg/L व्यावसायिक बुरशीनाशक रायझोलेक्स-टी ने उपचार केलेल्या वनस्पती (170.12 ± 9.50 आणि 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) या दोन्हींच्या संचयाच्या तुलनेत, H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; आकृती 5A) आणि O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; आकृती 5B) यांचा संचय लक्षणीयरीत्या कमी झाला. ७२ तासांनंतर, अनुक्रमे १५७.०० ± ७.८१ nmol.g−1 fr wt) H2O2 आणि O2•− चे उच्च प्रमाण जमा झाले (आकृती ५अ, ब). त्याचप्रमाणे, TCA-आधारित मॅलॉन्डियलडिहाइड (MDA) चाचणीने दाखवले की S. sclerotiorum-संक्रमित घेवड्याच्या रोपांच्या पानांमध्ये MDA चे उच्च प्रमाण (११३.४८ ± १०.०२ nmol.g fr wt) जमा झाले (आकृती ५क). तथापि, L-ऑर्निथिनच्या बाह्य वापरामुळे लिपिड पेरोक्सिडेशन लक्षणीयरीत्या कमी झाले, जे उपचारित रोपांमधील MDA च्या प्रमाणात झालेल्या घटीवरून (३३.०८ ± ४.०० nmol.g fr wt) दिसून आले.
आकृती ५. हरितगृह परिस्थितीत संसर्गानंतर ७२ तासांनी एस. स्क्लेरोटिओरमने संक्रमित झालेल्या घेवड्याच्या पानांमध्ये बाह्य एल-ऑर्निथिनच्या वापराचा ऑक्सिडेटिव्ह ताणाच्या प्रमुख निर्देशकांवर आणि गैर-एंझायमेटिक अँटिऑक्सिडेंट संरक्षण यंत्रणांवर होणारा परिणाम. (अ) ७२ hpt वर हायड्रोजन पेरॉक्साइड (H2O2; nmol g−1 FW), (ब) ७२ hpt वर सुपरऑक्साइड ॲनायन (O2•−; nmol g−1 FW), (क) ७२ hpt वर मॅलॉन्डियलडिहाइड (MDA; nmol g−1 FW), (ड) ७२ hpt वर एकूण विद्राव्य फिनॉल्स (mg GAE g−1 FW), (इ) ७२ hpt वर एकूण विद्राव्य फ्लेव्होनॉइड्स (mg RE g−1 FW), (फ) ७२ hpt वर एकूण मुक्त अमिनो ॲसिड्स (mg g−1 FW), आणि (ग) ७२ hpt वर प्रोलाइनचे प्रमाण (mg g−1 FW). मूल्ये ५ जैविक प्रतिकृतींचे (n = 5) सरासरी ± मानक विचलन (mean ± SD) दर्शवतात. वेगवेगळी अक्षरे उपचारांमधील सांख्यिकीय दृष्ट्या महत्त्वपूर्ण फरक दर्शवतात (p < 0.05).