आम्ही यापूर्वी असे कळवले होते की यकृत फायब्रोसिस असलेल्या रुग्णांमध्ये आतड्यांमधून तयार होणाऱ्या ट्रिप्टोफॅन मेटाबोलाइट इंडोल-३-प्रोपियोनिक ॲसिड (IPA) ची रक्तातील पातळी कमी असते. या अभ्यासात, आम्ही रक्तातील IPA पातळीच्या संदर्भात लठ्ठ यकृतांमधील ट्रान्सक्रिप्टोम आणि डीएनए मेथिलोमचा, तसेच इन विट्रोमध्ये यकृताच्या स्टिलेट पेशींचे (HSCs) फेनोटाइपिक निष्क्रियीकरण घडवून आणण्यात IPA च्या भूमिकेचा अभ्यास केला.
या अभ्यासात कुओपियो बॅरिएट्रिक सर्जरी सेंटर (KOBS) येथे बॅरिएट्रिक शस्त्रक्रिया झालेल्या, टाईप २ मधुमेह (T2DM) नसलेल्या ११६ लठ्ठ रुग्णांचा समावेश होता (वय ४६.८ ± ९.३ वर्षे; बीएमआय: ४२.७ ± ५.० किलोग्रॅम/मी²). रक्तातील आयपीए (IPA) पातळी लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) द्वारे मोजण्यात आली, यकृताच्या ट्रान्सक्रिप्टोमचे विश्लेषण टोटल आरएनए सिक्वेन्सिंगद्वारे करण्यात आले आणि डीएनए मेथिलेशनचे विश्लेषण इन्फिनियम ह्युमनमेथिलेशन४५० बीडचिप वापरून करण्यात आले. इन विट्रो प्रयोगांसाठी मानवी यकृताच्या स्टेललेट पेशी (LX-2) वापरण्यात आल्या.
रक्तातील आयपीएची पातळी यकृतातील ॲपोप्टोटिक, मायटोफॅजिक आणि दीर्घायुष्य मार्गांमध्ये सामील असलेल्या जनुकांच्या अभिव्यक्तीशी संबंधित होती. यकृताच्या ट्रान्सक्रिप्ट आणि डीएनए मिथायलेशन प्रोफाइलमध्ये AKT सेरीन/थ्रिओनिन कायनेज 1 (AKT1) हे जनुक सर्वात मुबलक आणि प्रमुख आंतरक्रिया करणारे जनुक होते. आयपीए उपचाराने LX-2 पेशींमधील फायब्रोसिस, ॲपोप्टोसिस आणि जगण्याचे नियमन करणाऱ्या जनुकांच्या अभिव्यक्तीमध्ये बदल घडवून ॲपोप्टोसिस प्रेरित केला, मायटोकॉन्ड्रियल श्वसन कमी केले आणि पेशींची रचना व मायटोकॉन्ड्रियल गतिशीलतेत बदल घडवला.
एकत्रितपणे पाहता, ही माहिती या गोष्टीला दुजोरा देते की आयपीए (IPA) मध्ये संभाव्य उपचारात्मक प्रभाव आहेत आणि ते एपोप्टोसिस प्रेरित करून एचएससी (HSC) फेनोटाइपला निष्क्रिय अवस्थेकडे वळवू शकते, ज्यामुळे एचएससी (HSC) सक्रियकरण आणि मायटोकॉन्ड्रियल चयापचयात हस्तक्षेप करून यकृत फायब्रोसिसला प्रतिबंध करण्याची शक्यता वाढते.
लठ्ठपणा आणि मेटाबॉलिक सिंड्रोमच्या वाढत्या प्रमाणामुळे मेटाबॉलिकली असोसिएटेड फॅटी लिव्हर डिसीज (MASLD) चे प्रमाण वाढत आहे; हा आजार सामान्य लोकसंख्येच्या २५% ते ३०% लोकांना होतो [१]. MASLD च्या कारणमीमांसेचा मुख्य परिणाम म्हणजे लिव्हर फायब्रोसिस, ही एक गतिशील प्रक्रिया आहे जी तंतुमय बाह्यकोशिकीय मॅट्रिक्स (ECM) च्या सतत संचयनाने वैशिष्ट्यीकृत आहे [२]. लिव्हर फायब्रोसिसमध्ये सामील असलेल्या मुख्य पेशी हेपॅटिक स्टिलेट सेल्स (HSCs) आहेत, ज्या चार ज्ञात फेनोटाइप दर्शवतात: शांत (quiescent), सक्रिय (activated), निष्क्रिय (inactivated), आणि वृद्ध (senescent) [३, ४]. HSCs सक्रिय होऊ शकतात आणि शांत स्वरूपातून उच्च ऊर्जेची मागणी असलेल्या, α-स्मूथ मसल ॲक्टिन (α-SMA) आणि टाइप I कोलेजन (Col-I) च्या वाढीव अभिव्यक्तीसह, प्रसारक्षम फायब्रोब्लास्ट-सारख्या पेशींमध्ये रूपांतरित होऊ शकतात [५, ६]. लिव्हर फायब्रोसिसच्या उलट प्रक्रियेदरम्यान, सक्रिय HSCs ॲपोप्टोसिस किंवा निष्क्रियतेद्वारे नष्ट होतात. या प्रक्रियांमध्ये फायब्रोजेनिक जनुकांचे डाउनरेग्युलेशन आणि प्रोसर्वायव्हल जनुकांचे मॉड्युलेशन (जसे की NF-κB आणि PI3K/Akt सिग्नलिंग मार्ग) [7, 8], तसेच मायटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स आणि कार्यात बदल [9] यांचा समावेश आहे.
आतड्यात तयार होणाऱ्या ट्रिप्टोफॅन मेटाबोलाइट इंडोल-३-प्रोपियोनिक ॲसिड (IPA) ची सीरम पातळी MASLD [10–13] सह मानवी चयापचय रोगांमध्ये कमी झाल्याचे आढळले आहे. IPA आहारातील फायबरच्या सेवनाशी संबंधित आहे, त्याच्या अँटिऑक्सिडंट आणि दाह-विरोधी प्रभावांसाठी ओळखले जाते, आणि इन विवो आणि इन विट्रोमध्ये आहारामुळे प्रेरित नॉन-अल्कोहोलिक स्टीटोहेपेटायटिस (NASH) फेनोटाइप कमी करते [11–14]. काही पुरावे आमच्या मागील अभ्यासातून मिळतात, ज्यामध्ये कुओपियो बॅरिएट्रिक सर्जरी स्टडी (KOBS) मध्ये यकृत फायब्रोसिस नसलेल्या लठ्ठ रुग्णांपेक्षा यकृत फायब्रोसिस असलेल्या रुग्णांमध्ये सीरम IPA पातळी कमी असल्याचे दिसून आले. याव्यतिरिक्त, आम्ही दाखवले की IPA उपचारामुळे मानवी यकृत स्टिलेट सेल (LX-2) मॉडेलमध्ये सेल ॲडेशन, सेल मायग्रेशन आणि हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल ॲक्टिव्हेशनचे क्लासिकल मार्कर असलेल्या जनुकांची अभिव्यक्ती कमी होऊ शकते आणि ते एक संभाव्य यकृतसंरक्षक मेटाबोलाइट आहे [15]. तथापि, HSC ॲपोप्टोसिस आणि मायटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स सक्रिय करून IPA यकृत फायब्रोसिसचा प्रतिगमन कसा घडवून आणते हे अद्याप अस्पष्ट आहे.
येथे, आम्ही हे दाखवून देतो की लठ्ठ परंतु टाइप २ मधुमेह नसलेल्या (KOBS) व्यक्तींच्या यकृतामध्ये, सीरम आयपीए (IPA) हे एपोप्टोसिस, मायटोफेजी आणि दीर्घायुष्य मार्गांमध्ये समृद्ध असलेल्या जनुकांच्या अभिव्यक्तीशी संबंधित आहे. याव्यतिरिक्त, आम्हाला असे आढळले की आयपीए (IPA) हे निष्क्रियीकरण मार्गाद्वारे सक्रिय हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल्सचे (HSCs) निर्मूलन आणि विघटन घडवून आणू शकते. हे परिणाम आयपीएची (IPA) एक नवीन भूमिका उघड करतात, ज्यामुळे यकृत फायब्रोसिसच्या प्रतिगमनाला चालना देण्यासाठी ते एक संभाव्य उपचारात्मक लक्ष्य बनते.
KOBS कोहोर्टमधील एका पूर्वीच्या अभ्यासात असे दिसून आले की यकृत फायब्रोसिस नसलेल्या रुग्णांच्या तुलनेत यकृत फायब्रोसिस असलेल्या रुग्णांमध्ये रक्तातील IPA पातळी कमी होती [15]. टाईप 2 मधुमेहाचा संभाव्य गोंधळ निर्माण करणारा परिणाम वगळण्यासाठी, आम्ही चालू असलेल्या KOBS अभ्यासातून टाईप 2 मधुमेह नसलेल्या 116 लठ्ठ रुग्णांना (सरासरी वय ± SD: 46.8 ± 9.3 वर्षे; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (तक्ता 1) अभ्यास लोकसंख्या म्हणून निवडले [16]. सर्व सहभागींनी लेखी माहितीपूर्ण संमती दिली आणि हेलसिंकीच्या घोषणेनुसार (54/2005, 104/2008 आणि 27/2010) नॉर्थ साओ काउंटी हॉस्पिटलच्या नीती समितीने अभ्यास प्रोटोकॉलला मान्यता दिली.
बॅरिएट्रिक शस्त्रक्रियेदरम्यान यकृताच्या बायोप्सीचे नमुने घेण्यात आले आणि अनुभवी पॅथॉलॉजिस्टद्वारे पूर्वी वर्णन केलेल्या निकषांनुसार [17, 18] त्यांचे हिस्टोलॉजिकली मूल्यांकन करण्यात आले. मूल्यांकनाचे निकष परिशिष्ट सारणी S1 मध्ये सारांशित केले आहेत आणि त्यांचे पूर्वी वर्णन केले आहे [19].
मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषणासाठी उपवास अवस्थेतील रक्ताच्या नमुन्यांचे अनटारगेटेड लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) द्वारे विश्लेषण करण्यात आले (n = 116). नमुन्यांचे विश्लेषण UHPLC-qTOF-MS प्रणाली (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) वापरून पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे¹⁹ करण्यात आले. आयसोप्रोपिल अल्कोहोल (IPA) ची ओळख रिटेन्शन टाइम आणि MS/MS स्पेक्ट्रमची शुद्ध मानकांशी तुलना करून करण्यात आली. पुढील सर्व विश्लेषणांमध्ये IPA सिग्नलची तीव्रता (पीक एरिया) विचारात घेतली गेली [20].
संपूर्ण यकृताचे आरएनए सिक्वेन्सिंग इल्युमिना हायसेक 2500 वापरून केले गेले आणि डेटावर पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे [19, 21, 22] प्रीप्रोसेसिंग केले गेले. आम्ही मायटोमायनर 4.0 डेटाबेसमधून निवडलेल्या 1957 जीन्सचा वापर करून मायटोकॉन्ड्रियल कार्य/बायोजेनेसिसवर परिणाम करणाऱ्या ट्रान्सक्रिप्ट्सचे लक्ष्यित भिन्न अभिव्यक्ती विश्लेषण केले [23]. यकृत डीएनए मेथिलेशन विश्लेषण इन्फिनियम ह्युमनमेथिलेशन450 बीडचिप (इल्युमिना, सॅन दिएगो, सीए, यूएसए) वापरून पूर्वी वर्णन केलेल्या पद्धतीनुसार [24, 25] केले गेले.
मानवी यकृत स्टेललेट पेशी (LX-2) प्रा. स्टेफानो रोमियो यांनी सदिच्छेने पुरवल्या होत्या आणि त्यांचे DMEM/F12 माध्यमात (बायोवेस्ट, L0093-500, 1% पेन/स्ट्रेप; लोंझा, DE17-602E, 2% FBS; गिब्को, 10270-106) संवर्धन व देखभाल करण्यात आली. IPA चा कार्यकारी डोस निवडण्यासाठी, LX-2 पेशींवर DMEM/F12 माध्यमात 24 तासांसाठी IPA च्या वेगवेगळ्या सांद्रतांसह (10 μM, 100 μM आणि 1 mM; सिग्मा, 220027) उपचार करण्यात आले. याव्यतिरिक्त, HSCs निष्क्रिय करण्याची IPA ची क्षमता तपासण्यासाठी, LX-2 पेशींवर सीरम-मुक्त माध्यमात 24 तासांसाठी 5 ng/ml TGF-β1 (R&D सिस्टीम्स, 240-B-002/CF) आणि 1 mM IPA सह एकत्रित उपचार करण्यात आले. संबंधित व्हेईकल कंट्रोल्ससाठी, TGF-β1 ट्रीटमेंटकरिता 0.1% BSA असलेले 4 nM HCL आणि IPA ट्रीटमेंटकरिता 0.05% DMSO वापरण्यात आले, आणि कॉम्बिनेशन ट्रीटमेंटसाठी दोन्ही एकत्र वापरण्यात आले.
उत्पादकाच्या सूचनांनुसार, FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) वापरून एपोप्टोसिसचे मूल्यांकन करण्यात आले. थोडक्यात, LX-2 (1 × 105 पेशी/वेल) 12-वेल प्लेट्समध्ये रात्रभर संवर्धित करण्यात आल्या आणि नंतर त्यांना IPA किंवा IPA आणि TGF-β1 च्या अनेक मात्रा देऊन उपचारित करण्यात आले. दुसऱ्या दिवशी, तरंगणाऱ्या आणि चिकटलेल्या पेशी गोळा करून, ट्रिप्सिनाइज करून, PBS ने धुऊन, Annexin V बाइंडिंग बफरमध्ये पुन्हा निलंबित करून, FITC-Annexin V आणि 7-AAD सोबत 15 मिनिटांसाठी इनक्यूबेट करण्यात आले.
जिवंत पेशींमधील मायटोकाँड्रियाला ऑक्सिडेटिव्ह क्रियाशीलतेसाठी मायटोट्रॅकर™ रेड CMXRos (MTR) (थर्मो फिशर सायंटिफिक, कार्ल्सबॅड, सीए) वापरून रंगवले गेले. MTR चाचण्यांसाठी, LX-2 पेशींना IPA आणि TGF-β1 सोबत समान घनतेमध्ये इनक्यूबेट केले गेले. 24 तासांनंतर, जिवंत पेशींना ट्रिप्सिनाइज्ड केले गेले, PBS ने धुतले गेले आणि नंतर पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे [26] 37 °C वर 20 मिनिटांसाठी सीरम-मुक्त माध्यमात 100 μM MTR सोबत इनक्यूबेट केले गेले. जिवंत पेशींच्या आकारविज्ञानाच्या विश्लेषणासाठी, पेशींचा आकार आणि सायटोप्लाज्मिक गुंतागुंत यांचे विश्लेषण अनुक्रमे फॉरवर्ड स्कॅटर (FSC) आणि साइड स्कॅटर (SSC) पॅरामीटर्स वापरून केले गेले.
सर्व डेटा (30,000 इव्हेंट्स) नोवोसाइट क्वांटिऑन (अजिलेंट) वापरून मिळवला गेला आणि नोवोएक्सप्रेस® 1.4.1 किंवा फ्लोजो V.10 सॉफ्टवेअर वापरून त्याचे विश्लेषण केले गेले.
उत्पादकाच्या सूचनांनुसार सीहॉर्स एक्सएफ सेल मायटो स्ट्रेसने सुसज्ज असलेल्या सीहॉर्स एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स अॅनालायझर (अजिलेंट टेक्नॉलॉजीज, सांता क्लारा, सीए) चा वापर करून ऑक्सिजन वापर दर (OCR) आणि बाह्यकोशिकीय आम्लीकरण दर (ECAR) रिअल-टाइममध्ये मोजले गेले. थोडक्यात, 2 × 104 LX-2 पेशी/वेल XF96 पेशी संवर्धन प्लेट्सवर पेरण्यात आल्या. रात्रभर उष्मायनानंतर, पेशींवर आयसोप्रोपेनॉल (IPA) आणि TGF-β1 (पूरक पद्धती 1) ने उपचार केले गेले. सीहॉर्स एक्सएफ वेव्ह सॉफ्टवेअर वापरून डेटा विश्लेषण केले गेले, ज्यामध्ये सीहॉर्स एक्सएफ सेल एनर्जी फेनोटाइप टेस्ट रिपोर्ट जनरेटरचा समावेश आहे. यावरून, बायोएनर्जेटिक हेल्थ इंडेक्स (BHI) ची गणना केली गेली [27].
एकूण RNA चे cDNA मध्ये लिप्यंतरण करण्यात आले. विशिष्ट पद्धतींसाठी, संदर्भ [15] पहा. मानवी 60S रायबोसोमल ॲसिडिक प्रोटीन P0 (RPLP0) आणि सायक्लोफिलिन A1 (PPIA) mRNA पातळींचा वापर घटक जीन नियंत्रक म्हणून करण्यात आला. क्वांटस्टुडिओ 6 प्रो रिअल-टाइम PCR सिस्टीम (थर्मो फिशर, लँड्समीर, नेदरलँड्स) चा वापर टॅकमॅन™ फास्ट ॲडव्हान्स्ड मास्टर मिक्स किट (ॲप्लाइड बायोसिस्टम्स) किंवा सेन्सिफास्ट SYBR लो-रॉक्स किट (बायोलाइन, BIO 94050) सोबत करण्यात आला, आणि तुलनात्मक Ct मूल्य सायकलिंग पॅरामीटर्स (ΔΔCt) आणि ∆∆Ct पद्धतीचा वापर करून सापेक्ष जीन अभिव्यक्ती पट मोजण्यात आली. प्रायमर्सचा तपशील पूरक सारण्या S2 आणि S3 मध्ये दिलेला आहे.
पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे [28], DNeasy ब्लड अँड टिश्यू किट (Qiagen) वापरून न्यूक्लियर डीएनए (ncDNA) आणि मायटोकाँड्रियल डीएनए (mtDNA) काढण्यात आले. पूरक पद्धती 2 मध्ये तपशीलवार वर्णन केल्याप्रमाणे, प्रत्येक लक्ष्य mtDNA क्षेत्राचे तीन न्यूक्लियर डीएनए क्षेत्रांच्या भूमितीय सरासरीशी गुणोत्तर (mtDNA/ncDNA) काढून mtDNA चे सापेक्ष प्रमाण मोजण्यात आले. mtDNA आणि ncDNA साठीच्या प्राइमर्सचा तपशील पूरक सारणी S4 मध्ये दिलेला आहे.
आंतरपेशीय आणि अंतःपेशीय मायटोकाँड्रियल नेटवर्क पाहण्यासाठी जिवंत पेशींना मायटोट्रॅकर™ रेड CMXRos (MTR) (थर्मो फिशर सायंटिफिक, कार्ल्सबॅड, सीए) ने रंगवले गेले. LX-2 पेशी (1 × 104 पेशी/वेल) संबंधित काचेच्या तळाच्या कल्चर प्लेट्समध्ये (इबिडी जीएमबीएच, मार्टिन्सरीड, जर्मनी) काचेच्या स्लाईड्सवर संवर्धित केल्या गेल्या. 24 तासांनंतर, जिवंत LX-2 पेशींना 37 °C तापमानावर 20 मिनिटांसाठी 100 μM MTR सोबत इनक्यूबेट केले गेले आणि पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे [29] पेशी केंद्रकांना DAPI (1 μg/ml, सिग्मा-अल्ड्रिच) ने रंगवले गेले. झाईस एलएसएम ८०० कॉन्फोकल मॉड्यूलने सुसज्ज असलेल्या झाईस ॲक्सिओ ऑब्झर्वर इन्व्हर्टेड मायक्रोस्कोपचा (कार्ल झाईस मायक्रोइमेजिंग जीएमबीएच, जेना, जर्मनी) वापर करून ३७°C तापमानात, ५% CO2 असलेल्या आर्द्र वातावरणात ६३×NA १.३ ऑब्जेक्टिव्हच्या साहाय्याने मायटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क्सचे व्हिज्युअलायझेशन करण्यात आले. आम्ही प्रत्येक नमुना प्रकारासाठी दहा झेड-सिरीज इमेजेस मिळवल्या. प्रत्येक झेड-सिरीजमध्ये ३० सेक्शन्स असतात, ज्या प्रत्येकाची जाडी ९.८६ μm असते. प्रत्येक नमुन्यासाठी, झेन २००९ सॉफ्टवेअरचा (कार्ल झाईस मायक्रोइमेजिंग जीएमबीएच, जेना, जर्मनी) वापर करून दहा वेगवेगळ्या फील्ड्स ऑफ व्ह्यूच्या इमेजेस मिळवण्यात आल्या आणि सप्लिमेंटरी मेथड्स ३ मध्ये तपशीलवार दिलेल्या पॅरामीटर्सनुसार इमेजजे सॉफ्टवेअर (v1.54d) [३०, ३१] वापरून मायटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजीचे विश्लेषण करण्यात आले.
पेशींना ०.१ एम फॉस्फेट बफरमधील २% ग्लुटाराल्डिहाइडने स्थिर करण्यात आले, त्यानंतर १% ऑस्मियम टेट्रॉक्साइड द्रावणाने (सिग्मा एल्ड्रिच, एमओ, यूएसए) स्थिर करण्यात आले, ॲसिटोनने (मर्क, डार्मस्टॅड, जर्मनी) हळूहळू निर्जलीकरण करण्यात आले आणि शेवटी इपॉक्सी रेझिनमध्ये एम्बेड करण्यात आले. अतिसूक्ष्म छेद तयार करून त्यांना १% युरॅनिल ॲसिटेट (मर्क, डार्मस्टॅड, जर्मनी) आणि १% लेड सायट्रेटने (मर्क, डार्मस्टॅड, जर्मनी) रंगवण्यात आले. ८० केव्हीच्या प्रवेगक व्होल्टेजवर जेईएम २१००एफ ईएक्सआयआय ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपचा (जेईओएल लिमिटेड, टोक्यो, जपान) वापर करून अल्ट्रास्ट्रक्चरल प्रतिमा मिळवण्यात आल्या.
IPA ने 24 तास उपचार केलेल्या LX-2 पेशींच्या आकारविज्ञानाचे विश्लेषण झाईस इनव्हर्टेड लाईट मायक्रोस्कोप (झाईस ॲक्सिओ व्हर्ट.ए1 आणि ॲक्सिओकॅम एमआरएम, जेना, जर्मनी) वापरून 50x मॅग्निफिकेशनवर फेज-कॉन्ट्रास्ट मायक्रोस्कोपीद्वारे करण्यात आले.
क्लिनिकल डेटा सरासरी ± मानक विचलन किंवा मध्यक (आंतरचतुर्थक श्रेणी: IQR) म्हणून व्यक्त करण्यात आला. तीन अभ्यास गटांमधील फरकांची तुलना करण्यासाठी एक-मार्गी विचलन विश्लेषण (सतत बदलणारे चल) किंवा χ² चाचणी (श्रेणीबद्ध चल) वापरण्यात आली. एकाधिक चाचणीतील त्रुटी सुधारण्यासाठी फॉल्स पॉझिटिव्ह रेट (FDR) वापरण्यात आला, आणि FDR < 0.05 असलेले जनुके सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण मानले गेले. CpG DNA मिथायलेशन आणि IPA सिग्नल तीव्रता यांच्यातील सहसंबंधासाठी स्पीअरमन सहसंबंध विश्लेषण वापरण्यात आले, ज्यामध्ये नाममात्र p मूल्ये (p < 0.05) नोंदवली गेली.
रक्तातील सीरम आयपीए (IPA) पातळीशी संबंधित असलेल्या ३०९३ यकृत ट्रान्सक्रिप्ट्सपैकी २६८ ट्रान्सक्रिप्ट्स (नाममात्र p < ०.०१), ११९ मायटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट्स (नाममात्र p < ०.०५), आणि ४३५० CpGs साठी वेब-आधारित जीन सेट विश्लेषण साधन (WebGestalt) वापरून पाथवे विश्लेषण करण्यात आले. ओव्हरलॅपिंग जीन्स शोधण्यासाठी विनामूल्य उपलब्ध असलेले Venny DB (आवृत्ती २.१.०) हे साधन वापरण्यात आले, आणि प्रोटीन-प्रोटीन आंतरक्रिया दृश्यमान करण्यासाठी StringDB (आवृत्ती ११.५) वापरण्यात आले.
LX-2 प्रयोगासाठी, डी'अगोस्टिनो-पिअरसन चाचणी वापरून नमुन्यांची सामान्यता तपासण्यात आली. किमान तीन जैविक प्रतिकृतींमधून डेटा मिळवण्यात आला आणि त्यावर बॉनफेरोनी पोस्ट हॉक चाचणीसह एक-मार्गी ANOVA करण्यात आला. 0.05 पेक्षा कमी असलेले p-मूल्य सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण मानले गेले. डेटा सरासरी ± SD म्हणून सादर केला आहे आणि प्रत्येक आकृतीमध्ये प्रयोगांची संख्या दर्शविली आहे. सर्व विश्लेषणे आणि आलेख विंडोजसाठी असलेल्या ग्राफपॅड प्रिझम 8 सांख्यिकीय सॉफ्टवेअरचा (ग्राफपॅड सॉफ्टवेअर इंक., आवृत्ती 8.4.3, सॅन दिएगो, यूएसए) वापर करून तयार करण्यात आले.
सर्वप्रथम, आम्ही सीरम आयपीए (IPA) पातळीचा यकृत, संपूर्ण शरीर आणि मायटोकाँड्रियल ट्रान्सक्रिप्ट्सशी असलेल्या संबंधाचा अभ्यास केला. एकूण ट्रान्सक्रिप्ट प्रोफाइलमध्ये, सीरम आयपीए (IPA) पातळीशी सर्वात जास्त संबंधित असलेले जनुक MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; मायटोजेन-ॲक्टिव्हेटेड प्रोटीन कायनेज-ॲक्टिव्हेटेड प्रोटीन कायनेज 3) होते; मायटोकाँड्रिया-संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट प्रोफाइलमध्ये, सर्वात जास्त संबंधित असलेले जनुक AKT1 (FDR = 0.7621; AKT सेरीन/थ्रिओनिन कायनेज 1) होते (अतिरिक्त फाइल 1 आणि अतिरिक्त फाइल 2).
त्यानंतर आम्ही जागतिक ट्रान्सक्रिप्ट्स (n = 268; p < 0.01) आणि मायटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट्स (n = 119; p < 0.05) यांचे विश्लेषण केले, आणि शेवटी एपोप्टोसिसला सर्वात महत्त्वपूर्ण कॅनोनिकल मार्ग म्हणून ओळखले (p = 0.0089). सीरम आयपीए पातळीशी संबंधित मायटोकॉन्ड्रियल ट्रान्सक्रिप्ट्ससाठी, आम्ही एपोप्टोसिस (FDR = 0.00001), मायटोफॅगी (FDR = 0.00029), आणि टीएनएफ सिग्नलिंग मार्गांवर (FDR = 0.000006) लक्ष केंद्रित केले (आकृती 1A, तक्ता 2, आणि पूरक आकृत्या 1A-B).
मानवी यकृतातील सीरम आयपीए (IPA) पातळीच्या संबंधात जागतिक, मायटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि डीएनए मेथिलेशन यांचे ओव्हरलॅपिंग विश्लेषण. A मध्ये २६८ जागतिक ट्रान्सक्रिप्ट्स, ११९ मायटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि डीएनए मेथिलेटेड ट्रान्सक्रिप्ट्स दर्शविले आहेत, जे सीरम आयपीए पातळीशी संबंधित ३०९२ CpG साइट्सवर मॅप केलेले आहेत (जागतिक ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि डीएनए मेथिलेटेडसाठी p मूल्ये < ०.०१, आणि मायटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट्ससाठी p मूल्ये < ०.०५). प्रमुख ओव्हरलॅपिंग ट्रान्सक्रिप्ट्स मध्यभागी दर्शविले आहेत (AKT1 आणि YKT6). B मध्ये, StringDB या ऑनलाइन साधनाद्वारे सीरम आयपीए पातळीशी लक्षणीयरीत्या संबंधित असलेल्या ५६ ओव्हरलॅपिंग जनुकांमधून (काळ्या रेषेचा भाग), इतर जनुकांशी सर्वाधिक इंटरॅक्शन स्कोअर (०.९००) असलेल्या १३ जनुकांचा इंटरॅक्शन नकाशा तयार करण्यात आला. हिरवा: जीन ऑन्टोलॉजी (GO) पेशीय घटक: मायटोकॉन्ड्रिया (GO:0005739) वर मॅप केलेली जनुके. डेटाच्या आधारे (टेक्स्ट मायनिंग, प्रयोग, डेटाबेस आणि को-एक्सप्रेशनवर आधारित), इतर प्रथिनांसोबतच्या आंतरक्रियांसाठी AKT1 हे सर्वाधिक गुण (0.900) असलेले प्रथिन आहे. नेटवर्क नोड्स प्रथिने दर्शवतात आणि एजेस प्रथिनांमधील जोडण्या दर्शवतात.
आतड्यातील सूक्ष्मजीवांचे चयापचय डीएनए मेथिलेशनद्वारे एपिजेनेटिक रचना नियंत्रित करू शकतात [32], म्हणून आम्ही रक्तातील आयपीएची पातळी यकृताच्या डीएनए मेथिलेशनशी संबंधित आहे की नाही हे तपासले. आम्हाला आढळले की रक्तातील आयपीएच्या पातळीशी संबंधित दोन प्रमुख मेथिलेशन स्थळे प्रोलाइन-सेरीन-समृद्ध प्रदेश 3 (C19orf55) आणि हीट शॉक प्रोटीन फॅमिली बी (स्मॉल) सदस्य 6 (HSPB6) जवळ होती (अतिरिक्त फाइल 3). 4350 CpG चे डीएनए मेथिलेशन (p < 0.01) रक्तातील आयपीएच्या पातळीशी संबंधित होते आणि दीर्घायुष्य नियामक मार्गांमध्ये समृद्ध होते (p = 0.006) (आकृती 1A, तक्ता 2, आणि पूरक आकृती 1C).
मानवी यकृतातील सीरम आयपीए पातळी, ग्लोबल ट्रान्सक्रिप्ट्स, मायटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि डीएनए मिथायलेशन यांच्यातील संबंधांमागील जैविक यंत्रणा समजून घेण्यासाठी, आम्ही मागील पाथवे विश्लेषणात ओळखलेल्या जनुकांचे ओव्हरलॅप विश्लेषण केले (आकृती 1A). 56 ओव्हरलॅपिंग जनुकांच्या (आकृती 1A मधील काळ्या रेषेच्या आत) पाथवे एनरिचमेंट विश्लेषणाच्या निकालांवरून असे दिसून आले की, ॲपोप्टोसिस पाथवेने (p = 0.00029) तिन्ही विश्लेषणांमध्ये सामायिक असलेली दोन जनुके अधोरेखित केली: AKT1 आणि YKT6 (YKT6 v-SNARE होमोलॉग), जसे वेन आकृतीमध्ये दाखवले आहे (पूरक आकृती 2 आणि आकृती 1A). विशेष म्हणजे, आम्हाला आढळले की AKT1 (cg19831386) आणि YKT6 (cg24161647) हे सीरम आयपीए पातळीशी सकारात्मकपणे सहसंबंधित होते (अतिरिक्त फाइल 3). जनुकीय उत्पादनांमधील संभाव्य प्रथिन आंतरक्रिया ओळखण्यासाठी, आम्ही 56 ओव्हरलॅपिंग जनुकांमधील सर्वाधिक सामायिक क्षेत्र स्कोअर (0.900) असलेली 13 जनुके इनपुट म्हणून निवडली आणि एक आंतरक्रिया नकाशा तयार केला. विश्वास पातळीनुसार (सीमान्त विश्वास), सर्वाधिक स्कोअर (0.900) असलेले AKT1 जनुके सर्वात वर होते (आकृती 1B).
पाथवे विश्लेषणाच्या आधारे, आम्हाला आढळले की एपोप्टोसिस हा प्रमुख पाथवे होता, म्हणून आम्ही तपासले की आयपीए उपचारामुळे इन विट्रोमध्ये एचएससीच्या एपोप्टोसिसवर परिणाम होईल का. आम्ही पूर्वी दाखवून दिले होते की आयपीएचे वेगवेगळे डोस (10 μM, 100 μM, आणि 1 mM) LX-2 पेशींसाठी विषारी नव्हते [15]. या अभ्यासात असे दिसून आले की 10 μM आणि 100 μM आयपीए उपचाराने जिवंत आणि मृत पेशींची संख्या वाढली. तथापि, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, 1 mM आयपीए सांद्रतेवर पेशींची जिवंतपणा कमी झाला, तर पेशी मृत होण्याचा दर अपरिवर्तित राहिला (आकृती 2A, B). पुढे, LX-2 पेशींमध्ये एपोप्टोसिस प्रेरित करण्यासाठी इष्टतम सांद्रता शोधण्याकरिता, आम्ही 24 तासांसाठी 10 μM, 100 μM, आणि 1 mM आयपीएची चाचणी केली (आकृती 2A-E आणि पूरक आकृती 3A-B). मनोरंजक म्हणजे, IPA 10 μM आणि 100 μM ने एपोप्टोसिसचा दर (%) कमी केला, तथापि, IPA 1 mM ने नियंत्रणाच्या तुलनेत उशिरा होणारा एपोप्टोसिस आणि एपोप्टोसिसचा दर (%) वाढवला आणि म्हणूनच पुढील प्रयोगांसाठी त्याची निवड करण्यात आली (आकृत्या 2A–D).
आयपीए (IPA) एलएक्स-२ (LX-2) पेशींमध्ये एपोप्टोसिस (apoptosis) प्रेरित करते. एपोप्टोटिक दर आणि पेशींच्या आकारविज्ञानाचे (cell morphology) प्रमाण निश्चित करण्यासाठी फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे ॲनेक्सिन व्ही (Annexin V) आणि ७-एएडी (7-AAD) डबल स्टेनिंग पद्धतीचा वापर करण्यात आला. बीए (BA) पेशींना २४ तासांसाठी १० μM, १०० μM आणि १ mM आयपीए (IPA) सोबत किंवा २४ तासांसाठी सीरम-मुक्त माध्यमात एफ-एच टीजीएफ-बीटा१ (F-H TGF-β1) (५ ng/ml) आणि १ mM आयपीए (IPA) सोबत इनक्यूबेट करण्यात आले. ए: जिवंत पेशी (ॲनेक्सिन व्ही -/ ७एएडी-); बी: मृत पेशी (ॲनेक्सिन व्ही -/ ७एएडी+); सी, एफ: प्रारंभिक (ॲनेक्सिन व्ही +/ ७एएडी-); डी, जी: उशिराच्या (ॲनेक्सिन व्ही+/७एएडी+); ई, एच: एपोप्टोटिक दरातील एकूण प्रारंभिक आणि उशिराच्या एपोप्टोटिक पेशींची टक्केवारी (%). डेटा सरासरी ± एसडी (SD) म्हणून व्यक्त केला आहे, n = ३ स्वतंत्र प्रयोग. बोनफेरोनी पोस्ट हॉक चाचणीसह वन-वे ॲनोव्हा (ANOVA) वापरून सांख्यिकीय तुलना करण्यात आली. *p < 0.05; ****p < 0.0001
जसे आम्ही पूर्वी दाखवले आहे, 5 ng/ml TGF-β1 क्लासिकल मार्कर जीन्सची अभिव्यक्ती वाढवून HSC सक्रियकरण प्रेरित करू शकते [15]. LX-2 पेशींवर 5 ng/ml TGF-β1 आणि 1 mM IPA यांचा एकत्रित उपचार करण्यात आला (आकृती 2E–H). TGF-β1 उपचाराने एपोप्टोसिसच्या दरात बदल झाला नाही, तथापि, TGF-β1 उपचाराच्या तुलनेत IPA सह-उपचाराने उशिरा होणारा एपोप्टोसिस आणि एपोप्टोसिसचा दर (%) वाढवला (आकृती 2E–H). हे परिणाम सूचित करतात की 1 mM IPA हे TGF-β1 प्रेरणेशिवाय LX-2 पेशींमध्ये एपोप्टोसिसला चालना देऊ शकते.
आम्ही LX-2 पेशींमधील मायटोकाँड्रियल श्वसनावर IPA च्या परिणामाचा अधिक तपास केला. निकालांवरून असे दिसून आले की, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत 1 mM IPA मुळे ऑक्सिजन वापराचा दर (OCR) चे पॅरामीटर्स: नॉन-मायटोकाँड्रियल श्वसन, मूलभूत आणि कमाल श्वसन, प्रोटॉन गळती आणि ATP उत्पादन कमी झाले (आकृती 3A, B), तर जैवऊर्जा आरोग्य निर्देशांक (BHI) मध्ये कोणताही बदल झाला नाही.
आयपीए (IPA) एलएक्स-२ (LX-2) पेशींमधील मायटोकाँड्रियल श्वसन कमी करते. मायटोकाँड्रियल श्वसन वक्र (OCR) हा मायटोकाँड्रियल श्वसन पॅरामीटर्स (नॉन-मायटोकाँड्रियल श्वसन, बेसल श्वसन, कमाल श्वसन, प्रोटॉन लीक, एटीपी निर्मिती, एसआरसी आणि बीएचआय) म्हणून सादर केला आहे. पेशी ए आणि बी यांना अनुक्रमे १० μM, १०० μM आणि १ mM आयपीए सोबत २४ तास इनक्यूबेट केले गेले. पेशी सी आणि डी यांना अनुक्रमे टीजीएफ-β१ (५ ng/ml) आणि १ mM आयपीए सोबत सीरम-मुक्त माध्यमात २४ तास इनक्यूबेट केले गेले. सायक्वांट किट वापरून सर्व मोजमापे डीएनएच्या प्रमाणानुसार सामान्यीकृत (नॉर्मलाइझ) केली गेली. बीएचआय: जैवऊर्जा आरोग्य निर्देशांक; एसआरसी: श्वसन राखीव क्षमता; ओसीआर: ऑक्सिजन वापराचा दर. डेटा सरासरी ± मानक विचलन (SD) म्हणून सादर केला आहे, n = ५ स्वतंत्र प्रयोग. सांख्यिकीय तुलना वन-वे ॲनोव्हा आणि बॉनफेरोनी पोस्ट हॉक चाचणी वापरून करण्यात आली. *p < ०.०५; **p < ०.०१; आणि ***p < 0.001
TGF-β1-सक्रियित LX-2 पेशींच्या जैवऊर्जा प्रोफाइलवर IPA च्या परिणामाची अधिक सखोल माहिती मिळवण्यासाठी, आम्ही OCR द्वारे मायटोकाँड्रियल ऑक्सिडेटिव्ह फॉस्फोरिलेशनचे विश्लेषण केले (आकृती 3C,D). निकालांवरून असे दिसून आले की, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत TGF-β1 उपचारामुळे कमाल श्वसन, श्वसन राखीव क्षमता (SRC) आणि BHI कमी होऊ शकते (आकृती 3C,D). याव्यतिरिक्त, एकत्रित उपचारामुळे मूलभूत श्वसन, प्रोटॉन गळती आणि ATP उत्पादन कमी झाले, परंतु SRC आणि BHI हे TGF-β1 ने उपचार केलेल्यांच्या तुलनेत लक्षणीयरीत्या जास्त होते (आकृती 3C,D).
आम्ही सीहॉर्स सॉफ्टवेअरद्वारे प्रदान केलेली “सेल्युलर एनर्जी फेनोटाइप टेस्ट” देखील केली (पूरक आकृती ४अ–ड). पूरक आकृती ३ब मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, TGF-β1 उपचारानंतर OCR आणि ECAR या दोन्ही चयापचय क्षमता कमी झाल्या, तथापि, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत संयोजन आणि IPA उपचार गटांमध्ये कोणताही फरक दिसून आला नाही. शिवाय, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत संयोजन आणि IPA उपचारानंतर OCR ची मूळ आणि तणाव पातळी दोन्ही कमी झाल्या (पूरक आकृती ४क). विशेष म्हणजे, संयोजन थेरपीमध्येही असाच नमुना दिसून आला, जिथे TGF-β1 उपचाराच्या तुलनेत ECAR च्या मूळ आणि तणाव पातळीमध्ये कोणताही बदल दिसून आला नाही (पूरक आकृती ४क). HSCs मध्ये, मायटोकाँड्रियल ऑक्सिडेटिव्ह फॉस्फोरिलेशनमधील घट आणि TGF-β1 उपचाराच्या संपर्कात आल्यानंतर SCR आणि BHI पुनर्संचयित करण्याची संयोजन उपचाराची क्षमता यामुळे चयापचय क्षमतेत (OCR आणि ECAR) बदल झाला नाही. एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की IPA एचएससीमधील जैवऊर्जा कमी करू शकते, असे सुचवते की IPA कमी ऊर्जावान प्रोफाइल प्रेरित करू शकते जे एचएससी फेनोटाइपला निष्क्रियतेकडे सरकवते (पूरक आकृती 4D).
मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजी आणि नेटवर्क कनेक्शन्सच्या त्रिमितीय प्रमाणीकरणाचा तसेच एमटीआर स्टेनिंग (आकृती ४ आणि पूरक आकृती ५) चा वापर करून मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्सवर आयपीएचा होणारा परिणाम तपासण्यात आला. आकृती ४ दर्शवते की, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, टीजीएफ-β1 उपचाराने सरासरी पृष्ठभाग क्षेत्रफळ, शाखांची संख्या, एकूण शाखा लांबी आणि शाखा जंक्शनची संख्या कमी केली (आकृती ४अ आणि ब) आणि गोलाकार ते मध्यवर्ती मॉर्फोलॉजीमध्ये मायटोकाँड्रियाचे प्रमाण बदलले (आकृती ४क). नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, केवळ आयपीए उपचाराने सरासरी मायटोकाँड्रियल व्हॉल्यूम कमी केला आणि गोलाकार ते मध्यवर्ती मॉर्फोलॉजीमध्ये मायटोकाँड्रियाचे प्रमाण बदलले (आकृती ४अ). याउलट, गोलाकारपणा, सरासरी शाखा लांबी आणि मायटोकाँड्रियल मेम्ब्रेन पोटेन्शिअल-डिपेंडेंट एमटीआर (आकृती ४अ आणि इ) द्वारे मूल्यांकन केलेली मायटोकाँड्रियल क्रियाशीलता अपरिवर्तित राहिली आणि हे पॅरामीटर्स गटांमध्ये भिन्न नव्हते. एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की टीजीएफ-β1 आणि आयपीए उपचार जिवंत एलएक्स-२ पेशींमध्ये मायटोकाँड्रियल आकार आणि आकारमान तसेच नेटवर्कची गुंतागुंत नियंत्रित करतात.
आयपीए (IPA) एलएक्स-२ (LX-2) पेशींमधील मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्स आणि मायटोकाँड्रियल डीएनएच्या विपुलतेत बदल घडवते. अ. सीरम-मुक्त माध्यमात २४ तास टीजीएफ-बीटा१ (TGF-β1) (५ नॅनोग्रॅम/मिलिलिटर) आणि १ मिलिमोलर आयपीए (IPA) सह इनक्यूबेट केलेल्या जिवंत एलएक्स-२ (LX-2) पेशींच्या प्रतिनिधी कॉन्फोकल प्रतिमा, ज्यामध्ये मायटोट्रॅकर™ रेड सीएमएक्सआरओएस (Mitotracker™ Red CMXRos) ने रंगवलेली मायटोकाँड्रियल नेटवर्क्स आणि डीएपीआय (DAPI) ने निळ्या रंगात रंगवलेली केंद्रके दिसत आहेत. सर्व डेटामध्ये प्रत्येक गटासाठी किमान १५ प्रतिमा होत्या. आम्ही प्रत्येक नमुना प्रकारासाठी १० झेड-स्टॅक (Z-stack) प्रतिमा मिळवल्या. प्रत्येक झेड-अक्ष अनुक्रमात ३० स्लाइस होत्या, प्रत्येकाची जाडी ९.८६ मायक्रोमीटर होती. स्केल बार: १० मायक्रोमीटर. ब. प्रतिमेवर अ‍ॅडॅप्टिव्ह थ्रेशोल्डिंग लागू करून ओळखलेल्या प्रतिनिधी वस्तू (फक्त मायटोकाँड्रिया). प्रत्येक गटातील सर्व पेशींसाठी मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजिकल नेटवर्क कनेक्शनचे संख्यात्मक विश्लेषण आणि तुलना करण्यात आली. क. मायटोकाँड्रियल आकार गुणोत्तरांची वारंवारता. 0 च्या जवळच्या किमती गोलाकार आकार दर्शवतात, आणि 1 च्या जवळच्या किमती तंतुमय आकार दर्शवतात. D मायटोकॉन्ड्रियल डीएनए (mtDNA) चे प्रमाण 'साहित्य आणि पद्धती' मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे निश्चित केले गेले. E मायटोट्रॅकर™ रेड CMXRos विश्लेषण 'साहित्य आणि पद्धती' मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे (30,000 इव्हेंट्स) केले गेले. डेटा सरासरी ± SD म्हणून सादर केला आहे, n = 3 स्वतंत्र प्रयोग. सांख्यिकीय तुलना वन-वे ANOVA आणि बॉनफेरोनी पोस्ट हॉक चाचणी वापरून करण्यात आली. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
त्यानंतर आम्ही मायटोकाँड्रियल संख्येचे सूचक म्हणून LX-2 पेशींमधील mtDNA सामग्रीचे विश्लेषण केले. नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, TGF-β1-उपचारित गटामध्ये mtDNA सामग्री वाढली होती (आकृती 4D). TGF-β1-उपचारित गटाच्या तुलनेत, संयुक्त उपचार गटामध्ये mtDNA सामग्री कमी झाली होती (आकृती 4D), यावरून असे सूचित होते की IPA हे mtDNA सामग्री आणि शक्यतो मायटोकाँड्रियल संख्या तसेच मायटोकाँड्रियल श्वसन देखील कमी करू शकते (आकृती 3C). शिवाय, असे दिसून आले की IPA ने संयुक्त उपचारांमध्ये mtDNA सामग्री कमी केली, परंतु MTR-मध्यस्थ मायटोकाँड्रियल क्रियेवर कोणताही परिणाम केला नाही (आकृत्या 4A–C).
आम्ही LX-2 पेशींमध्ये फायब्रोसिस, एपोप्टोसिस, सर्व्हायव्हल आणि मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्सशी संबंधित जनुकांच्या mRNA पातळीसोबत IPA च्या संबंधाचा अभ्यास केला (आकृती 5A–D). नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, TGF-β1-उपचारित गटामध्ये कोलेजन प्रकार I α2 चेन (COL1A2), α-स्मूथ मसल ॲक्टिन (αSMA), मॅट्रिक्स मेटॅलोप्रोटीनेज 2 (MMP2), टिश्यू इनहिबिटर ऑफ मेटॅलोप्रोटीनेज 1 (TIMP1), आणि डायनॅमिन 1-लाइक जीन (DRP1) यांसारख्या जनुकांची अभिव्यक्ती वाढलेली दिसून आली, जे वाढलेला फायब्रोसिस आणि सक्रियता दर्शवते. याव्यतिरिक्त, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, TGF-β1 उपचाराने न्यूक्लियर प्रेग्नेन एक्स रिसेप्टर (PXR), कॅस्पेस 8 (CASP8), MAPKAPK3, इनहिबिटर ऑफ बी-सेल α, एनहान्सर ऑफ न्यूक्लियर फॅक्टर κ जीन लाइट पेप्टाइड (NFκB1A), आणि इनहिबिटर ऑफ न्यूक्लियर फॅक्टर κB कायनेज सबयुनिट β (IKBKB) यांच्या mRNA पातळी कमी केल्या (आकृती 5A–D). TGF-β1 उपचाराच्या तुलनेत, TGF-β1 आणि IPA च्या एकत्रित उपचाराने COL1A2 आणि MMP2 ची अभिव्यक्ती कमी केली, परंतु PXR, TIMP1, बी-सेल लिम्फोमा-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, आणि IKBKB यांच्या mRNA पातळी वाढवल्या. IPA उपचाराने MMP2, Bcl-2-असोसिएटेड प्रोटीन X (BAX), AKT1, ऑप्टिक ॲट्रोफी प्रोटीन 1 (OPA1), आणि मायटोकॉन्ड्रियल फ्युजन प्रोटीन 2 (MFN2) यांची अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या कमी केली, तर नियंत्रण गटाच्या तुलनेत CASP8, NFκB1A, NFκB1B, आणि IKBKB यांची अभिव्यक्ती वाढली. तथापि, कॅस्पेस-3 (CASP3), ॲपोप्टोटिक पेप्टिडेस ॲक्टिव्हेटिंग फॅक्टर 1 (APAF1), मायटोकॉन्ड्रियल फ्युजन प्रोटीन 1 (MFN1), आणि फिशन प्रोटीन 1 (FIS1) यांच्या अभिव्यक्तीमध्ये कोणताही फरक आढळला नाही. एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की आयपीए उपचार फायब्रोसिस, एपोप्टोसिस, सर्व्हायव्हल आणि मायटोकाँड्रियल डायनॅमिक्सशी संबंधित जनुकांच्या अभिव्यक्तीमध्ये बदल घडवतो. आमच्या डेटानुसार, आयपीए उपचार एलएक्स-२ पेशींमधील फायब्रोसिस कमी करतो; त्याच वेळी, तो फेनोटाइपला निष्क्रियतेकडे वळवून सर्व्हायव्हलला उत्तेजित करतो.
आयपीए (IPA) हे एलएक्स-२ (LX-2) पेशींमधील फायब्रोब्लास्ट, ॲपोप्टोटिक, जीवनक्षमता आणि मायटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स जनुकांच्या अभिव्यक्तीचे नियमन करते. सीरम-मुक्त माध्यमात २४ तासांसाठी टीजीएफ-बीटा१ (TGF-β1) आणि आयपीए (IPA) ने एलएक्स-२ (LX-2) पेशी प्रेरित केल्यानंतर, हिस्टोग्राम अंतर्जात नियंत्रणाच्या (RPLP0 किंवा PPIA) सापेक्ष एमआरएनए (mRNA) अभिव्यक्ती दर्शवतात. ए (A) फायब्रोब्लास्ट, बी (B) ॲपोप्टोटिक पेशी, सी (C) जिवंत पेशी आणि डी (D) मायटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स जनुकीय अभिव्यक्ती दर्शवते. डेटा सरासरी ± मानक विचलन (SD) म्हणून सादर केला आहे, n = ३ स्वतंत्र प्रयोग. सांख्यिकीय तुलना वन-वे ॲनोव्हा (ANOVA) आणि बॉनफेरोनी पोस्ट हॉक चाचणी वापरून करण्यात आली. *पी < ०.०५; **पी < ०.०१; ***पी < ०.००१; ****पी < ०.०००१
त्यानंतर, फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे पेशींच्या आकारात (FSC-H) आणि सायटोप्लाज्मिक जटिलतेत (SSC-H) झालेल्या बदलांचे मूल्यांकन करण्यात आले (आकृती 6A,B), आणि IPA उपचारानंतर पेशींच्या आकारविज्ञानात झालेल्या बदलांचे मूल्यांकन ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (TEM) आणि फेज कॉन्ट्रास्ट मायक्रोस्कोपीद्वारे करण्यात आले (पूरक आकृती 6A-B). अपेक्षेप्रमाणे, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत TGF-β1-उपचारित गटातील पेशींचा आकार वाढला (आकृती 6A,B), ज्यामुळे रफ एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम (ER*) आणि फॅगोलिसोसोम्स (P) यांचा नेहमीचा विस्तार दिसून आला, जो हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रिय झाल्याचे दर्शवतो (पूरक आकृती 6A). तथापि, TGF-β1-उपचारित गटाच्या तुलनेत, TGF-β1 आणि IPA च्या एकत्रित उपचार गटात पेशींचा आकार, सायटोप्लाज्मिक जटिलता (आकृती 6A,B) आणि ER* चे प्रमाण कमी झाले होते (पूरक आकृती 6A). शिवाय, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, IPA उपचाराने पेशींचा आकार, सायटोप्लाझमिक गुंतागुंत (आकृती 6A,B), P आणि ER* चे प्रमाण (पूरक आकृती 6A) कमी केले. याव्यतिरिक्त, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत IPA उपचाराच्या 24 तासांनंतर ॲपोप्टोटिक पेशींचे प्रमाण वाढले (पांढरे बाण, पूरक आकृती 6B). एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की 1 mM IPA हे HSC ॲपोप्टोसिसला उत्तेजित करू शकते आणि TGF-β1 मुळे प्रेरित पेशींच्या आकारशास्त्रीय मापदंडांमधील बदल उलटवू शकते, ज्यामुळे पेशींचा आकार आणि गुंतागुंत नियंत्रित होते, जे HSC च्या निष्क्रियतेशी संबंधित असू शकते.
आयपीए (IPA) एलएक्स-२ (LX-2) पेशींमधील पेशींचा आकार आणि सायटोप्लाझमिक गुंतागुंत बदलते. फ्लो सायटोमेट्री विश्लेषणाची प्रातिनिधिक प्रतिमा. या विश्लेषणात एलएक्स-२ पेशींसाठी विशिष्ट गेटिंग स्ट्रॅटेजी वापरली गेली: पेशींचा समूह परिभाषित करण्यासाठी एसएससी-ए/एफएससी-ए (SSC-A/FSC-A), डबलेट्स ओळखण्यासाठी एफएससी-एच/एफएससी-ए (FSC-H/FSC-A), आणि पेशींचा आकार व गुंतागुंतीच्या विश्लेषणासाठी एसएससी-एच/एफएससी-एच (SSC-H/FSC-H). पेशींना सीरम-मुक्त माध्यमात टीजीएफ-बीटा१ (TGF-β1) (५ नॅनोग्रॅम/मिलिलिटर) आणि १ मिलिमोलर आयपीए (1 mM IPA) सोबत २४ तास इनक्यूबेट केले गेले. पेशींचा आकार आणि सायटोप्लाझमिक गुंतागुंतीच्या विश्लेषणासाठी एलएक्स-२ (LX-2) पेशींचे खालच्या डाव्या चतुर्थांशात (SSC-H-/FSC-H-), वरच्या डाव्या चतुर्थांशात (SSC-H+/FSC-H-), खालच्या उजव्या चतुर्थांशात (SSC-H-/FSC-H+), आणि वरच्या उजव्या चतुर्थांशात (SSC-H+/FSC-H+) विभाजन केले गेले. ब. FSC-H (फॉरवर्ड स्कॅटर, पेशीचा आकार) आणि SSC-H (साइड स्कॅटर, सायटोप्लाज्मिक गुंतागुंत) (३०,००० इव्हेंट्स) वापरून फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे पेशी आकारविज्ञानाचे विश्लेषण करण्यात आले. डेटा सरासरी ± SD म्हणून सादर केला आहे, n = ३ स्वतंत्र प्रयोग. सांख्यिकीय तुलना वन-वे ॲनोव्हा (ANOVA) आणि बॉनफेरोनी पोस्ट हॉक चाचणी वापरून करण्यात आली. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 आणि ****p < 0.0001
आयपीए (IPA) सारखे आतड्यातील मेटाबोलाइट्स संशोधनाचा एक महत्त्वाचा विषय बनले आहेत, जे सूचित करतात की आतड्यातील मायक्रोबायोटामध्ये नवीन लक्ष्ये शोधली जाऊ शकतात. त्यामुळे हे मनोरंजक आहे की आयपीए, एक मेटाबोलाइट ज्याचा संबंध आम्ही मानवांमध्ये यकृत फायब्रोसिसशी जोडला आहे [15], तो प्राण्यांच्या मॉडेल्समध्ये एक संभाव्य अँटी-फायब्रोटिक संयुग असल्याचे दिसून आले आहे [13, 14]. येथे, आम्ही प्रथमच टाइप 2 मधुमेह (T2D) नसलेल्या लठ्ठ व्यक्तींमध्ये सीरम आयपीए आणि जागतिक यकृत ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि डीएनए मेथिलेशन यांच्यातील संबंध दर्शवितो, जो एपोप्टोसिस, मायटोफॅगी आणि दीर्घायुष्य, तसेच यकृत होमियोस्टॅसिसचे नियमन करणारे संभाव्य उमेदवार जनुक AKT1 यावर प्रकाश टाकतो. आमच्या अभ्यासाचे आणखी एक नावीन्य म्हणजे आम्ही LX-2 पेशींमध्ये एपोप्टोसिस, पेशी आकारविज्ञान, मायटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स आणि डायनॅमिक्स यांच्याशी आयपीए उपचाराची आंतरक्रिया दर्शविली, जी कमी ऊर्जा स्पेक्ट्रम दर्शवते, ज्यामुळे एचएससी फेनोटाइप निष्क्रियतेकडे सरकतो आणि आयपीए यकृत फायब्रोसिस सुधारण्यासाठी एक संभाव्य उमेदवार ठरतो.
आम्हाला आढळले की रक्तातील सीरम आयपीए (IPA) शी संबंधित यकृताच्या जनुकांमध्ये एपोप्टोसिस, मायटोफॅगी आणि दीर्घायुष्य हे सर्वात महत्त्वाचे कॅनोनिकल मार्ग होते. मायटोकाँड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण (MQC) प्रणालीतील व्यत्यय मायटोकाँड्रियल डिसफंक्शन, मायटोफॅगी आणि एपोप्टोसिसला कारणीभूत ठरू शकतो, ज्यामुळे एमएएसएलडी (MASLD) ची शक्यता वाढते [33, 34]. म्हणून, आपण असा अंदाज लावू शकतो की यकृतामध्ये एपोप्टोसिस, मायटोफॅगी आणि दीर्घायुष्याच्या माध्यमातून पेशींची गतिशीलता आणि मायटोकाँड्रियल अखंडता राखण्यात आयपीए (IPA) चा सहभाग असू शकतो. आमच्या डेटानुसार, तीनही चाचण्यांमध्ये दोन जनुके समान होती: YKT6 आणि AKT1. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की YKT6 हे एक SNARE प्रथिन आहे जे पेशी पटलाच्या एकत्रीकरणाच्या प्रक्रियेत सामील असते. ते ऑटोफॅगोसोमवरील STX17 आणि SNAP29 सोबत एक आरंभिक संकुल (initiation complex) तयार करून ऑटोफॅगी आणि मायटोफॅगीमध्ये भूमिका बजावते, ज्यामुळे ऑटोफॅगोसोम आणि लायसोसोमच्या एकत्रीकरणास प्रोत्साहन मिळते [35]. शिवाय, YKT6 च्या कार्याच्या कमतरतेमुळे मायटोफॅगीमध्ये बिघाड होतो [36], तर YKT6 चे अपरेग्युलेशन हेपेटोसेल्युलर कार्सिनोमा (HCC) च्या प्रगतीशी संबंधित आहे, जे पेशींचे वाढलेले अस्तित्व दर्शवते [37]. दुसरीकडे, AKT1 हे सर्वात महत्त्वाचे आंतरक्रिया करणारे जनुक आहे आणि ते यकृताच्या आजारांमध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावते, ज्यात PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग, पेशी चक्र, पेशी स्थलांतर, पेशींची वाढ, फोकल अॅडेशन, मायटोकॉन्ड्रियल कार्य आणि कोलेजन स्राव यांचा समावेश आहे [38–40]. सक्रिय PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल्स (HSCs) ला सक्रिय करू शकतो, ज्या एक्स्ट्रासेल्युलर मॅट्रिक्स (ECM) च्या उत्पादनासाठी जबाबदार पेशी आहेत, आणि त्याचे नियमन बिघडल्यास यकृत फायब्रोसिसच्या निर्मिती आणि प्रगतीस हातभार लागू शकतो [40]. याव्यतिरिक्त, AKT हा पेशी टिकवून ठेवणाऱ्या प्रमुख घटकांपैकी एक आहे जो p53-अवलंबित पेशी एपोप्टोसिसला प्रतिबंधित करतो, आणि AKT चे सक्रियकरण यकृत पेशींच्या एपोप्टोसिसच्या प्रतिबंधाशी संबंधित असू शकते [41, 42]. मिळालेल्या निष्कर्षांवरून असे सूचित होते की, यकृताच्या मायटोकाँड्रियाशी संबंधित ॲपोप्टोसिसमध्ये आयपीएचा सहभाग असू शकतो, जो यकृताच्या पेशींना ॲपोप्टोसिसमध्ये प्रवेश करायचा की टिकून राहायचे या निर्णयावर परिणाम करतो. हे परिणाम यकृताच्या होमियोस्टॅसिससाठी महत्त्वपूर्ण असलेल्या AKT आणि/किंवा YKT6 या संभाव्य जनुकांद्वारे नियंत्रित केले जाऊ शकतात.
आमच्या निष्कर्षांवरून असे दिसून आले की, TGF-β1 उपचारांपासून स्वतंत्रपणे, 1 mM IPA ने LX-2 पेशींमध्ये एपोप्टोसिस प्रेरित केला आणि मायटोकाँड्रियल श्वसन कमी केले. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की एपोप्टोसिस हा फायब्रोसिस निराकरण आणि हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियतेसाठी एक प्रमुख मार्ग आहे, आणि यकृत फायब्रोसिसच्या उलटसुलट शारीरिक प्रतिसादातील एक प्रमुख घटना देखील आहे [4, 43]. शिवाय, संयुक्त उपचारानंतर LX-2 पेशींमध्ये BHI ची पुनर्स्थापना झाल्याने मायटोकाँड्रियल बायोएनर्जेटिक्सच्या नियमनामध्ये IPA च्या संभाव्य भूमिकेबद्दल नवीन अंतर्दृष्टी मिळाली. विश्रांती आणि निष्क्रिय परिस्थितीत, हेमॅटोपोएटिक पेशी सामान्यतः ATP तयार करण्यासाठी मायटोकाँड्रियल ऑक्सिडेटिव्ह फॉस्फोरिलेशनचा वापर करतात आणि त्यांची चयापचय क्रिया कमी असते. दुसरीकडे, HSC सक्रियता ग्लायकोलिटिक अवस्थेत प्रवेश करण्याच्या ऊर्जेच्या गरजांची भरपाई करण्यासाठी मायटोकाँड्रियल श्वसन आणि जैवसंश्लेषण वाढवते [44]. IPA ने चयापचय क्षमता आणि ECAR वर परिणाम केला नाही या वस्तुस्थितीवरून असे सूचित होते की ग्लायकोलिटिक मार्गाला कमी प्राधान्य दिले जाते. त्याचप्रमाणे, आणखी एका अभ्यासात असे दिसून आले की 1 mM IPA हे कार्डिओमायोसाइट्स, मानवी हेपॅटोसाइट सेल लाइन (Huh7) आणि मानवी नाळ शिरा एंडोथेलियल पेशी (HUVEC) मध्ये मायटोकॉन्ड्रियल श्वसन साखळी क्रियाकलाप नियंत्रित करण्यास सक्षम होते; तथापि, कार्डिओमायोसाइट्समधील ग्लायकोलिसिसवर IPA चा कोणताही परिणाम आढळला नाही, ज्यामुळे असे सूचित होते की IPA इतर पेशी प्रकारांच्या जैवऊर्जेवर परिणाम करू शकते [45]. म्हणून, आम्ही असा अंदाज लावतो की 1 mM IPA एक सौम्य रासायनिक अनकप्लर म्हणून कार्य करू शकते, कारण ते mtDNA चे प्रमाण न बदलता फायब्रोजेनिक जीन अभिव्यक्ती, पेशी आकारविज्ञान आणि मायटोकॉन्ड्रियल जैवऊर्जेमध्ये लक्षणीय घट करू शकते [46]. मायटोकॉन्ड्रियल अनकप्लर्स कल्चर-प्रेरित फायब्रोसिस आणि HSC सक्रियतेला प्रतिबंधित करू शकतात [47] आणि अनकप्लिंग प्रोटीन्स (UCP) किंवा ॲडेनाइन न्यूक्लियोटाइड ट्रान्सलोकेस (ANT) सारख्या विशिष्ट प्रथिनांद्वारे नियंत्रित किंवा प्रेरित मायटोकॉन्ड्रियल ATP उत्पादन कमी करू शकतात. पेशी प्रकारानुसार, ही घटना पेशींना ॲपोप्टोसिसपासून वाचवू शकते आणि/किंवा ॲपोप्टोसिसला प्रोत्साहन देऊ शकते [46]. तथापि, हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल निष्क्रियतेमध्ये मायटोकाँड्रियल अनकप्लर म्हणून आयपीएच्या भूमिकेवर प्रकाश टाकण्यासाठी पुढील अभ्यासाची आवश्यकता आहे.
त्यानंतर आम्ही जिवंत LX-2 पेशींमध्ये मायटोकाँड्रियल श्वसनातील बदल मायटोकाँड्रियल मॉर्फोलॉजीमध्ये प्रतिबिंबित होतात की नाही याचा तपास केला. विशेष म्हणजे, TGF-β1 उपचारामुळे मायटोकाँड्रियलचे प्रमाण गोलाकारापासून मध्यवर्ती आकारात बदलते, ज्यामुळे मायटोकाँड्रियल शाखा कमी होतात आणि मायटोकाँड्रियल विखंडनातील एक प्रमुख घटक असलेल्या DRP1 ची अभिव्यक्ती वाढते [48]. शिवाय, मायटोकाँड्रियल विखंडन हे एकूण नेटवर्कच्या गुंतागुंतीशी संबंधित आहे, आणि फ्यूजनपासून फिशनमध्ये होणारे संक्रमण हे हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) च्या सक्रियतेसाठी महत्त्वपूर्ण आहे, तर मायटोकाँड्रियल विखंडनाच्या प्रतिबंधामुळे HSC एपोप्टोसिस होतो [49]. अशाप्रकारे, आमचे निष्कर्ष सूचित करतात की TGF-β1 उपचारामुळे मायटोकाँड्रियल नेटवर्कची गुंतागुंत कमी होऊ शकते आणि शाखा कमी होऊ शकतात, जे सक्रिय हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल्स (HSCs) शी संबंधित मायटोकाँड्रियल विखंडनामध्ये अधिक सामान्य आहे. शिवाय, आमच्या डेटाने दाखवले की IPA मायटोकाँड्रियाचे प्रमाण गोलाकारापासून मध्यवर्ती आकारात बदलू शकते, ज्यामुळे OPA1 आणि MFN2 ची अभिव्यक्ती कमी होते. अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की OPA1 च्या डाउनरेग्युलेशनमुळे मायटोकाँड्रियल मेम्ब्रेन पोटेन्शिअलमध्ये घट होऊ शकते आणि पेशी एपोप्टोसिस सुरू होऊ शकतो [50]. MFN2 हे मायटोकाँड्रियल फ्यूजन आणि एपोप्टोसिसमध्ये मध्यस्थी करते असे ज्ञात आहे [51]. मिळालेल्या परिणामांनुसार असे सूचित होते की TGF-β1 आणि/किंवा IPA द्वारे LX-2 पेशींचे प्रेरण हे मायटोकाँड्रियल आकार आणि आकारमान, तसेच सक्रियता स्थिती आणि नेटवर्क गुंतागुंत नियंत्रित करते.
आमच्या निष्कर्षांवरून असे दिसून येते की, TGFβ-1 आणि IPA चा एकत्रित उपचार, ॲपोप्टोसिस टाळणाऱ्या पेशींमध्ये फायब्रोसिस, ॲपोप्टोसिस आणि जगण्याशी संबंधित जनुकांच्या mRNA अभिव्यक्तीचे नियमन करून mtDNA आणि पेशींचे आकारिक मापदंड कमी करू शकतो. खरंच, IPA ने AKT1 आणि COL1A2 व MMP2 सारख्या महत्त्वाच्या फायब्रोसिस जनुकांच्या mRNA अभिव्यक्तीची पातळी कमी केली, परंतु ॲपोप्टोसिसशी संबंधित असलेल्या CASP8 च्या अभिव्यक्तीची पातळी वाढवली. आमच्या निष्कर्षांवरून असे दिसून आले की, IPA उपचारानंतर, BAX ची अभिव्यक्ती कमी झाली आणि TIMP1 फॅमिली सबयुनिट्स, BCL-2 व NF-κB यांच्या mRNA अभिव्यक्तीमध्ये वाढ झाली, यावरून असे सूचित होते की IPA ॲपोप्टोसिस टाळणाऱ्या हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल्स (HSCs) मध्ये जगण्याचे संकेत उत्तेजित करू शकते. हे रेणू सक्रिय हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल्समध्ये जगण्यास मदत करणारे संकेत म्हणून कार्य करू शकतात, जे ॲपोप्टोसिस-विरोधी प्रथिनांच्या (जसे की Bcl-2) वाढलेल्या अभिव्यक्तीशी, ॲपोप्टोसिस-समर्थक BAX च्या कमी झालेल्या अभिव्यक्तीशी आणि TIMP व NF-κB यांच्यातील गुंतागुंतीच्या आंतरक्रियेशी संबंधित असू शकते [5, 7]. आयपीए (IPA) पीएक्सआर (PXR) द्वारे आपले परिणाम घडवून आणते, आणि आम्हाला आढळले की टीजीएफ-बीटा१ (TGF-β1) आणि आयपीए (IPA) यांच्या एकत्रित उपचाराने पीएक्सआर एमआरएनए (PXR mRNA) अभिव्यक्तीची पातळी वाढली, जे एचएससी (HSC) सक्रियतेचे दमन दर्शवते. सक्रिय पीएक्सआर (PXR) सिग्नलिंग हे इन विवो (in vivo) आणि इन व्हिट्रो (in vitro) दोन्हीमध्ये एचएससी (HSC) सक्रियतेला प्रतिबंधित करते हे ज्ञात आहे [52, 53]. आमचे निष्कर्ष सूचित करतात की आयपीए (IPA) एपोप्टोसिसला प्रोत्साहन देऊन, फायब्रोसिस आणि मायटोकॉन्ड्रियल चयापचय कमी करून, आणि जगण्याचे संकेत वाढवून सक्रिय एचएससी (HSCs) च्या निर्मूलनामध्ये सहभागी होऊ शकते, ज्या सक्रिय एचएससी (HSC) फेनोटाइपला निष्क्रिय फेनोटाइपमध्ये रूपांतरित करणाऱ्या सामान्य प्रक्रिया आहेत. एपोप्टोसिसमधील आयपीएच्या (IPA) संभाव्य यंत्रणा आणि भूमिकेसाठी आणखी एक संभाव्य स्पष्टीकरण असे आहे की ते प्रामुख्याने मायटोफॅगी (अंतर्गत मार्ग) आणि बाह्य टीएनएफ (TNF) सिग्नलिंग मार्गाद्वारे (तक्ता १) अकार्यक्षम मायटोकॉन्ड्रिया नष्ट करते, जो थेट एनएफ-कप्पाबी (NF-κB) जगण्याच्या सिग्नलिंग मार्गाशी जोडलेला आहे (पूरक आकृती ७). मनोरंजक म्हणजे, IPA-संबंधित समृद्ध जनुके ॲपोप्टोटिक मार्गात प्रो-ॲपोप्टोटिक आणि प्रो-सर्व्हायव्हल सिग्नल प्रेरित करण्यास सक्षम आहेत [54], जे सूचित करते की IPA या जनुकांशी संवाद साधून ॲपोप्टोटिक मार्ग किंवा सर्व्हायव्हल प्रेरित करू शकते. तथापि, HSC सक्रियतेदरम्यान IPA ॲपोप्टोसिस किंवा सर्व्हायव्हल कसे प्रेरित करते आणि त्याचे यांत्रिक मार्ग अस्पष्ट आहेत.
आयपीए (IPA) हे आतड्यातील सूक्ष्मजीवांद्वारे आहारातील ट्रिप्टोफॅनपासून तयार होणारे एक सूक्ष्मजैविक चयापचय उत्पादन आहे. अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की आतड्यांच्या वातावरणात त्यात दाह-विरोधी, अँटीऑक्सिडंट आणि एपिजेनेटिक नियामक गुणधर्म आहेत.[55] अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की आयपीए आतड्यांच्या अडथळ्याच्या कार्याचे नियमन करू शकते आणि ऑक्सिडेटिव्ह ताण कमी करू शकते, ज्यामुळे त्याच्या स्थानिक शारीरिक परिणामांमध्ये योगदान मिळू शकते.[56] खरं तर, आयपीए रक्ताभिसरणाद्वारे लक्ष्य अवयवांपर्यंत पोहोचवले जाते, आणि ट्रिप्टोफॅन, सेरोटोनिन आणि इंडोल डेरिव्हेटिव्ह्जसोबत आयपीएची प्रमुख चयापचय रचना समान असल्यामुळे, आयपीए चयापचय क्रिया करते ज्यामुळे स्पर्धात्मक चयापचय परिणाम होतात.[52] आयपीए एन्झाइम्स किंवा रिसेप्टर्सवरील बंधन स्थळांसाठी ट्रिप्टोफॅन-व्युत्पन्न चयापचय उत्पादनांशी स्पर्धा करू शकते, ज्यामुळे सामान्य चयापचय मार्गांमध्ये व्यत्यय येऊ शकतो. यामुळे त्याच्या उपचारात्मक मर्यादेबद्दल अधिक चांगल्या प्रकारे समजून घेण्यासाठी त्याच्या फार्माकोकायनेटिक्स आणि फार्माकोडायनॅमिक्सवर पुढील अभ्यासाची गरज अधोरेखित होते.[57] हे हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल्स (HSCs) मध्ये देखील घडू शकते की नाही हे पाहणे बाकी आहे.
आम्ही मान्य करतो की आमच्या अभ्यासाला काही मर्यादा आहेत. विशेषतः IPA शी संबंधित संबंध तपासण्यासाठी, आम्ही टाईप २ मधुमेह (T2DM) असलेल्या रुग्णांना वगळले. आम्ही हे मान्य करतो की यामुळे आमचे निष्कर्ष टाईप २ मधुमेह आणि यकृताच्या प्रगत आजाराने ग्रस्त असलेल्या रुग्णांपुरते मर्यादित राहतात. मानवी सीरममध्ये IPA ची शारीरिक पातळी १-१० μM [११, २०] असली तरी, १ mM IPA ची पातळी सर्वोच्च अविषारी पातळीवर [१५] आणि ॲपोप्टोसिसच्या सर्वोच्च दरावर आधारित निवडली गेली, ज्यात मृत पेशींच्या टक्केवारीत कोणताही फरक आढळला नाही. या अभ्यासात IPA ची अतिशारीरिक पातळी वापरली गेली असली तरी, IPA च्या प्रभावी मात्रेबद्दल सध्या कोणताही एकमत नाही [५२]. आमचे निष्कर्ष महत्त्वपूर्ण असले तरी, IPA चे व्यापक चयापचय भवितव्य हे संशोधनाचे एक सक्रिय क्षेत्र आहे. शिवाय, सीरम IPA पातळी आणि यकृताच्या डीएनए मेथिलेशनमधील संबंधांवरील आमचे निष्कर्ष केवळ हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल्स (HSCs) मधूनच नव्हे, तर यकृताच्या ऊतींमधूनही प्राप्त झाले आहेत. आमच्या ट्रान्सक्रिप्टोम विश्लेषणातून मिळालेल्या पूर्वीच्या निष्कर्षांनुसार, IPA हे हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियतेशी संबंधित आहे [15], आणि यकृताच्या फायब्रोसिसच्या प्रगतीमध्ये HSCs या प्रमुख पेशींचा सहभाग असतो, या आधारावर आम्ही मानवी LX-2 पेशी वापरण्याचे निवडले. यकृत हे अनेक प्रकारच्या पेशींनी बनलेले असते, त्यामुळे IPA ची भूमिका आणि यकृताच्या इतर पेशी प्रकारांशी होणारी त्याची आंतरक्रिया यांचा अभ्यास करण्यासाठी, कॅस्पेस सक्रियता आणि डीएनए विखंडन यांच्यासह हेपॅटोसाइट-HSC-इम्यून सेल को-कल्चर सिस्टीमसारख्या इतर पेशी मॉडेल्सचा, तसेच प्रथिन पातळीसह कार्यप्रणालीचा विचार केला पाहिजे.