हा लेख "रोगजनक आणि कीटकांना शेंगांच्या प्रतिकारशक्तीत सुधारणा करणे" या संशोधन विषयाचा भाग आहे, सर्व ५ लेख पहा.
बुरशीजन्य वनस्पती रोग नेक्रोसिस स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटीओरम (लिब.) डी बॅरी वेगवेगळ्या यजमान वनस्पतींना संक्रमित करण्यासाठी बहु-स्तरीय रणनीती वापरतो. या अभ्यासात डायमाइन एल-ऑर्निथिनचा वापर प्रस्तावित केला आहे, जो एक नॉन-प्रोटीन अमीनो आम्ल आहे जो इतर आवश्यक अमीनो आम्लांच्या संश्लेषणाला उत्तेजित करतो, ज्यामुळे स्यूडोमोनास स्क्लेरोटीओरममुळे होणाऱ्या पांढऱ्या बुरशीला फेसोलस वल्गारिस एल. च्या आण्विक, शारीरिक आणि जैवरासायनिक प्रतिसाद वाढविण्यासाठी पर्यायी व्यवस्थापन धोरण म्हणून केला जातो. इन विट्रो प्रयोगांमधून असे दिसून आले की एल-ऑर्निथिनने डोस-आश्रित पद्धतीने एस. पायरेनोइडोसाच्या मायसेलियल वाढीस लक्षणीयरीत्या रोखले. शिवाय, ते ग्रीनहाऊस परिस्थितीत पांढऱ्या बुरशीची तीव्रता लक्षणीयरीत्या कमी करू शकते. शिवाय, एल-ऑर्निथिनने उपचारित वनस्पतींच्या वाढीस उत्तेजन दिले, जे दर्शवते की एल-ऑर्निथिनची चाचणी केलेली सांद्रता उपचारित वनस्पतींसाठी फायटोटॉक्सिक नव्हती. याव्यतिरिक्त, एल-ऑर्निथिनने नॉन-एंझायमेटिक अँटीऑक्सिडंट्स (एकूण विरघळणारे फिनोलिक्स आणि फ्लेव्होनॉइड्स) आणि एंझायमेटिक अँटीऑक्सिडंट्स (कॅटलेस (CAT), पेरोक्सिडेस (POX), आणि पॉलीफेनॉल ऑक्सिडेस (PPO)) ची अभिव्यक्ती वाढवली आणि तीन अँटीऑक्सिडंट-संबंधित जनुकांची (PvCAT1, PvSOD आणि PvGR) अभिव्यक्ती वाढवली. शिवाय, सिलिको विश्लेषणात एस. स्क्लेरोटीओरम जीनोममध्ये पुटेटिव्ह ऑक्सॅलोएसेटेट एसिटाइलहायड्रोलेस (SsOAH) प्रथिनांची उपस्थिती उघड झाली, जी कार्यात्मक विश्लेषण, संरक्षित डोमेन आणि टोपोलॉजीच्या बाबतीत एस्परगिलस फिजिएन्सिस (AfOAH) आणि पेनिसिलियम sp. (PlOAH) च्या ऑक्सॅलोएसेटेट एसिटाइलहायड्रोलेस (SsOAH) प्रथिनांसारखी होती. मनोरंजक गोष्ट म्हणजे, बटाटा डेक्स्ट्रोज ब्रोथ (PDB) माध्यमात L-ऑर्निथिन जोडल्याने एस. स्क्लेरोटीओरम मायसेलियामध्ये एस. स्क्लेरोटीओरम मायसेलिया जनुकाची अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या कमी झाली. त्याचप्रमाणे, उपचारित वनस्पतींमधून गोळा केलेल्या बुरशीजन्य मायसेलियामध्ये एल-ऑर्निथिनच्या बाह्य वापरामुळे SsOAH जनुकाची अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या कमी झाली. शेवटी, एल-ऑर्निथिनच्या वापरामुळे पीडीबी माध्यम आणि संक्रमित पानांमध्ये ऑक्सॅलिक अॅसिड स्राव लक्षणीयरीत्या कमी झाला. शेवटी, एल-ऑर्निथिन रेडॉक्स स्थिती राखण्यात तसेच संक्रमित वनस्पतींचा संरक्षण प्रतिसाद वाढविण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावते. या अभ्यासाचे निकाल पांढरी बुरशी नियंत्रित करण्यासाठी आणि बीन उत्पादन आणि इतर पिकांवर त्याचा परिणाम कमी करण्यासाठी नाविन्यपूर्ण, पर्यावरणास अनुकूल पद्धती विकसित करण्यास मदत करू शकतात.
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम (लिब.) डी बॅरी या नेक्रोट्रॉफिक बुरशीमुळे होणारा पांढरा बुरशी हा एक विनाशकारी, उत्पादन कमी करणारा रोग आहे जो जागतिक बीन्स (फेजोलस वल्गारिस एल.) उत्पादनासाठी गंभीर धोका निर्माण करतो (बोल्टन एट अल., २००६). स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम हा मातीतून पसरणाऱ्या बुरशीजन्य वनस्पती रोगजनकांपैकी एक आहे ज्याचे नियंत्रण करणे सर्वात कठीण आहे, ज्यामध्ये ६०० हून अधिक वनस्पती प्रजातींचा विस्तृत यजमान वर्ग आहे आणि यजमान ऊतींना एका विशिष्ट नसलेल्या पद्धतीने जलद गतीने मॅकरेट करण्याची क्षमता आहे (लियांग आणि रोलिन्स, २०१८). प्रतिकूल परिस्थितीत, ते त्याच्या जीवनचक्राच्या एका गंभीर टप्प्यातून जाते, जमिनीत 'स्क्लेरोटिआ' नावाच्या काळ्या, कठीण, बियाण्यासारख्या रचना म्हणून किंवा संक्रमित वनस्पतींच्या मायसेलियम किंवा स्टेम पिथमध्ये पांढरे, फुललेले वाढ म्हणून दीर्घकाळ सुप्त राहते (श्वार्ट्झ एट अल., २००५). एस. स्क्लेरोटीओरम स्क्लेरोटीया तयार करण्यास सक्षम आहे, ज्यामुळे ते संक्रमित शेतात दीर्घकाळ टिकून राहू शकते आणि रोगादरम्यान टिकून राहू शकते (श्वार्ट्झ एट अल., २००५). स्क्लेरोटीया पोषक तत्वांनी समृद्ध असतात, जमिनीत दीर्घकाळ टिकून राहू शकतात आणि त्यानंतरच्या संसर्गासाठी प्राथमिक रोगप्रतिबंधक म्हणून काम करतात (श्वार्ट्झ एट अल., २००५). अनुकूल परिस्थितीत, स्क्लेरोटीया अंकुरित होतात आणि हवेतील बीजाणू तयार करतात जे वनस्पतीच्या सर्व जमिनीवरील भागांना संक्रमित करू शकतात, ज्यामध्ये फुले, देठ किंवा शेंगा समाविष्ट आहेत परंतु त्यापुरते मर्यादित नाहीत (श्वार्ट्झ एट अल., २००५).
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटीओरम त्याच्या यजमान वनस्पतींना संक्रमित करण्यासाठी बहु-स्तरीय रणनीती वापरते, ज्यामध्ये स्क्लेरोटियल अंकुरणापासून ते लक्षणांच्या विकासापर्यंत समन्वित घटनांची मालिका समाविष्ट असते. सुरुवातीला, एस. स्क्लेरोटीओरम एपोथेसिया नावाच्या मशरूमसारख्या रचनांमधून निलंबित बीजाणू (ज्याला एस्कोस्पोर्स म्हणतात) तयार करते, जे हवेत जातात आणि संक्रमित वनस्पतींच्या ढिगाऱ्यावर नॉन-मोटाइल स्क्लेरोटीयामध्ये विकसित होतात (बोल्टन एट अल., २००६). नंतर बुरशी वनस्पतींच्या पेशी भिंतीचे पीएच नियंत्रित करण्यासाठी, एंजाइमॅटिक डिग्रेडेशन आणि ऊतींचे आक्रमण वाढविण्यासाठी (हेगेडस आणि रिमर, २००५) आणि यजमान वनस्पतीच्या ऑक्सिडेटिव्ह स्फोटाला दडपण्यासाठी ऑक्सॅलिक अॅसिड, एक विषाणू घटक स्रावित करते. ही आम्लीकरण प्रक्रिया वनस्पती पेशी भिंतीला कमकुवत करते, बुरशीजन्य पेशी भिंतीचे विघटन करणाऱ्या एंजाइम्स (CWDEs) च्या सामान्य आणि कार्यक्षम ऑपरेशनसाठी अनुकूल वातावरण प्रदान करते, ज्यामुळे रोगजनक भौतिक अडथळा पार करू शकतो आणि यजमान ऊतींमध्ये प्रवेश करू शकतो (मार्सियानो एट अल., १९८३). एकदा आत शिरल्यानंतर, एस. स्क्लेरोटीओरम पॉलीगॅलेक्चुरोनेज आणि सेल्युलेज सारख्या अनेक CWDEs चे स्राव करते, जे संक्रमित ऊतींमध्ये त्याचा प्रसार सुलभ करतात आणि ऊतींचे नेक्रोसिस निर्माण करतात. जखम आणि हायफल मॅट्सच्या प्रगतीमुळे पांढऱ्या बुरशीची वैशिष्ट्यपूर्ण लक्षणे दिसून येतात (हेगेडस आणि रिमर, २००५). दरम्यान, यजमान वनस्पती पॅटर्न रिकग्निशन रिसेप्टर्स (PRRs) द्वारे रोगजनकांशी संबंधित आण्विक नमुने (PAMPs) ओळखतात, ज्यामुळे सिग्नलिंग घटनांची मालिका सुरू होते जी शेवटी संरक्षण प्रतिसाद सक्रिय करते.
रोग नियंत्रणाच्या अनेक दशकांच्या प्रयत्नांनंतरही, रोगजनकांच्या प्रतिकारशक्ती, जगण्याची क्षमता आणि अनुकूलतेमुळे, इतर व्यावसायिक पिकांप्रमाणेच बीन्समध्ये पुरेशा प्रतिरोधक जर्मप्लाझमची कमतरता कायम आहे. म्हणूनच, रोग व्यवस्थापन अत्यंत आव्हानात्मक आहे आणि त्यासाठी एकात्मिक, बहुआयामी धोरणाची आवश्यकता आहे ज्यामध्ये सांस्कृतिक पद्धती, जैविक नियंत्रण आणि रासायनिक बुरशीनाशकांचे संयोजन समाविष्ट आहे (ओ'सुलिवान एट अल., २०२१). पांढऱ्या बुरशीचे रासायनिक नियंत्रण सर्वात प्रभावी आहे कारण बुरशीनाशके, योग्य वेळी आणि योग्य वेळी वापरल्यास, रोगाचा प्रसार प्रभावीपणे नियंत्रित करू शकतात, संसर्गाची तीव्रता कमी करू शकतात आणि उत्पन्नाचे नुकसान कमी करू शकतात. तथापि, बुरशीनाशकांवर अतिवापर आणि अतिरेकीपणामुळे एस. स्क्लेरोटीओरमच्या प्रतिरोधक जातींचा उदय होऊ शकतो आणि लक्ष्य नसलेल्या जीवांवर, मातीच्या आरोग्यावर आणि पाण्याच्या गुणवत्तेवर नकारात्मक परिणाम होऊ शकतो (ले कॉइंटे एट अल., २०१६; सेरेसिनी एट अल., २०२४). म्हणून, पर्यावरणास अनुकूल पर्याय शोधणे ही सर्वोच्च प्राथमिकता बनली आहे.
पॉलीमाइन्स (पीए), जसे की पुट्रेसिन, स्पर्मिडीन, स्पर्माइन आणि कॅडेव्हरिन, मातीतून निर्माण होणाऱ्या वनस्पती रोगजनकांविरुद्ध आशादायक पर्याय म्हणून काम करू शकतात, ज्यामुळे घातक रासायनिक बुरशीनाशकांचा वापर पूर्णपणे किंवा अंशतः कमी होतो (नेहेला एट अल., २०२४; यी एट अल., २०२४). उच्च वनस्पतींमध्ये, पीए अनेक शारीरिक प्रक्रियांमध्ये सामील असतात ज्यात पेशी विभाजन, भेदभाव आणि अजैविक आणि जैविक ताणांना प्रतिसाद समाविष्ट आहे (किलिनी आणि नेहेला, २०२०). ते अँटीऑक्सिडंट्स म्हणून काम करू शकतात, प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजाती (ROS) साफ करण्यास मदत करतात, रेडॉक्स होमिओस्टॅसिस राखतात (नेहेला आणि किलिनी, २०२३), संरक्षण-संबंधित जनुके प्रेरित करतात (रोमेरो एट अल., २०१८), विविध चयापचय मार्गांचे नियमन करतात (नेहेला आणि किलिनी, २०२३), अंतर्जात फायटोहार्मोन्सचे नियमन करतात (नेहेला आणि किलिनी, २०१९), प्रणालीगत अधिग्रहित प्रतिकार (SAR) स्थापित करतात आणि वनस्पती-रोगजनक परस्परसंवादांचे नियमन करतात (नेहेला आणि किलिनी, २०२०; असिजा एट अल., २०२२; झेरवोनिक, २०२२). हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की वनस्पती संरक्षणात PA ची विशिष्ट यंत्रणा आणि भूमिका वनस्पती प्रजाती, रोगजनक आणि पर्यावरणीय परिस्थितीनुसार बदलतात. वनस्पतींमध्ये सर्वात मुबलक PA आवश्यक पॉलिमाइन एल-ऑर्निथिन (किलिनी आणि नेहेला, २०२०) पासून जैवसंश्लेषित केले जाते.
वनस्पतींच्या वाढीमध्ये आणि विकासात एल-ऑर्निथिन अनेक भूमिका बजावते. उदाहरणार्थ, मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की तांदळात (ओरिझा सॅटिवा), ऑर्निथिन नायट्रोजन पुनर्वापराशी संबंधित असू शकते (लिऊ एट अल., २०१८), भाताचे उत्पादन, गुणवत्ता आणि सुगंध (लू एट अल., २०२०) आणि पाण्याच्या ताणाच्या प्रतिसादाशी (यांग एट अल., २०००). शिवाय, एल-ऑर्निथिनच्या बाह्य वापरामुळे साखर बीट (बीटा वल्गारिस) (हुसेन एट अल., २०१९) मध्ये दुष्काळ सहनशीलता लक्षणीयरीत्या वाढली आणि कांद्यामध्ये (अ‍ॅलियम सेपा) (कावुसोओलु आणि कावुसोओलु, २०२१) आणि काजू (अ‍ॅनाकार्डियम ऑक्सीडेंटेल) वनस्पतींमध्ये (दा रोचा एट अल., २०१२) मीठाचा ताण कमी झाला. अजैविक ताण संरक्षणात एल-ऑर्निथिनची संभाव्य भूमिका प्रक्रिया केलेल्या वनस्पतींमध्ये प्रोलाइन संचयनात त्याच्या सहभागामुळे असू शकते. उदाहरणार्थ, प्रोलाइन चयापचयशी संबंधित जीन्स, जसे की ऑर्निथिन डेल्टा एमिनोट्रान्सफेरेज (डेल्टा-ओएटी) आणि प्रोलाइन डिहायड्रोजनेज (प्रोडीएच१ आणि प्रोडीएच२) जीन्स, पूर्वी निकोटियाना बेंथामियाना आणि अरेबिडोप्सिस थालियाना यांच्या नॉन-होस्ट स्यूडोमोनास सिरिंगे स्ट्रेन (सेंथिल-कुमार आणि म्हैसूर, २०१२) विरुद्ध संरक्षणात सहभागी असल्याचे नोंदवले गेले आहे. दुसरीकडे, रोगजनकांच्या वाढीसाठी बुरशीजन्य ऑर्निथिन डेकार्बोक्सिलेज (ओडीसी) आवश्यक आहे (सिंह एट अल., २०२०). यजमान-प्रेरित जीन सायलेन्सिंग (एचआयजीएस) द्वारे फ्युसेरियम ऑक्सिस्पोरम एफ. एसपी. लायकोपर्सिसीच्या ओडीसीला लक्ष्य केल्याने टोमॅटोच्या वनस्पतींचा फ्युसेरियम विल्टला प्रतिकार लक्षणीयरीत्या वाढला (सिंह एट अल., २०२०). तथापि, फायटोपॅथोजेन्स सारख्या जैविक ताणांविरुद्ध बाह्य ऑर्निथिन अनुप्रयोगाच्या संभाव्य भूमिकेचा चांगला अभ्यास केलेला नाही. अधिक महत्त्वाचे म्हणजे, ऑर्निथिनचा रोग प्रतिकारशक्तीवर होणारा परिणाम आणि त्याच्याशी संबंधित जैवरासायनिक आणि शारीरिक घटनांचा अद्यापही अभ्यास झालेला नाही.
प्रभावी नियंत्रण धोरणे विकसित करण्यासाठी शेंगदाण्यांमध्ये एस. स्क्लेरोटीओरम संसर्गाची जटिलता समजून घेणे महत्वाचे आहे. या अभ्यासात, आम्ही स्क्लेरोटीनिया स्क्लेरोटीओरम संसर्गाविरुद्ध शेंगदाण्यांच्या वनस्पतींच्या संरक्षण यंत्रणा आणि प्रतिकारशक्ती वाढविण्यात डायमाइन एल-ऑर्निथिनची संभाव्य भूमिका ओळखण्याचे उद्दिष्ट ठेवले आहे. आम्ही असे गृहीत धरतो की, संक्रमित वनस्पतींच्या संरक्षणात्मक प्रतिक्रिया वाढविण्याव्यतिरिक्त, एल-ऑर्निथिन रेडॉक्स स्थिती राखण्यात देखील महत्त्वाची भूमिका बजावते. आम्ही असे प्रस्तावित करतो की एल-ऑर्निथिनचे संभाव्य परिणाम एंजाइमॅटिक आणि नॉन-एंजाइमॅटिक अँटीऑक्सिडंट संरक्षण यंत्रणेच्या नियमनाशी आणि बुरशीजन्य रोगजनकता/विषाणू घटक आणि संबंधित प्रथिनांमध्ये हस्तक्षेपाशी संबंधित आहेत. एल-ऑर्निथिनची ही दुहेरी कार्यक्षमता पांढऱ्या बुरशीचा प्रभाव कमी करण्यासाठी आणि या शक्तिशाली बुरशीजन्य रोगजनकांना सामान्य शेंगदाण्यांच्या पिकांचा प्रतिकार वाढवण्यासाठी शाश्वत धोरणासाठी एक आशादायक उमेदवार बनवते. या अभ्यासाचे निकाल पांढऱ्या बुरशीचे नियंत्रण करण्यासाठी आणि शेंगदाण्यांच्या उत्पादनावर त्याचा प्रभाव कमी करण्यासाठी नाविन्यपूर्ण, पर्यावरणास अनुकूल पद्धती विकसित करण्यास मदत करू शकतात.
या अभ्यासात, सामान्य बीनची एक संवेदनशील व्यावसायिक जात, गिझा ३ (फेजोलस वल्गारिस एल. सीव्ही. गिझा ३) प्रायोगिक साहित्य म्हणून वापरली गेली. इजिप्तमधील फील्ड क्रॉप्स रिसर्च इन्स्टिट्यूट (एफसीआरआय), कृषी संशोधन केंद्र (एआरसी) या कृषी संशोधन केंद्राने शेंगा संशोधन विभागाने निरोगी बियाणे प्रदान केले. पाच बियाणे प्लास्टिकच्या कुंड्यांमध्ये (अंतर्गत व्यास ३५ सेमी, खोली ५० सेमी) एस. स्क्लेरोटीओरम-संक्रमित मातीने भरलेल्या ग्रीनहाऊस परिस्थितीत (२५ ± २ °से, सापेक्ष आर्द्रता ७५ ± १%, ८ तास हलकी/१६ तास गडद) पेरण्यात आली. पेरणीनंतर ७-१० दिवसांनी (डीपीएस), रोपे पातळ करण्यात आली जेणेकरून प्रत्येक कुंडात एकसमान वाढ असलेली आणि तीन पूर्णपणे वाढलेली पाने असलेली फक्त दोन रोपे शिल्लक राहतील. सर्व कुंड्यातील रोपांना दर दोन आठवड्यांनी एकदा पाणी दिले गेले आणि दिलेल्या जातीसाठी शिफारस केलेल्या दराने दरमहा खत दिले गेले.
एल-ऑर्निथिनेडायमिन (ज्याला (+)-(S)-2,5-डायमिनोपेंटानोइक अॅसिड; सिग्मा-अल्ड्रिच, डार्मस्टॅड, जर्मनी) असे ५०० मिलीग्राम/लिटर एकाग्रता तयार करण्यासाठी, ५० मिलीग्राम प्रथम १०० मिली निर्जंतुकीकरण डिस्टिल्ड पाण्यात विरघळवले गेले. नंतर स्टॉक सोल्यूशन पातळ केले गेले आणि त्यानंतरच्या प्रयोगांमध्ये वापरले गेले. थोडक्यात, एल-ऑर्निथिन सांद्रतेच्या सहा मालिका (१२.५, २५, ५०, ७५, १०० आणि १२५ मिलीग्राम/लिटर) इन विट्रो चाचणी घेण्यात आल्या. याव्यतिरिक्त, निर्जंतुकीकरण डिस्टिल्ड वॉटरचा वापर नकारात्मक नियंत्रण (मॉक) म्हणून करण्यात आला आणि व्यावसायिक बुरशीनाशक "रिझोलेक्स-टी" ५०% ओले करण्यायोग्य पावडर (टोक्लोफॉस-मिथाइल २०% + थायरम ३०%; केझेड-काफर एल झायत पेस्टिसाइड्स अँड केमिकल्स कंपनी, काफर एल झायत, घार्बिया गव्हर्नरेट, इजिप्त) सकारात्मक नियंत्रण म्हणून करण्यात आला. व्यावसायिक बुरशीनाशक "रिझोलेक्स-टी" ची चाचणी इन विट्रोमध्ये पाच सांद्रतांवर (२, ४, ६, ८ आणि १० मिग्रॅ/लीटर) करण्यात आली.
सामान्य बीनच्या देठांचे आणि शेंगांचे नमुने ज्यात पांढरी बुरशीची विशिष्ट लक्षणे दिसून येतात (प्रभाव दर: १०-३०%) व्यावसायिक शेतातून गोळा करण्यात आले. जरी बहुतेक संक्रमित वनस्पती साहित्य प्रजाती/प्रकार (संवेदनशील व्यावसायिक प्रकार गिझा ३) द्वारे ओळखले गेले असले तरी, इतर, विशेषतः स्थानिक बाजारपेठेतून मिळवलेले, अज्ञात प्रजातींचे होते. गोळा केलेले संक्रमित साहित्य प्रथम ०.५% सोडियम हायपोक्लोराइट द्रावणाने ३ मिनिटांसाठी निर्जंतुक केले गेले, नंतर निर्जंतुकीकरण केलेल्या पाण्याने अनेक वेळा धुतले गेले आणि अतिरिक्त पाणी काढून टाकण्यासाठी निर्जंतुकीकरण फिल्टर पेपरने पुसले गेले. त्यानंतर संक्रमित अवयवांना मधल्या ऊतींमधून (निरोगी आणि संक्रमित ऊतींमधील) लहान तुकड्यांमध्ये कापले गेले, बटाट्याच्या डेक्स्ट्रोज अगर (पीडीए) माध्यमावर संवर्धन केले गेले आणि स्क्लेरोटिया निर्मितीला चालना देण्यासाठी १२ तासांच्या प्रकाश/१२ तासांच्या गडद चक्रासह २५ ± २ °C तापमानावर ५ दिवसांसाठी उबवले गेले. मिश्रित किंवा दूषित कल्चरमधून बुरशीजन्य आयसोलेट शुद्ध करण्यासाठी मायसेलियल टिप पद्धत देखील वापरली गेली. शुद्ध केलेल्या बुरशीजन्य आयसोलेटची ओळख प्रथम त्याच्या सांस्कृतिक आकारिकीय वैशिष्ट्यांवरून करण्यात आली आणि नंतर सूक्ष्म वैशिष्ट्यांवरून एस. स्क्लेरोटीओरम असल्याची पुष्टी करण्यात आली. शेवटी, कोचच्या सिद्धांतांना पूर्ण करण्यासाठी सर्व शुद्ध केलेल्या आयसोलेटची संवेदनशील सामान्य बीन जाती गिझा 3 वर रोगजनकतेसाठी चाचणी करण्यात आली.
याव्यतिरिक्त, व्हाईट एट अल., १९९०; बटुरो-सिस्निव्हस्का एट अल., २०१७ यांनी वर्णन केल्याप्रमाणे अंतर्गत ट्रान्सक्राइब्ड स्पेसर (ITS) सिक्वेन्सिंगच्या आधारे सर्वात आक्रमक S. स्क्लेरोटीओरियम आयसोलेट (आयसोलेट #३) आणखी पुष्टी करण्यात आली. थोडक्यात, आयसोलेट बटाट्याच्या डेक्सट्रोज ब्रॉथ (PDB) मध्ये कल्चर केले गेले आणि २५ ± २ °C वर ५-७ दिवसांसाठी उबवले गेले. त्यानंतर फंगल मायसेलियम गोळा केले गेले, चीजक्लोथमधून फिल्टर केले गेले, निर्जंतुकीकरण पाण्याने दोनदा धुतले गेले आणि निर्जंतुकीकरण फिल्टर पेपरने वाळवले गेले. Quick-DNA™ फंगल/बॅक्टेरियल मिनीप्रेप किट (कुरामे-इझिओका, १९९७; अटाल्लाह एट अल., २०२२, २०२४) वापरून जीनोमिक डीएनए वेगळे केले गेले. त्यानंतर ITS rDNA क्षेत्र विशिष्ट प्राइमर जोडी ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; अपेक्षित आकार: 540 bp) वापरून वाढवण्यात आले (बटुरो-सिएस्नीव्स्का एट अल., २०१७). शुद्ध केलेले PCR उत्पादने सिक्वेन्सिंगसाठी सादर करण्यात आली (बीजिंग आओके डिंगशेंग बायोटेक्नॉलॉजी कंपनी, लिमिटेड). ITS rDNA अनुक्रम सेन्जर सिक्वेन्सिंग पद्धतीचा वापर करून द्विदिशात्मकपणे अनुक्रमित केले गेले. त्यानंतर एकत्रित केलेल्या क्वेरी अनुक्रमांची तुलना BLASTn सॉफ्टवेअर वापरून GenBank आणि नॅशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नॉलॉजी इन्फॉर्मेशन (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) मधील नवीनतम डेटाशी करण्यात आली. क्वेरी अनुक्रमाची तुलना आण्विक उत्क्रांती अनुनाद पॅकेज (MEGA-11; आवृत्ती 11) (कुमार एट अल., 2024) मध्ये ClustalW वापरून NCBI GenBank (सप्लिमेंटरी टेबल S1) मधील नवीनतम डेटामधून मिळवलेल्या 20 इतर S. sclerotiorum strains/isolates शी करण्यात आली. उत्क्रांती विश्लेषण जास्तीत जास्त शक्यता पद्धत आणि सामान्य वेळ-उलटता येणारे न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन मॉडेल (नी आणि कुमार, २०००) वापरून केले गेले. सर्वाधिक लाकूड-संभाव्यता असलेले झाड दाखवले आहे. ह्युरिस्टिक शोधासाठी प्रारंभिक झाड शेजारी-जोडता येणारे (एनजे) झाड (कुमार आणि इतर, २०२४) आणि जास्तीत जास्त पार्सिमनी (एमपी) झाड यांच्यातील जास्त लाकूड-संभाव्यता असलेले झाड निवडून निवडले जाते. सामान्य वेळ-उलटता येणारे मॉडेल (नी आणि कुमार, २०००) वापरून गणना केलेल्या जोडीनुसार अंतर मॅट्रिक्स वापरून एनजे झाड तयार केले गेले.
एल-ऑर्निथिन आणि "रिझोलेक्स-टी" या जीवाणूनाशकाची जीवाणूनाशक क्रिया आगर प्रसार पद्धतीद्वारे इन विट्रोमध्ये निश्चित केली गेली. पद्धत: एल-ऑर्निथिनच्या स्टॉक सोल्यूशनची योग्य मात्रा (५०० मिलीग्राम/लीटर) घ्या आणि ते १० मिली पीडीए पोषक माध्यमात पूर्णपणे मिसळा जेणेकरून अनुक्रमे १२.५, २५, ५०, ७५, १०० आणि १२५ मिलीग्राम/लीटरच्या अंतिम सांद्रतेसह द्रावण तयार होईल. नियंत्रण म्हणून "रिझोलेक्स-टी" या बुरशीनाशकाच्या पाच सांद्रता (२, ४, ६, ८ आणि १० मिलीग्राम/लीटर) आणि निर्जंतुक डिस्टिल्ड वॉटरचा वापर करण्यात आला. माध्यम घट्ट झाल्यानंतर, ४ मिमी व्यासाचा स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटीओरम कल्चरचा ताजा तयार केलेला मायसेलियल प्लग पेट्री डिशच्या मध्यभागी हस्तांतरित करण्यात आला आणि २५±२°C वर मायसेलियमने संपूर्ण नियंत्रण पेट्री डिश व्यापेपर्यंत कल्चर करण्यात आला, त्यानंतर बुरशीची वाढ नोंदवण्यात आली. समीकरण १ वापरून एस. स्क्लेरोटीओरमच्या रेडियल वाढीच्या टक्केवारीच्या प्रतिबंधाची गणना करा:
प्रयोगाची पुनरावृत्ती दोनदा करण्यात आली, प्रत्येक नियंत्रण/प्रायोगिक गटासाठी सहा जैविक प्रतिकृती आणि प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीसाठी पाच कुंड्या (प्रति कुंड दोन वनस्पती) होत्या. प्रायोगिक निकालांची अचूकता, विश्वासार्हता आणि पुनरुत्पादनक्षमता सुनिश्चित करण्यासाठी प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीचे दोनदा विश्लेषण करण्यात आले (दोन तांत्रिक प्रतिकृती). याव्यतिरिक्त, अर्ध-कमाल प्रतिबंधात्मक एकाग्रता (IC50) आणि IC99 (प्रेंटिस, 1976) मोजण्यासाठी प्रोबिट रिग्रेशन विश्लेषण वापरले गेले.
हरितगृह परिस्थितीत एल-ऑर्निथिनच्या क्षमतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी, सलग दोन कुंड्यांचे प्रयोग करण्यात आले. थोडक्यात, कुंड्या निर्जंतुकीकृत चिकणमाती-वाळू मातीने (३:१) भरल्या गेल्या आणि त्यांना एस. स्क्लेरोटीओरमच्या ताज्या तयार केलेल्या कल्चरने टोचण्यात आले. प्रथम, एस. स्क्लेरोटीओरम (आयसोलेट #३) चा सर्वात आक्रमक आयसोलेट एक स्क्लेरोटीयम अर्ध्या भागात कापून, पीडीएवर तोंड करून ठेवून आणि मायसेलियल वाढीस चालना देण्यासाठी २५°C वर सतत अंधारात (२४ तास) ४ दिवस उबवून संवर्धन करण्यात आला. त्यानंतर ५ मिमी व्यासाचे चार आगर प्लग अग्रभागी घेतले गेले आणि त्यात १०० ग्रॅम गहू आणि तांदळाच्या कोंडाचे निर्जंतुकीकरण मिश्रण (१:१, v/v) टोचण्यात आले आणि सर्व फ्लास्क २५ ± २ °C वर १२ तासांच्या प्रकाश/१२ तासांच्या गडद चक्राखाली ५ दिवसांसाठी उबवले गेले जेणेकरून स्क्लेरोटीया निर्मिती उत्तेजित होईल. माती घालण्यापूर्वी सर्व फ्लास्कमधील सामग्री एकसंधता सुनिश्चित करण्यासाठी पूर्णपणे मिसळण्यात आली. नंतर, रोगजनकांच्या सतत एकाग्रतेची खात्री करण्यासाठी प्रत्येक कुंडीत १०० ग्रॅम कोंडा मिश्रण घालण्यात आले. बुरशीची वाढ सक्रिय करण्यासाठी लसीकरण केलेल्या कुंडींना पाणी देण्यात आले आणि ७ दिवसांसाठी ग्रीनहाऊस परिस्थितीत ठेवण्यात आले.
त्यानंतर प्रत्येक कुंडीत गिझा ३ जातीचे पाच बियाणे पेरण्यात आले. एल-ऑर्निथिन आणि रिझोलेक्स-टी या बुरशीनाशकाने उपचार केलेल्या कुंडीसाठी, निर्जंतुक केलेले बियाणे प्रथम अनुक्रमे सुमारे २५० मिलीग्राम/लीटर आणि ५० मिलीग्राम/लीटरच्या अंतिम IC99 सांद्रतेसह दोन्ही संयुगांच्या जलीय द्रावणात दोन तास भिजवले गेले आणि नंतर पेरणीपूर्वी एक तास हवेत वाळवले गेले. दुसरीकडे, नकारात्मक नियंत्रण म्हणून बियाणे निर्जंतुक डिस्टिल्ड पाण्यात भिजवले गेले. १० दिवसांनंतर, पहिल्या पाणी देण्यापूर्वी, रोपे पातळ केली गेली, प्रत्येक कुंडीत फक्त दोन स्वच्छ रोपे उरली. याव्यतिरिक्त, एस. स्क्लेरोटीओरमचा संसर्ग सुनिश्चित करण्यासाठी, समान विकास टप्प्यावर (१० दिवस) बीन रोपाचे देठ निर्जंतुकीकरण केलेल्या स्केलपेल वापरून दोन वेगवेगळ्या ठिकाणी कापले गेले आणि प्रत्येक जखमेत अंदाजे ०.५ ग्रॅम कोंडा मिश्रण टाकण्यात आले, त्यानंतर सर्व लसीकरण केलेल्या वनस्पतींमध्ये संसर्ग आणि रोगाच्या विकासाला चालना देण्यासाठी उच्च आर्द्रता दिली गेली. नियंत्रण वनस्पतींनाही अशाच प्रकारे जखमा करण्यात आल्या आणि जखमेत समान प्रमाणात (०.५ ग्रॅम) निर्जंतुक, वसाहत नसलेले कोंडा मिश्रण टाकण्यात आले आणि रोगाच्या विकासासाठी वातावरणाचे अनुकरण करण्यासाठी आणि उपचार गटांमध्ये सुसंगतता सुनिश्चित करण्यासाठी उच्च आर्द्रतेखाली राखण्यात आले.
उपचार पद्धत: बीन रोपांना मातीत सिंचन करून ५०० मिली एल-ऑर्निथिन (२५० मिलीग्राम/ली) किंवा बुरशीनाशक रिझोलेक्स-टी (५० मिलीग्राम/ली) च्या जलीय द्रावणाने पाणी दिले गेले, त्यानंतर १० दिवसांच्या अंतराने तीन वेळा उपचार केले गेले. प्लेसिबो-उपचारित नियंत्रणांना ५०० मिली निर्जंतुक डिस्टिल्ड वॉटरने सिंचन केले गेले. सर्व उपचार हरितगृह परिस्थितीत (२५ ± २°C, ७५ ± १% सापेक्ष आर्द्रता आणि ८ तास प्रकाश/१६ तास अंधाराचा फोटोपीरियड) केले गेले. सर्व कुंड्यांना दर पंधरा दिवसांनी पाणी दिले गेले आणि दर महिन्याला संतुलित NPK खत (२०-२०-२०, ३.६% सल्फर आणि TE सूक्ष्म घटकांसह; झैन सीड्स, इजिप्त) सह ३-४ ग्रॅम/ली च्या एकाग्रतेसह विशिष्ट जातीच्या शिफारसी आणि उत्पादकाच्या सूचनांनुसार पानांवर फवारणी करून प्रक्रिया केली गेली. अन्यथा सांगितले नसल्यास, पूर्णपणे वाढलेली प्रौढ पाने (वरून दुसरी आणि तिसरी पाने) प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमधून ७२ तासांच्या उपचारानंतर (hpt) गोळा केली गेली, एकसंध केली गेली, एकत्रित केली गेली आणि -८० °C वर संग्रहित केली गेली, ज्यामध्ये ऑक्सिडेटिव्ह स्ट्रेस इंडिकेटरचे इन सिटू हिस्टोकेमिकल स्थानिकीकरण, लिपिड पेरोक्सिडेशन, एंजाइमॅटिक आणि नॉन-एंजाइमॅटिक अँटीऑक्सिडंट्स आणि जीन अभिव्यक्ती यांचा समावेश आहे, परंतु त्यापुरते मर्यादित नाही.
टेरन एट अल. (२००६) द्वारे सुधारित पेटझोल्ड आणि डिक्सन स्केल (१९९६) वर आधारित, लसीकरणानंतर आठवड्यातून २१ दिवसांनी (dpi) पांढऱ्या बुरशीच्या संसर्गाची तीव्रता १-९ (पूरक तक्ता S2) च्या स्केलचा वापर करून मोजण्यात आली. थोडक्यात, बीन वनस्पतींच्या देठांची आणि फांद्यांची तपासणी लसीकरणाच्या बिंदूपासून सुरू करून इंटरनोड्स आणि नोड्ससह जखमांच्या प्रगतीचे अनुसरण करण्यासाठी करण्यात आली. नंतर लसीकरणाच्या बिंदूपासून स्टेम किंवा फांदीच्या सर्वात दूरच्या बिंदूपर्यंत जखमेचे अंतर मोजण्यात आले आणि जखमेच्या स्थानावर आधारित १-९ गुण देण्यात आले, जिथे (१) लसीकरणाच्या बिंदूजवळ कोणताही दृश्यमान संसर्ग नसल्याचे दर्शविले आणि (२-९) नोड्स/इंटर्नोड्ससह जखमांच्या आकारात आणि प्रगतीमध्ये हळूहळू वाढ दर्शविली (पूरक तक्ता S2). नंतर सूत्र २ वापरून पांढऱ्या बुरशीच्या संसर्गाची तीव्रता टक्केवारीत रूपांतरित करण्यात आली:
याव्यतिरिक्त, रोग प्रगती वक्र (AUDPC) अंतर्गत क्षेत्रफळ सूत्र (शेनर आणि फिनी, १९७७) वापरून मोजले गेले, जे अलीकडेच समीकरण ३ वापरून सामान्य बीनच्या पांढऱ्या कुजण्यासाठी (चौहान आणि इतर, २०२०) अनुकूलित केले गेले:
जिथे Yi = ti वेळी रोगाची तीव्रता, Yi+1 = पुढच्या वेळी रोगाची तीव्रता ti+1, ti = पहिल्या मापनाची वेळ (दिवसांमध्ये), ti+1 = पुढील मापनाची वेळ (दिवसांमध्ये), n = एकूण वेळ बिंदू किंवा निरीक्षण बिंदूंची संख्या. सर्व जैविक प्रतिकृतींमध्ये वनस्पतीची उंची (सेमी), प्रत्येक वनस्पतीच्या फांद्यांची संख्या आणि प्रत्येक वनस्पतीच्या पानांची संख्या यासह बीन वनस्पती वाढीचे मापदंड आठवड्यातून २१ दिवस नोंदवले गेले.
प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमध्ये, पानांचे नमुने (वरून दुसरी आणि तिसरी पूर्णपणे विकसित पाने) उपचारानंतर ४५ व्या दिवशी (शेवटच्या उपचारानंतर १५ दिवसांनी) गोळा केले गेले. प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमध्ये पाच कुंड्या (प्रति कुंड दोन रोपे) होत्या. सुमारे ५०० मिलीग्राम कुस्करलेल्या ऊतींचा वापर प्रकाशसंश्लेषक रंगद्रव्ये (क्लोरोफिल ए, क्लोरोफिल बी आणि कॅरोटीनॉइड्स) काढण्यासाठी ४°C तापमानात अंधारात ८०% एसीटोन वापरून केला गेला. २४ तासांनंतर, नमुने सेंट्रीफ्यूज केले गेले आणि तीन वेगवेगळ्या तरंगलांबींवर (A470, A646 आणि A663 nm) शोषण मोजून (Lichtenthaler, 1987) पद्धतीनुसार UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (Shimadzu Corporation, Japan) वापरून रंगीत पद्धतीने क्लोरोफिल ए, क्लोरोफिल बी आणि कॅरोटीनॉइड सामग्री निश्चित करण्यासाठी सुपरनॅटंट गोळा केले गेले. शेवटी, प्रकाशसंश्लेषक रंगद्रव्यांची सामग्री Lichtenthaler (1987) ने वर्णन केलेल्या खालील सूत्र ४-६ वापरून मोजली गेली.
उपचारानंतर ७२ तासांनी (hpt), हायड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) आणि सुपरऑक्साइड आयन (O2•−) च्या इन सिटू हिस्टोकेमिकल स्थानिकीकरणासाठी प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमधून पाने (वरून दुसरी आणि तिसरी पूर्णपणे विकसित पाने) गोळा केली गेली. प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमध्ये पाच कुंड्या (प्रति कुंड दोन वनस्पती) होत्या. पद्धतीची अचूकता, विश्वासार्हता आणि पुनरुत्पादनक्षमता सुनिश्चित करण्यासाठी प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीचे डुप्लिकेटमध्ये (दोन तांत्रिक प्रतिकृती) विश्लेषण केले गेले. रोमेरो-प्युर्टास एट अल. (२००४) आणि अॅडम एट अल. (१९८९) यांनी वर्णन केलेल्या पद्धतींचा वापर करून, अनुक्रमे ०.१% ३,३′-डायमिनोबेंझिडाइन (DAB; सिग्मा-अल्ड्रिच, डार्मस्टॅड, जर्मनी) किंवा नायट्रोब्लू टेट्राझोलियम (NBT; सिग्मा-अल्ड्रिच, डार्मस्टॅड, जर्मनी) वापरून H2O2 आणि O2•− निश्चित केले गेले, जे किरकोळ सुधारणांसह केले गेले. H2O2 चे हिस्टोकेमिकल स्थानिकीकरण करण्यासाठी, पत्रके 10 mM ट्रिस बफर (pH 7.8) मध्ये 0.1% DAB सह व्हॅक्यूममध्ये घुसवली गेली आणि नंतर खोलीच्या तपमानावर प्रकाशात 60 मिनिटे उबवली गेली. पत्रके 0.15% (v/v) TCA मध्ये 4:1 (v/v) इथेनॉल:क्लोरोफॉर्म (अल-गोमहोरिया फार्मास्युटिकल्स अँड मेडिकल सप्लाय, कैरो, इजिप्त) मध्ये ब्लीच केली गेली आणि नंतर ती गडद होईपर्यंत प्रकाशात ठेवली गेली. त्याचप्रमाणे, व्हॉल्व्ह 10 mM पोटॅशियम फॉस्फेट बफर (pH 7.8) सह व्हॅक्यूममध्ये घुसवली गेली ज्यामध्ये 0.1 w/v % HBT आहे जेणेकरून O2•− चे हिस्टोकेमिकल स्थानिकीकरण होईल. पत्रके खोलीच्या तपमानावर 20 मिनिटे प्रकाशात उबवली गेली, नंतर वरीलप्रमाणे ब्लीच केली गेली आणि नंतर गडद निळे/जांभळे डाग दिसेपर्यंत प्रकाशित केली गेली. परिणामी तपकिरी (H2O2 निर्देशकाच्या रूपात) किंवा निळ्या-व्हायलेट (O2•− निर्देशकाच्या रूपात) रंगाची तीव्रता इमेज प्रोसेसिंग पॅकेज इमेजजे (http://fiji.sc; ७ मार्च २०२४ रोजी अॅक्सेस केलेले) च्या फिजी आवृत्तीचा वापर करून मूल्यांकन करण्यात आली.
मॅलोन्डायल्डिहाइड (एमडीए; लिपिड पेरोक्सिडेशनचे मार्कर म्हणून) हे थोड्याफार बदलांसह डू आणि ब्रॅमलेज (१९९२) च्या पद्धतीनुसार निश्चित केले गेले. प्रत्येक जैविक प्रतिकृती (वरून दुसरी आणि तिसरी पूर्णपणे विकसित पाने) मधील पाने उपचारानंतर ७२ तासांनी (एचपीटी) गोळा केली गेली. प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमध्ये पाच कुंड्या (प्रति कुंड दोन वनस्पती) समाविष्ट होत्या. पद्धतीची अचूकता, विश्वासार्हता आणि पुनरुत्पादनक्षमता सुनिश्चित करण्यासाठी प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीचे डुप्लिकेटमध्ये (दोन तांत्रिक प्रतिकृती) विश्लेषण केले गेले. थोडक्यात, २०% ट्रायक्लोरोएसेटिक आम्ल (टीसीए; मिलिपोरसिग्मा, बर्लिंग्टन, एमए, यूएसए) सह ०.०१% ब्युटायलेटेड हायड्रॉक्सीटोल्यूइन (बीएचटी; सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, एमओ, यूएसए) असलेले ०.५ ग्रॅम ग्राउंड लीफ टिश्यू एमडीए काढण्यासाठी वापरले गेले. त्यानंतर सुपरनॅटंटमधील MDA सामग्री UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाडझू कॉर्पोरेशन, जपान) वापरून 532 आणि 600 nm वर शोषकता मोजून रंगमितीय पद्धतीने निश्चित केली गेली आणि नंतर nmol g−1 FW म्हणून व्यक्त केली गेली.
नॉन-एंझायमेटिक आणि एंझायमेटिक अँटिऑक्सिडंट्सचे मूल्यांकन करण्यासाठी, उपचारानंतर ७२ तासांनी (hpt) प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमधून पाने (वरून दुसरी आणि तिसरी पूर्णपणे विकसित पाने) गोळा केली गेली. प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीमध्ये पाच कुंड्या (प्रति कुंड दोन वनस्पती) होत्या. प्रत्येक जैविक नमुन्याचे डुप्लिकेटमध्ये विश्लेषण केले गेले (दोन तांत्रिक नमुने). दोन पाने द्रव नायट्रोजनने बारीक केली गेली आणि एंझायमेटिक आणि नॉन-एंझायमेटिक अँटिऑक्सिडंट्स, एकूण अमीनो आम्ल, प्रोलाइन सामग्री, जनुक अभिव्यक्ती आणि ऑक्सलेट प्रमाण निश्चित करण्यासाठी थेट वापरली गेली.
काहकोनेन आणि इतरांनी वर्णन केलेल्या पद्धतीत थोडे बदल करून फोलिन-सिओकाल्टेयू अभिकर्मक (सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, एमओ, यूएसए) वापरून एकूण विद्रव्य फिनोलिक्स निश्चित केले गेले. थोडक्यात, अंदाजे ०.१ ग्रॅम एकसंध पानांचे ऊतक २० मिली ८०% मिथेनॉलसह २४ तासांसाठी अंधारात काढले गेले आणि सेंट्रीफ्यूगेशननंतर सुपरनॅटंट गोळा केले गेले. नमुना अर्काचा ०.१ मिली ०.५ मिली फोलिन-सिओकाल्टेयू अभिकर्मक (१०%) मध्ये मिसळला गेला, ३० सेकंदांसाठी हलवला गेला आणि ५ मिनिटांसाठी अंधारात सोडला गेला. नंतर प्रत्येक नळीत २०% सोडियम कार्बोनेट द्रावणाचे ०.५ मिली (Na2CO3; अल-गोम्होरिया फार्मास्युटिकल्स अँड मेडिकल सप्लाय कंपनी, कैरो, इजिप्त) जोडले गेले, पूर्णपणे मिसळले गेले आणि अंधारात खोलीच्या तपमानावर १ तासासाठी उबवले गेले. उष्मायनानंतर, प्रतिक्रिया मिश्रणाचे शोषण UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाडझू कॉर्पोरेशन, जपान) वापरून 765 nm वर मोजले गेले. नमुना अर्कांमध्ये एकूण विरघळणारे फिनॉलचे प्रमाण गॅलिक अॅसिड कॅलिब्रेशन वक्र (फिशर सायंटिफिक, हॅम्प्टन, NH, यूएसए) वापरून निश्चित केले गेले आणि प्रति ग्रॅम ताज्या वजनाच्या (mg GAE g-1 ताज्या वजनाच्या) मिलीग्राम गॅलिक अॅसिड समतुल्य म्हणून व्यक्त केले गेले.
एकूण विद्रव्य फ्लेव्होनॉइडचे प्रमाण जेरिडेन एट अल. (२००६) च्या पद्धतीनुसार थोड्याफार बदलांसह निश्चित केले गेले. थोडक्यात, वरील मिथेनॉल अर्काचे ०.३ मिली ५% अॅल्युमिनियम क्लोराइड द्रावणात (AlCl3; फिशर सायंटिफिक, हॅम्प्टन, NH, USA) मिसळले गेले, जोरदारपणे ढवळले गेले आणि नंतर खोलीच्या तपमानावर ५ मिनिटे उबवले गेले, त्यानंतर ०.३ मिली १०% पोटॅशियम एसीटेट द्रावण (अल-गोमहोरिया फार्मास्युटिकल्स अँड मेडिकल सप्लाय, कैरो, इजिप्त) जोडले गेले, पूर्णपणे मिसळले गेले आणि खोलीच्या तपमानावर अंधारात ३० मिनिटे उबवले गेले. उबवणीनंतर, प्रतिक्रिया मिश्रणाचे शोषण UV-१६०A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाडझू कॉर्पोरेशन, जपान) वापरून ४३० nm वर मोजले गेले. नमुना अर्कांमध्ये एकूण विरघळणारे फ्लेव्होनॉइड्सचे प्रमाण रुटिन कॅलिब्रेशन वक्र (TCI अमेरिका, पोर्टलँड, OR, USA) वापरून निश्चित केले गेले आणि नंतर प्रति ग्रॅम ताज्या वजनाच्या (mg RE g-1 ताज्या वजनाच्या) मिलीग्राम रुटिन समतुल्य म्हणून व्यक्त केले गेले.
योकोयामा आणि हिरामात्सू (२००३) यांनी प्रस्तावित केलेल्या आणि सन एट अल. (२००६) यांनी सुधारित केलेल्या पद्धतीवर आधारित, बीनच्या पानांमधील एकूण मुक्त अमीनो आम्ल सामग्री सुधारित निनहायड्रिन अभिकर्मक (थर्मो सायंटिफिक केमिकल्स, वॉल्थम, एमए, यूएसए) वापरून निश्चित केली गेली. थोडक्यात, पीएच ५.४ बफरसह ०.१ ग्रॅम ग्राउंड टिशू काढला गेला आणि २०० μL सुपरनॅटंटची २०० μL निनहायड्रिन (२%) आणि २०० μL पायरीडिन (१०%; स्पेक्ट्रम केमिकल, न्यू ब्रंसविक, एनजे, यूएसए) सह अभिक्रिया करण्यात आली, उकळत्या पाण्याच्या बाथमध्ये ३० मिनिटे उबवले गेले, नंतर थंड केले गेले आणि UV-१६०A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाडझू कॉर्पोरेशन, जपान) वापरून ५८० एनएम मोजले गेले. दुसरीकडे, बेट्स पद्धतीद्वारे प्रोलाइन निश्चित केले गेले (बेट्स एट अल., १९७३). प्रोलाइन ३% सल्फोसॅलिसिलिक आम्ल (थर्मो सायंटिफिक केमिकल्स, वॉल्थम, एमए, यूएसए) वापरून काढण्यात आले आणि सेंट्रीफ्यूगेशननंतर, ०.५ मिली सुपरनॅटंट १ मिली ग्लेशियल एसिटिक आम्ल (फिशर सायंटिफिक, हॅम्प्टन, एनएच, यूएसए) आणि निनहायड्रिन अभिकर्मकात मिसळण्यात आले, ९०°C वर ४५ मिनिटांसाठी उबवले गेले, थंड केले गेले आणि वरीलप्रमाणेच स्पेक्ट्रोफोटोमीटर वापरून ५२० nm वर मोजले गेले. पानांच्या अर्कांमधील एकूण मुक्त अमीनो आम्ल आणि प्रोलाइन अनुक्रमे ग्लाइसिन आणि प्रोलाइन कॅलिब्रेशन वक्र (सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, MO, यूएसए) वापरून निश्चित केले गेले आणि mg/g ताजे वजन म्हणून व्यक्त केले गेले.
अँटिऑक्सिडंट एन्झाईम्सची एन्झाइमॅटिक क्रिया निश्चित करण्यासाठी, अंदाजे ५०० मिलीग्राम एकसंध ऊती ३ मिली ५० मिलीमीटर ट्रिस बफर (पीएच ७.८) वापरून काढली गेली ज्यामध्ये १ मिलीमीटर EDTA-Na2 (सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, MO, USA) आणि ७.५% पॉलीव्हिनिलपायरोलिडोन (PVP; सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, MO, USA) होते, रेफ्रिजरेशन (४ °C) अंतर्गत २० मिनिटांसाठी १०,००० × g वर सेंट्रीफ्यूज केले गेले आणि सुपरनॅटंट (क्रूड एन्झाईम अर्क) गोळा केले गेले (एल-नगर एट अल., २०२३; ओस्मान एट अल., २०२३). त्यानंतर कॅटालेस (CAT) ला 0.1 M सोडियम फॉस्फेट बफरच्या 2 मिली (pH 6.5; सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, MO, USA) आणि 100 μl 269 mM H2O2 द्रावणाने अभिक्रिया करून त्याची एंजाइमॅटिक क्रिया Aebi (1984) च्या पद्धतीनुसार थोड्याशा बदलांसह निश्चित केली गेली (एल-नागर एट अल., 2023; ओस्मान एट अल., 2023). हॅराच एट अल. (2009) च्या पद्धतीचा वापर करून ग्वायाकोल-आश्रित पेरोक्सिडेस (POX) एंजाइमॅटिक क्रिया निश्चित केली गेली. (२००८) किरकोळ बदलांसह (एल-नगर एट अल., २०२३; ओस्मान एट अल., २०२३) आणि पॉलीफेनॉल ऑक्सिडेस (पीपीओ) ची एंजाइमॅटिक क्रिया १०० एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच ६.०) च्या २.२ मिली, ग्वायाकोलचे १०० μl (टीसीआय केमिकल्स, पोर्टलँड, ओरेगॉन, यूएसए) आणि १२ एमएम एच२ओ२ च्या १०० μl सह अभिक्रिया केल्यानंतर निश्चित केली गेली. ही पद्धत (एल-नगर एट अल., २०२३; ओस्मान एट अल., २०२३) पासून थोडीशी सुधारित करण्यात आली. ०.१ एम फॉस्फेट बफर (पीएच ६.०) मध्ये ताज्या पद्धतीने तयार केलेल्या ३ मिली कॅटेकॉल द्रावण (थर्मो सायंटिफिक केमिकल्स, वॉल्थम, एमए, यूएसए) (०.०१ एम) सह अभिक्रिया केल्यानंतर परख करण्यात आली. २४० एनएम (A२४०) वर H2O2 च्या विघटनाचे निरीक्षण करून CAT क्रियाकलाप मोजला गेला, ४३६ एनएम (A४३६) वर शोषण वाढीचे निरीक्षण करून POX क्रियाकलाप मोजला गेला आणि UV-१६०A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाडझू, जपान) वापरून ३ मिनिटांसाठी दर ३० सेकंदांनी ४९५ एनएम (A४९५) वर शोषण चढउतार नोंदवून PPO क्रियाकलाप मोजला गेला.
शेवटच्या उपचारानंतर ७२ तासांनी बीनच्या पानांमध्ये (वरच्या बाजूला दुसरी आणि तिसरी पूर्णपणे विकसित पाने) पेरोक्सिसोमल कॅटालेस (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), सुपरऑक्साइड डिसम्युटेज (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), आणि ग्लूटाथिओन रिडक्टेस (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1) यासह तीन अँटीऑक्सिडंट-संबंधित जनुकांच्या ट्रान्सक्रिप्ट पातळी शोधण्यासाठी रिअल-टाइम RT-PCR वापरण्यात आला. थोडक्यात, उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार सिम्पली पी टोटल आरएनए एक्सट्रॅक्शन किट (कॅट. क्र. BSC52S1; बायोफ्लक्स, बायोरी टेक्नॉलॉजी, चीन) वापरून आरएनए वेगळे करण्यात आले. त्यानंतर, उत्पादकाच्या सूचनांनुसार TOP स्क्रिप्ट™ cDNA सिंथेसिस किट वापरून cDNA संश्लेषित करण्यात आले. वरील तीन जनुकांचे प्राइमर अनुक्रम पूरक तक्ता S3 मध्ये सूचीबद्ध आहेत. घरकाम जनुक म्हणून PvActin-3 (GenBank अ‍ॅक्सेसन क्रमांक: XM_068616709.1) वापरण्यात आला आणि सापेक्ष जनुक अभिव्यक्ती 2-ΔΔCT पद्धतीचा वापर करून मोजण्यात आली (Livak आणि Schmittgen, 2001). जैविक ताण (सामान्य शेंगदाणे आणि अँथ्रॅकनोज बुरशी कोलेटोट्रिचम लिंडेमुथियानम यांच्यातील विसंगत संवाद) आणि अजैविक ताण (दुष्काळ, क्षारता, कमी तापमान) अंतर्गत अॅक्टिन स्थिरता दर्शविली गेली (बोर्जेस एट अल., 2012).
आम्ही सुरुवातीला प्रोटीन-प्रोटीन BLAST टूल (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) वापरून S. sclerotiorum मधील ऑक्सॅलोएसीटेट एसिटाइलहायड्रोलेज (OAH) प्रथिनांचे जीनोम-वाइड इन सिलिको विश्लेषण केले. थोडक्यात, आम्ही S. sclerotiorum (टॅक्साइड: 5180) मधील होमोलोगस प्रथिन मॅप करण्यासाठी क्वेरी अनुक्रम म्हणून Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; टॅक्साइड: 1191702; GenBank अॅक्सेसियन नंबर XP_040799428.1; 342 अमीनो अॅसिड) आणि Penicillium lagena (PlOAH; टॅक्साइड: 94218; GenBank अॅक्सेसियन नंबर XP_056833920.1; 316 अमीनो अॅसिड) मधील OAH वापरले. नॅशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नॉलॉजी इन्फॉर्मेशन (NCBI) च्या वेबसाइट, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ वर GenBank मधील सर्वात अलिकडच्या उपलब्ध S. sclerotiorum जीनोम डेटावर BLASTp चाचणी करण्यात आली.
याव्यतिरिक्त, एस. स्क्लेरोटीओरम (SsOAH) मधील अंदाजित OAH जनुक आणि ए. फिजिएन्सिस CBS 313.89 मधील AfOAH चे उत्क्रांती विश्लेषण आणि फायलोजेनेटिक ट्री आणि पी. लगेना मधील PlOAH चे MEGA11 (Tamura et al., 2021) आणि JTT मॅट्रिक्स-आधारित मॉडेल (जोन्स et al., 1992) मध्ये जास्तीत जास्त शक्यता पद्धत वापरून अनुमान काढले गेले. फायलोजेनेटिक ट्री हे एस. स्क्लेरोटीओरम मधील सर्व अंदाजित OAH जनुकांच्या (SsOAH) प्रथिने अनुक्रमांच्या बहुविध संरेखन विश्लेषणासह आणि कंस्ट्रेंट-बेस्ड अलाइनमेंट टूल (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (पापाडोपौलोस आणि अगरवाला, 2007) वापरून क्वेरी अनुक्रमासह एकत्रित केले गेले. याव्यतिरिक्त, S. sclerotiorum मधील SsOAH चे सर्वोत्तम जुळणारे अमीनो आम्ल अनुक्रम ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) वापरून क्वेरी अनुक्रम (AfOAH आणि PlOAH) (Larkin et al., 2007) शी संरेखित केले गेले आणि ESPript टूल (आवृत्ती 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) वापरून संरेखनातील संरक्षित प्रदेश दृश्यमान केले गेले.
शिवाय, इंटरप्रो टूल (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (ब्लम एट अल., २०२१) वापरून एस. स्क्लेरोटीओरम एसएसओएएचचे अंदाजित कार्यात्मक प्रतिनिधी डोमेन आणि संरक्षित स्थळे परस्परसंवादीपणे वेगवेगळ्या कुटुंबांमध्ये वर्गीकृत करण्यात आली. शेवटी, प्रोटीन होमोलॉजी/अ‍ॅनालॉजी रिकग्निशन इंजिन (फायर२ सर्व्हर आवृत्ती २.०; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (केली एट अल., २०१५) वापरून अंदाजित एस. स्क्लेरोटीओरम एसएसओएएचचे त्रिमितीय (३डी) संरचना मॉडेलिंग केले गेले आणि SWISS-MODEL सर्व्हर (https://swissmodel.expasy.org/) (बियासिनी एट अल., २०१४) वापरून प्रमाणित केले गेले. अंदाजित त्रिमितीय संरचना (PDB स्वरूप) UCSF-Chimera पॅकेज (आवृत्ती 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004) वापरून परस्परसंवादीपणे दृश्यमान केल्या गेल्या.
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटीओरमच्या मायसेलियामध्ये ऑक्सॅलोएसीटेट एसिटाइलहायड्रोलेज (SsOAH; जेनबँक अ‍ॅक्सेसन नंबर: XM_001590428.1) चे ट्रान्सक्रिप्शनल लेव्हल निश्चित करण्यासाठी क्वांटिटेटिव्ह रिअल-टाइम फ्लूरोसेन्स पीसीआर वापरण्यात आला. थोडक्यात, एस. स्क्लेरोटीओरमला पीडीबी असलेल्या फ्लास्कमध्ये टोचण्यात आले आणि २५ ± २ °C तापमानावर १५० आरपीएमवर २४ तासांसाठी आणि सतत अंधारात (२४ तास) ठेवण्यात आले जेणेकरून मायसेलियाची वाढ उत्तेजित होईल. त्यानंतर, पेशींवर अंतिम IC50 सांद्रता (अनुक्रमे अंदाजे ४० आणि ३.२ मिलीग्राम/लीटर) वर एल-ऑर्निथिन आणि बुरशीनाशक रिझोलेक्स-टीने उपचार करण्यात आले आणि नंतर त्याच परिस्थितीत आणखी २४ तासांसाठी कल्चर करण्यात आले. उष्मायनानंतर, कल्चरना 5 मिनिटांसाठी 2500 rpm वर सेंट्रीफ्यूज केले गेले आणि जनुक अभिव्यक्ती विश्लेषणासाठी सुपरनॅटंट (फंगल मायसेलियम) गोळा केले गेले. त्याचप्रमाणे, संक्रमित ऊतींच्या पृष्ठभागावर पांढरा बुरशी आणि कापसाचा मायसेलियम तयार झालेल्या संक्रमित वनस्पतींमधून संसर्गानंतर 0, 24, 48, 72, 96 आणि 120 तासांवर बुरशीजन्य मायसेलियम गोळा केले गेले. बुरशीजन्य मायसेलियममधून RNA काढला गेला आणि नंतर वर वर्णन केल्याप्रमाणे cDNA संश्लेषित केले गेले. SsOAH साठी प्रायमर अनुक्रम पूरक तक्ता S3 मध्ये सूचीबद्ध आहेत. SsActin (GenBank प्रवेश क्रमांक: XM_001589919.1) हाऊसकीपिंग जीन म्हणून वापरला गेला आणि 2-ΔΔCT पद्धत वापरून सापेक्ष जनुक अभिव्यक्तीची गणना केली गेली (Livak आणि Schmittgen, 2001).
बटाट्याच्या डेक्स्ट्रोज ब्रोथ (PDB) आणि स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम या बुरशीजन्य रोगजनक असलेल्या वनस्पतींच्या नमुन्यांमध्ये ऑक्सॅलिक अॅसिडचे निर्धारण झू आणि झांग (२०००) यांच्या पद्धतीनुसार थोड्याफार बदलांसह करण्यात आले. थोडक्यात, एस. स्क्लेरोटिओरम आयसोलेट्सना PDB असलेल्या फ्लास्कमध्ये टोचण्यात आले आणि नंतर हलणाऱ्या इनक्यूबेटरमध्ये (मॉडेल I2400, न्यू ब्रंसविक सायंटिफिक कंपनी, एडिसन, NJ, USA) १५० rpm वर २५ ± २ °C वर ३-५ दिवस सतत अंधारात (२४ तास) कल्चर केले गेले जेणेकरून मायसेलियल वाढ उत्तेजित होईल. उष्मायनानंतर, बुरशीजन्य कल्चर प्रथम व्हॉटमन #१ फिल्टर पेपरद्वारे फिल्टर केले गेले आणि नंतर अवशिष्ट मायसेलियम काढून टाकण्यासाठी २५०० rpm वर ५ मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले. ऑक्सलेटचे अधिक परिमाणात्मक निर्धारण करण्यासाठी सुपरनॅटंट ४°C वर गोळा केले गेले आणि साठवले गेले. वनस्पतींचे नमुने तयार करण्यासाठी, अंदाजे ०.१ ग्रॅम वनस्पती ऊतींचे तुकडे डिस्टिल्ड वॉटरने तीन वेळा (प्रत्येक वेळी २ मिली) काढले गेले. त्यानंतर नमुने २५०० आरपीएमवर ५ मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले, सुपरनॅटंट व्हॉटमन नंबर १ फिल्टर पेपरद्वारे कोरडे फिल्टर केले गेले आणि पुढील विश्लेषणासाठी गोळा केले गेले.
ऑक्सॅलिक आम्लाच्या परिमाणात्मक विश्लेषणासाठी, प्रतिक्रिया मिश्रण एका काचेच्या स्टॉपर्ड ट्यूबमध्ये खालील क्रमाने तयार केले गेले: 0.2 मिली नमुना (किंवा PDB कल्चर फिल्टरेट किंवा ऑक्सॅलिक आम्लाचे मानक द्रावण), 0.11 मिली ब्रोमोफेनॉल ब्लू (BPB, 1 mM; फिशर केमिकल, पिट्सबर्ग, PA, USA), 0.198 मिली 1 M सल्फ्यूरिक आम्ल (H2SO4; अल-गोम्होरिया फार्मास्युटिकल्स अँड मेडिकल सप्लाय, कैरो, इजिप्त) आणि 0.176 मिली 100 mM पोटॅशियम डायक्रोमेट (K2Cr2O7; TCI रसायने, पोर्टलँड, OR, USA), आणि नंतर द्रावण डिस्टिल्ड पाण्याने 4.8 मिली पर्यंत पातळ केले गेले, जोरदारपणे मिसळले गेले आणि लगेच 60 °C पाण्याच्या बाथमध्ये ठेवले गेले. 10 मिनिटांनंतर, 0.5 मिली सोडियम हायड्रॉक्साईड द्रावण (NaOH; 0.75 M) घालून प्रतिक्रिया थांबवण्यात आली. UV-160 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाडझू कॉर्पोरेशन, जपान) वापरून प्रतिक्रिया मिश्रणाचे शोषण (A600) 600 nm वर मोजले गेले. कल्चर फिल्टरेट्स आणि वनस्पती नमुन्यांच्या प्रमाणासाठी अनुक्रमे PDB आणि डिस्टिल्ड वॉटरचा वापर नियंत्रण म्हणून केला गेला. कल्चर फिल्टरेट्समधील ऑक्सॅलिक अॅसिड सांद्रता, PDB माध्यमाच्या प्रति मिलीलीटर (μg.mL−1) मायक्रोग्राम ऑक्सॅलिक अॅसिड म्हणून व्यक्त केली जाते आणि पानांच्या अर्कांमध्ये, ताज्या वजनाच्या प्रति ग्रॅम (μg.g−1 FW) मायक्रोग्राम ऑक्सॅलिक अॅसिड म्हणून व्यक्त केली जाते, ऑक्सॅलिक अॅसिड कॅलिब्रेशन वक्र (थर्मो फिशर सायंटिफिक केमिकल्स, वॉल्थम, एमए, यूएसए) वापरून निश्चित केली गेली.
संपूर्ण अभ्यासादरम्यान, सर्व प्रयोग पूर्णपणे यादृच्छिक डिझाइन (CRD) मध्ये डिझाइन केले गेले होते ज्यामध्ये प्रत्येक उपचारासाठी सहा जैविक प्रतिकृती आणि प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीसाठी पाच कुंड्या (प्रति कुंड दोन वनस्पती) होत्या, जोपर्यंत अन्यथा सांगितले जात नाही. जैविक प्रतिकृतींचे डुप्लिकेटमध्ये विश्लेषण केले गेले (दोन तांत्रिक प्रतिकृती). तांत्रिक प्रतिकृतींचा वापर एकाच प्रयोगाची पुनरुत्पादनक्षमता तपासण्यासाठी केला गेला परंतु बनावट प्रतिकृती टाळण्यासाठी सांख्यिकीय विश्लेषणात त्यांचा वापर केला गेला नाही. डेटाचे सांख्यिकीय विश्लेषण भिन्नतेचे विश्लेषण (ANOVA) वापरून केले गेले आणि त्यानंतर तुके-क्रामर प्रामाणिकपणे लक्षणीय फरक (HSD) चाचणी (p ≤ 0.05) केली गेली. इन विट्रो प्रयोगांसाठी, प्रोबिट मॉडेल वापरून IC50 आणि IC99 मूल्ये मोजली गेली आणि 95% आत्मविश्वास अंतराल मोजले गेले.
इजिप्तमधील एल गाबिया गव्हर्नरेटमधील वेगवेगळ्या सोयाबीन शेतातून एकूण चार आयसोलेट गोळा करण्यात आले. पीडीए माध्यमावर, सर्व आयसोलेटने क्रिमी व्हाइट मायसेलियम तयार केले जे त्वरीत कापसाचे पांढरे झाले (आकृती 1A) आणि नंतर स्क्लेरोटियम टप्प्यावर बेज किंवा तपकिरी झाले. स्क्लेरोटिया सहसा दाट, काळा, गोलाकार किंवा अनियमित आकाराचे असतात, 5.2 ते 7.7 मिमी लांब आणि 3.4 ते 5.3 मिमी व्यासाचे (आकृती 1B). जरी चार आयसोलेटने 25 ± 2 °C (आकृती 1A) वर 10-12 दिवसांच्या उष्मायनानंतर कल्चर माध्यमाच्या काठावर स्क्लेरोटियाचा एक सीमांत नमुना विकसित केला, तरीही प्रति प्लेट स्क्लेरोटियाची संख्या त्यांच्यामध्ये लक्षणीयरीत्या भिन्न होती (P < 0.001), आयसोलेट 3 मध्ये स्क्लेरोटियाची सर्वाधिक संख्या होती (प्रति प्लेट 32.33 ± 1.53 स्क्लेरोटिया; आकृती 1C). त्याचप्रमाणे, आयसोलेट #3 ने इतर आयसोलेटपेक्षा PDB मध्ये जास्त ऑक्सॅलिक अॅसिड तयार केले (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; आकृती 1D). आयसोलेट #3 मध्ये फायटोपॅथोजेनिक बुरशी स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरमची विशिष्ट आकारिकीय आणि सूक्ष्म वैशिष्ट्ये दिसून आली. उदाहरणार्थ, PDA वर, आयसोलेट #3 च्या वसाहती वेगाने वाढल्या, त्या क्रिमी पांढर्‍या होत्या (आकृती 1A), उलट बेज किंवा हलक्या सॅल्मन पिवळ्या-तपकिरी होत्या आणि 9 सेमी व्यासाच्या प्लेटची पृष्ठभाग पूर्णपणे झाकण्यासाठी 25 ± 2°C वर 6-7 दिवस लागतात. वरील आकारिकीय आणि सूक्ष्म वैशिष्ट्यांवर आधारित, आयसोलेट #3 ला स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम म्हणून ओळखले गेले.
आकृती १. सामान्य शेंगा पिकांमधून एस. स्क्लेरोटीओरम आयसोलेट्सची वैशिष्ट्ये आणि रोगजनकता. (अ) पीडीए माध्यमावर चार एस. स्क्लेरोटीओरम आयसोलेट्सची मायसेलियल वाढ, (ब) चार एस. स्क्लेरोटीओरम आयसोलेट्सची स्क्लेरोटीया, (क) स्क्लेरोटीयाची संख्या (प्रति प्लेट), (ड) पीडीबी माध्यमावर ऑक्सॅलिक आम्ल स्राव (μg.mL−1), आणि (ई) ग्रीनहाऊस परिस्थितीत संवेदनशील व्यावसायिक शेंगा जाती गिझा ३ वर चार एस. स्क्लेरोटीओरम आयसोलेट्सची रोग तीव्रता (%). मूल्ये पाच जैविक प्रतिकृतींचे सरासरी ± SD दर्शवतात (n = 5). वेगवेगळी अक्षरे उपचारांमधील सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण फरक दर्शवतात (p < 0.05). (F–H) आयसोलेट #3 (dpi) सह लसीकरणानंतर 10 दिवसांनी जमिनीवरील देठांवर आणि सिलिकवर विशिष्ट पांढरी बुरशीची लक्षणे दिसू लागली. (I) एस. स्क्लेरोटीओरम आयसोलेट #3 च्या अंतर्गत ट्रान्सक्राइब्ड स्पेसर (ITS) क्षेत्राचे उत्क्रांती विश्लेषण जास्तीत जास्त शक्यता पद्धतीचा वापर करून केले गेले आणि नॅशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नॉलॉजी इन्फॉर्मेशन (NCBI) डेटाबेस (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) मधून मिळवलेल्या २० संदर्भ आयसोलेट्स/स्ट्रेन्सशी तुलना केली गेली. क्लस्टरिंग लाईन्सच्या वरील संख्या प्रदेश कव्हरेज (%) दर्शवितात आणि क्लस्टरिंग लाईन्सच्या खाली संख्या शाखेची लांबी दर्शवितात.
शिवाय, रोगजनकतेची पुष्टी करण्यासाठी, चार मिळवलेले एस. स्क्लेरोटीओरम आयसोलेट्स ग्रीनहाऊस परिस्थितीत संवेदनशील व्यावसायिक बीन जाती गिझा 3 ला लसीकरण करण्यासाठी वापरले गेले, जे कोचच्या सिद्धांतांशी सुसंगत आहे (आकृती 1E). जरी मिळवलेले सर्व बुरशीजन्य आयसोलेट्स रोगजनक होते आणि हिरव्या बीनला संक्रमित करू शकतात (cv. गिझा 3), ज्यामुळे जमिनीवरील सर्व भागांवर (आकृती 1F), विशेषतः देठांवर (आकृती 1G) आणि शेंगा (आकृती 1H) 10 दिवसांच्या लसीकरणानंतर (dpi), विशिष्ट पांढरी बुरशीची लक्षणे उद्भवतात, दोन स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये आयसोलेट्स 3 सर्वात आक्रमक आयसोलेट्स होते. आयसोलेट्स 3 मध्ये बीन वनस्पतींवर सर्वाधिक रोग तीव्रता (%) होती (अनुक्रमे 7, 14 आणि 21 दिवसांच्या संसर्गानंतर; आकृती 1F).
सर्वात आक्रमक एस. स्क्लेरोटीओरम आयसोलेट #3 ची ओळख अंतर्गत ट्रान्सक्राइब्ड स्पेसर (ITS) सिक्वेन्सिंग (आकृती 1I) च्या आधारे आणखी पुष्टी करण्यात आली. आयसोलेट #3 आणि 20 रेफरन्स आयसोलेट्स/स्ट्रेन्समधील फायलोजेनेटिक विश्लेषणात त्यांच्यामध्ये उच्च समानता (>99%) दिसून आली. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की एस. स्क्लेरोटीओरम आयसोलेट #3 (533 bp) मध्ये कोरड्या वाटाणा बियाण्यांपासून वेगळे केलेल्या अमेरिकन एस. स्क्लेरोटीओरम आयसोलेट LPM36 (GenBank अ‍ॅक्सेसियन क्रमांक MK896659.1; 540 bp) आणि चायनीज एस. स्क्लेरोटीओरम आयसोलेट YKY211 (GenBank अ‍ॅक्सेसियन क्रमांक OR206374.1; 548 bp) शी उच्च समानता आहे, ज्यामुळे व्हायलेट (मॅथिओला इंकाना) स्टेम रॉट होतो, जे सर्व डेंड्रोग्रामच्या शीर्षस्थानी स्वतंत्रपणे गटबद्ध केले आहेत (आकृती 1I). नवीन क्रम NCBI डेटाबेसमध्ये जमा करण्यात आला आहे आणि त्याला “स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटीओरम – आयसोलेट YN-25” (GenBank अ‍ॅक्सेसियन क्रमांक PV202792) असे नाव देण्यात आले आहे. हे दिसून येते की आयसोलेट 3 हा सर्वात आक्रमक आयसोलेट आहे; म्हणून, त्यानंतरच्या सर्व प्रयोगांमध्ये अभ्यासासाठी हा आयसोलेट निवडला गेला.
वेगवेगळ्या सांद्रतेमध्ये (१२.५, २५, ५०, ७५, १०० आणि १२५ मिलीग्राम/लिटर) एस. स्क्लेरोटीओरम आयसोलेट ३ विरुद्ध डायमाइन एल-ऑर्निथिन (सिग्मा-अल्ड्रिच, डार्मस्टॅड, जर्मनी) च्या बॅक्टेरियाच्या वाढीस प्रतिबंध करणारा पदार्थ क्रियाकलापांचा अभ्यास इन विट्रोमध्ये करण्यात आला. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की एल-ऑर्निथिनने बॅक्टेरियाच्या वाढीस प्रतिबंध करणारा पदार्थ प्रभाव पाडला आणि डोस-अवलंबित पद्धतीने एस. स्क्लेरोटीओरम हायफेच्या रेडियल वाढीस हळूहळू प्रतिबंधित केले (आकृती २अ, ब). चाचणी केलेल्या सर्वोच्च एकाग्रतेवर (१२५ मिलीग्राम/लिटर), एल-ऑर्निथिनने सर्वोच्च मायसेलियल वाढ प्रतिबंध दर (९९.६२ ± ०.२७%; आकृती २ब) प्रदर्शित केला, जो व्यावसायिक बुरशीनाशक रिझोलेक्स-टी (प्रतिबंध दर ९९.४५ ± ०.३९%; आकृती २क) च्या समतुल्य होता, जो चाचणी केलेल्या सर्वोच्च सांद्रतेवर (१० मिलीग्राम/लिटर) समान कार्यक्षमता दर्शवितो.
आकृती २. स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटीओरम विरुद्ध एल-ऑर्निथिनची इन विट्रो अँटीबॅक्टेरियल क्रिया. (अ) एस. स्क्लेरोटीओरम विरुद्ध एल-ऑर्निथिनच्या वेगवेगळ्या सांद्रतांच्या अँटीबॅक्टेरियल क्रियाकलापांची तुलना व्यावसायिक बुरशीनाशक रिझोलेक्स-टी (१० मिग्रॅ/लिटर) सह. (ब, क) अनुक्रमे एल-ऑर्निथिन (१२.५, २५, ५०, ७५, १०० आणि १२५ मिग्रॅ/लिटर) किंवा रिझोलेक्स-टी (२, ४, ६, ८ आणि १० मिग्रॅ/लिटर) च्या वेगवेगळ्या सांद्रतांसह उपचारानंतर एस. स्क्लेरोटीओरम मायसेलियल वाढीचा प्रतिबंध दर (%). मूल्ये पाच जैविक प्रतिकृतींचे सरासरी ± SD दर्शवतात (n = ५). वेगवेगळी अक्षरे उपचारांमधील सांख्यिकीय फरक दर्शवतात (पी < ०.०५). (ड, ई) अनुक्रमे एल-ऑर्निथिन आणि व्यावसायिक बुरशीनाशक रिझोलेक्स-टीचे प्रोबिट मॉडेल रिग्रेशन विश्लेषण. प्रोबिट मॉडेल रिग्रेशन लाइन एका घन निळ्या रेषे म्हणून दर्शविली आहे आणि कॉन्फिडन्स इंटरव्हल (95%) एका तुटक लाल रेषे म्हणून दर्शविली आहे.
याव्यतिरिक्त, प्रोबिट रिग्रेशन विश्लेषण केले गेले आणि संबंधित प्लॉट तक्ता 1 आणि आकृती 2D,E मध्ये दर्शविले आहेत. थोडक्यात, L-ऑर्निथिनचे स्वीकार्य उतार मूल्य (y = 2.92x − 4.67) आणि संबंधित महत्त्वपूर्ण आकडेवारी (कॉक्स आणि स्नेल R2 = 0.3709, नागेलकेर्क R2 = 0.4998 आणि p < 0.0001; आकृती 2D) व्यावसायिक बुरशीनाशक रिझोलेक्स-टी (y = 1.96x − 0.99, कॉक्स आणि स्नेल R2 = 0.1242, नागेलकेर्क R2 = 0.1708 आणि p < 0.0001) (तक्ता 1) च्या तुलनेत एस. स्क्लेरोटीओरम विरुद्ध वाढीव अँटीफंगल क्रियाकलाप दर्शविते.
तक्ता १. एस. स्क्लेरोटीओरम विरुद्ध एल-ऑर्निथिन आणि व्यावसायिक बुरशीनाशक "रिझोलेक्स-टी" च्या अर्ध्या-जास्तीत जास्त प्रतिबंधात्मक एकाग्रता (IC50) आणि IC99 (mg/l) ची मूल्ये.
एकंदरीत, उपचार न केलेल्या एस. स्क्लेरोटीओरम-संक्रमित वनस्पतींच्या तुलनेत उपचार न केलेल्या सामान्य बीन वनस्पतींवर एल-ऑर्निथिन (२५० मिग्रॅ/लिटर) ने पांढर्‍या बुरशीचा विकास आणि तीव्रता लक्षणीयरीत्या कमी केली (नियंत्रण; आकृती ३अ). थोडक्यात, उपचार न केलेल्या संक्रमित नियंत्रण वनस्पतींची रोगाची तीव्रता हळूहळू वाढली (५२.६७ ± १.५३, ८३.२१ ± २.६१ आणि ९२.३३ ± ३.०६%), एल-ऑर्निथिनने संपूर्ण प्रयोगात (८.९७ ± ०.१५, १८.०० ± १.०० आणि २६.३६ ± ३.०७) अनुक्रमे ७, १४ आणि २१ दिवसांच्या उपचारानंतर (डीपीटी) रोगाची तीव्रता (%) लक्षणीयरीत्या कमी केली (आकृती ३अ). त्याचप्रमाणे, जेव्हा एस. स्क्लेरोटीओरम-संक्रमित बीन रोपांवर २५० मिलीग्राम/लिटर एल-ऑर्निथिनने उपचार केले गेले, तेव्हा रोग प्रगती वक्र (AUDPC) अंतर्गत क्षेत्र उपचार न केलेल्या नियंत्रणात १२७४.३३ ± ३३.१३ वरून २८१.०३ ± ७.९५ पर्यंत कमी झाले, जे सकारात्मक नियंत्रण ५० मिलीग्राम/लिटर रिझोलेक्स-टी बुरशीनाशकापेक्षा किंचित कमी होते (१८३.६१ ± ७.७१; आकृती ३ब). दुसऱ्या प्रयोगातही हाच ट्रेंड दिसून आला.
आकृती ३. ग्रीनहाऊस परिस्थितीत स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटीओरममुळे होणाऱ्या सामान्य बीनच्या पांढऱ्या कुजण्याच्या विकासावर एल-ऑर्निथिनच्या बाह्य वापराचा परिणाम. (अ) २५० मिलीग्राम/लिटर एल-ऑर्निथिनने उपचार केल्यानंतर सामान्य बीनच्या पांढऱ्या बुरशीचा रोग प्रगती वक्र. (ब) एल-ऑर्निथिनने उपचार केल्यानंतर सामान्य बीनच्या पांढऱ्या बुरशीच्या रोग प्रगती वक्र (AUDPC) अंतर्गत क्षेत्र. मूल्ये पाच जैविक प्रतिकृतींचे सरासरी ± SD दर्शवतात (n = 5). वेगवेगळी अक्षरे उपचारांमधील सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण फरक दर्शवतात (p < 0.05).
२५० मिलीग्राम/लिटर एल-ऑर्निथिनच्या बाह्य वापरामुळे ४२ दिवसांनी हळूहळू झाडाची उंची (आकृती ४अ), प्रत्येक झाडाच्या फांद्यांची संख्या (आकृती ४ब) आणि प्रत्येक झाडाच्या पानांची संख्या (आकृती ४क) वाढली. व्यावसायिक बुरशीनाशक रिझोलेक्स-टी (५० मिलीग्राम/लिटर) चा अभ्यास केलेल्या सर्व पौष्टिक मापदंडांवर सर्वात जास्त परिणाम झाला, तर २५० मिलीग्राम/लिटर एल-ऑर्निथिनच्या बाह्य वापरामुळे उपचार न केलेल्या नियंत्रणांच्या तुलनेत दुसरा सर्वात मोठा परिणाम झाला (आकृती ४अ–क). दुसरीकडे, एल-ऑर्निथिन उपचाराचा प्रकाशसंश्लेषणात्मक रंगद्रव्ये क्लोरोफिल ए (आकृती 4D) आणि क्लोरोफिल बी (आकृती 4E) च्या सामग्रीवर कोणताही महत्त्वपूर्ण परिणाम झाला नाही, परंतु नकारात्मक नियंत्रण (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) आणि सकारात्मक नियंत्रण (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; आकृती 4F) च्या तुलनेत एकूण कॅरोटीनॉइड सामग्री (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) किंचित वाढली. एकंदरीत, हे निकाल सूचित करतात की एल-ऑर्निथिन प्रक्रिया केलेल्या शेंगांसाठी फायटोटॉक्सिक नाही आणि त्यांची वाढ देखील उत्तेजित करू शकते.
आकृती ४. ग्रीनहाऊस परिस्थितीत स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटीओरमने संक्रमित बीन पानांच्या वाढीच्या वैशिष्ट्यांवर आणि प्रकाशसंश्लेषण रंगद्रव्यांवर बाह्य एल-ऑर्निथिन वापराचा परिणाम. (अ) वनस्पतीची उंची (सेमी), (ब) प्रत्येक वनस्पतीच्या फांद्यांची संख्या, (क) प्रत्येक वनस्पतीच्या पानांची संख्या, (ड) क्लोरोफिल ए चे प्रमाण (मिग्रॅ जी-१ फ्रा wt), (इ) क्लोरोफिल बी चे प्रमाण (मिग्रॅ जी-१ फ्रा wt), (फ) एकूण कॅरोटीनॉइडचे प्रमाण (मिग्रॅ जी-१ फ्रा wt). मूल्ये ही पाच जैविक प्रतिकृतींचे सरासरी ± SD आहेत (n = 5). वेगवेगळी अक्षरे उपचारांमधील सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण फरक दर्शवतात (पी < ०.०५).
प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजातींचे (ROS; हायड्रोजन पेरोक्साइड [H2O2] म्हणून व्यक्त केलेले) आणि मुक्त रॅडिकल्स (सुपरऑक्साइड आयन म्हणून व्यक्त केलेले [O2•−]) इन सिटू हिस्टोकेमिकल लोकॅलायझेशन असे दिसून आले की L-ऑर्निथिन (250 mg/L) च्या बाह्य वापरामुळे H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; आकृती 5A) आणि O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; आकृती 5B) चे संचय लक्षणीयरीत्या कमी झाले, जे अनुक्रमे उपचार न केलेल्या संक्रमित वनस्पती (173.31 ± 12.06 आणि 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) आणि व्यावसायिक बुरशीनाशक Rizolex-T (170.12 ± 9.50 आणि 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr) च्या संचयाच्या तुलनेत होते. ७२ तासांवर अनुक्रमे wt). hpt अंतर्गत H2O2 आणि O2•− चे उच्च स्तर जमा झाले (आकृती ५A, B). त्याचप्रमाणे, TCA-आधारित मॅलोंडियाल्डिहाइड (MDA) चाचणीने असे दर्शविले की S. स्क्लेरोटीओरम-संक्रमित बीन वनस्पतींनी त्यांच्या पानांमध्ये MDA (११३.४८ ± १०.०२ nmol.g fr wt) चे उच्च स्तर जमा केले (आकृती ५C). तथापि, L-ऑर्निथिनच्या बाह्य वापरामुळे लिपिड पेरोक्सिडेशनमध्ये लक्षणीय घट झाली, जी प्रक्रिया केलेल्या वनस्पतींमध्ये MDA सामग्रीमध्ये घट (३३.०८ ± ४.०० nmol.g fr wt) द्वारे सिद्ध होते.
आकृती ५. ग्रीनहाऊस परिस्थितीत संसर्ग झाल्यानंतर ७२ तासांनी एस. स्क्लेरोटीओरमने संक्रमित बीनच्या पानांमध्ये ऑक्सिडेटिव्ह ताण आणि नॉन-एंझायमेटिक अँटीऑक्सिडंट संरक्षण यंत्रणेच्या प्रमुख मार्करवर बाह्य एल-ऑर्निथिन वापराचा परिणाम. (अ) ७२ एचपीटीवर हायड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2; nmol g−1 FW), (ब) ७२ एचपीटीवर सुपरऑक्साइड आयन (O2•−; nmol g−1 FW), (क) ७२ एचपीटीवर मॅलोंडियाल्डिहाइड (MDA; nmol g−1 FW), (ड) ७२ एचपीटीवर एकूण विरघळणारे फिनॉल (मिग्रॅ GAE g−1 FW), (ई) ७२ एचपीटीवर एकूण विरघळणारे फ्लेव्होनॉइड्स (मिग्रॅ RE g−1 FW), (फॉर्म) ७२ एचपीटीवर एकूण मुक्त अमीनो आम्ल (मिग्रॅ g−1 FW) आणि (ग) ७२ एचपीटीवर प्रोलाइन सामग्री (मिग्रॅ g−1 FW). मूल्ये ५ जैविक प्रतिकृतींचे सरासरी ± मानक विचलन (सरासरी ± SD) दर्शवतात (n = ५). वेगवेगळी अक्षरे उपचारांमधील सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण फरक दर्शवतात (p < ०.०५).