पेशींचे विभाजन आणि समस्थिती राखण्यासाठी स्रावी मार्गातील प्रथिनांचे वर्गीकरण आवश्यक आहे. कवच-मध्यस्थ वर्गीकरणाव्यतिरिक्त, स्रावी वहनाच्या प्रक्रियेत कायनेसिन वर्गीकरणामध्ये लिपिड्सची भूमिका हा एक दीर्घकाळ चाललेला मूलभूत प्रश्न आहे, ज्याचे उत्तर अद्याप मिळालेले नाही. येथे, आम्ही सजीवांमध्ये हे सिद्ध करण्यासाठी ३डी एकाच वेळी बहुरंगी उच्च-रिझोल्यूशन रिअल-टाइम इमेजिंग करतो की, अत्यंत लांब सेरामाइड लिपिड अंश असलेली नव्याने संश्लेषित ग्लायकोसिलफॉस्फॅटिडिलिनोसिटॉल-स्थिर प्रथिने एकत्रित होतात आणि एंडोप्लाझमच्या विशिष्ट निर्गमन स्थळांमध्ये वर्गीकृत केली जातात, जे ट्रान्समेम्ब्रेन प्रथिनांद्वारे वापरल्या जाणाऱ्या स्थळापेक्षा वेगळे आहे. याव्यतिरिक्त, आम्ही हे दाखवतो की एंडोप्लाझमिक रेटिक्युलमच्या पटलातील सेरामाइडची साखळी लांबी या वर्गीकरणाच्या निवडकतेसाठी महत्त्वपूर्ण आहे. आमचा अभ्यास स्रावी मार्गातील निवडक निर्गमन स्थळांमध्ये लिपिड साखळीच्या लांबीच्या आधारावर प्रथिनांच्या भाराचे वर्गीकरण करण्यासाठी पहिला थेट सजीव पुरावा प्रदान करतो.
युकेरियोटिक पेशींमध्ये, एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम (ER) मध्ये संश्लेषित झालेली प्रथिने नंतर स्रावी मार्गातून वाहतूक होत असताना त्यांच्या योग्य पेशीय स्थानी पोहोचवण्यासाठी त्यांची विभागणी केली जाते (1). आवरणाद्वारे होणाऱ्या विभागणीव्यतिरिक्त, असा दीर्घकाळ अंदाज वर्तवला जात होता की काही विशिष्ट लिपिड्स देखील विशिष्ट प्रथिनांना विशिष्ट पडदा डोमेनमध्ये एकत्रित करून निवडक निर्गमन बिंदू म्हणून काम करू शकतात (2-5). तथापि, या संभाव्य लिपिड-आधारित यंत्रणेला सिद्ध करण्यासाठी अद्याप थेट इन व्हिविओ (in vivo) पुराव्याचा अभाव आहे. ही मूलभूत समस्या सोडवण्यासाठी, आम्ही यीस्टमध्ये अभ्यास केला की ग्लायकोसिलफॉस्फॅटिडिलिनोसिटॉल (GPI) अँकर्ड प्रथिने (GPI-APs) ER मधून वेगवेगळ्या प्रकारे कशी निर्यात केली जातात. GPI-APs हे विविध प्रकारचे लिपिड-जोडलेले पेशी पृष्ठभागावरील प्रथिने आहेत (6, 7). GPI-AP हे एक स्रावित प्रथिन आहे जे ग्लायकोलिपिड मोइटी (GPI अँकर) द्वारे प्लाझ्मा पडद्याच्या बाहेरील थरांना जोडलेले असते. ते ER ल्युमेनमध्ये संरक्षणात्मक पोस्ट-ट्रान्सलेशनल सुधारणा म्हणून GPI अँकर स्वीकारतात (8). संलग्न झाल्यानंतर, GPI-AP हे गॉल्गी उपकरणामधून (5, 9) ER पासून प्लाझ्मा मेम्ब्रेनपर्यंत जाते. GPI अँकर्सच्या उपस्थितीमुळे GPI-AP ची वाहतूक ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रथिनांपासून (इतर प्लाझ्मा मेम्ब्रेन प्रथिनांसह) स्रावी मार्गावर (5, 9, 10) स्वतंत्रपणे होते. यीस्ट पेशींमध्ये, GPI-APs एंडोप्लाझमिक रेटिक्युलममध्ये इतर स्रावित प्रथिनांपासून वेगळे केले जातात आणि नंतर कोट प्रोटीन कॉम्प्लेक्स II (COPII) ने वेढलेल्या विशिष्ट वेसिकल्समध्ये पॅक केले जातात (6, 7). ER निर्यात प्रक्रियेतील या वर्गीकरण प्रक्रियेचे निर्धारक अस्पष्ट आहेत, परंतु असा अंदाज आहे की या यंत्रणेसाठी लिपिड्सची, विशेषतः GPI अँकरच्या लिपिड भागाच्या संरचनात्मक पुनर्रचनेची आवश्यकता असू शकते (5, 8). यीस्टमध्ये, GPI संलग्न झाल्यानंतर लगेचच GPI लिपिड पुनर्रचना सुरू होते आणि बऱ्याच प्रकरणांमध्ये, यामुळे सेरामाइड 26-कार्बन लांब-साखळी संतृप्त फॅटी ऍसिड (C26:0) शी जोडले जाते (11, 12). C26 सेरामाइड हे आतापर्यंत यीस्ट पेशींद्वारे उत्पादित होणारे मुख्य सेरामाइड आहे. त्याचे संश्लेषण ER मध्ये होते आणि त्यातील बहुतेक भाग COPII वेसिकल्सद्वारे गॉल्गी उपकरणात निर्यात केला जातो (13). विशेषतः GPI-AP च्या ER निर्यातीसाठी सतत सेरामाइड संश्लेषणाची आवश्यकता असते (14, 15), आणि त्या बदल्यात, गॉल्गी उपकरणात सेरामाइडचे इनोसिटॉल फॉस्फेट सेरामाइड (IPC) मध्ये रूपांतर GPI अँकर संश्लेषणावर अवलंबून असते (16). कृत्रिम पडद्यांसह केलेल्या जैवभौतिक अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की खूप लांब एसिल चेन सेरामाइड्स एकत्र येऊन अद्वितीय भौतिक गुणधर्मांसह सुव्यवस्थित डोमेन तयार करू शकतात (17, 18). या माहितीमुळे असा सिद्धांत मांडला जातो की C26 सेरामाइड आणि C26 सेरामाइडसह GPI-AP हे त्यांच्या भौतिक गुणधर्मांचा वापर करून तुलनेने अव्यवस्थित ER पडद्याच्या लिपिड वातावरणात सुव्यवस्थित प्रदेशांमध्ये किंवा क्षेत्रांमध्ये एकत्र येतात. हे प्रामुख्याने लहान आणि असंतृप्त ग्लिसरोलिपिड्स (C16:1 आणि C18:1) ने बनलेले असते (19, 20). हे प्रदेश निवडकपणे विशिष्ट ER एक्झिट साइट्स (ERES) वर लक्ष केंद्रित करतील, जिथे सेरामाइड आणि सेरामाइड-आधारित GPI-AP एकाच समर्पित COPII वेसिकलमध्ये गोल्जीमध्ये सह-वाहतूक केले जाऊ शकतात (5).
या अभ्यासात, आम्ही सुपर-रिझोल्यूशन कॉन्फोकल रिअल-टाइम इमेजिंग मायक्रोस्कोपी (SCLIM) वापरून या लिपिड-आधारित यंत्रणेची थेट चाचणी केली आहे, जे एक अत्याधुनिक मायक्रोस्कोपी तंत्र आहे जे एकाच वेळी फ्लोरोसेंटली लेबल केलेल्या प्रथिनांचे निरीक्षण करू शकते. जिवंत पेशींमध्ये तीन-रंगीत आणि त्रिमितीय (3D) प्रतिमांमध्ये अत्यंत उच्च रिझोल्यूशन आणि वेग असतो (21, 22).
S. cerevisiae मध्ये ER सोडल्यानंतर C26 सेरामाइड गटासह सामान्य GPI-AP ला ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रथिनांपासून कसे वेगळे केले जाते हे अधिक स्पष्ट करण्यासाठी आम्ही प्रथम SCLIM तंत्रज्ञान वापरले. ER चे वर्गीकरण तपासण्यासाठी, आम्ही एक जनुकीय प्रणाली वापरली जी इन विवो (in vivo) मध्ये ERES मध्ये प्रवेश करणाऱ्या नव्याने संश्लेषित कार्गोला थेट पाहू शकते (7, 23). कार्गो म्हणून, आम्ही हिरव्या प्रतिदीप्त प्रथिनाने (GFP) लेबल केलेले C26 सेरामाइड-आधारित GPI-AP Gas1 आणि जवळच्या-अवरक्त प्रतिदीप्त प्रथिनाने (iRFP) लेबल केलेले ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रथिन Mid2 निवडले, जे दोन्ही प्लाझ्मा मेम्ब्रेनला लक्ष्य करतात (24–26). sec31-1 तापमान-संवेदनशील म्युटंटमध्ये, हे दोन्ही कार्गो गॅलॅक्टोज-प्रेरित प्रमोटर आणि एका कॉन्स्टिट्यूटिव्ह ERES मार्कर अंतर्गत व्यक्त केले जातात. अत्यधिक तापमानात (37°C), sec31-1 उत्परिवर्तनामुळे COPII अंकुरण आणि ER निर्यात रोखण्याच्या COPII आवरण घटक Sec31 च्या कार्यावर परिणाम होत असल्यामुळे, नव्याने संश्लेषित कार्गो ER मध्ये जमा होतो (23). कमी तापमानात (24°C) थंड केल्यावर, sec31-1 उत्परिवर्तित पेशी स्रावी क्षेत्रातून बाहेर पडल्या आणि जमा झालेला नवीन संश्लेषित कार्गो ER मधून निर्यात होऊ लागला. CLIM व्हिज्युअलायझेशनने दाखवले की 37°C तापमानात उष्मायन केल्यानंतर आणि नंतर 24°C तापमानात 5 मिनिटांसाठी सोडल्यानंतरही, बहुतेक नव्याने संश्लेषित Gas1-GFP आणि Mid2-iRFP अजूनही sec31-1 उत्परिवर्तित पेशींच्या ER मध्ये जमा झाले होते (आकृती 1). Mid2-iRFP संपूर्ण ER पटलावर वितरित असल्यामुळे आणि Gas1-GFP खंडित ER पटल क्षेत्रात केंद्रित आणि गोळा झाल्यामुळे, त्यांचे वितरण पूर्णपणे भिन्न आहे (आकृती 1, A ते C आणि मूव्ही S1). याव्यतिरिक्त, आकृती 1D मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, Gas1-GFP क्लस्टरमध्ये Mid2-iRFP नाही. हे परिणाम सूचित करतात की GPI-AP आणि ट्रान्समेम्ब्रेन प्रथिने सुरुवातीच्या काळात ER पडद्याच्या वेगवेगळ्या भागांमध्ये विभागली गेली होती. Gas1-GFP क्लस्टर हे mCherry च्या COPII कोट प्रोटीन Sec13 ने लेबल केलेल्या विशिष्ट ERES च्या लगत आहे (आकृती 1, E आणि F, आणि मूव्ही S1) (23).
sec31-1 पेशी गॅलॅक्टोज-प्रेरित स्राव, एक लांब एसिल चेन (C26) सेरामाइड GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, हिरवा) आणि ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीन Mid2-iRFP (TMP, निळा) व्यक्त करतात आणि या रचनात्मक ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, किरमिजी) ला ३७°C वर ३० मिनिटांसाठी इनक्यूबेट केले गेले, २४°C वर हलवले गेले आणि ५ मिनिटांनंतर SCLIM द्वारे प्रतिमा घेतली गेली. (A ते C) एका प्रतलाची प्रातिनिधिक विलीन केलेली किंवा एकल २डी प्रतिमा (A), १० झेड-सेक्शन्सची २डी प्रोजेक्शन प्रतिमा (B) किंवा कार्गो आणि ERES मार्कर्सची ३डी पेशी गोलार्ध प्रतिमा (C) दर्शवते. स्केल बार १μm (A आणि B). स्केल युनिट ०.५५१μm आहे (C). Gas1-GFP विशिष्ट ER प्रदेशांमध्ये किंवा क्लस्टर्समध्ये आढळले, तर Mid2-iRFP संपूर्ण ER मेम्ब्रेनमध्ये आढळले आणि वितरित झाले होते (C). (D) हा आलेख पांढऱ्या बाणाच्या रेषेवर (डावीकडे) Gas1-GFP क्लस्टरमधील Gas1-GFP आणि Mid2-iRFP ची सापेक्ष प्रतिदीप्ती तीव्रता दर्शवतो. AU, अनियंत्रित एकक. (E आणि F) वस्तू आणि ERES चिन्ह एकत्र करणारी 3D प्रतिमा दर्शवतात. Gas1-GFP क्लस्टर्स विशिष्ट ERES जवळ आढळले. स्केलचे एकक 0.551μm आहे. (F) पांढरा भरीव बाण ERES शी संबंधित Gas1-GFP क्लस्टर चिन्हांकित करतो. मधले आणि उजवे पॅनेल एकत्रित विस्तारित 3D प्रतिमा आणि निवडलेल्या Gas1-GFP क्लस्टरचे फिरवलेले दृश्य दर्शवतात.
Gas1-GFP क्लस्टर आणि एका विशिष्ट ERES मधील जवळचा अवकाशीय संबंध हे दर्शवतो की Gas1-GFP निवडक ERES मध्ये प्रवेश करू शकते, जे Mid2-iRFP द्वारे ER मधून बाहेर पडण्यासाठी वापरल्या जाणाऱ्या निवडकतेपेक्षा वेगळे आहे. या शक्यतेची पडताळणी करण्यासाठी, आम्ही केवळ एक किंवा दोन प्रकारच्या मालासाठी ERES गुणोत्तराचे परिमाणीकरण केले (आकृती २, A ते C). आम्हाला आढळले की बहुतेक ERES (७०%) मध्ये केवळ एकाच प्रकारचा माल असतो. आकृती २C मधील खालची प्रतिमा केवळ Gas1-GFP (आकृती १) किंवा केवळ Mid2-iRFP (आकृती २) असलेल्या ERES ची दोन प्रातिनिधिक उदाहरणे दर्शवते. याउलट, अंदाजे २०% ERES मध्ये दोन प्रकारचे माल असतात जे एकाच क्षेत्रात एकमेकांवर आच्छादित होतात. असे आढळले की काही ERES (१०%) मध्ये दोन प्रकारचे माल होते, परंतु ते स्पष्टपणे वेगवेगळ्या क्षेत्रांमध्ये विलग होते. म्हणून, हे सांख्यिकीय विश्लेषण दर्शवते की ER मधून बाहेर पडल्यानंतर, GPI-AP Gas1-GFP आणि ट्रान्समेम्ब्रेन माल Mid2-iRFP वेगवेगळ्या ERES मध्ये विभागले जातात (आकृती २D). ही वर्गीकरण कार्यक्षमता मागील जैवरासायनिक विश्लेषण (6) आणि आकारशास्त्रीय निर्धारण (7) यांच्याशी अगदी सुसंगत आहे. आपण ERES मध्ये प्रवेश करणाऱ्या अलग ठेवलेल्या कार्गोचे वर्तन देखील पाहू शकतो (आकृती 2E आणि मूव्ही S2). आकृती 2E दर्शवते की Gas1-GFP (पॅनेल 3) किंवा Mid2-iRFP (पॅनेल 4) चा फक्त एक लहान भाग एका बाजूने ERES मध्ये प्रवेश करतो आणि एका विशिष्ट क्षेत्रात मर्यादित राहतो. आकृती 2E चे पॅनेल 5 दर्शवते की Gas1-GFP आणि Mid2-iRFP कधीकधी एकाच ERES मध्ये आढळतात, परंतु ते वेगवेगळ्या बाजूंनी प्रवेश करतात आणि वेगवेगळ्या प्रदेशांमध्ये केंद्रित होतात जे कदाचित भिन्न COPII वेसिकल्स दर्शवतात. आम्ही हे देखील पुष्टी केली की C26 सेरामाइड-आधारित GPI-AP Gas1 चे निवडक ERES म्हणून निरीक्षण केलेले पृथक्करण आणि वर्गीकरण विशिष्ट आहे कारण दुसरा ट्रान्समेम्ब्रेन स्राव कार्गो, GFP-टॅग केलेले प्लाझ्मा मेम्ब्रेन प्रोटीन Axl2 (27), Mid2-iRFP सारखेच वर्तन दर्शवितो. (चित्र S1 आणि मूव्ही S3). नव्याने संश्लेषित झालेले Axl2-GFP हे Mid2-iRFP प्रमाणेच ER पटलामध्ये वितरित होते (आकृती S1, A आणि B), आणि बहुतेक ERES मध्ये Mid2-iRFP सोबत सह-स्थानिक असते (आकृती S1, B ते D). आकृती 1. S1C चे पॅनेल 1 आणि 2 हे ERES ची दोन प्रातिनिधिक उदाहरणे दर्शवतात, जिथे दोन ट्रान्समेम्ब्रेन कार्गो एकमेकांवर आच्छादित होतात. या प्रकरणांमध्ये, दोन्ही वस्तू एकत्र ERES मध्ये प्रवेश करतात (आकृती S1E, पॅनेल 3 आणि मूव्ही S3).
गॅलॅक्टोज-प्रेरित स्राव व्यक्त करणाऱ्या sec31-1 पेशी, Gas1-GFP (GPI-AP, हिरवा) आणि Mid2-iRFP (TMP, निळा) आणि घटक ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, किरमिजी) यांना 37°C तापमानावर ठेवण्यात आले. 30 मिनिटे उबवल्यानंतर, स्रावाचा अडथळा दूर करण्यासाठी त्यांना 24°C तापमानावर हलवा आणि 20 मिनिटांनंतर SCLIM ने प्रतिमा घ्या. (A ते C) कार्गोच्या आणि ERES ने चिन्हांकित केलेल्या 10 z-सेक्शन्सच्या प्रातिनिधिक 2D प्रोजेक्शन प्रतिमा (A; स्केल बार, 1μm) किंवा 3D पेशी गोलार्ध प्रतिमा (B आणि C; स्केल युनिट, 0.456μm). (B) मधील खालचा पॅनेल आणि (C) मधील पॅनेल केवळ ERES मध्ये उपस्थित असलेल्या वस्तू (किरमिजी) [Gas1-GFP (राखाडी) आणि Mid2-iRFP (फिकट निळा)] दर्शविण्यासाठी प्रक्रिया केलेल्या प्रतिमा दाखवतात. (C) मोकळा बाण: ERES फक्त एकच माल (1 ते 4) वाहून नेतो. राखाडी बाण: ERES मध्ये विभक्त केलेला माल (5) आहे. पांढरा भरीव बाण: ERES मध्ये एकाच ठिकाणी असलेला माल आहे. खाली: निवडलेल्या एका ERES मध्ये फक्त Gas1-GFP (1) किंवा Mid2-iRFP (2) आहे. स्केल बार, 100 nm. (D) (C) मध्ये वर्णन केलेल्या फोटोमायक्रोग्राफचे संख्यात्मक विश्लेषण. फक्त एकच माल (Gas1-GFP किंवा Mid2-iRFP), विभक्त केलेला माल आणि एकमेकांवर आलेला माल असलेल्या ERES ची सरासरी टक्केवारी. तीन स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये, 54 पेशींमध्ये n=432. एरर बार = SD. द्विपक्षीय असंबद्ध टी चाचणी. *** P = 0.0002. (E) (C) ने चिन्हांकित केलेल्या विलगीकरण केलेल्या मालाच्या निवडलेल्या ERES ची 3D प्रतिमा. Gas1-GFP (हिरवा) (3) किंवा Mid2-iRFP (निळा) (4) एका बाजूने ERES (मॅजेंटा) मध्ये प्रवेश करतो आणि ERES मधील एका लहान क्षेत्रापुरता मर्यादित राहतो. कधीकधी, दोन्ही प्रकारचे माल एकाच बाजूने एकाच ERES (5) मध्ये प्रवेश करतात आणि ERES मधील एका वेगळ्या भागात बंदिस्त केले जातात. स्केल बार, 100 nm.
पुढे, आम्ही एका गृहितकाची चाचणी केली की ER पडद्यामध्ये उपस्थित लांब एसिल चेन सेरामाइड (C26) हे Gas1 चे निवडक ERES मध्ये विशिष्ट क्लस्टरिंग आणि वर्गीकरण करण्यास चालना देते. यासाठी, आम्ही GhLag1 नावाचा एक सुधारित यीस्ट स्ट्रेन वापरला, ज्यामध्ये दोन स्वदेशी सेरामाइड सिंथेसेस Lag1 आणि Lac1 यांच्या जागी GhLag1 (कापसाचा Lag1 होमोलॉग) ठेवण्यात आला, ज्यामुळे वाइल्ड टाइपपेक्षा लहान पेशी पडद्याचा सेरामाइड असलेला यीस्ट स्ट्रेन तयार झाला (आकृती 3A) (28). मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) विश्लेषणातून असे दिसून आले की वाइल्ड-टाइप स्ट्रेनमध्ये, एकूण सेरामाइडपैकी 95% हे खूप लांब (C26) चेन सेरामाइड असते, तर GhLag1 मध्ये, 85% सेरामाइड हे खूप लांब (C18 आणि C16) चेन सेरामाइड असते, आणि केवळ 2% सेरामाइड हे खूप लांब (C26) चेन सेरामाइड असते. जरी आतापर्यंत GhLag1 पडद्यामध्ये C18 आणि C16 सेरामाइड्स हे मुख्य सेरामाइड्स आढळले असले तरी, MS विश्लेषणाने हे देखील पुष्टी केली की GhLag1 स्ट्रेनमध्ये व्यक्त केलेल्या Gas1-GFP च्या GPI अँकरमध्ये C26 सेरामाइड असते, जे वाइल्ड-टाइप लिपिड्सच्या तुलनेत समान गुणवत्तेचे आहे (आकृती 3A) (26). म्हणून, याचा अर्थ असा आहे की सेरामाइड रिमॉडेलिंग एन्झाइम Cwh43 हे C26 सेरामाइडसाठी अत्यंत निवडक आहे, जसे आकृती 26 मध्ये दर्शविले आहे, ते GhLag1 स्ट्रेनमधील कमी प्रमाणात असलेल्या C26 सेरामाइडमधून प्राधान्याने GPI अँकर समाविष्ट करते. S2 (29). तरीही, GhLag1 च्या पेशी पडद्यामध्ये मूलतः फक्त C18-C16 सेरामाइड असते, तर Gas1-GFP मध्ये अजूनही C26 सेरामाइड असते. ही वस्तुस्थिती या स्ट्रेनला ER मधील पडदा सेरामाइडच्या एसिल चेन लांबीची समस्या विशेषतः सोडवण्यासाठी एक आदर्श साधन बनवते. वर्ग आणि वर्गीकरणाची काल्पनिक भूमिका. मग, आम्ही प्रथम पारंपरिक फ्लुरोसेन्स मायक्रोस्कोपीद्वारे sec31-1 च्या तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तित अ‍ॅलीलसह GhLag1 मध्ये C26 Gas1-GFP च्या क्लस्टर्समध्ये जमा होण्याच्या क्षमतेचा अभ्यास केला, जिथे ER मेम्ब्रेन सेरामाइडमध्ये फक्त लांब (C18-C16) साखळी अस्तित्वात असते (आकृती ३). आमच्या लक्षात आले की sec31-1 मध्ये, बहुतेक Gas1-GFP क्लस्टर्समध्ये केंद्रित होते, तर लांब (C18-C16) सेरामाइड ER मेम्ब्रेन असलेल्या sec31-1 GhLag1 मधील Gas1-GFP मुख्यत्वे क्लस्टर्समध्ये नव्हते आणि संपूर्ण ER मेम्ब्रेनमध्ये वितरित होते. अधिक अचूकपणे सांगायचे झाल्यास, C26 सेरामाइड-आधारित क्लस्टरिंग विशिष्ट ERES शी जवळून संबंधित असल्यामुळे (आकृती १), आम्ही पुढे तपासले की या प्रक्रियेमध्ये ER एक्सपोर्ट प्रोटीन यंत्रणेच्या कार्याचा देखील समावेश असू शकतो का. GPI-AP ER एक्सपोर्टसाठी एक विशेष COPII प्रणाली वापरते, जी Ted1 द्वारे GPI अँकरच्या ग्लायकॅन भागाच्या संरचनात्मक पुनर्रचनेद्वारे सक्रियपणे नियंत्रित केली जाते (३०, ३१). त्यानंतर रिकॉम्बिनंट GPI-ग्लायकॅन ट्रान्समेम्ब्रेन कार्गो रिसेप्टर p24 कॉम्प्लेक्सद्वारे ओळखले जाते, जे पुढे निवडकपणे Lst1 ला रिक्रूट करते, जे प्रमुख COPII कार्गो बाइंडिंग सबयुनिट Sec24 चा एक विशिष्ट आयसोफॉर्म आहे, ज्यामुळे GPI-AP-समृद्ध COPII वेसिकल्स तयार होतात जे आवश्यक आहेत (31-33). म्हणून, आम्ही एक डबल म्युटंट तयार केला ज्यामध्ये या एकल प्रथिनांचे (p24 कॉम्प्लेक्स घटक Emp24, GPI-ग्लायकॅन रिमॉडेलिंग एन्झाइम Ted1 आणि विशिष्ट COPII सबयुनिट Lst1) विलोपन sec31-1 म्युटंट स्ट्रेनसह एकत्रित केले आणि Gas1-क्लस्टर GFP तयार करणे शक्य आहे का याचा अभ्यास केला (आकृती 3). आम्ही असे निरीक्षण केले की sec31-1emp24Δ आणि sec31-1ted1Δ मध्ये, Gas1-GFP हे मुख्यत्वेकरून विखुरलेले असते आणि ER पटलावर सर्वत्र पसरलेले असते, जसे पूर्वी sec31-1 GhLag1 मध्ये पाहिले होते, तर sec31-1lst1Δ मध्ये, Gas1-GFP हे sec31-1 प्रमाणेच असते. या परिणामांवरून असे दिसून येते की ER पटलामध्ये C26 सेरामाइडच्या उपस्थितीव्यतिरिक्त, Gas1-GFP च्या एकत्र येण्यासाठी p24 कॉम्प्लेक्सला बांधण्याची देखील आवश्यकता असते आणि त्यासाठी विशिष्ट Lst1 भरतीची गरज नसते. त्यानंतर, आम्ही ही शक्यता तपासली की ER पटलातील सेरामाइडच्या साखळीची लांबी Gas1-GFP चे p24 शी होणारे बंधन नियंत्रित करू शकते का. तथापि, आम्हाला असे आढळले की पटलामध्ये C18-C16 सेरामाइडची उपस्थिती p24 कॉम्प्लेक्सद्वारे पुनर्रचित GPI-ग्लायकॅन्सवर (आकृती S3 आणि S4, A आणि B) किंवा GPI-AP शी बंधन आणि GPI-AP निर्यात करण्याच्या क्षमतेवर परिणाम करत नाही. COPII उपप्रकार Lst1 ची भरती करा (आकृती S4C). त्यामुळे, C26 सेरामाइड-अवलंबित क्लस्टरिंगसाठी वेगवेगळ्या ER निर्यात प्रथिन यंत्रणांसोबत प्रथिन आंतरक्रियांची आवश्यकता नसते, परंतु ते लिपिडच्या लांबीद्वारे चालवल्या जाणाऱ्या एका पर्यायी वर्गीकरण यंत्रणेला समर्थन देते. त्यानंतर, आम्ही विश्लेषण केले की ER पडद्यातील सेरामाइड एसिल साखळीची लांबी Gas1-GFP च्या निवडक ERES म्हणून प्रभावी वर्गीकरणासाठी महत्त्वाची आहे का. लहान-साखळी सेरामाइड असलेल्या GhLag1 स्ट्रेनमधील Gas1 ER सोडून प्लाझ्मा पडद्यात प्रवेश करत असल्यामुळे (आकृती S5), आमचा विश्वास आहे की जर वर्गीकरण सेरामाइड एसिल साखळीच्या लांबीद्वारे चालवले जात असेल, तर GhLag1 स्ट्रेनमधील Gas1 ला पुनर्निर्देशित करून त्याच पडद्यासह ERES घटकांना पार करता येऊ शकते.
(अ) GhLag1 च्या पेशीपटलामध्ये प्रामुख्याने लहान C18-C16 सेरामाइड्स असतात, तर Gas1-GFP च्या GPI अँकरमध्ये वाइल्ड-टाइप पेशींप्रमाणेच C26 IPC असतो. वरील: मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) द्वारे वाइल्ड-टाइप (Wt) आणि GhLag1p स्ट्रेनच्या पेशीपटलातील सेरामाइडच्या एसिल चेन लांबीचे विश्लेषण. डेटा एकूण सेरामाइडची टक्केवारी दर्शवतो. तीन स्वतंत्र प्रयोगांची सरासरी. एरर बार = SD. टू-टेल्ड अनपेअर्ड टी टेस्ट. **** P ＜0.0001. खालील पॅनेल: वाइल्ड-टाइप आणि GhLag1p स्ट्रेनमध्ये व्यक्त केलेल्या Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI अँकरमध्ये असलेल्या IPC च्या एसिल चेन लांबीचे MS विश्लेषण. डेटा एकूण IPC सिग्नलची टक्केवारी दर्शवतो. पाच स्वतंत्र प्रयोगांची सरासरी. एरर बार = SD. टू-टेल्ड अनपेअर्ड टी टेस्ट. ns, महत्त्वाचे नाही. P = 0.9134. (B) गॅलॅक्टोज-प्रेरित Gas1-GFP व्यक्त करणाऱ्या sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ आणि sec31-1lst1Δ पेशींचे प्रतिदीप्ती सूक्ष्मचित्र, ज्यांना ३७°C वर ३० मिनिटे उबवून २४°C नंतर नेहमीच्या प्रतिदीप्ती सूक्ष्मदर्शनासाठी ठेवण्यात आले होते. पांढरा बाण: ER Gas1-GFP समूह. मोकळा बाण: समूहरहित Gas1-GFP संपूर्ण ER पटलावर पसरलेले आहे, जे ER चे वैशिष्ट्यपूर्ण केंद्रकीय वलय रंगांकन दर्शवते. स्केल बार, ५μm. (C) (B) मध्ये वर्णन केलेल्या सूक्ष्मचित्राचे संख्यात्मक मापन. ठिपक्यांच्या स्वरूपातील Gas1-GFP रचना असलेल्या पेशींची सरासरी टक्केवारी. तीन स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये, n≥३०० पेशी. त्रुटी बार = SD. द्विपक्षीय असंबद्ध टी-चाचणी. **** P ＜०.०००१.
या समस्येचे थेट निराकरण करण्यासाठी, आम्ही sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्ती अ‍ॅलीलसह GhLag1 मध्ये Gas1-GFP आणि Mid2-iRFP चे SCLIM व्हिज्युअलायझेशन केले (आकृती ४ आणि मूव्ही S4). ER ला ३७°C वर ठेवल्यानंतर आणि नंतर २४°C वर सोडल्यावर, पारंपरिक सूक्ष्मदर्शकांद्वारे निरीक्षण केल्याप्रमाणे, नव्याने संश्लेषित झालेले बहुतेक Gas1-GFP हे ER पटलावर एकत्रित आणि वितरित झालेले नव्हते (आकृती ४, A आणि B). याव्यतिरिक्त, ERES च्या मोठ्या टक्केवारीमध्ये (६७%) दोन प्रकारचे कार्गो एकाच ठिकाणी आढळतात (आकृती ४D). आकृती ४C चे पॅनेल १ आणि २ हे ERES ची दोन वैशिष्ट्यपूर्ण उदाहरणे दर्शवतात, ज्यात Gas1-GFP आणि Mid2-GFP एकमेकांवर आच्छादित आहेत. याव्यतिरिक्त, दोन्ही कार्गो एकाच ERES मध्ये समाविष्ट झाले होते (आकृती ४E, पॅनेल ३ आणि मूव्ही S4). म्हणून, आमचे निष्कर्ष सूचित करतात की ER पटलातील सेरामाइड अ‍ॅसिल साखळीची लांबी ही ER प्रथिनांच्या एकत्रीकरण आणि वर्गीकरणाचा एक महत्त्वाचा निर्धारक आहे.
गॅलॅक्टोज-प्रेरित स्राव, Gas1-GFP (GPI-AP, हिरवा) आणि Mid2-iRFP (TMP, निळा) व्यक्त करणाऱ्या Sec31-1 GhLag1 पेशी आणि घटक ERES-लेबल केलेले Sec13-mCherry (ERES, किरमिजी) यांना ३७°C वर उबवा. ३० मिनिटे चालू ठेवा, स्राव बाहेर पडण्यासाठी तापमान २४°C पर्यंत कमी करा आणि २० मिनिटांनंतर SCLIM ने प्रतिमा घ्या. (A ते C) कार्गो आणि ERES ने चिन्हांकित केलेल्या १० झेड-सेक्शन्सच्या प्रातिनिधिक २डी प्रोजेक्शन प्रतिमा (A; स्केल बार, १μm) किंवा ३डी पेशी गोलार्ध प्रतिमा (B आणि C; स्केल युनिट, ०.४५μm). (B) मधील खालचा पॅनेल आणि (C) मधील पॅनेल केवळ ERES मध्ये उपस्थित असलेल्या वस्तू (किरमिजी) [Gas1-GFP (राखाडी) आणि Mid2-iRFP (फिकट निळा)] दर्शविण्यासाठी प्रक्रिया केलेल्या प्रतिमा दाखवतात. (C) पांढरा भरलेला बाण: ERES, वस्तूंचे आच्छादन. मोकळा बाण: ERES मध्ये फक्त एकच वस्तू आहे. खालचा पॅनेल: निवडलेल्या ERES मध्ये (C) मध्ये चिन्हांकित केलेल्या ओव्हरलॅपिंग वस्तू (1 आणि 2) आहेत. स्केल बार, 100 nm. (D) (C) मध्ये वर्णन केलेल्या फोटोमायक्रोग्राफचे प्रमाणीकरण. sec31-1 आणि sec31-1 GhLag1 युनिट्समध्ये, फक्त एकच कार्गो (Gas1-GFP किंवा Mid2-iRFP) समाविष्ट आहे, आणि वेगळ्या कार्गोसाठी व ओव्हरलॅपिंग कार्गोसाठी ERES ची सरासरी टक्केवारी. तीन स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये, 54 पेशींमध्ये n = 432 (sec31-1) आणि 47 पेशींमध्ये n = 430 (sec31-1 GhLag1). एरर बार = SD. टू-टेल्ड अनपेअर्ड टी टेस्ट. *** P = 0.0002 (sec31-1) आणि ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) (C) मध्ये चिन्हांकित केलेल्या ओव्हरलॅपिंग कार्गो (3) सह निवडलेल्या ERES ची 3D प्रतिमा. Gas1-GFP (हिरवा) आणि Mid2-iRFP (निळा) एकाच बाजूने ERES (मॅजेंटा) कडे येतात आणि त्याच ERES प्रतिबंधित क्षेत्रात राहतात. स्केल बार, 100 nm.
हा अभ्यास थेट इन व्हिविओ पुरावा देतो की लिपिड-आधारित प्रथिने स्रावी मार्गातील निवडक निर्यात स्थळांमध्ये वर्गीकृत केली जातात आणि वर्गीकरण निवडकतेसाठी एसिल चेन लांबीचे महत्त्व प्रकट करतो. SCLIM नावाचे एक शक्तिशाली आणि अत्याधुनिक मायक्रोस्कोपी तंत्र वापरून, आम्ही यीस्टमध्ये नव्याने संश्लेषित Gas1-GFP (एक प्रमुख प्लाझ्मा मेम्ब्रेन GPI-AP ज्यामध्ये खूप लांब एसिल चेन (C26) सेरामाइड लिपिड भाग आहे) प्रदर्शित केले. वेगळ्या ERs मध्ये एकत्रित झालेले प्रदेश विशिष्ट ERES शी संबंधित आहेत, तर ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रथिने संपूर्ण ER मेम्ब्रेनमध्ये वितरित आहेत (आकृती 1). याव्यतिरिक्त, हे दोन प्रकारचे पदार्थ निवडकपणे वेगवेगळ्या ERES मध्ये प्रवेश करतात (आकृती 2). मेम्ब्रेनमधील सेल्युलर सेरामाइडची एसिल चेन लांबी C26 वरून C18-C16 पर्यंत कमी केली जाते, Gas1-GFP क्लस्टर वेगळ्या ER प्रदेशात विस्कळीत होतो आणि Gas1-GFP ला ट्रान्समेम्ब्रेन प्रथिनासह त्याच ERES द्वारे ER मधून बाहेर पडण्यासाठी पुनर्निर्देशित केले जाते (आकृती 3 आणि आकृती 3.4).
जरी GPI-AP ER मधून बाहेर पडण्यासाठी एका विशेष प्रथिन यंत्रणेचा वापर करत असले तरी, आम्हाला आढळले की C26 सेरामाइड-अवलंबित विलगीकरण हे भिन्न प्रथिन आंतरक्रियांवर अवलंबून नाही, ज्यामुळे ERES विशेषीकरण होऊ शकते (आकृत्या S4 आणि S5). त्याऐवजी, आमचे निष्कर्ष लिपिड-आधारित प्रथिन क्लस्टरिंग आणि त्यानंतर इतर कार्गोच्या वगळण्याद्वारे चालणाऱ्या एका पर्यायी वर्गीकरण यंत्रणेला समर्थन देतात. आमच्या निरीक्षणांवरून असे दिसून येते की एका विशिष्ट ERES शी संबंधित Gas1-GFP क्षेत्र किंवा क्लस्टरमध्ये ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रथिन Mid2-iRFP चा अभाव असतो, जे दर्शवते की C26 सेरामाइड-अवलंबित GPI-AP क्लस्टर त्यांच्या संबंधित ERES मध्ये प्रवेशास सुलभ करेल आणि त्याच वेळी, ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावांना या विशिष्ट ERES मध्ये प्रवेश करण्यापासून वगळेल (आकृत्या 1 आणि 2). याउलट, ER पडद्यामध्ये C18-C16 सेरामाइड्सच्या उपस्थितीमुळे GPI-AP क्षेत्रे किंवा क्लस्टर तयार करत नाही, त्यामुळे ते त्याच ERES मध्ये ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रथिनांना वगळत नाहीत किंवा त्यांची जागा घेत नाहीत (आकृत्या 3 आणि 4). म्हणून, आम्ही असे सुचवतो की C26 सेरामाइड विशिष्ट ERES शी जोडलेल्या प्रथिनांचे क्लस्टरिंग सुलभ करून विलगीकरण आणि वर्गीकरणास चालना देते.
एका विशिष्ट ER क्षेत्रात हे C26 सेरामाइड-अवलंबित क्लस्टरिंग कसे साध्य करावे? पडद्यावरील सेरामाइडची बाजूने वेगळे होण्याची प्रवृत्ती, लहान आणि असंतृप्त ग्लिसरोलिपिड्स असलेल्या ER पडद्याच्या अधिक अनियमित लिपिड वातावरणात GPI-AP आणि C26 सेरामाइडला लहान आणि त्वरित सुव्यवस्थित लिपिड्स तयार करण्यास कारणीभूत ठरू शकते. दर्जेदार क्लस्टर्स (17, 18). हे लहान तात्पुरते क्लस्टर्स p24 कॉम्प्लेक्सला बांधल्यानंतर मोठ्या, अधिक स्थिर क्लस्टर्समध्ये विलीन होऊ शकतात (34). याच्याशी सुसंगत, आम्ही दाखवले की मोठे दृश्यमान क्लस्टर्स तयार करण्यासाठी C26 Gas1-GFP ला p24 कॉम्प्लेक्सशी संवाद साधण्याची आवश्यकता असते (आकृती 3). p24 कॉम्प्लेक्स हे यीस्टमधील चार वेगवेगळ्या p24 ट्रान्समेम्ब्रेन प्रथिनांनी बनलेले एक हेटेरोजायगस ऑलिगोमर आहे (35), जे मल्टीव्हॅलेंट बंधन प्रदान करते, ज्यामुळे लहान GPI-AP क्लस्टर्सचे क्रॉस-लिंकिंग होऊ शकते, आणि त्यामुळे मोठे स्थिर क्लस्टर तयार होते (34). सस्तन प्राण्यांच्या ध्रुवीकृत उपकला पेशींमध्ये (36) त्यांच्या गॉल्गी वाहतुकीदरम्यान दाखवल्याप्रमाणे, GPI-AP च्या प्रथिन एक्टोडोमेन्समधील आंतरक्रिया देखील त्यांच्या एकत्रीकरणात योगदान देऊ शकते. तथापि, जेव्हा ER पडद्यामध्ये C18-C16 सेरामाइड उपस्थित असते, तेव्हा p24 कॉम्प्लेक्स Gas1-GFP शी जोडला जातो, तेव्हा मोठे वेगळे समूह तयार होणार नाहीत. यामागील यंत्रणा लांब एसिल चेन सेरामाइडच्या विशिष्ट भौतिक आणि रासायनिक गुणधर्मांवर अवलंबून असू शकते. कृत्रिम पडद्यांच्या जैवभौतिक अभ्यासातून असे दिसून येते की, जरी लांब (C24) आणि लहान (C18-C16) एसिल चेन सेरामाइड दोन्ही फेज सेपरेशनला कारणीभूत ठरू शकतात, तरी केवळ लांब एसिल चेन सेरामाइड (C24) उच्च वक्रता आणि फिल्मला पुन्हा आकार देण्यासाठी फिल्म वाकण्यास प्रोत्साहन देऊ शकतात. परस्पर संदर्भाद्वारे (17, 37, 38). हे दाखवून देण्यात आले आहे की TMED2 चा ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्स, जो Emp24 चा मानवी समजात आहे, सायटोप्लाज्मिक लोब्यूल्समध्ये C18 सेरामाइड-आधारित स्फिंगोमायलिनशी निवडकपणे संवाद साधतो (39). मॉलिक्युलर डायनॅमिक्स (MD) सिम्युलेशनचा वापर करून, आम्हाला आढळले की C18 आणि C26 दोन्ही सेरामाइड्स Emp24 ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्सच्या सायटोप्लाज्मिक लोब्यूल्सभोवती जमा होतात आणि त्यांची पसंती समान आहे (आकृती S6). हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की हे सूचित करते की Emp24 चा ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्स पडद्यामध्ये लिपिड्सच्या असममित वितरणास कारणीभूत ठरू शकतो. हा सस्तन प्राण्यांच्या पेशींवर आधारित एक अलीकडील निष्कर्ष आहे. अशाच प्रकारच्या MD सिम्युलेशनमध्ये इथर लिपिड्सची उपस्थिती देखील दिसून येते (40). म्हणून, आम्ही असा अंदाज लावतो की ER26 च्या दोन लोब्यूल्समध्ये C26 सेरामाइड स्थानिकरित्या समृद्ध आहे. जेव्हा ल्युमिनल लोब्यूल्समधील GPI-AP थेट मल्टीव्हॅलेंट p24 शी जोडले जाते आणि सायटोप्लाज्मिक लोब्यूल्समध्ये p24 च्या भोवती C26 सेरामाइड जमा होते, तेव्हा ते फिंगर्सद्वारे (41) तयार होणाऱ्या प्रोटीन एकत्रीकरण आणि पडद्याच्या वक्रतेला चालना देऊ शकते, ज्यामुळे GPI-AP हे ERES च्या लगतच्या स्वतंत्र भागांमध्ये विभागले जाते, जे ER पडद्याच्या अत्यंत वक्र भागांना देखील अनुकूल ठरवते (42). मागील अहवालांनी प्रस्तावित यंत्रणेला समर्थन दिले (43, 44). प्लाझ्मा पडद्यावरील सेरामाइड-आधारित ग्लायकोस्फिंगोलिपिड्स (GSL) शी ओलिगोलेक्टिन्स, रोगजनक किंवा अँटीबॉडीजचे मल्टीव्हॅलेंट बंधन मोठ्या GSL एकत्रीकरणास चालना देते, फेज सेपरेशन वाढवते आणि पडद्याचे विकृतीकरण आणि इंटर्नलायझेशन घडवते (44). इवाबुची इत्यादी. (43) असे आढळून आले की लांब (C24) अ‍ॅसिल साखळ्यांच्या उपस्थितीत, परंतु लहान (C16) अ‍ॅसिल साखळ्यांच्या उपस्थितीत नाही, GSL लॅक्टोसिलसेरामाइडला बांधलेल्या बहुसंयुजी लिगँडने मोठ्या क्लस्टर्सची निर्मिती आणि पडदा अंतर्वलन प्रेरित केले आणि जोडलेल्या न्यूट्रोफिल्समध्ये पत्र्यांवरील सायटोप्लाझम लिन-मध्यस्थ सिग्नल ट्रान्सडक्शन अ‍ॅसिल साखळ्यांद्वारे आंतरबोटित केले जाते.
सस्तन प्राण्यांच्या ध्रुवीकृत उपकला पेशींमध्ये, एपिकल प्लाझ्मा मेम्ब्रेनच्या पातळीपर्यंत अँटी-गॉल्गी नेटवर्कचे (TGN) केंद्रीकरण GPI-AP चे विलगीकरण आणि वर्गीकरण नियंत्रित करते (10, 45). हे एकत्रीकरण GPI-AP ऑलिगोमेराइझेशनमुळे होते (36), परंतु ते यीस्टमध्ये आढळणाऱ्या सेरामाइड साखळीच्या लांबीवर देखील अवलंबून असू शकते. जरी सस्तन प्राण्यांच्या GPI-AP मध्ये इथर लिपिड-आधारित अँकर असला आणि त्याची रासायनिक रचना अति-लांब एसिल साखळी सेरामाइडपेक्षा खूप वेगळी असली तरी, एका अलीकडील अभ्यासात असे आढळून आले आहे की दोन्ही लिपिड्समध्ये उत्क्रांतीच्या दृष्टीने समान भौतिक आणि रासायनिक गुणधर्म आणि कार्य आहेत (40). म्हणून, सस्तन प्राण्यांच्या पेशींमधील इथर लिपिड भाग यीस्टमधील C26 सेरामाइडसारखा असू शकतो आणि त्याची भूमिका GPI-AP चे एकत्रीकरण आणि वर्गीकरण वाढवण्यासाठी मेम्ब्रेनमधील लांब-साखळी सेरामाइडशी संलग्न होण्याची आहे. जरी या शक्यतेची थेट चाचणी करणे अजून बाकी असले तरी, मागील निष्कर्ष असे दर्शवतात की लांब एसिल चेन सेरामाइडची गॉल्गी बॉडीमध्ये वाहतूक सायटोप्लाज्मिक ट्रान्सफर प्रथिनांद्वारे होत नाही, तर यीस्टप्रमाणे GPI अँकर्सच्या संश्लेषणावर अवलंबून असते. म्हणून, उत्क्रांतीच्या दृष्टीने स्थिर असलेली यंत्रणा एकाच ट्रान्सपोर्ट व्हेसिकलमध्ये अत्यंत लांब एसिल चेन सेरामाइड आणि GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) यांची निवडकपणे सह-वाहतूक करण्यास सक्षम असल्याचे दिसते.
यीस्ट आणि सस्तन प्राण्यांच्या ध्रुवीकृत उपकला पेशी प्रणालींमध्ये, GPI-AP चे एकत्रीकरण आणि इतर प्लाझ्मा पडदा प्रथिनांपासून त्याचे विलगीकरण, हे सर्व पेशीच्या पृष्ठभागावर पोहोचण्यापूर्वीच घडते. पॅलाडिनो आणि सहकाऱ्यांनी (48) असे आढळले की सस्तन प्राण्यांच्या ध्रुवीकृत उपकला पेशींच्या TGN वर, GPI-AP चे क्लस्टरिंग केवळ एपिकल प्लाझ्मा पडद्यावर GPI-AP च्या निवडक वर्गीकरणासाठीच आवश्यक नाही, तर ते GPI-AP च्या क्लस्टरिंग रचनेचे आणि त्याच्या पेशी पृष्ठभागावरील जैविक क्रियाकलापांचे नियमन देखील करते. यीस्टमध्ये, या अभ्यासाने दाखवले की ER वरील C26 सेरामाइड-अवलंबित GPI-AP क्लस्टर प्लाझ्मा पडद्यावरील GPI-AP च्या क्लस्टर रचनेचे आणि कार्यात्मक क्रियाकलापांचे नियमन करू शकते (24, 49). या मॉडेलशी सुसंगतपणे, GhLag1 पेशी GPI अवरोधकांना किंवा पेशीभित्तीच्या अखंडतेवर परिणाम करणाऱ्या औषधांना ऍलर्जीक असतात (28), आणि यीस्ट पेशींच्या मिलनात प्रक्षेपित केलेल्या टोकाच्या सेरामाइडच्या कार्यात्मक Gas1-GFP क्लस्टर्सची आवश्यकता (49) hLag1 पेशींच्या संभाव्य शारीरिक परिणामांकडे सूचित करते. GPI-AP त्रुटी. तथापि, लिपिडच्या लांबीवर आधारित वर्गीकरण पद्धतीद्वारे पेशीच्या पृष्ठभागाची कार्यात्मक रचना ER मधून पूर्वनियोजित केली गेली आहे की नाही, याची पुढील चाचणी करणे हा आमच्या भविष्यातील संशोधनाचा विषय असेल.
या कामात वापरलेले सॅकरोमायसेस सेरेव्हिसिया स्ट्रेन टेबल S1 मध्ये सूचीबद्ध आहेत. लाईव्ह सेल इमेजिंगसाठी SCLIM चे MMY1583 आणि MMY1635 स्ट्रेन W303 च्या पार्श्वभूमीवर तयार केले गेले. फ्लोरोसेंट प्रोटीन टॅगसह Sec13-mCherry व्यक्त करणारे हे स्ट्रेन, pFA6a प्लास्मिडला टेम्पलेट म्हणून वापरून पॉलिमरेज चेन रिॲक्शन (PCR)-आधारित पद्धतीने तयार केले गेले (23). GAL1 प्रमोटरच्या नियंत्रणाखाली फ्लोरोसेंट प्रोटीनने लेबल केलेले Mid2-iRFP व्यक्त करणारा स्ट्रेन खालीलप्रमाणे तयार केला गेला. pKTiRFP-KAN व्हेक्टरमधून (ई. ओ'शेआ यांची देणगी, ॲडजीन प्लास्मिड क्रमांक 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; रिसर्च रिसोर्स आयडेंटिफायर (RRID): Addgene_64687) iRFP-KanMx सिक्वेन्सचे PCR ॲम्प्लिफिकेशन करून ते एंडोजिनस Mid2 च्या C-टर्मिनसमध्ये समाविष्ट केले. Mid2-iRFP जीनोम अनुक्रमाचे प्रवर्धन करून GAL1 प्रमोटरमध्ये क्लोन केल्यानंतर, ते pRS306 या इंटिग्रेशन प्लास्मिडच्या Not I-Sac I साइटमध्ये समाकलित करण्यात आले. परिणामी तयार झालेले प्लास्मिड pRGS7, URA3 लोकसमध्ये समाकलित करण्यासाठी Pst I ने लिनिअराइझ करण्यात आले.
Gas1-GFP फ्यूजन जीन सेंट्रोमियर (CEN) प्लास्मिडमध्ये GAL1 प्रमोटरच्या नियंत्रणाखाली व्यक्त केले जाते, ज्याची रचना खालीलप्रमाणे आहे. Gas1-GFP अनुक्रम pRS416-GAS1-GFP प्लास्मिड (24) (एल. पोपोलो यांनी दिलेले) मधून PCR द्वारे प्रवर्धित करण्यात आला आणि CEN प्लास्मिड pBEVY-GL LEU2 (सी. मिलर यांनी दिलेले) च्या Xma I–Xho I साइटमध्ये क्लोन करण्यात आला; अॅडजीन प्लास्मिड क्रमांक 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). परिणामी प्लास्मिडला pRGS6 असे नाव देण्यात आले. Axl2-GFP फ्यूजन जीन देखील pBEVY-GL LEU2 वेक्टरच्या GAL1 प्रमोटरच्या नियंत्रणाखाली व्यक्त केले जाते आणि त्याची रचना खालीलप्रमाणे आहे. pRS304-p2HSE-Axl2-GFP प्लास्मिड (23) मधून Axl2-GFP अनुक्रम PCR द्वारे प्रवर्धित करण्यात आला आणि pBEVY-GL LEU2 वेक्टरच्या Bam HI-Pst I साइटमध्ये क्लोन करण्यात आला. परिणामी प्लास्मिडला pRGS12 असे नाव देण्यात आले. या अभ्यासात वापरलेल्या ऑलिगोन्यूक्लिओटाइड्सचा अनुक्रम तक्ता S2 मध्ये सूचीबद्ध आहे.
या स्ट्रेनला पोषणासाठी आवश्यक असलेले योग्य अमिनो आम्ल आणि क्षार पुरवण्यासाठी, कार्बन स्रोत म्हणून 0.2% ॲडेनाइन आणि 2% ग्लुकोज [वायपी-डेक्स्ट्रोज (वायपीडी)], 2% रॅफिनोज [वायपी-रॅफिनोज] समृद्ध यीस्ट अर्क प्रोटीन पी (वायपी) माध्यम (1% यीस्ट अर्क आणि 2% प्रोटीन पीईटी) (वायपीआर)] किंवा 2% गॅलॅक्टोज [वायपी-गॅलॅक्टोज (वायपीजी)] पुरवण्यात आले, किंवा एका कृत्रिम किमान माध्यमात (0.15% यीस्ट नायट्रोजन बेस आणि 0.5% अमोनियम सल्फेट), आणि कार्बन स्रोत म्हणून 2% ग्लुकोज (कृत्रिम ग्लुकोज किमान माध्यम) किंवा 2% गॅलॅक्टोज (कृत्रिम गॅलॅक्टोज किमान माध्यम) समाविष्ट करण्यात आले.
रिअल-टाइम इमेजिंगसाठी, GAL1 प्रमोटरखाली कन्स्ट्रक्ट व्यक्त करणाऱ्या तापमान-संवेदनशील sec31-1 म्युटंट पेशींना YPR माध्यमात २४°C तापमानावर रात्रभर मिड-लॉग फेजपर्यंत वाढवण्यात आले. २४°C तापमानावर YPG मध्ये १ तास इंडक्शन केल्यानंतर, पेशींना ३७°C तापमानावर SG मध्ये ३० मिनिटांसाठी इनक्युबेट करण्यात आले, आणि नंतर सिक्रेशन ब्लॉकमधून मुक्त करण्यासाठी त्यांना २४°C तापमानावर स्थानांतरित करण्यात आले. पेशींना ग्लास स्लाईडवर स्थिर करण्यासाठी कॉनकानावालिन ए (Concanavalin A) वापरण्यात आले आणि SCLIM द्वारे त्यांची इमेजिंग करण्यात आली. SCLIM हे ऑलिंपस IX-71 इन्व्हर्टेड फ्लुरोसेन्स मायक्रोस्कोप आणि UPlanSApo 100×1.4 न्यूमेरिकल ॲपर्चर ऑइल लेन्स (ऑलिंपस), हाय-स्पीड आणि हाय-सिग्नल-टू-नॉईज रेशो रोटेटिंग डिस्क कॉन्फोकल स्कॅनर (योकोगावा इलेक्ट्रिक), कस्टम स्पेक्ट्रोमीटर आणि कस्टम कूलिंग यांचे संयोजन आहे. या प्रणालीचा इमेज इंटेन्सिफायर (हामामात्सु फोटोनिक्स) ×266.7 च्या अंतिम मॅग्निफिकेशनसह एक मॅग्निफायिंग लेन्स प्रणाली आणि इलेक्ट्रॉन्सची संख्या वाढवणारा चार्ज-कपल्ड डिव्हाइस कॅमेरा (हामामात्सु फोटोनिक्स) (21) प्रदान करू शकतो. प्रतिमा संपादन कस्टम सॉफ्टवेअर (योकोगावा इलेक्ट्रिक) द्वारे केले जाते. 3D प्रतिमांसाठी, आम्ही ऑब्जेक्टिव्ह लेन्सला उभ्या दिशेने कंपन देण्यासाठी कस्टम-मेड पिझोइलेक्ट्रिक ॲक्ट्युएटर वापरला आणि 100 nm अंतरावर असलेले ऑप्टिकल भाग एका स्टॅकमध्ये गोळा केले. झेड-स्टॅक प्रतिमेचे ३डी व्हॉक्सेल डेटामध्ये रूपांतर केले जाते आणि रोटेटिंग डिस्क कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपसाठी वापरल्या जाणाऱ्या सैद्धांतिक पॉइंट स्प्रेड फंक्शनचा उपयोग व्होलोसिटी सॉफ्टवेअर (पर्किनएल्मर) द्वारे डीकन्व्होल्यूशन प्रक्रियेसाठी केला जातो. को-लोकेशन विश्लेषणासाठी स्वयंचलितपणे थ्रेशोल्ड करण्याकरिता व्होलोसिटी सॉफ्टवेअरचा वापर करून, कार्गोसह ईआरईएस (ERES) मोजण्यात आले. मेटामॉर्फ सॉफ्टवेअर (मॉलिक्युलर डिव्हाइसेस) वापरून लाइन स्कॅन विश्लेषण करण्यात आले.
सांख्यिकीय महत्त्व निश्चित करण्यासाठी ग्राफपॅड प्रिझम सॉफ्टवेअर वापरा. ​​दोन-पुच्छ स्टुडंटच्या टी-चाचणी आणि सामान्य एक-मार्गी विचलन विश्लेषण (ANOVA) चाचणीसाठी, गटांमधील फरकांचा महत्त्वपूर्ण परिणाम P <0.05 (*) वर मानला जातो.
Gas1-GFP च्या फ्लुरोसेन्स मायक्रोस्कोपीसाठी, लॉग फेज पेशी YPD मध्ये रात्रभर वाढवण्यात आल्या आणि सेंट्रीफ्युगेशनद्वारे गोळा करण्यात आल्या, फॉस्फेट बफर्ड सलाइनने दोनदा धुतल्या गेल्या, आणि कमीतकमी १५ मिनिटांसाठी बर्फावर ठेवण्यात आल्या, आणि नंतर पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे (24) मायक्रोस्कोपखाली प्रक्रिया करण्यात आली. प्रतिमा मिळवण्यासाठी ऑब्जेक्टिव्ह लेन्स, L5 (GFP) फिल्टर, हमामात्सु कॅमेरा आणि ॲप्लिकेशन सूट X (LAS X) सॉफ्टवेअरने सुसज्ज असलेला लायका DMi8 मायक्रोस्कोप (HCX PL APO 1003/1.40 ऑइल PH3 CS) वापरण्यात आला.
नमुने ६५°C तापमानावर १० मिनिटांसाठी SDS सॅम्पल बफरने विकृत (denatured) करण्यात आले, आणि नंतर SDS-पॉलिॲक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (PAGE) द्वारे वेगळे करण्यात आले. इम्युनोब्लॉटिंग विश्लेषणासाठी, प्रत्येक लेनमध्ये १० μl नमुना लोड करण्यात आला. प्राथमिक अँटीबॉडी: ससा पॉलिक्लोनल अँटी-Gas1 १:३००० च्या विरलतेवर, ससा पॉलिक्लोनल अँटी-Emp24 १:५०० च्या विरलतेवर, आणि ससा पॉलिक्लोनल अँटी-GFP (एच. रिझमन यांच्याकडून भेट) १:३००० च्या विरलतेवर वापरण्यात आले. उंदीर मोनोक्लोनल अँटी-Pgk1 अँटीबॉडी १:५००० च्या विरलतेवर वापरण्यात आली (जे. दे ला क्रूझ यांच्याकडून भेट). द्वितीयक अँटीबॉडी: हॉर्सरॅडिश पेरॉक्सिडेज (HRP) संयुग्मित शेळी अँटी-ससा इम्युनोग्लोबुलिन जी (IgG) १:३००० च्या विरलतेवर वापरण्यात आली (पिअर्स). HRP-संयुग्मित शेळीचे अँटी-माऊस IgG 1:3000 च्या विरलतेवर वापरले गेले (पियर्स). सुपरसिग्नल वेस्ट पिको अभिकर्मकाच्या (थर्मो फिशर सायंटिफिक) रसायनदीप्ती पद्धतीने रोगप्रतिकारक प्रतिसाद क्षेत्राचे निरीक्षण केले गेले.
(31) मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, संवर्धित ER अंशावर एक नैसर्गिक इम्युनोप्रिसिपिटेशन प्रयोग करण्यात आला. थोडक्यात, यीस्ट पेशी TNE बफरने [50 mM ट्रिस-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM फेनिलमिथाइलसल्फोनाइल फ्लोराइड आणि प्रोटीज इनहिबिटर मिश्रण] 600 nm (OD600) वर 100 ऑप्टिकल डेन्सिटीवर दोनदा धुतल्या गेल्या. त्या काचेच्या मण्यांनी फोडण्यात आल्या, आणि नंतर पेशींचे अवशेष आणि काचेचे मणी सेंट्रीफ्युगेशनद्वारे काढून टाकण्यात आले. त्यानंतर सुपरनॅटंटला 4°C तापमानावर 15 मिनिटांसाठी 17,000 g वर सेंट्रीफ्युज करण्यात आले. पेलेटला TNE मध्ये पुन्हा निलंबित करण्यात आले आणि डिजिटलिस सॅपोनीन 1% च्या अंतिम सांद्रतेपर्यंत मिसळण्यात आले. हे निलंबन 4°C तापमानावर 1 तास फिरवत ठेवण्यात आले, आणि नंतर 4°C तापमानावर 60 मिनिटांसाठी 13,000 g वर सेंट्रीफ्युगेशन करून अविद्राव्य घटक काढून टाकण्यात आले. Gas1-GFP इम्युनोप्रेसिपिटेशनसाठी, प्रथम नमुना रिकाम्या ॲगारोज बीड्स (क्रोमोटेक) सोबत ४°C तापमानावर १ तास प्री-इन्क्युबेट करा, आणि नंतर GFP-Trap_A (क्रोमोटेक) सोबत ४°C तापमानावर ३ तास ​​इन्क्युबेट करा. इम्युनोप्रेसिपिटेटेड बीड्स ०.२% डायजॉक्सिजेनिन असलेल्या TNE ने पाच वेळा धुतले गेले, SDS सॅम्पल बफरने इल्युट केले गेले, SDS-PAGE वर वेगळे केले गेले आणि इम्युनोब्लॉटिंगद्वारे विश्लेषण केले गेले.
(31) मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, संवर्धित ER अंशावर क्रॉस-लिंकिंग निर्धारण केले गेले. थोडक्यात, संवर्धित ER अंश 0.5 mM डायथियोबिस(सक्सिनिमिडिल प्रोपिओनेट) (पियर्स, थर्मो फिशर सायंटिफिक, रॉकफोर्ड, IL, USA; 20°C, 20 मिनिटे) सह इनक्यूबेट केले गेले. ग्लायसीन (50 mM अंतिम सांद्रता, 5 मिनिटे, 20°C) टाकून क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया थांबवली गेली.
पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे (50), वाइल्ड-टाइप आणि GhLag1 स्ट्रेन्समध्ये सेरामाइडचे एमएस विश्लेषण केले गेले. थोडक्यात, पेशी YPD मध्ये 30°C तापमानावर एक्सपोनेंशियल फेजपर्यंत (3 ते 4 OD600 युनिट्स/मिली) वाढवल्या गेल्या आणि 25×107 पेशी काढण्यात आल्या. ट्रायक्लोरोएसेटिक ऍसिडने त्यांचे चयापचय थांबवले जाते. निष्कर्षण द्रावक [इथेनॉल, पाणी, ईथर, पायरीडीन आणि 4.2 N अमोनियम हायड्रॉक्साइड (15:15:5:1:0.018 v/v)] आणि 1.2 nmol अंतर्गत मानक C17 सेरामाइड (860517, अवंती पोलर लिपिड गुणवत्ता) वापरा. ​​अर्काचे सौम्य अल्कधर्मी जलविच्छेदन करण्यासाठी मोनोमेथिलअमाइन अभिकर्मक [मेथॅनॉल, पाणी, एन-ब्युटेनॉल आणि मेथिलअमाइन द्रावण (4:3:1:5 v/v)] वापरा आणि नंतर क्षार काढण्यासाठी पाण्याने संतृप्त एन-ब्युटेनॉल वापरा. शेवटी, अर्क पॉझिटिव्ह मोड सॉल्व्हेंटमध्ये [क्लोरोफॉर्म/मिथेनॉल/पाणी (२:७:१) + ५ mM अमोनियम ॲसिटेट] पुन्हा विरघळवून मास स्पेक्ट्रोमीटरमध्ये इंजेक्ट करण्यात आला. स्फिंगोलिपिड रेणूंची ओळख आणि प्रमाणीकरणासाठी मल्टी-रिॲक्शन मॉनिटरिंग (MRM) केले गेले. लिपिड विश्लेषणासाठी TSQ व्हँटेज टर्शियरी क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर सायंटिफिक) मध्ये रोबोटिक नॅनोफ्लो आयन सोर्स नॅनोमेट HD (ॲडव्हिऑन बायोसायन्सेस, इथाका, NY) बसवलेला आहे. प्रत्येक सेरामाइड श्रेणीसाठी कोलिजन एनर्जी ऑप्टिमाइझ केली जाते. MS डेटा पॉझिटिव्ह मोडमध्ये मिळवला गेला. प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीसाठी, लिपिड सिग्नल हा तीन स्वतंत्र मापनांचा मध्यक आहे.
(31) मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, Gas1-GFP व्यक्त करणाऱ्या पेशी (800×107) नैसर्गिक इम्युनोप्रेसिपिटेशनसाठी वापरण्यात आल्या. शुद्ध केलेले Gas1-GFP SDS-PAGE द्वारे वेगळे केले गेले आणि पॉलिव्हिनिलिडेन फ्लोराइड (PVDF) पडद्यावर स्थानांतरित केले गेले. अमाइड ब्लॅकने PVDF ला रंग देऊन प्रथिने दृश्यमान करण्यात आली. Gas1-GFP बँड PVDF मधून कापला गेला आणि मिथेनॉलने 5 वेळा आणि लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-MS (LC-MS) ग्रेड पाण्याने एकदा धुतला गेला. पडद्याच्या पट्टीला 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), बफर आणि 500μl ताजे विरघळलेले 1 M सोडियम नायट्राइट मिश्रणासह 37°C वर 3 तास उबवून, लिपिड अंश Gas1-GFP पासून वेगळा होतो आणि ग्लुकोसामाइन आणि इनोसिटॉलमधील इनोसिन फॉस्फेट सेरामाइडचे विघटन होते (51). त्यानंतर, मेम्ब्रेन स्ट्रिप एलसी-एमएस ग्रेड पाण्याने चार वेळा धुतली गेली, खोलीच्या तापमानाला वाळवली गेली आणि विश्लेषणापर्यंत -80°C तापमानावर नायट्रोजनच्या वातावरणात साठवली गेली. नियंत्रक म्हणून, प्रत्येक प्रयोगासाठी पीव्हीडीएफ मेम्ब्रेनचा एक ब्लँक नमुना वापरण्यात आला. त्यानंतर Gas1-GFP मधून काढलेल्या लिपिडचे विश्लेषण वर्णन केल्याप्रमाणे (50) एमएस द्वारे करण्यात आले. थोडक्यात, जीपीआय-लिपिड असलेल्या पीव्हीडीएफ स्ट्रिप्स 75μl निगेटिव्ह मोल्ड सॉल्व्हेंट [क्लोरोफॉर्म/मिथेनॉल (1:2) + 5 mM अमोनियम ॲसिटेट] मध्ये पुन्हा निलंबित केल्या गेल्या आणि स्फिंगोलिपिड प्रजातींच्या इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI)-एमआरएम/एमएस विश्लेषणासाठी (टीएसक्यू व्हँटेज) पास केल्या गेल्या. या प्रकरणात, एमएस डेटा निगेटिव्ह आयन मोडमध्ये प्राप्त झाला.
आधी सांगितल्याप्रमाणे, GPI अँकरचा लिपिड भाग [3H]-इनोसिटॉल-लेबल केलेल्या GPI-AP (16) पासून वेगळा करण्यात आला. लिपिड्स थिन-लेयर क्रोमॅटोग्राफीद्वारे सॉल्व्हेंट सिस्टम (55:45:10 क्लोरोफॉर्म-मिथेनॉल-0.25% KCl) वापरून वेगळे केले गेले आणि FLA-7000 (फुजीफिल्म) वापरून दृश्यमान केले गेले.
Gas1-GFP (600×107) व्यक्त करणाऱ्या पेशी TNE बफरने दोनदा धुतल्या गेल्या, काचेच्या मण्यांनी फोडल्या गेल्या आणि नंतर पेशींचे अवशेष व काचेचे मणी काढून टाकण्यासाठी सेंट्रीफ्यूज केल्या गेल्या. त्यानंतर सुपरनॅटंटला 4°C तापमानावर 1 तासासाठी 17,000 g वर सेंट्रीफ्यूज केले गेले. पेलेटला TNE मध्ये धुतले गेले आणि 0.2% डिजिटलिस सॅपोनीन असलेल्या TNE मध्ये 37°C तापमानावर 1 तासासाठी 1 U PI-PLC (Invitrogen) सोबत इनक्यूबेट केले गेले. एन्झाइम उपचारानंतर, 4°C तापमानावर 1 तासासाठी 1 तासासाठी 17,000 g वर सेंट्रीफ्यूज करून मेम्ब्रेन काढून टाकण्यात आले. Gas1-GFP चे इम्युनोप्रेसिपिटेशन करण्यासाठी, सुपरनॅटंटला 4°C तापमानावर रात्रभर GFP-Trap_A (ChromoTek) सोबत इनक्यूबेट केले गेले. SDS-PAGE द्वारे वेगळे केलेले शुद्ध Gas1-GFP, कुमासी ब्रिलियंट ब्लूने रंगवले गेले. गॅस१-जीएफपी (Gas1-GFP) स्टैनिंग बँड ॲक्वेडक्टच्या सभोवतालच्या राखाडी भागातून कापून वेगळा करण्यात आला, आणि नंतर आयोडोॲसिटामाइडने अल्किलेशन व डायथियोथ्रिटॉलने रिडक्शन केल्यावर, ट्रिप्सिन वापरून इन-जेल डायजेशन करण्यात आले. ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स आणि जीपीआय-ग्लायकॅन्स असलेले पेप्टाइड्स वेगळे काढून वाळवण्यात आले. वाळवलेला पेप्टाइड २० μl पाण्यात विरघळवण्यात आला. त्याचा एक भाग (८μl) एलसीमध्ये (LC) इंजेक्ट करण्यात आला. विशिष्ट ग्रेडियंट परिस्थितीत पेप्टाइड्स वेगळे करण्यासाठी ऑक्टाडेसिलसिलेन (ODS) कॉलम (डेव्हलॉसिल ३००ओडीएस-एचजी-५; आतील व्यास १५० मिमी×१.० मिमी; नोमुरा केमिकल, आयची प्रांत, जपान) वापरण्यात आला. मोबाइल फेजमध्ये सॉल्व्हेंट ए (०.०८% फॉर्मिक ॲसिड) आणि सॉल्व्हेंट बी (८०% ॲसिटोनायट्राइलमध्ये ०.१५% फॉर्मिक ॲसिड) यांचा समावेश आहे. अ‍ॅक्सेला एचपीएलसी प्रणाली (थर्मो फिशर सायंटिफिक, बोस्टन, मॅसॅच्युसेट्स) वापरून, ५५ मिनिटांच्या आत ५० μl/मिनिट या प्रवाह दराने ५ मिनिटांसाठी सॉल्व्हेंट A ने कॉलममधून द्रावण काढण्यात आले, आणि नंतर सॉल्व्हेंट B ची सांद्रता ४०% पर्यंत वाढवण्यात आली. (युनायटेड स्टेट्स). हे द्रावण सतत ESI आयन सोर्समध्ये सोडण्यात आले, आणि ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स व GPI-ग्लायकॅन्स असलेल्या पेप्टाइड्सचे विश्लेषण LTQ ऑर्बिट्रॅप XL (हायब्रीड लिनियर आयन ट्रॅप-ऑर्बिट्रॅप मास स्पेक्ट्रोमीटर; थर्मो फिशर सायंटिफिक) द्वारे करण्यात आले. एमएस सेटअपमध्ये, कॅपिलरी सोर्सचा व्होल्टेज ४.५ kV वर सेट करण्यात आला होता, आणि ट्रान्सफर कॅपिलरीचे तापमान ३००°C वर ठेवण्यात आले होते. कॅपिलरी व्होल्टेज आणि ट्यूब लेन्स व्होल्टेज अनुक्रमे १५ V आणि ५० V वर सेट करण्यात आले होते. MS डेटा पॉझिटिव्ह आयन मोडमध्ये (60,000 चे रिझोल्यूशन; 10 पार्ट्स पर मिलियनची मास ॲक्युरसी) 300/m/z मास/चार्ज रेशो (m/z) 3000 च्या मास रेंजमध्ये मिळवला गेला. MS/MS डेटा LTQ ऑर्बिट्रॅप XL मधील आयन ट्रॅपद्वारे मिळवला जातो [ज्या पहिल्या 3 अंकांवर डेटा अवलंबून असतो, ते कोलिजन इंड्युस्ड डिसोसिएशन (CID) आहेत].
GROMACS (52) सॉफ्टवेअर आणि MARTINI 2 फोर्स फील्ड (53-55) वापरून एमडी सिम्युलेशन केले गेले. त्यानंतर डायओलिओइलफॉस्फॅटिडिलकोलीन (DOPC) आणि Cer C18 किंवा DOPC आणि Cer C26 असलेले बायलेअर तयार करण्यासाठी CHARMM GUI मेंब्रेन बिल्डर (56, 57) वापरण्यात आले. स्फिंगोसीन टेलमधून अतिरिक्त बीड्स काढून टाकून DXCE मधून Cer C26 ची टोपोलॉजी आणि कोऑर्डिनेट्स मिळवले जातात. डबल लेयर संतुलित करण्यासाठी आणि ते चालवण्यासाठी खाली वर्णन केलेल्या प्रक्रियेचा वापर करा, त्यानंतर Emp24 असलेली प्रणाली तयार करण्यासाठी सिस्टमच्या शेवटच्या कोऑर्डिनेट्सचा वापर करा. यीस्ट Emp24 चा ट्रान्समेम्ब्रेन डोमेन (अवशेष 173 ते 193) व्हिज्युअल एमडी (VMD) टूल मॉलिक्युलर स्ट्रक्चर (58) वापरून α-हेलिक्स म्हणून तयार करण्यात आला. त्यानंतर, ओव्हरलॅपिंग लिपिड्स काढून टाकल्यानंतर, CHARMM GUI वापरून प्रोटीनचे जाडसर कण बनवून ते बायलेअरमध्ये समाविष्ट केले गेले. अंतिम प्रणालीमध्ये 1202 DOPC आणि 302 Cer C26 किंवा 1197 DOPC आणि 295 Cer C18 आणि Emp24 यांचा समावेश आहे. प्रणालीला 0.150M सांद्रतेपर्यंत आयनीकृत करा. दोन बायलेअर रचनांसाठी चार स्वतंत्र प्रतिकृती तयार करण्यात आल्या.
लिपिड बायलेअरला CHARMM GUI प्रक्रियेचा वापर करून संतुलित केले जाते, ज्यामध्ये ४,०५,००० स्टेप्स मिनिमाइज करून नंतर संतुलित केले जातात. यामध्ये पोझिशन कन्स्ट्रेंट्स हळूहळू कमी करून काढून टाकले जातात आणि टाइम स्टेप ०.००५ ps वरून ०.०२ ps पर्यंत वाढवला जातो. इक्विलिब्रेशननंतर, ते ०.०२ ps च्या टाइम स्टेपसह ६ µs निर्माण करते. Emp24 इन्सर्ट केल्यानंतर, सिस्टीम मिनिमाइज आणि बॅलन्स करण्यासाठी त्याच CHARMM GUI प्रक्रियेचा वापर करा आणि नंतर प्रोडक्शनमध्ये ८ सेकंदांसाठी चालवा.
सर्व प्रणालींसाठी, संतुलन प्रक्रियेदरम्यान, दाब बेरेंडसेन बॅरोस्टॅट (59) द्वारे नियंत्रित केला जातो आणि उत्पादन प्रक्रियेदरम्यान, दाब पॅरिनेलो-रहमान बॅरोस्टॅट (60) द्वारे नियंत्रित केला जातो. सर्व प्रकरणांमध्ये, सरासरी दाब 1 बार असतो आणि एक सेमी-आयसोट्रॉपिक प्रेशर कपलिंग योजना वापरली जाते. संतुलन आणि उत्पादन प्रक्रियेमध्ये, अनुक्रमे प्रथिने, लिपिड आणि सॉल्व्हेंट कणांचे तापमान जोडण्यासाठी वेग पुनर्मापनासह थर्मोस्टॅट (61) वापरला जातो. संपूर्ण ऑपरेशन दरम्यान, लक्ष्य तापमान 310K असते. 0.005 बफर टॉलरन्ससह वर्लेट योजनेचा वापर करून पेअरिंग लिस्ट तयार करून नॉन-बॉन्डिंग इंटरॅक्शनची गणना केली जाते. कूलॉम्ब टर्मची गणना रिॲक्शन फील्ड आणि 1.1 nm च्या कट-ऑफ अंतराचा वापर करून केली जाते. वँडर वाल्स टर्म 1.1 nm च्या कट-ऑफ अंतरासह कट-ऑफ योजना वापरते आणि पोटेन्शियल ड्रिफ्टसाठी (62) वर्लेट कट-ऑफ योजना वापरली जाते.
VMD वापरून, DOPC फॉस्फेट बीड्स किंवा सेरामाइड AM1 बीड्स आणि प्रथिन यांच्यातील कटऑफ तरंगलांबी 0.7 nm आहे, आणि प्रथिनाशी आंतरक्रिया करणाऱ्या लिपिड्सची संख्या मोजली जाते. खालील सूत्रानुसार, (63) मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे डिप्लेशन-एनरिचमेंट (DE) फॅक्टरची गणना करा: DE फॅक्टर = (प्रथिनातील एकूण लिपिड्सचे प्रमाण 0.7) / (एकूण लिपिड्समधील Cer चे प्रमाण)
नोंदवलेले मूल्य सरासरी म्हणून मिळवले जाते आणि एरर बार हे SE च्या चार स्वतंत्र प्रती आहेत. DE घटकाची सांख्यिकीय सार्थकता टी-टेस्टद्वारे [(सरासरी-DE-घटक-1)/SE] मोजली जाते. एक-पुच्छ वितरणावरून P मूल्य काढा.
ट्रेसच्या शेवटच्या २५० नॅनोसेकंदांमधील Emp24 असलेल्या प्रणालीचा २डी पार्श्व घनता नकाशा मोजण्यासाठी GROMACS टूलचा वापर करण्यात आला. सेरामाइडचा संवर्धन/क्षीणता नकाशा मिळवण्यासाठी, Cer च्या घनता नकाशाला Cer आणि DOPC च्या नकाशांच्या बेरजेने भागले जाते, आणि नंतर शरीरातील Cer च्या सांद्रतेने भागले जाते. यासाठी समान कलर मॅप स्केल वापरला जातो.
या लेखासाठीच्या पूरक सामग्रीकरिता, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 येथे पहा.
हा एक मुक्त प्रवेश लेख आहे जो क्रिएटिव्ह कॉमन्स ॲट्रिब्युशन-नॉन-कमर्शियल लायसन्सच्या अटींनुसार वितरित केला जातो, जो कोणत्याही माध्यमात वापर, वितरण आणि पुनरुत्पादनास परवानगी देतो, जोपर्यंत अंतिम वापर व्यावसायिक फायद्यासाठी नाही आणि मूळ काम अचूक आहे हे गृहीत धरले जाते. संदर्भ.
टीप: आम्ही तुम्हाला तुमचा ईमेल पत्ता देण्यास फक्त यासाठी सांगतो, जेणेकरून तुम्ही ज्या व्यक्तीची या पेजवर शिफारस कराल, त्या व्यक्तीला हे कळावे की तुम्ही त्यांना हा ईमेल दाखवू इच्छिता आणि तो स्पॅम नाही. आम्ही कोणताही ईमेल पत्ता नोंदवून घेणार नाही.
तुम्ही अभ्यागत आहात की नाही हे तपासण्यासाठी आणि स्वयंचलित स्पॅम सबमिशन रोखण्यासाठी या प्रश्नाचा वापर केला जातो.
सोफिया रॉड्रिग्ज-गॅलार्डो, काझुओ कुरोकावा, सुसाना सबीडो-बोझो, अलेजांद्रो कॉर्टेझ · गोमेझ (अलेजांद्रो कॉर्टेस-गोमेझ), अत्सुको इकेडा (अत्सुको इकेडा), व्हॅलेरिया झोनी (व्हॅलेरिया झोनी), ऑक्सिलिएडोरा अगुइलेरा-रोमेरो, अनालोजी पेरोजी, ॲनालोगिरो, ॲना झोनी लोपेझ), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकिरा, स्टेफानो फॅनी, अकिहिको नाकानो, मॅन्युएल मुनिझ
3D उच्च-रिझोल्यूशन रिअल-टाइम इमेजिंगद्वारे निवडक आउटपुट साइट्समध्ये प्रथिने वर्गीकरणासाठी सेरामाइड साखळीच्या लांबीचे महत्त्व उघड होते.
सोफिया रॉड्रिग्ज-गॅलार्डो, काझुओ कुरोकावा, सुसाना सबीडो-बोझो, अलेजांद्रो कॉर्टेझ · गोमेझ (अलेजांद्रो कॉर्टेस-गोमेझ), अत्सुको इकेडा (अत्सुको इकेडा), व्हॅलेरिया झोनी (व्हॅलेरिया झोनी), ऑक्सिलिएडोरा अगुइलेरा-रोमेरो, अनालोजी पेरोजी, ॲनालोगिरो, ॲना झोनी लोपेझ), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकिरा, स्टेफानो फॅनी, अकिहिको नाकानो, मॅन्युएल मुनिझ
3D उच्च-रिझोल्यूशन रिअल-टाइम इमेजिंगद्वारे निवडक आउटपुट साइट्समध्ये प्रथिने वर्गीकरणासाठी सेरामाइड साखळीच्या लांबीचे महत्त्व उघड होते.
©2020 अमेरिकन असोसिएशन फॉर द ॲडव्हान्समेंट ऑफ सायन्स. सर्व हक्क राखीव. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef आणि COUNTER चे भागीदार आहे. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.