आम्ही पूर्वी नोंदवले होते की यकृत फायब्रोसिस असलेल्या रुग्णांमध्ये आतड्यांमधून मिळणारे ट्रिप्टोफॅन मेटाबोलाइट इंडोल-३-प्रोपियोनिक अॅसिड (IPA) चे सीरम लेव्हल कमी असते. या अभ्यासात, आम्ही सीरम IPA लेव्हलच्या संबंधात लठ्ठ यकृतातील ट्रान्सक्रिप्टोम आणि DNA मिथाइलॉम तसेच इन विट्रोमध्ये यकृताच्या स्टेलेट पेशी (HSCs) च्या फेनोटाइपिक निष्क्रियतेला प्रेरित करण्यात IPA ची भूमिका तपासली.
या अभ्यासात टाइप २ मधुमेह मेल्तिस (T2DM) नसलेल्या ११६ लठ्ठ रुग्णांचा (वय ४६.८ ± ९.३ वर्षे; BMI: ४२.७ ± ५.० kg/m²) समावेश होता ज्यांनी कुओपिओ बॅरिएट्रिक सर्जरी सेंटर (KOBS) येथे बॅरिएट्रिक शस्त्रक्रिया केली. लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) द्वारे परिसंचरण IPA पातळी मोजली गेली, एकूण RNA सिक्वेन्सिंगद्वारे लिव्हर ट्रान्सक्रिप्टोम विश्लेषण केले गेले आणि इन्फिनियम ह्युमन मेथिलेशन४५० बीडचिप वापरून DNA मेथिलेशन विश्लेषण केले गेले. इन विट्रो प्रयोगांसाठी मानवी यकृताच्या स्टेलेट पेशी (LX-2) वापरल्या गेल्या.
यकृतातील अपोप्टोटिक, मायटोफॅजिक आणि दीर्घायुष्य मार्गांमध्ये सामील असलेल्या जनुकांच्या अभिव्यक्तीशी सीरम आयपीए पातळीचा संबंध होता. यकृत ट्रान्सक्रिप्ट आणि डीएनए मिथाइलेशन प्रोफाइलमध्ये AKT सेरीन/थ्रेओनाईन काइनेज 1 (AKT1) जनुक हा सर्वात मुबलक आणि प्रभावी परस्परसंवादी जनुक होता. IPA उपचारामुळे फायब्रोसिस, अपोप्टोसिस आणि LX-2 पेशींचे अस्तित्व नियंत्रित करण्यासाठी ज्ञात असलेल्या जनुकांच्या अभिव्यक्तीचे मॉड्युलेट करून एपोप्टोसिस, मायटोकॉन्ड्रियल श्वसन कमी झाले आणि पेशींचे आकारविज्ञान आणि मायटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता बदलली.
एकत्रितपणे, हे डेटा समर्थन देतात की IPA मध्ये संभाव्य उपचारात्मक प्रभाव आहेत आणि ते एपोप्टोसिसला प्रेरित करू शकतात आणि HSC फेनोटाइपला निष्क्रिय स्थितीकडे वळवू शकतात, ज्यामुळे HSC सक्रियकरण आणि मायटोकॉन्ड्रियल चयापचयात व्यत्यय आणून यकृत फायब्रोसिस रोखण्याची शक्यता वाढते.
लठ्ठपणा आणि मेटाबॉलिक सिंड्रोमचा प्रसार मेटाबॉलिकली संबंधित फॅटी लिव्हर डिसीज (MASLD) च्या वाढत्या घटनांशी संबंधित आहे; हा रोग सामान्य लोकसंख्येच्या 25% ते 30% लोकांना प्रभावित करतो [1]. MASLD एटिओलॉजीचा मुख्य परिणाम म्हणजे लिव्हर फायब्रोसिस, ही एक गतिमान प्रक्रिया आहे जी तंतुमय बाह्य पेशीय मॅट्रिक्स (ECM) [2] च्या सतत संचयनाद्वारे दर्शविली जाते. यकृत फायब्रोसिसमध्ये सहभागी असलेल्या मुख्य पेशी हेपेटिक स्टेलेट पेशी (HSCs) आहेत, ज्या चार ज्ञात फेनोटाइप प्रदर्शित करतात: शांत, सक्रिय, निष्क्रिय आणि वृद्ध [3, 4]. HSCs सक्रिय केले जाऊ शकतात आणि α-स्मूथ स्नायू अ‍ॅक्टिन (α-SMA) आणि टाइप I कोलेजन (Col-I) [5, 6] च्या वाढीव अभिव्यक्तीसह, उच्च ऊर्जा मागणी असलेल्या प्रजननक्षम फायब्रोब्लास्ट-सारख्या पेशींमध्ये शांत स्वरूपातून रूपांतरित केले जाऊ शकतात. यकृत फायब्रोसिस रिव्हर्सल दरम्यान, सक्रिय HSCs एपोप्टोसिस किंवा निष्क्रियतेद्वारे काढून टाकले जातात. या प्रक्रियांमध्ये फायब्रोजेनिक जनुकांचे डाउनरेग्युलेशन आणि प्रोसर्व्हायव्हल जनुकांचे मॉड्युलेशन (जसे की NF-κB आणि PI3K/Akt सिग्नलिंग मार्ग) [7, 8], तसेच माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स आणि फंक्शनमधील बदल [9] यांचा समावेश आहे.
आतड्यात तयार होणाऱ्या ट्रिप्टोफॅन मेटाबोलाइट इंडोल-३-प्रोपियोनिक अॅसिड (IPA) चे सीरम लेव्हल, MASLD [10-13] यासारख्या मानवी चयापचय रोगांमध्ये कमी झाल्याचे आढळून आले आहे. IPA आहारातील फायबरच्या सेवनाशी संबंधित आहे, त्याच्या अँटिऑक्सिडंट आणि दाहक-विरोधी प्रभावांसाठी ओळखले जाते आणि आहार-प्रेरित नॉन-अल्कोहोलिक स्टीटोहेपेटायटीस (NASH) फेनोटाइप इन विवो आणि इन विट्रो [11-14] कमी करते. काही पुरावे आमच्या मागील अभ्यासातून आले आहेत, ज्याने कुओपिओ बॅरिएट्रिक सर्जरी स्टडी (KOBS) मध्ये लिव्हर फायब्रोसिस नसलेल्या लठ्ठ रुग्णांपेक्षा लिव्हर फायब्रोसिस असलेल्या रुग्णांमध्ये सीरम IPA लेव्हल कमी असल्याचे दाखवून दिले. शिवाय, आम्ही दाखवून दिले की IPA उपचार मानवी यकृताच्या स्टेलेट सेल (LX-2) मॉडेलमध्ये पेशी आसंजन, पेशी स्थलांतर आणि हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल सक्रियतेचे शास्त्रीय मार्कर असलेल्या जनुकांची अभिव्यक्ती कमी करू शकतात आणि एक संभाव्य हेपॅटोप्रोटेक्टिव्ह मेटाबोलाइट आहे [15]. तथापि, HSC अपोप्टोसिस आणि मायटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स सक्रिय करून IPA लिव्हर फायब्रोसिस रिग्रेशन कसे प्रेरित करते हे अद्याप स्पष्ट नाही.
येथे, आम्ही दाखवून देतो की सीरम IPA हे लठ्ठ परंतु नॉन-टाइप 2 मधुमेह (KOBS) व्यक्तींच्या यकृतातील एपोप्टोसिस, मायटोफॅगी आणि दीर्घायुष्य मार्गांमध्ये समृद्ध जनुकांच्या अभिव्यक्तीशी संबंधित आहे. शिवाय, आम्हाला आढळले की IPA निष्क्रियता मार्गाद्वारे सक्रिय हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल्स (HSCs) च्या क्लिअरन्स आणि डिग्रेडेशनला प्रेरित करू शकते. हे निकाल IPA साठी एक नवीन भूमिका प्रकट करतात, ज्यामुळे ते यकृत फायब्रोसिस रिग्रेशनला प्रोत्साहन देण्यासाठी एक संभाव्य उपचारात्मक लक्ष्य बनते.
KOBS गटातील मागील अभ्यासात असे दिसून आले की यकृत फायब्रोसिस असलेल्या रुग्णांमध्ये यकृत फायब्रोसिस नसलेल्या रुग्णांच्या तुलनेत कमी रक्ताभिसरण IPA पातळी होती [15]. टाइप 2 मधुमेहाचा संभाव्य गोंधळात टाकणारा परिणाम वगळण्यासाठी, आम्ही टाइप 2 मधुमेह नसलेल्या 116 लठ्ठ रुग्णांना (सरासरी वय ± SD: 46.8 ± 9.3 वर्षे; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (तक्ता 1) अभ्यास लोकसंख्या म्हणून चालू KOBS अभ्यासातून निवडले [16]. सर्व सहभागींनी लेखी माहितीपूर्ण संमती दिली आणि हेलसिंकीच्या घोषणेनुसार (54/2005, 104/2008 आणि 27/2010) नॉर्थ सावो काउंटी हॉस्पिटलच्या नीतिमत्ता समितीने अभ्यास प्रोटोकॉलला मान्यता दिली.
बॅरिएट्रिक शस्त्रक्रियेदरम्यान यकृत बायोप्सीचे नमुने घेतले गेले आणि पूर्वी वर्णन केलेल्या निकषांनुसार अनुभवी पॅथॉलॉजिस्टद्वारे हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन केले गेले [17, 18]. मूल्यांकन निकष पूरक तक्ता S1 मध्ये सारांशित केले आहेत आणि पूर्वी वर्णन केले गेले आहेत [19].
मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषणासाठी (n = 116) अनटार्गेटेड लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) द्वारे फास्टिंग सीरम नमुन्यांचे विश्लेषण केले गेले. पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे UHPLC-qTOF-MS प्रणाली (1290 LC, 6540 qTOF-MS, एजिलेंट टेक्नॉलॉजीज, वॉल्डब्रॉन, कार्लस्रुहे, जर्मनी) वापरून नमुन्यांचे विश्लेषण केले गेले. आयसोप्रोपाइल अल्कोहोल (IPA) ची ओळख धारणा वेळेवर आणि MS/MS स्पेक्ट्रमची शुद्ध मानकांशी तुलना करण्यावर आधारित होती. पुढील सर्व विश्लेषणांमध्ये IPA सिग्नल तीव्रता (पीक एरिया) विचारात घेण्यात आली [20].
संपूर्ण यकृत आरएनए सिक्वेन्सिंग इल्युमिना हायसेक २५०० वापरून केले गेले आणि पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे डेटा प्रीप्रोसेस केला गेला [१९, २१, २२]. आम्ही मिटोमायनर ४.० डेटाबेसमधून निवडलेल्या १९५७ जीन्सचा वापर करून माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन/बायोजेनेसिसवर परिणाम करणाऱ्या ट्रान्सक्रिप्ट्सचे लक्ष्यित विभेदक अभिव्यक्ती विश्लेषण केले [२३]. यकृत डीएनए मिथाइलेशन विश्लेषण पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे [२४, २५] समान पद्धती वापरून इन्फिनियम ह्युमनमेथिलेशन४५० बीडचिप (इल्युमिना, सॅन दिएगो, सीए, यूएसए) वापरून केले गेले.
प्रोफेसर स्टेफानो रोमियो यांनी मानवी यकृताच्या तारक पेशी (LX-2) दयाळूपणे प्रदान केल्या आणि DMEM/F12 माध्यमात (बायोवेस्ट, L0093-500, 1% पेन/स्ट्रेप; लोंझा, DE17-602E, 2% FBS; गिब्को, 10270-106) कल्चर आणि देखभाल केल्या. IPA चा कार्यरत डोस निवडण्यासाठी, LX-2 पेशींवर DMEM/F12 माध्यमात 24 तासांसाठी वेगवेगळ्या IPA सांद्रता (10 μM, 100 μM आणि 1 mM; सिग्मा, 220027) सह उपचार केले गेले. शिवाय, HSC निष्क्रिय करण्यासाठी IPA ची क्षमता तपासण्यासाठी, LX-2 पेशींवर 5 ng/ml TGF-β1 (R&D सिस्टम्स, 240-B-002/CF) आणि 1 mM IPA सह 24 तासांसाठी सीरम-मुक्त माध्यमात सह-उपचार केले गेले. संबंधित वाहन नियंत्रणांसाठी, TGF-β1 उपचारासाठी 0.1% BSA असलेले 4 nM HCL वापरले गेले आणि IPA उपचारासाठी 0.05% DMSO वापरले गेले, आणि दोन्ही एकत्रित उपचारांसाठी एकत्रितपणे वापरले गेले.
उत्पादकाच्या सूचनांनुसार 7-AAD (बायोलेजेंड, सॅन दिएगो, सीए, यूएसए, कॅट# 640922) सह FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit वापरून अपोप्टोसिसचे मूल्यांकन करण्यात आले. थोडक्यात, LX-2 (1 × 105 पेशी/विहीर) रात्रभर 12-विहीर प्लेट्समध्ये कल्चर केले गेले आणि नंतर IPA किंवा IPA आणि TGF-β1 च्या अनेक डोसने उपचार केले गेले. दुसऱ्या दिवशी, तरंगत्या आणि चिकटलेल्या पेशी गोळा केल्या गेल्या, ट्रिप्सिनाइज केल्या गेल्या, PBS ने धुतल्या गेल्या, Annexin V बाइंडिंग बफरमध्ये पुन्हा सस्पेंड केल्या गेल्या आणि FITC-Annexin V आणि 7-AAD ने 15 मिनिटांसाठी इनक्युबेट केल्या गेल्या.
Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (थर्मो फिशर सायंटिफिक, कार्ल्सबॅड, CA) वापरून सजीव पेशींमधील माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सिडेटिव्ह क्रियाकलापांसाठी रंगवले गेले. MTR चाचण्यांसाठी, LX-2 पेशी IPA आणि TGF-β1 सह समान घनतेवर उष्मायन करण्यात आल्या. 24 तासांनंतर, सजीव पेशींना ट्रिप्सिनाइज करण्यात आले, PBS ने धुतले गेले आणि नंतर पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे 37 °C वर 20 मिनिटांसाठी सीरम-मुक्त माध्यमात 100 μM MTR सह उष्मायन करण्यात आले [26]. सजीव पेशी आकारविज्ञान विश्लेषणासाठी, अनुक्रमे फॉरवर्ड स्कॅटर (FSC) आणि साइड स्कॅटर (SSC) पॅरामीटर्स वापरून पेशी आकार आणि सायटोप्लाज्मिक जटिलतेचे विश्लेषण केले गेले.
सर्व डेटा (३०,००० इव्हेंट्स) नोवोसाइट क्वांटियन (एजिलेंट) वापरून मिळवला गेला आणि नोवोएक्सप्रेस® १.४.१ किंवा फ्लोजो व्ही.१० सॉफ्टवेअर वापरून त्याचे विश्लेषण केले गेले.
उत्पादकाच्या सूचनांनुसार, सीहॉर्स एक्सएफ सेल मिटो स्ट्रेसने सुसज्ज असलेल्या सीहॉर्स एक्सट्रासेल्युलर फ्लक्स अॅनालायझर (एजिलेंट टेक्नॉलॉजीज, सांता क्लारा, सीएआर) वापरून ऑक्सिजन वापर दर (ओसीआर) आणि एक्सट्रासेल्युलर अॅसिडिफिकेशन दर (ईसीएआर) रिअल टाइममध्ये मोजण्यात आला. थोडक्यात, 2 × 104 एलएक्स-2 पेशी/विहीर XF96 सेल कल्चर प्लेट्सवर सीड करण्यात आल्या. रात्रीच्या उष्मायनानंतर, पेशींवर आयसोप्रोपॅनॉल (आयपीए) आणि टीजीएफ-β1 (पूरक पद्धती 1) वापरून उपचार करण्यात आले. सीहॉर्स एक्सएफ वेव्ह सॉफ्टवेअर वापरून डेटा विश्लेषण केले गेले, ज्यामध्ये सीहॉर्स एक्सएफ सेल एनर्जी फेनोटाइप टेस्ट रिपोर्ट जनरेटर समाविष्ट आहे. यावरून, बायोएनर्जेटिक हेल्थ इंडेक्स (बीएचआय) मोजण्यात आला [27].
एकूण आरएनएचे सीडीएनएमध्ये लिप्यंतरण करण्यात आले. विशिष्ट पद्धतींसाठी, संदर्भ पहा [15]. मानवी 60S राइबोसोमल अ‍ॅसिडिक प्रोटीन P0 (RPLP0) आणि सायक्लोफिलिन A1 (PPIA) mRNA पातळी घटक जनुक नियंत्रण म्हणून वापरली गेली. क्वांटस्टुडिओ 6 प्रो रिअल-टाइम पीसीआर सिस्टम (थर्मो फिशर, लँडस्मीर, नेदरलँड्स) चा वापर टॅकमन™ फास्ट अॅडव्हान्स्ड मास्टर मिक्स किट (अप्लाइड बायोसिस्टम्स) किंवा सेन्सिफास्ट एसवायबीआर लो-रॉक्स किट (बायोलाइन, बायो 94050) सह केला गेला आणि तुलनात्मक सीटी व्हॅल्यू सायकलिंग पॅरामीटर्स (ΔΔCt) आणि ∆∆Ct पद्धत वापरून सापेक्ष जीन अभिव्यक्ती पट मोजला गेला. प्रायमरची तपशील पूरक तक्ते S2 आणि S3 मध्ये दिली आहेत.
पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे [28] DNeasy रक्त आणि ऊती किट (कियाजेन) वापरून न्यूक्लियर डीएनए (ncDNA) आणि मायटोकॉन्ड्रियल डीएनए (mtDNA) काढले गेले. पूरक पद्धती 2 मध्ये तपशीलवार वर्णन केल्याप्रमाणे, प्रत्येक लक्ष्य mtDNA प्रदेशाचे तीन न्यूक्लियर डीएनए प्रदेशांच्या भौमितिक सरासरीशी (mtDNA/ncDNA) गुणोत्तर मोजून mtDNA चे सापेक्ष प्रमाण मोजले गेले. mtDNA आणि ncDNA साठी प्रायमरची माहिती पूरक तक्ता S4 मध्ये दिली आहे.
इंटरसेल्युलर आणि इंट्रासेल्युलर माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क्सची कल्पना करण्यासाठी जिवंत पेशींना Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (थर्मो फिशर सायंटिफिक, कार्ल्सबॅड, CA) ने रंगवले गेले. LX-2 पेशी (1 × 104 पेशी/विहीर) संबंधित काचेच्या तळाशी असलेल्या कल्चर प्लेट्समध्ये काचेच्या स्लाईडवर कल्चर करण्यात आल्या (Ibidi GmbH, Martinsried, जर्मनी). 24 तासांनंतर, जिवंत LX-2 पेशींना 37 °C वर 20 मिनिटांसाठी 100 μM MTR सह इनक्युबेट केले गेले आणि सेल न्यूक्ली DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) ने रंगवले गेले जसे पूर्वी वर्णन केले आहे [29]. 63×NA 1.3 ऑब्जेक्टिव्ह वापरून 5% CO2 असलेल्या आर्द्र वातावरणात 37 °C वर Zeiss Axio Observer इनव्हर्टेड मायक्रोस्कोप (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) वापरून Mitochondrial नेटवर्क्सचे दृश्यमानीकरण करण्यात आले. प्रत्येक नमुना प्रकारासाठी आम्ही दहा Z-मालिका प्रतिमा मिळवल्या. प्रत्येक Z-मालिका मध्ये 30 विभाग आहेत, प्रत्येकाची जाडी 9.86 μm आहे. प्रत्येक नमुन्यासाठी, ZEN 2009 सॉफ्टवेअर (कार्ल झीस मायक्रोइमेजिंग GmbH, जेना, जर्मनी) वापरून दहा वेगवेगळ्या दृश्य क्षेत्रांच्या प्रतिमा मिळवल्या गेल्या आणि पूरक पद्धती 3 मध्ये तपशीलवार दिलेल्या पॅरामीटर्सनुसार इमेजजे सॉफ्टवेअर (v1.54d) [30, 31] वापरून माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी विश्लेषण केले गेले.
पेशींना ०.१ एम फॉस्फेट बफरमध्ये २% ग्लूटारल्डिहाइडने निश्चित केले गेले, त्यानंतर १% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड द्रावणाने (सिग्मा अल्ड्रिक, एमओ, यूएसए) निश्चित केले गेले, हळूहळू एसीटोनने निर्जलीकरण केले गेले (मर्क, डार्मस्टॅड, जर्मनी) आणि शेवटी इपॉक्सी रेझिनमध्ये एम्बेड केले गेले. अल्ट्राथिन विभाग तयार केले गेले आणि १% युरेनिल एसीटेट (मर्क, डार्मस्टॅड, जर्मनी) आणि १% लीड सायट्रेट (मर्क, डार्मस्टॅड, जर्मनी) ने रंगवले गेले. ८० केव्हीच्या प्रवेगक व्होल्टेजवर JEM २१००F EXII ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (JEOL लिमिटेड, टोकियो, जपान) वापरून अल्ट्रास्ट्रक्चरल प्रतिमा मिळवल्या गेल्या.
झीस इनव्हर्टेड लाईट मायक्रोस्कोप (झीस अ‍ॅक्सिओ व्हर्ट.ए१ आणि अ‍ॅक्सिओकॅम एमआरएम, जेना, जर्मनी) वापरून ५०x मॅग्निफिकेशनवर फेज-कॉन्ट्रास्ट मायक्रोस्कोपीद्वारे २४ तासांसाठी आयपीएने उपचार केलेल्या एलएक्स-२ पेशींच्या आकारविज्ञानाचे विश्लेषण केले गेले.
क्लिनिकल डेटा सरासरी ± मानक विचलन किंवा मध्यक (इंटरक्वार्टाइल रेंज: IQR) म्हणून व्यक्त केला गेला. तीन अभ्यास गटांमधील फरकांची तुलना करण्यासाठी भिन्नतेचे एक-मार्गी विश्लेषण (सतत चल) किंवा χ² चाचणी (वर्गीकृत चल) वापरले गेले. अनेक चाचणींसाठी दुरुस्त करण्यासाठी खोटे सकारात्मक दर (FDR) वापरले गेले आणि FDR < 0.05 असलेले जनुक सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण मानले गेले. IPA सिग्नल तीव्रतेसह CpG DNA मेथिलेशन सहसंबंधित करण्यासाठी स्पीअरमन सहसंबंध विश्लेषण वापरले गेले, ज्यामध्ये नाममात्र p मूल्ये (p < 0.05) नोंदवली गेली.
३०९३ यकृत ट्रान्सक्रिप्टपैकी २६८ ट्रान्सक्रिप्ट्स (नाममात्र p < ०.०१), ११९ मायटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट्स (नाममात्र p < ०.०५) आणि ४३५० CpGs साठी वेब-आधारित जीन सेट विश्लेषण टूल (वेबगेस्टाल्ट) वापरून पाथवे विश्लेषण केले गेले जे रक्ताभिसरण करणाऱ्या सीरम IPA पातळीशी संबंधित होते. मुक्तपणे उपलब्ध असलेले व्हेनी डीबी (आवृत्ती २.१.०) टूल ओव्हरलॅपिंग जीन्स शोधण्यासाठी वापरले गेले आणि स्ट्रिंगडीबी (आवृत्ती ११.५) प्रथिने-प्रथिने परस्परसंवाद दृश्यमान करण्यासाठी वापरले गेले.
LX-2 प्रयोगासाठी, D'Agostino-Pearson चाचणी वापरून नमुन्यांची सामान्यता तपासण्यात आली. किमान तीन जैविक प्रतिकृतींमधून डेटा मिळवण्यात आला आणि बोनफेरोनी पोस्ट हॉक चाचणीसह एकतर्फी ANOVA मध्ये टाकण्यात आला. 0.05 पेक्षा कमी p-मूल्य सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण मानले गेले. डेटा सरासरी ± SD म्हणून सादर केला आहे आणि प्रत्येक आकृतीमध्ये प्रयोगांची संख्या दर्शविली आहे. सर्व विश्लेषणे आणि आलेख विंडोजसाठी ग्राफपॅड प्रिझम 8 सांख्यिकीय सॉफ्टवेअर वापरून केले गेले (ग्राफपॅड सॉफ्टवेअर इंक., आवृत्ती 8.4.3, सॅन दिएगो, यूएसए).
प्रथम, आम्ही यकृत, संपूर्ण शरीर आणि माइटोकॉन्ड्रियल ट्रान्सक्रिप्ट्ससह सीरम IPA पातळीच्या संबंधाची तपासणी केली. एकूण ट्रान्सक्रिप्ट प्रोफाइलमध्ये, सीरम IPA पातळीशी संबंधित सर्वात मजबूत जनुक MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज-सक्रिय प्रोटीन काइनेज 3) होता; माइटोकॉन्ड्रियल-संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट प्रोफाइलमध्ये, सर्वात मजबूत संबंधित जनुक AKT1 (FDR = 0.7621; AKT सेरीन/थ्रेओनाईन काइनेज 1) (अतिरिक्त फाइल 1 आणि अतिरिक्त फाइल 2) होता.
त्यानंतर आम्ही जागतिक ट्रान्सक्रिप्ट्स (n = 268; p < 0.01) आणि मायटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट्स (n = 119; p < 0.05) चे विश्लेषण केले, शेवटी एपोप्टोसिसला सर्वात महत्त्वपूर्ण कॅनोनिकल मार्ग म्हणून ओळखले (p = 0.0089). सीरम IPA पातळीशी संबंधित माइटोकॉन्ड्रियल ट्रान्सक्रिप्ट्ससाठी, आम्ही एपोप्टोसिस (FDR = 0.00001), मायटोफॅजी (FDR = 0.00029) आणि TNF सिग्नलिंग मार्ग (FDR = 0.000006) (आकृती 1A, तक्ता 2, आणि पूरक आकृत्या 1A-B) वर लक्ष केंद्रित केले.
सीरम आयपीए पातळीशी संबंधित जागतिक, मायटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि मानवी यकृतातील डीएनए मिथाइलेशनचे ओव्हरलॅपिंग विश्लेषण. ए २६८ जागतिक ट्रान्सक्रिप्ट्स, ११९ मायटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि डीएनए मिथाइलेटेड ट्रान्सक्रिप्ट्स दर्शवते जे सीरम आयपीए पातळीशी संबंधित ३०९२ सीपीजी साइट्सवर मॅप केले जातात (जागतिक ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि डीएनए मिथाइलेटेडसाठी पी व्हॅल्यूज <०.०१ आणि माइटोकॉन्ड्रियल ट्रान्सक्रिप्ट्ससाठी पी व्हॅल्यूज <०.०५). प्रमुख ओव्हरलॅपिंग ट्रान्सक्रिप्ट्स मध्यभागी दर्शविल्या आहेत (AKT1 आणि YKT6). B इतर जनुकांसह सर्वाधिक परस्परसंवाद स्कोअर (०.९००) असलेल्या १३ जनुकांचा परस्परसंवाद नकाशा स्ट्रिंगडीबी या ऑनलाइन टूलचा वापर करून सीरम आयपीए पातळीशी लक्षणीयरीत्या संबंधित असलेल्या ५६ ओव्हरलॅपिंग जनुकांपासून (ब्लॅक लाइन रिजन) तयार करण्यात आला. हिरवा: जीन ऑन्टोलॉजी (GO) सेल्युलर घटकाशी मॅप केलेले जीन्स: मायटोकॉन्ड्रिया (GO:0005739). डेटाच्या आधारावर (टेक्स्ट मायनिंग, प्रयोग, डेटाबेस आणि सह-अभिव्यक्तीवर आधारित) इतर प्रथिनांशी परस्परसंवादासाठी AKT1 हा सर्वोच्च स्कोअर (0.900) असलेला प्रथिन आहे. नेटवर्क नोड्स प्रथिनांचे प्रतिनिधित्व करतात आणि कडा प्रथिनांमधील कनेक्शन दर्शवतात.
आतड्यांतील मायक्रोबायोटा मेटाबोलाइट्स डीएनए मेथिलेशन [32] द्वारे एपिजेनेटिक रचना नियंत्रित करू शकतात, म्हणून आम्ही सीरम आयपीए पातळी यकृत डीएनए मेथिलेशनशी संबंधित आहेत का याचा तपास केला. आम्हाला आढळले की सीरम आयपीए पातळीशी संबंधित दोन प्रमुख मेथिलेशन साइट्स प्रोलाइन-सेरिन-समृद्ध प्रदेश 3 (C19orf55) आणि उष्मा शॉक प्रोटीन फॅमिली बी (लहान) सदस्य 6 (HSPB6) (अतिरिक्त फाइल 3) जवळ होत्या. 4350 CpG (p < 0.01) चे डीएनए मेथिलेशन सीरम आयपीए पातळीशी संबंधित होते आणि दीर्घायुष्य नियामक मार्गांमध्ये समृद्ध होते (p = 0.006) (आकृती 1A, तक्ता 2, आणि पूरक आकृती 1C).
मानवी यकृतातील सीरम IPA पातळी, जागतिक ट्रान्सक्रिप्ट्स, मायटोकॉन्ड्रियाशी संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि DNA मिथिलेशन यांच्यातील संबंधांमधील जैविक यंत्रणा समजून घेण्यासाठी, आम्ही मागील मार्ग विश्लेषणात (आकृती 1A) ओळखल्या गेलेल्या जनुकांचे ओव्हरलॅप विश्लेषण केले. 56 ओव्हरलॅपिंग जनुकांच्या (आकृती 1A मधील काळ्या रेषेच्या आत) मार्ग समृद्ध विश्लेषणाच्या निकालांवरून असे दिसून आले की व्हेन आकृतीमध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, AKT1 आणि YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog) या तीन विश्लेषणांमध्ये सामान्य असलेल्या दोन जनुकांना अपोप्टोसिस मार्ग (p = 0.00029) हायलाइट केले (पूरक आकृती 2 आणि आकृती 1A). मनोरंजकपणे, आम्हाला आढळले की AKT1 (cg19831386) आणि YKT6 (cg24161647) सीरम IPA पातळीशी सकारात्मकरित्या सहसंबंधित होते (अतिरिक्त फाइल 3). जनुक उत्पादनांमधील संभाव्य प्रथिने परस्परसंवाद ओळखण्यासाठी, आम्ही इनपुट म्हणून 56 ओव्हरलॅपिंग जनुकांपैकी सर्वाधिक सामान्य प्रदेश स्कोअर (0.900) असलेले 13 जनुक निवडले आणि एक परस्परसंवाद नकाशा तयार केला. आत्मविश्वास पातळी (किमान आत्मविश्वास) नुसार, सर्वाधिक गुण (0.900) असलेला AKT1 जनुक शीर्षस्थानी होता (आकृती 1B).
मार्ग विश्लेषणाच्या आधारे, आम्हाला आढळले की अपोप्टोसिस हा प्रमुख मार्ग होता, म्हणून आम्ही IPA उपचार HSCs इन विट्रोच्या अपोप्टोसिसवर परिणाम करेल का याचा तपास केला. आम्ही पूर्वी दाखवून दिले की IPA चे वेगवेगळे डोस (10 μM, 100 μM आणि 1 mM) LX-2 पेशींसाठी गैर-विषारी होते [15]. या अभ्यासात असे दिसून आले की 10 μM आणि 100 μM वर IPA उपचाराने व्यवहार्य आणि नेक्रोटिक पेशींची संख्या वाढवली. तथापि, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, पेशी व्यवहार्यता 1 mM IPA एकाग्रतेवर कमी झाली, तर पेशी नेक्रोसिस दर अपरिवर्तित राहिला (आकृती 2A, B). पुढे, LX-2 पेशींमध्ये अपोप्टोसिस प्रेरित करण्यासाठी इष्टतम एकाग्रता शोधण्यासाठी, आम्ही 24 तासांसाठी 10 μM, 100 μM आणि 1 mM IPA चाचणी केली (आकृती 2A-E आणि पूरक आकृती 3A-B). मनोरंजक गोष्ट म्हणजे, IPA 10 μM आणि 100 μM ने एपोप्टोसिस दर (%) कमी केला, तथापि, IPA 1 mM ने नियंत्रणाच्या तुलनेत उशीरा एपोप्टोसिस आणि एपोप्टोसिस दर (%) वाढवला आणि म्हणूनच पुढील प्रयोगांसाठी निवडले गेले (आकृती 2A-D).
IPA LX-2 पेशींचा अपोप्टोसिस प्रेरित करतो. फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे अपोप्टोटिक रेट आणि सेल मॉर्फोलॉजी मोजण्यासाठी अॅनेक्सिन V आणि 7-AAD डबल स्टेनिंग पद्धत वापरली गेली. BA पेशींना 24 तासांसाठी 10 μM, 100 μM आणि 1 mM IPA किंवा F–H TGF-β1 (5 ng/ml) आणि 1 mM IPA सह सीरम-मुक्त माध्यमात 24 तासांसाठी इनक्युबेट केले गेले. A: जिवंत पेशी (अ‍ॅनेक्सिन V -/ 7AAD-); B: नेक्रोटिक पेशी (अ‍ॅनेक्सिन V -/ 7AAD+); C, F: लवकर (अ‍ॅनेक्सिन V +/ 7AAD-); D, G: उशीरा (अ‍ॅनेक्सिन V+/7AAD.+); E, H: अपोप्टोटिक रेटमध्ये एकूण लवकर आणि उशीरा अपोप्टोटिक पेशींची टक्केवारी (%). डेटा सरासरी ± SD, n = 3 स्वतंत्र प्रयोग म्हणून व्यक्त केला जातो. बोनफेरोनी पोस्ट हॉक चाचणीसह एकतर्फी ANOVA वापरून सांख्यिकीय तुलना करण्यात आली. *p < 0.05; ****p < 0.0001
जसे आपण आधी दाखवले आहे की, 5 ng/ml TGF-β1 क्लासिकल मार्कर जीन्सची अभिव्यक्ती वाढवून HSC सक्रियकरणाला प्रेरित करू शकते [15]. LX-2 पेशींवर 5 ng/ml TGF-β1 आणि 1 mM IPA एकत्रितपणे उपचार केले गेले (आकृती 2E–H). TGF-β1 उपचाराने एपोप्टोसिस दर बदलला नाही, तथापि, IPA सह-उपचाराने TGF-β1 उपचारांच्या तुलनेत उशिरा एपोप्टोसिस आणि एपोप्टोसिस दर (%) वाढवला (आकृती 2E–H). हे परिणाम सूचित करतात की 1 mM IPA TGF-β1 प्रेरणेपासून स्वतंत्रपणे LX-2 पेशींमध्ये एपोप्टोसिसला प्रोत्साहन देऊ शकते.
आम्ही LX-2 पेशींमध्ये मायटोकॉन्ड्रियल श्वसनावर IPA चा परिणाम कसा होतो याचा अधिक अभ्यास केला. निकालांवरून असे दिसून आले की 1 mM IPA ने ऑक्सिजन वापर दर (OCR) पॅरामीटर्स कमी केले: नॉन-मायटोकॉन्ड्रियल श्वसन, बेसल आणि कमाल श्वसन, प्रोटॉन गळती आणि ATP उत्पादन नियंत्रण गटाच्या तुलनेत (आकृती 3A, B), तर बायोएनर्जेटिक हेल्थ इंडेक्स (BHI) बदलला नाही.
IPA LX-2 पेशींमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन कमी करते. माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन वक्र (OCR) माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन पॅरामीटर्स (नॉन-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन, बेसल श्वसन, जास्तीत जास्त श्वसन, प्रोटॉन गळती, ATP निर्मिती, SRC आणि BHI) म्हणून सादर केले जाते. पेशी A आणि B ला अनुक्रमे 10 μM, 100 μM आणि 1 mM IPA सह 24 तासांसाठी इनक्युबेट केले गेले. पेशी C आणि D ला अनुक्रमे TGF-β1 (5 ng/ml) आणि 1 mM IPA सह 24 तासांसाठी सीरम-मुक्त माध्यमात इनक्युबेट केले गेले. सर्व मोजमाप CyQuant किट वापरून DNA सामग्रीवर सामान्यीकृत केले गेले. BHI: बायोएनर्जेटिक आरोग्य निर्देशांक; SRC: श्वसन राखीव क्षमता; OCR: ऑक्सिजन वापर दर. डेटा सरासरी ± मानक विचलन (SD), n = 5 स्वतंत्र प्रयोग म्हणून सादर केला जातो. एकतर्फी ANOVA आणि बोनफेरोनी पोस्ट हॉक चाचणी वापरून सांख्यिकीय तुलना केली गेली. *p < 0.05; **p < 0.01; आणि ***p < ०.००१
TGF-β1-सक्रिय LX-2 पेशींच्या बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलवर IPA च्या परिणामाची अधिक व्यापक समज मिळविण्यासाठी, आम्ही OCR द्वारे माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सिडेटिव्ह फॉस्फोरायलेशनचे विश्लेषण केले (आकृती 3C,D). निकालांवरून असे दिसून आले की TGF-β1 उपचार नियंत्रण गटाच्या तुलनेत जास्तीत जास्त श्वसन, श्वसन राखीव क्षमता (SRC) आणि BHI कमी करू शकतात (आकृती 3C,D). याव्यतिरिक्त, संयोजन उपचाराने बेसल श्वसन, प्रोटॉन गळती आणि ATP उत्पादन कमी केले, परंतु SRC आणि BHI TGF-β1 (आकृती 3C,D) ने उपचार केलेल्या उपचारांपेक्षा लक्षणीयरीत्या जास्त होते.
आम्ही सीहॉर्स सॉफ्टवेअरने प्रदान केलेली "सेल्युलर एनर्जी फेनोटाइप टेस्ट" देखील केली (पूरक आकृती 4A-D). पूरक आकृती 3B मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, TGF-β1 उपचारानंतर OCR आणि ECAR दोन्ही चयापचय क्षमता कमी झाल्या, तथापि, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत संयोजन आणि IPA उपचार गटांमध्ये कोणताही फरक दिसून आला नाही. शिवाय, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत संयोजन आणि IPA उपचारानंतर OCR चे बेसल आणि स्ट्रेस दोन्ही पातळी कमी झाली (पूरक आकृती 4C). मनोरंजकपणे, संयोजन थेरपीमध्ये समान नमुना दिसून आला, जिथे TGF-β1 उपचारांच्या तुलनेत ECAR च्या बेसल आणि स्ट्रेस पातळीत कोणताही बदल दिसून आला नाही (पूरक आकृती 4C). HSC मध्ये, माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सिडेटिव्ह फॉस्फोरायलेशनमध्ये घट आणि TGF-β1 उपचारांच्या संपर्कात आल्यानंतर SCR आणि BHI पुनर्संचयित करण्यासाठी संयोजन उपचारांची क्षमता चयापचय क्षमता (OCR आणि ECAR) मध्ये बदल करत नाही. एकत्रितपणे, हे निकाल सूचित करतात की IPA HSC मध्ये बायोएनर्जेटिक्स कमी करू शकते, असे सूचित करते की IPA कमी ऊर्जावान प्रोफाइलला प्रेरित करू शकते जे HSC फेनोटाइपला निष्क्रियतेकडे वळवते (पूरक आकृती 4D).
मायटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी आणि नेटवर्क कनेक्शनचे त्रिमितीय परिमाणीकरण तसेच MTR स्टेनिंग (आकृती 4 आणि पूरक आकृती 5) वापरून IPA चा मायटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्सवरील परिणाम तपासण्यात आला. आकृती 4 दर्शविते की, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, TGF-β1 उपचाराने सरासरी पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ, शाखा संख्या, एकूण शाखा लांबी आणि शाखा जंक्शन क्रमांक (आकृती 4A आणि B) कमी केला आणि मायटोकॉन्ड्रियाचे प्रमाण गोलाकार ते मध्यवर्ती आकारशास्त्र (आकृती 4C) मध्ये बदलले. केवळ IPA उपचाराने सरासरी मायटोकॉन्ड्रियल व्हॉल्यूम कमी केला आणि नियंत्रण गटाच्या तुलनेत मायटोकॉन्ड्रियलचे प्रमाण गोलाकार ते मध्यवर्ती आकारशास्त्रात बदलले (आकृती 4A). याउलट, मायटोकॉन्ड्रियल मेम्ब्रेन पोटेंशियल-अवलंबित MTR (आकृती 4A आणि E) द्वारे मूल्यांकन केलेली गोलाकारता, सरासरी शाखा लांबी आणि मायटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलाप अपरिवर्तित राहिले आणि हे पॅरामीटर्स गटांमध्ये भिन्न नव्हते. एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की TGF-β1 आणि IPA उपचार जिवंत LX-2 पेशींमध्ये मायटोकॉन्ड्रियल आकार आणि आकार तसेच नेटवर्क जटिलतेमध्ये बदल करतात असे दिसते.
IPA LX-2 पेशींमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स आणि माइटोकॉन्ड्रियल DNA विपुलतेमध्ये बदल करते. A. TGF-β1 (5 ng/ml) आणि 1 mM IPA सह 24 तासांसाठी सीरम-मुक्त माध्यमात इनक्यूबेट केलेल्या जिवंत LX-2 पेशींच्या प्रतिनिधी कॉन्फोकल प्रतिमा ज्यामध्ये Mitotracker™ Red CMXRos ने रंगवलेले माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क आणि DAPI ने रंगवलेले न्यूक्लीय दर्शविलेले आहे. सर्व डेटामध्ये प्रत्येक गटासाठी किमान 15 प्रतिमा होत्या. आम्ही प्रत्येक नमुना प्रकारासाठी 10 Z-स्टॅक प्रतिमा मिळवल्या. प्रत्येक Z-अक्ष अनुक्रमात 30 स्लाइस होते, प्रत्येकाची जाडी 9.86 μm होती. स्केल बार: 10 μm. B. प्रतिमेला अनुकूली थ्रेशोल्डिंग लागू करून ओळखल्या जाणाऱ्या प्रतिनिधी वस्तू (फक्त माइटोकॉन्ड्रियल). प्रत्येक गटातील सर्व पेशींसाठी माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजिकल नेटवर्क कनेक्शनचे परिमाणात्मक विश्लेषण आणि तुलना करण्यात आली. C. माइटोकॉन्ड्रियल आकार गुणोत्तरांची वारंवारता. 0 च्या जवळची मूल्ये गोलाकार आकार दर्शवितात आणि 1 च्या जवळची मूल्ये फिलामेंटस आकार दर्शवितात. माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (mtDNA) चे प्रमाण मटेरियल्स आणि मेथड्स मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे निश्चित केले गेले. मटेरियल्स आणि मेथड्स मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे फ्लो सायटोमेट्री (३०,००० इव्हेंट्स) द्वारे E माइटोकॉन्ड्रियल ™ रेड CMXRos विश्लेषण केले गेले. डेटा सरासरी ± SD, n = ३ स्वतंत्र प्रयोग म्हणून सादर केला जातो. एकतर्फी ANOVA आणि बोनफेरोनी पोस्ट हॉक चाचणी वापरून सांख्यिकीय तुलना केली गेली. *p < ०.०५; **p < ०.०१; ***p < ०.००१; ****p < ०.०००१
त्यानंतर आम्ही LX-2 पेशींमधील mtDNA सामग्रीचे विश्लेषण माइटोकॉन्ड्रियल संख्येचे सूचक म्हणून केले. नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, TGF-β1-उपचारित गटात mtDNA सामग्री वाढली (आकृती 4D). TGF-β1-उपचारित गटाच्या तुलनेत, संयोजन उपचार गटात (आकृती 4D) mtDNA सामग्री कमी झाली, ज्यामुळे असे सूचित होते की IPA mtDNA सामग्री आणि शक्यतो माइटोकॉन्ड्रियल संख्या तसेच माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन (आकृती 3C) कमी करू शकते. शिवाय, IPA ने संयोजन उपचारात mtDNA सामग्री कमी केल्याचे दिसून आले परंतु MTR-मध्यस्थ माइटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलापांवर त्याचा परिणाम झाला नाही (आकृती 4A-C).
आम्ही LX-2 पेशींमध्ये फायब्रोसिस, एपोप्टोसिस, सर्व्हायव्हल आणि माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्सशी संबंधित जीन्सच्या mRNA पातळीशी IPA च्या संबंधाची तपासणी केली (आकृती 5A–D). नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, TGF-β1-उपचारित गटाने कोलेजन प्रकार I α2 चेन (COL1A2), α-स्मूथ मसल अ‍ॅक्टिन (αSMA), मॅट्रिक्स मेटॅलोप्रोटीनेज 2 (MMP2), मेटॅलोप्रोटीनेज 1 (TIMP1) चे टिश्यू इनहिबिटर आणि डायनामिन 1-लाइक जीन (DRP1) सारख्या जनुकांची वाढलेली अभिव्यक्ती दर्शविली, जी वाढलेली फायब्रोसिस आणि सक्रियता दर्शवते. शिवाय, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, TGF-β1 उपचाराने न्यूक्लियर प्रेग्नेन X रिसेप्टर (PXR), कॅस्पेस 8 (CASP8), MAPKAPK3, B-सेल α चे इनहिबिटर, न्यूक्लियर फॅक्टर κ जीन लाईट पेप्टाइड (NFκB1A) चे एन्हान्सर आणि न्यूक्लियर फॅक्टर κB किनेज सबयुनिट β (IKBKB) चे इनहिबिटर (आकृती 5A–D) चे mRNA पातळी कमी केली. TGF-β1 उपचारांच्या तुलनेत, TGF-β1 आणि IPA सह संयोजन उपचारांमुळे COL1A2 आणि MMP2 ची अभिव्यक्ती कमी झाली, परंतु PXR, TIMP1, B-सेल लिम्फोमा-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β आणि IKBKB चे mRNA स्तर वाढले. IPA उपचारांमुळे MMP2, Bcl-2-संबंधित प्रोटीन X (BAX), AKT1, ऑप्टिक अ‍ॅट्रोफी प्रोटीन 1 (OPA1), आणि मायटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन प्रोटीन 2 (MFN2) ची अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या कमी झाली, तर CASP8, NFκB1A, NFκB1B आणि IKBKB ची अभिव्यक्ती नियंत्रण गटाच्या तुलनेत वाढली. तथापि, कॅस्पेस-3 (CASP3), अपोप्टोटिक पेप्टिडेस सक्रिय घटक 1 (APAF1), मायटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन प्रोटीन 1 (MFN1) आणि फिशन प्रोटीन 1 (FIS1) च्या अभिव्यक्तीमध्ये कोणताही फरक आढळला नाही. एकत्रितपणे, हे निकाल सूचित करतात की IPA उपचार फायब्रोसिस, एपोप्टोसिस, सर्व्हायव्हल आणि माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्सशी संबंधित जनुकांच्या अभिव्यक्तीचे नियमन करते. आमचा डेटा सूचित करतो की IPA उपचार LX-2 पेशींमध्ये फायब्रोसिस कमी करतो; त्याच वेळी, ते फेनोटाइपला निष्क्रियतेकडे हलवून जगण्यास उत्तेजन देते.
IPA LX-2 पेशींमध्ये फायब्रोब्लास्ट, अपोप्टोटिक, व्यवहार्यता आणि माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स जीन्सच्या अभिव्यक्तीचे नियमन करते. LX-2 पेशींना 24 तासांसाठी सीरम-मुक्त माध्यमात TGF-β1 आणि IPA सह प्रेरित केल्यानंतर हिस्टोग्राम अंतर्जात नियंत्रण (RPLP0 किंवा PPIA) च्या सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ती प्रदर्शित करतात. A फायब्रोब्लास्ट दर्शवितो, B अपोप्टोटिक पेशी दर्शवितो, C जिवंत पेशी दर्शवितो आणि D माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्स जीन अभिव्यक्ती दर्शवितो. डेटा सरासरी ± मानक विचलन (SD), n = 3 स्वतंत्र प्रयोग म्हणून सादर केला जातो. एक-मार्गी ANOVA आणि बोनफेरोनी पोस्ट हॉक चाचणी वापरून सांख्यिकीय तुलना केली गेली. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
त्यानंतर, पेशींच्या आकारात (FSC-H) आणि सायटोप्लाज्मिक कॉम्प्लेक्सिटी (SSC-H) बदलांचे मूल्यांकन फ्लो सायटोमेट्री (आकृती 6A,B) द्वारे केले गेले आणि IPA उपचारानंतर पेशींच्या आकारविज्ञानातील बदलांचे मूल्यांकन ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (TEM) आणि फेज कॉन्ट्रास्ट मायक्रोस्कोपी (पूरक आकृती 6A-B) द्वारे केले गेले. अपेक्षेप्रमाणे, TGF-β1-उपचारित गटातील पेशींचा आकार नियंत्रण गटाच्या तुलनेत वाढला (आकृती 6A,B), जो रफ एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम (ER*) आणि फॅगोलिसोसोम्स (P) चा क्लासिक विस्तार दर्शवितो, जो हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियता दर्शवितो (पूरक आकृती 6A). तथापि, TGF-β1-उपचारित गटाच्या तुलनेत, TGF-β1 आणि IPA संयोजन उपचार गटात (पूरक आकृती 6A) पेशींचा आकार, सायटोप्लाज्मिक कॉम्प्लेक्सिटी (आकृती 6A,B) आणि ER* सामग्री कमी झाली. शिवाय, IPA उपचारांमुळे नियंत्रण गटाच्या तुलनेत पेशींचा आकार, सायटोप्लाज्मिक जटिलता (आकृती 6A,B), P आणि ER* सामग्री (पूरक आकृती 6A) कमी झाली. याव्यतिरिक्त, नियंत्रण गटाच्या तुलनेत IPA उपचारांच्या 24 तासांनंतर अपोप्टोटिक पेशींचे प्रमाण वाढले (पांढरे बाण, पूरक आकृती 6B). एकत्रितपणे, हे निकाल सूचित करतात की 1 mM IPA HSC अपोप्टोसिसला उत्तेजित करू शकते आणि TGF-β1 द्वारे प्रेरित पेशी आकारशास्त्रीय पॅरामीटर्समधील बदल उलट करू शकते, ज्यामुळे पेशींचा आकार आणि जटिलता नियंत्रित होते, जी HSC निष्क्रियतेशी संबंधित असू शकते.
IPA LX-2 पेशींमध्ये पेशींचा आकार आणि सायटोप्लाज्मिक जटिलता बदलते. फ्लो सायटोमेट्री विश्लेषणाच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा. विश्लेषणात LX-2 पेशींसाठी विशिष्ट गेटिंग स्ट्रॅटेजी वापरली गेली: पेशींची संख्या परिभाषित करण्यासाठी SSC-A/FSC-A, दुहेरी ओळखण्यासाठी FSC-H/FSC-A आणि पेशी आकार आणि जटिलता विश्लेषणासाठी SSC-H/FSC-H. पेशींना TGF-β1 (5 ng/ml) आणि 1 mM IPA सह 24 तासांसाठी सीरम-मुक्त माध्यमात इनक्युबेट केले गेले. LX-2 पेशींना खालच्या डाव्या चतुर्थांश (SSC-H-/FSC-H-), वरच्या डाव्या चतुर्थांश (SSC-H+/FSC-H-), खालच्या उजव्या चतुर्थांश (SSC-H-/FSC-H+), आणि वरच्या उजव्या चतुर्थांश (SSC-H+/FSC-H+) मध्ये वितरित केले गेले. पेशी आकार आणि सायटोप्लाज्मिक जटिलता विश्लेषणासाठी. ब. FSC-H (फॉरवर्ड स्कॅटर, सेल आकार) आणि SSC-H (साइड स्कॅटर, सायटोप्लाज्मिक जटिलता) (३०,००० इव्हेंट्स) वापरून फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे सेल मॉर्फोलॉजीचे विश्लेषण केले गेले. डेटा सरासरी ± SD, n = ३ स्वतंत्र प्रयोग म्हणून सादर केला आहे. एकेरी ANOVA आणि बोनफेरोनी पोस्ट हॉक चाचणी वापरून सांख्यिकीय तुलना करण्यात आली. *p < ०.०५; **p < ०.०१; ***p < ०.००१ आणि ****p < ०.०००१
आतड्यांतील मायक्रोबायोटामध्ये नवीन लक्ष्ये शोधली जाऊ शकतात असे सूचित करणारे IPA हे संशोधनाचा एक चर्चेचा विषय बनले आहे. म्हणूनच हे मनोरंजक आहे की IPA, एक मेटाबोलाइट ज्याला आपण मानवांमध्ये यकृत फायब्रोसिसशी जोडले आहे [15], प्राण्यांच्या मॉडेल्समध्ये [13, 14] एक संभाव्य अँटी-फायब्रोटिक कंपाऊंड असल्याचे दर्शविले गेले आहे. येथे, आम्ही प्रथमच टाइप 2 मधुमेह (T2D) नसलेल्या लठ्ठ व्यक्तींमध्ये सीरम IPA आणि ग्लोबल लिव्हर ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि DNA मेथिलेशन यांच्यातील संबंध प्रदर्शित करतो, जो एपोप्टोसिस, मायटोफॅगी आणि दीर्घायुष्य तसेच यकृत होमिओस्टॅसिसचे नियमन करणारा संभाव्य उमेदवार जीन AKT1 हायलाइट करतो. आमच्या अभ्यासाची आणखी एक नवीनता अशी आहे की आम्ही LX-2 पेशींमध्ये एपोप्टोसिस, सेल मॉर्फोलॉजी, मायटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स आणि डायनॅमिक्ससह IPA उपचारांचा परस्परसंवाद प्रदर्शित केला, जो कमी ऊर्जा स्पेक्ट्रम दर्शवितो जो HSC फेनोटाइपला निष्क्रियतेकडे हलवतो, ज्यामुळे IPA यकृत फायब्रोसिस सुधारण्यासाठी संभाव्य उमेदवार बनतो.
आम्हाला आढळले की रक्ताभिसरण करणाऱ्या सीरम IPA शी संबंधित यकृत जनुकांमध्ये समृद्ध झालेले सर्वात महत्वाचे कॅनोनिकल मार्ग म्हणजे एपोप्टोसिस, मायटोफॅगी आणि दीर्घायुष्य. माइटोकॉन्ड्रियल क्वालिटी कंट्रोल (MQC) सिस्टीममध्ये व्यत्यय आल्याने माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, मायटोफॅगी आणि अपोप्टोसिस होऊ शकते, ज्यामुळे MASLD [33, 34] ची घटना घडते. म्हणून, आपण असा अंदाज लावू शकतो की IPA यकृतातील एपोप्टोसिस, मायटोफॅगी आणि दीर्घायुष्याद्वारे पेशी गतिमानता आणि मायटोकॉन्ड्रियल अखंडता राखण्यात सहभागी असू शकते. आमच्या डेटावरून असे दिसून आले की तीन चाचण्यांमध्ये दोन जीन्स सामान्य होती: YKT6 आणि AKT1. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की YKT6 हे सेल मेम्ब्रेन फ्यूजन प्रक्रियेत सामील असलेले SNARE प्रोटीन आहे. ते ऑटोफॅगोसोमवर STX17 आणि SNAP29 सह इनिशिएशन कॉम्प्लेक्स तयार करून ऑटोफॅगोसोम आणि मायटोफॅगीमध्ये भूमिका बजावते, ज्यामुळे ऑटोफॅगोसोम आणि लायसोसोम्सचे फ्यूजन होण्यास प्रोत्साहन मिळते [35]. शिवाय, YKT6 फंक्शन कमी झाल्यामुळे मायटोफॅगी बिघडते[36], तर YKT6 चे अपरेग्युलेशन हेपेटोसेल्युलर कार्सिनोमा (HCC) च्या प्रगतीशी संबंधित आहे, ज्यामुळे पेशींचे अस्तित्व वाढलेले दिसून येते[37]. दुसरीकडे, AKT1 हा सर्वात महत्त्वाचा परस्परसंवादी जनुक आहे आणि यकृताच्या आजारांमध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावतो, ज्यामध्ये PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग, पेशी चक्र, पेशी स्थलांतर, प्रसार, फोकल आसंजन, मायटोकॉन्ड्रियल फंक्शन आणि कोलेजन स्राव यांचा समावेश आहे[38–40]. सक्रिय PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल्स (HSCs) सक्रिय करू शकतो, जे बाह्य पेशी मॅट्रिक्स (ECM) च्या उत्पादनासाठी जबाबदार पेशी आहेत आणि त्याचे डिसरेग्युलेशन यकृत फायब्रोसिसच्या घटनेत आणि प्रगतीमध्ये योगदान देऊ शकते[40]. याव्यतिरिक्त, AKT हा p53-आश्रित पेशी अपोप्टोसिसला प्रतिबंधित करणारा प्रमुख पेशी जगण्याच्या घटकांपैकी एक आहे आणि AKT सक्रियकरण यकृत पेशी अपोप्टोसिसच्या प्रतिबंधाशी संबंधित असू शकते[41, 42]. मिळालेल्या निकालांवरून असे दिसून येते की आयपीए यकृताच्या मायटोकॉन्ड्रियाशी संबंधित एपोप्टोसिसमध्ये सहभागी असू शकते, ज्यामुळे हेपॅटोसाइट्स एपोप्टोसिसमध्ये प्रवेश करतात किंवा जगतात यामधील निर्णयावर परिणाम होतो. हे परिणाम AKT आणि/किंवा YKT6 उमेदवार जीन्सद्वारे नियंत्रित केले जाऊ शकतात, जे यकृताच्या होमिओस्टॅसिससाठी महत्त्वपूर्ण आहेत.
आमच्या निकालांवरून असे दिसून आले की TGF-β1 उपचारांशिवाय LX-2 पेशींमध्ये 1 mM IPA ने अपोप्टोसिस प्रेरित केले आणि मायटोकॉन्ड्रियल श्वसन कमी केले. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की अपोप्टोसिस हा फायब्रोसिस रिझोल्यूशन आणि हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियतेसाठी एक प्रमुख मार्ग आहे आणि यकृत फायब्रोसिसच्या उलट करण्यायोग्य शारीरिक प्रतिसादात देखील एक महत्त्वाची घटना आहे [4, 43]. शिवाय, संयोजन उपचारानंतर LX-2 पेशींमध्ये BHI पुनर्संचयित केल्याने मायटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्सच्या नियमनात IPA च्या संभाव्य भूमिकेबद्दल नवीन अंतर्दृष्टी मिळाली. विश्रांती आणि निष्क्रिय परिस्थितीत, हेमॅटोपोएटिक पेशी सामान्यतः ATP तयार करण्यासाठी मायटोकॉन्ड्रियल ऑक्सिडेटिव्ह फॉस्फोरायलेशनचा वापर करतात आणि कमी चयापचय क्रिया करतात. दुसरीकडे, HSC सक्रियकरण ग्लायकोलिटिक अवस्थेत प्रवेश करण्याच्या उर्जेच्या मागणीची भरपाई करण्यासाठी मायटोकॉन्ड्रियल श्वसन आणि जैवसंश्लेषण वाढवते [44]. IPA चा चयापचय क्षमता आणि ECAR वर परिणाम झाला नाही हे सूचित करते की ग्लायकोलिटिक मार्गाला कमी प्राधान्य दिले जाते. त्याचप्रमाणे, दुसऱ्या एका अभ्यासात असे दिसून आले की 1 mM IPA कार्डिओमायोसाइट्स, मानवी हेपॅटोसाइट सेल लाइन (Huh7) आणि मानवी नाभीसंबंधी शिरा एंडोथेलियल पेशी (HUVEC) मध्ये माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन साखळी क्रियाकलाप नियंत्रित करण्यास सक्षम होता; तथापि, कार्डिओमायोसाइट्समधील ग्लायकोलिसिसवर IPA चा कोणताही परिणाम आढळला नाही, असे सूचित करते की IPA इतर पेशी प्रकारांच्या बायोएनर्जेटिक्सवर परिणाम करू शकते [45]. म्हणून, आम्ही असा अंदाज लावतो की 1 mM IPA सौम्य रासायनिक अनकप्लर म्हणून काम करू शकते, कारण ते mtDNA चे प्रमाण बदलल्याशिवाय फायब्रोजेनिक जीन अभिव्यक्ती, पेशी आकारविज्ञान आणि माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स लक्षणीयरीत्या कमी करू शकते [46]. माइटोकॉन्ड्रियल अनकप्लर कल्चर-प्रेरित फायब्रोसिस आणि HSC सक्रियकरण रोखू शकतात [47] आणि अनकप्लिंग प्रथिने (UCP) किंवा एडेनिन न्यूक्लियोटाइड ट्रान्सलोकेस (ANT) सारख्या विशिष्ट प्रथिनांद्वारे नियंत्रित किंवा प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल ATP उत्पादन कमी करू शकतात. पेशी प्रकारावर अवलंबून, ही घटना पेशींना एपोप्टोसिसपासून संरक्षण करू शकते आणि/किंवा एपोप्टोसिसला प्रोत्साहन देऊ शकते [46]. तथापि, हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल निष्क्रियतेमध्ये मायटोकॉन्ड्रियल अनकप्लर म्हणून IPA ची भूमिका स्पष्ट करण्यासाठी पुढील अभ्यास आवश्यक आहेत.
त्यानंतर आम्ही तपासले की जिवंत LX-2 पेशींमधील माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजीमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल श्वसनातील बदल प्रतिबिंबित होतात का. मनोरंजक गोष्ट म्हणजे, TGF-β1 उपचारामुळे माइटोकॉन्ड्रियल प्रमाण गोलाकार ते मध्यवर्ती असे बदलते, माइटोकॉन्ड्रियल शाखा कमी होते आणि DRP1 ची अभिव्यक्ती वाढते, जो माइटोकॉन्ड्रियल विखंडनात एक महत्त्वाचा घटक आहे [48]. शिवाय, माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन हे एकूण नेटवर्क जटिलतेशी संबंधित आहे आणि फ्यूजन ते विखंडन मध्ये संक्रमण हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियतेसाठी महत्त्वपूर्ण आहे, तर माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन प्रतिबंध HSC एपोप्टोसिसकडे नेतो [49]. अशाप्रकारे, आमचे निकाल सूचित करतात की TGF-β1 उपचारामुळे कमी झालेल्या ब्रांचिंगसह माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क जटिलतेत घट होऊ शकते, जी सक्रिय हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल्स (HSCs) शी संबंधित माइटोकॉन्ड्रियल विखंडनात अधिक सामान्य आहे. शिवाय, आमच्या डेटावरून असे दिसून आले आहे की IPA माइटोकॉन्ड्रियलचे प्रमाण गोलाकार ते मध्यवर्ती आकारात बदलू शकते, ज्यामुळे OPA1 आणि MFN2 ची अभिव्यक्ती कमी होते. अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की OPA1 चे डाउनरेग्युलेशन माइटोकॉन्ड्रियल मेम्ब्रेन क्षमता कमी करू शकते आणि सेल एपोप्टोसिस ट्रिगर करू शकते [50]. MFN2 हे माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन आणि एपोप्टोसिसमध्ये मध्यस्थी करण्यासाठी ओळखले जाते [51]. मिळालेल्या निकालांवरून असे दिसून येते की TGF-β1 आणि/किंवा IPA द्वारे LX-2 पेशींचे प्रेरण माइटोकॉन्ड्रियल आकार आणि आकार तसेच सक्रियकरण स्थिती आणि नेटवर्क जटिलतेमध्ये सुधारणा करते असे दिसते.
आमचे निकाल असे दर्शवितात की TGFβ-1 आणि IPA च्या एकत्रित उपचारांमुळे अपोप्टोसिस टाळणाऱ्या पेशींमध्ये फायब्रोसिस, अपोप्टोसिस आणि जगण्याशी संबंधित जीन्सच्या mRNA अभिव्यक्तीचे नियमन करून mtDNA आणि पेशी आकारिकीय मापदंड कमी होऊ शकतात. खरंच, IPA ने AKT1 आणि COL1A2 आणि MMP2 सारख्या महत्त्वाच्या फायब्रोसिस जनुकांची mRNA अभिव्यक्ती पातळी कमी केली, परंतु CASP8 ची अभिव्यक्ती पातळी वाढवली, जी अपोप्टोसिसशी संबंधित आहे. आमच्या निकालांवरून असे दिसून आले की IPA उपचारानंतर, BAX अभिव्यक्ती कमी झाली आणि TIMP1 कुटुंब उपयुनिट्स, BCL-2 आणि NF-κB ची mRNA अभिव्यक्ती वाढली, ज्यामुळे असे सूचित होते की IPA हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल्स (HSCs) मध्ये जगण्याचे सिग्नल उत्तेजित करू शकते जे अपोप्टोसिस टाळतात. हे रेणू सक्रिय हेमॅटोपोएटिक स्टेम पेशींमध्ये जगण्यासाठी प्रो-सिद्धांत म्हणून काम करू शकतात, जे अँटी-अपोप्टोटिक प्रथिनांच्या (जसे की Bcl-2) वाढीव अभिव्यक्तीशी संबंधित असू शकतात, प्रो-अपोप्टोटिक BAX ची अभिव्यक्ती कमी होते आणि TIMP आणि NF-κB मधील जटिल परस्परसंवादाशी संबंधित असू शकतात [5, 7]. IPA PXR द्वारे त्याचे परिणाम दाखवते आणि आम्हाला आढळले की TGF-β1 आणि IPA सह संयोजन उपचाराने PXR mRNA अभिव्यक्ती पातळी वाढवली, ज्यामुळे HSC सक्रियतेचे दमन दिसून येते. सक्रिय PXR सिग्नलिंग हे इन विवो आणि इन विट्रो [52, 53] दोन्हीमध्ये HSC सक्रियतेला प्रतिबंधित करते असे ज्ञात आहे. आमचे निकाल असे दर्शवितात की IPA एपोप्टोसिसला प्रोत्साहन देऊन, फायब्रोसिस आणि मायटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिझम कमी करून आणि सर्व्हायव्हल सिग्नल वाढवून सक्रिय HSC च्या क्लिअरन्समध्ये सहभागी होऊ शकते, जे सक्रिय HSC फेनोटाइपला निष्क्रिय केलेल्यामध्ये रूपांतरित करणाऱ्या सामान्य प्रक्रिया आहेत. एपोप्टोसिसमध्ये IPA च्या संभाव्य यंत्रणेचे आणि भूमिकेचे आणखी एक संभाव्य स्पष्टीकरण म्हणजे ते प्रामुख्याने मायटोफॅगी (आंतरिक मार्ग) आणि बाह्य TNF सिग्नलिंग मार्ग (सारणी 1) द्वारे अकार्यक्षम मायटोकॉन्ड्रियाचे सफाई करते, जे थेट NF-κB सर्व्हायव्हल सिग्नलिंग मार्ग (पूरक आकृती 7) शी जोडलेले आहे. मनोरंजक गोष्ट म्हणजे, IPA-संबंधित समृद्ध जनुके अपोप्टोटिक मार्गात प्रो-अपोप्टोटिक आणि प्रो-सर्व्हायव्हल सिग्नल प्रेरित करण्यास सक्षम आहेत [54], असे सूचित करते की IPA या जनुकांशी संवाद साधून अपोप्टोटिक मार्ग किंवा जगण्याची प्रेरणा देऊ शकते. तथापि, HSC सक्रियतेदरम्यान IPA अपोप्टोटिक मार्ग किंवा जगण्याची प्रेरणा कशी देते आणि त्याचे यांत्रिक मार्ग अस्पष्ट आहेत.
IPA हा आतड्यांतील मायक्रोबायोटा द्वारे आहारातील ट्रिप्टोफॅनपासून तयार होणारा एक सूक्ष्मजीव मेटाबोलाइट आहे. अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की त्यात आतड्यांतील वातावरणात दाहक-विरोधी, अँटिऑक्सिडंट आणि एपिजेनेटिक नियामक गुणधर्म आहेत.[55] अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की IPA आतड्यांतील अडथळा कार्य सुधारू शकते आणि ऑक्सिडेटिव्ह ताण कमी करू शकते, जे त्याच्या स्थानिक शारीरिक प्रभावांमध्ये योगदान देऊ शकते.[56] खरं तर, IPA रक्ताभिसरणाद्वारे लक्ष्यित अवयवांमध्ये वाहून नेले जाते आणि IPA ट्रिप्टोफॅन, सेरोटोनिन आणि इंडोल डेरिव्हेटिव्ह्ज सारख्याच प्रमुख मेटाबोलाइट रचना सामायिक करत असल्याने, IPA चयापचय क्रिया करतो ज्यामुळे स्पर्धात्मक चयापचय भाग्य निर्माण होते.[52] IPA एंजाइम किंवा रिसेप्टर्सवर बंधनकारक साइट्ससाठी ट्रिप्टोफॅन-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्सशी स्पर्धा करू शकते, ज्यामुळे सामान्य चयापचय मार्गांमध्ये व्यत्यय येऊ शकतो. हे त्याच्या उपचारात्मक विंडोला चांगल्या प्रकारे समजून घेण्यासाठी त्याच्या फार्माकोकाइनेटिक्स आणि फार्माकोडायनामिक्सवर पुढील अभ्यास करण्याची आवश्यकता अधोरेखित करते.[57] हे हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल्स (HSCs) मध्ये देखील होऊ शकते का हे पाहणे बाकी आहे.
आमच्या अभ्यासात काही मर्यादा आहेत हे आम्ही मान्य करतो. IPA शी संबंधित संबंधांचे विशेषतः परीक्षण करण्यासाठी, आम्ही टाइप 2 मधुमेह मेल्तिस (T2DM) असलेल्या रुग्णांना वगळले. आम्ही मान्य करतो की हे टाइप 2 मधुमेह मेल्तिस आणि प्रगत यकृत रोग असलेल्या रुग्णांना आमच्या निष्कर्षांची व्यापक लागूता मर्यादित करते. मानवी सीरममध्ये IPA ची शारीरिक एकाग्रता 1-10 μM [11, 20] असली तरी, नेक्रोटिक पेशींच्या लोकसंख्येच्या टक्केवारीत कोणताही फरक नसताना, सर्वाधिक गैर-विषारी एकाग्रता [15] आणि एपोप्टोसिसच्या सर्वोच्च दरावर आधारित 1 mM IPA ची एकाग्रता निवडली गेली. जरी या अभ्यासात IPA चे सुप्राफिजियोलॉजिकल स्तर वापरले गेले असले तरी, IPA च्या प्रभावी डोसबद्दल सध्या कोणतेही एकमत नाही [52]. आमचे निकाल महत्त्वपूर्ण असले तरी, IPA चे व्यापक चयापचय भाग्य संशोधनाचे एक सक्रिय क्षेत्र आहे. शिवाय, सीरम IPA पातळी आणि यकृत ट्रान्सक्रिप्ट्सच्या DNA मेथिलेशनमधील संबंधांबद्दलचे आमचे निष्कर्ष केवळ हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल्स (HSCs) मधूनच नव्हे तर यकृताच्या ऊतींमधून देखील प्राप्त झाले. ट्रान्सक्रिप्टोम विश्लेषणातून मिळालेल्या आमच्या मागील निष्कर्षांवर आधारित आम्ही मानवी LX-2 पेशी वापरण्याचा निर्णय घेतला की IPA हेमॅटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियतेशी संबंधित आहे [15], आणि HSC हे यकृत फायब्रोसिसच्या प्रगतीमध्ये सहभागी असलेल्या प्रमुख पेशी आहेत. यकृत हे अनेक पेशी प्रकारांनी बनलेले असते, म्हणून इतर पेशी मॉडेल्स जसे की हेपॅटोसाइट-HSC-इम्यून सेल को-कल्चर सिस्टम, कॅस्पेस सक्रियता आणि DNA फ्रॅगमेंटेशनसह एकत्रित, तसेच प्रथिने पातळीसह कृतीची यंत्रणा यांचा विचार केला पाहिजे जेणेकरून IPA ची भूमिका आणि इतर यकृत पेशी प्रकारांशी त्याचा परस्परसंवाद अभ्यासता येईल.