पेशींच्या विभाजनीकरण आणि होमिओस्टॅसिस राखण्यासाठी सेक्रेटरी मार्गात प्रथिने वर्गीकरण करणे आवश्यक आहे. शेल-मध्यस्थ वर्गीकरणाव्यतिरिक्त, सेक्रेटरी वाहतुकीच्या प्रक्रियेत किनेसिन वर्गीकरणात लिपिड्सची भूमिका हा एक दीर्घकाळापासूनचा मूलभूत प्रश्न आहे ज्याचे उत्तर अद्याप मिळालेले नाही. येथे, आम्ही 3D एकाचवेळी मल्टीकलर हाय-रिझोल्यूशन रिअल-टाइम इमेजिंग करतो जेणेकरून हे सिद्ध होईल की खूप लांब सेरामाइड लिपिड मोएटीजसह नवीन संश्लेषित ग्लायकोसिलफॉस्फेटिडायलिनॉसिटॉल-इमोबिलाइज्ड प्रथिने क्लस्टर केली जातात आणि विशेष एंडोप्लाझममध्ये वर्गीकृत केली जातात. नेट एक्झिट साइट, जी ट्रान्समेम्ब्रेन प्रथिनांद्वारे वापरल्या जाणाऱ्यापेक्षा वेगळी आहे. याव्यतिरिक्त, आम्ही दाखवतो की एंडोप्लाझमिक रेटिक्युलम मेम्ब्रेनमधील सेरामाइडची साखळी लांबी या सॉर्टिंग निवडीसाठी महत्त्वपूर्ण आहे. आमचा अभ्यास लिपिड साखळी लांबीवर आधारित प्रोटीन कार्गोचे सेक्रेटरी मार्गातील निवडक निर्यात साइटमध्ये वर्गीकरण करण्यासाठी पहिला थेट इन व्हिव्हो पुरावा प्रदान करतो.
युकेरियोटिक पेशींमध्ये, एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम (ER) मध्ये संश्लेषित केलेले प्रथिने नंतर त्यांच्या योग्य सेल्युलर डेस्टिनेशन (1) पर्यंत पोहोचवण्यासाठी स्राव मार्गाद्वारे वाहतुकीदरम्यान क्रमवारी लावले जातात. कोट-मध्यस्थ वर्गीकरणाव्यतिरिक्त, असे बरेच दिवस अनुमान लावले जात होते की काही लिपिड विशिष्ट प्रथिनांच्या विशिष्ट पडदा डोमेनमध्ये क्लस्टर करून निवडक निर्गमन बिंदू म्हणून देखील काम करू शकतात (2-5). तथापि, ही संभाव्य लिपिड-आधारित यंत्रणा सिद्ध करण्यासाठी थेट इन व्हिव्हो पुराव्याचा अभाव आहे. या मूलभूत समस्येचे निराकरण करण्यासाठी, आम्ही यीस्टमध्ये अभ्यास केला की ग्लायकोसिलफॉस्फेटिडायलिनॉसिटॉल (GPI-APs) ER मधून वेगळ्या पद्धतीने कसे निर्यात केले जातात. GPI-APs हे लिपिड-कनेक्टेड सेल पृष्ठभाग प्रथिने आहेत (6, 7). GPI-AP हे ग्लायकोलिपिड मोइटी (GPI अँकर) द्वारे प्लाझ्मा झिल्लीच्या बाह्य पत्रकांशी जोडलेले एक स्रावित प्रथिने आहे. ते ER लुमेनमध्ये रूढीवादी पोस्ट-ट्रान्सलेशनल बदल म्हणून GPI अँकर स्वीकारतात (8). जोडणीनंतर, GPI-AP हे Golgi उपकरणातून (5, 9) ER पासून प्लाझ्मा झिल्लीपर्यंत जाते. GPI अँकरच्या उपस्थितीमुळे GPI-AP हे ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रथिनांपासून (इतर प्लाझ्मा झिल्ली प्रथिनांसह) स्रावित मार्गाने वेगळे वाहून नेले जाते (5, 9, 10). यीस्ट पेशींमध्ये, GPI-AP हे एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलममधील इतर स्रावित प्रथिनांपासून वेगळे केले जातात आणि नंतर कोट प्रोटीन कॉम्प्लेक्स II (COPII) (6, 7) द्वारे गुंडाळलेल्या अद्वितीय वेसिकल्समध्ये पॅक केले जातात. ER निर्यात प्रक्रियेत या वर्गीकरण प्रक्रियेचे निर्धारक अस्पष्ट आहेत, परंतु असा अंदाज आहे की या यंत्रणेसाठी लिपिड्सची आवश्यकता असू शकते, विशेषतः GPI अँकरच्या लिपिड भागाचे स्ट्रक्चरल रीमॉडेलिंग (5, 8). यीस्टमध्ये, GPI लिपिड रीमॉडेलिंग GPI जोडल्यानंतर लगेचच सुरू होते आणि बर्‍याच प्रकरणांमध्ये, ते सिरामाइडला 26-कार्बन लाँग-चेन सॅच्युरेटेड फॅटी अॅसिड (C26:0) (11, 12) ला बांधण्यास कारणीभूत ठरते. C26 सिरामाइड हे आतापर्यंत यीस्ट पेशींद्वारे उत्पादित केलेले मुख्य सिरामाइड आहे. ते ER मध्ये संश्लेषित केले जाते आणि त्यातील बहुतेक COPII वेसिकल्स (13) द्वारे गोल्गी उपकरणात निर्यात केले जाते. GPI-AP च्या ER निर्यातीसाठी विशेषतः सतत सिरामाइड संश्लेषण आवश्यक असते (14, 15), आणि त्या बदल्यात, गोल्गी उपकरणात सिरामाइडचे इनोसिटॉल फॉस्फेट सिरामाइड (IPC) मध्ये रूपांतर GPI अँकर संश्लेषणावर अवलंबून असते (16). कृत्रिम पडद्यासह बायोफिजिकल अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की खूप लांब अ‍ॅसिल चेन सिरामाइड अद्वितीय भौतिक गुणधर्मांसह क्रमबद्ध डोमेन तयार करण्यासाठी एकत्र येऊ शकतात (17, 18). या डेटामुळे असे गृहीतक निर्माण होते की C26 सिरामाइड आणि GPI-AP C26 सिरामाइडसह तुलनेने गोंधळलेल्या ER झिल्ली लिपिड वातावरणात सुव्यवस्थित प्रदेशांमध्ये किंवा प्रदेशांमध्ये एकत्र येण्यासाठी त्यांच्या भौतिक गुणधर्मांचा वापर करतात. ते प्रामुख्याने लहान आणि असंतृप्त ग्लिसरोलिपिड्स (C16:1 आणि C18:1) (19, 20) पासून बनलेले आहे. हे प्रदेश निवडकपणे विशिष्ट ER एक्झिट साइट्स (ERES) वर केंद्रित केले जातील, जिथे सिरामाइड आणि सिरामाइड-आधारित GPI-AP एकाच समर्पित COPII वेसिकलमध्ये गोल्गीमध्ये सह-वाहतूक केले जाऊ शकतात (5).
या अभ्यासात, आम्ही सुपर-रिझोल्यूशन कॉन्फोकल रिअल-टाइम इमेजिंग मायक्रोस्कोपी (SCLIM) वापरून या लिपिड-आधारित यंत्रणेची थेट चाचणी केली आहे, जी एक अत्याधुनिक मायक्रोस्कोपी तंत्र आहे जी एकाच वेळी फ्लोरोसेंटली लेबल केलेल्या प्रथिनांचे निरीक्षण करू शकते. तीन-रंगी आणि त्रि-आयामी (3D) प्रतिमांमध्ये जिवंत पेशींमध्ये अत्यंत उच्च रिझोल्यूशन आणि गती असते (21, 22).
S. cerevisiae मध्ये ER सोडल्यानंतर ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रथिनांपासून C26 सिरामाइड गटासह सामान्य GPI-AP कसे तपासले गेले हे अधिक स्पष्ट करण्यासाठी आम्ही प्रथम SCLIM तंत्रज्ञानाचा वापर केला. ER चे वर्गीकरण तपासण्यासाठी, आम्ही एक अनुवांशिक प्रणाली वापरली जी ERES मध्ये प्रवेश करणाऱ्या नवीन संश्लेषित कार्गोची थेट कल्पना करू शकते (7, 23). कार्गो म्हणून, आम्ही हिरव्या फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) सह लेबल केलेले C26 सिरामाइड-आधारित GPI-AP Gas1 आणि जवळ-इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (iRFP) सह लेबल केलेले ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन Mid2 निवडले, जे दोन्ही प्लाझ्मा झिल्लीला लक्ष्य करतात (24-26). sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तनात, हे दोन कार्गो गॅलेक्टोज-इंड्युसिबल प्रमोटर आणि घटक ERES मार्कर अंतर्गत व्यक्त केले जातात. अत्यंत तापमानात (37°C), कारण sec31-1 उत्परिवर्तन COPII कोट घटक Sec31 च्या कार्यावर परिणाम करते जेणेकरून COPII उगवण आणि ER निर्यात रोखता येईल, नवीन संश्लेषित कार्गो ER (23) वर जमा होतो. कमी तापमानात (२४°C) थंड झाल्यानंतर, sec31-1 उत्परिवर्ती पेशी स्रावी क्षेत्रातून परत आल्या आणि जमा झालेले नवीन कृत्रिम कार्गो ER मधून निर्यात करण्यास सुरुवात झाली. CLIM व्हिज्युअलायझेशनमध्ये असे दिसून आले की बहुतेक नवीन संश्लेषित Gas1-GFP आणि Mid2-iRFP अजूनही sec31-1 उत्परिवर्ती पेशींच्या ER मध्ये ३७°C वर उष्मायनानंतर आणि नंतर २४°C वर ५ मिनिटांसाठी सोडल्यानंतर देखील जमा होतात (आकृती १). Mid2-iRFP संपूर्ण ER पडद्यावर वितरित केले जात असल्याने आणि Gas1-GFP हे एकाग्र आणि विरहित ER पडद्याच्या क्षेत्रात एकत्रित केले जात असल्याने, त्यांचे वितरण पूर्णपणे वेगळे आहे (आकृती १, A ते C आणि चित्रपट S1). याव्यतिरिक्त, आकृती १D मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, Gas1-GFP क्लस्टरमध्ये Mid2-iRFP नाही. हे परिणाम सूचित करतात की GPI-AP आणि ट्रान्समेम्ब्रेन प्रथिने लवकर वेगवेगळ्या ER पडदा क्षेत्रांमध्ये विभक्त केली गेली होती. Gas1-GFP क्लस्टर mCherry च्या COPII कोट प्रोटीन Sec13 (आकृती 1, E आणि F, आणि चित्रपट S1) (23) सह लेबल केलेल्या विशिष्ट ERES ला लागून आहे.
sec31-1 पेशी गॅलेक्टोज-प्रेरित स्राव, एक लांब अ‍ॅसिल साखळी (C26) सिरामाइड GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, हिरवा) आणि ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीन Mid2-iRFP (TMP, निळा) व्यक्त करतात आणि हे रचनात्मक ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, मॅजेन्टा) 30 मिनिटांसाठी 37°C वर उष्मायन केले गेले, 24°C वर हलवले गेले आणि 5 मिनिटांनंतर SCLIM द्वारे प्रतिमा काढली गेली. (A ते C) एका समतल (A) ची एक प्रातिनिधिक विलीन किंवा एकल 2D प्रतिमा, 10 z-विभाग (B) ची 2D प्रोजेक्शन प्रतिमा किंवा कार्गो आणि ERES मार्कर (C) ची 3D सेल गोलार्ध प्रतिमा दर्शविते. स्केल बार 1μm (A आणि B). स्केल युनिट 0.551μm (C) आहे. Gas1-GFP स्वतंत्र ER क्षेत्रांमध्ये किंवा क्लस्टर्समध्ये आढळले आणि वितरित केले गेले. (ड) आलेख पांढऱ्या बाण रेषेसह (डावीकडे) Gas1-GFP क्लस्टरमध्ये Gas1-GFP आणि Mid2-iRFP ची सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता दर्शवितो. AU, अनियंत्रित एकक. (E आणि F) वस्तू आणि ERES चिन्ह एकत्रित करणारी 3D प्रतिमा दर्शविते. विशिष्ट ERES जवळ Gas1-GFP क्लस्टर आढळले. स्केल युनिट 0.551μm आहे. (F) पांढरा घन बाण ERES शी संबंधित Gas1-GFP क्लस्टर चिन्हांकित करतो. मधले आणि उजवे पॅनेल एकत्रित वाढवलेले 3D प्रतिमा आणि निवडलेल्या Gas1-GFP क्लस्टरचे फिरवलेले दृश्य दर्शवितात.
Gas1-GFP क्लस्टर आणि विशिष्ट ERES मधील जवळचा स्थानिक संबंध दर्शवितो की Gas1-GFP निवडक ERES मध्ये प्रवेश करू शकतो, जो ER सोडण्यासाठी Mid2-iRFP द्वारे वापरल्या जाणाऱ्या निवडकतेपेक्षा वेगळा आहे. या शक्यतेला संबोधित करण्यासाठी, आम्ही फक्त एक किंवा दोन वस्तूंसाठी ERES गुणोत्तर मोजले (आकृती 2, A ते C). आम्हाला आढळले की बहुतेक ERES (70%) मध्ये फक्त एक प्रकारचा माल असतो. आकृती 2C ची खालची प्रतिमा फक्त Gas1-GFP (आकृती 1) किंवा फक्त Mid2-iRFP (आकृती 2) असलेल्या ERES ची दोन सामान्य उदाहरणे दर्शविते. याउलट, अंदाजे 20% ERES मध्ये दोन कार्गो असतात जे एकाच क्षेत्रात ओव्हरलॅप होतात. असे आढळून आले की काही ERES (10%) मध्ये दोन प्रकारचे कार्गो होते, परंतु ते स्पष्टपणे वेगवेगळ्या भागात वेगळे केले गेले होते. म्हणून, हे सांख्यिकीय विश्लेषण दर्शविते की ER निर्यात केल्यानंतर, GPI-AP Gas1-GFP आणि ट्रान्समेम्ब्रेन कार्गो Mid2-iRFP वेगवेगळ्या ERES मध्ये विभागले जातात (आकृती 2D). ही वर्गीकरण कार्यक्षमता मागील जैवरासायनिक विश्लेषण (6) आणि आकारिकीय निर्धारण (7) शी अगदी सुसंगत आहे. आपण ERES मध्ये प्रवेश करणाऱ्या क्वारंटाईन कार्गोचे वर्तन देखील पाहू शकतो (आकृती 2E आणि चित्रपट S2). आकृती 2E दर्शविते की Gas1-GFP (पॅनेल 3) किंवा Mid2-iRFP (पॅनेल 4) चा फक्त एक छोटासा भाग एका बाजूने ERES मध्ये प्रवेश करतो आणि एका स्वतंत्र क्षेत्रात बंदिस्त असतो. आकृती 2E च्या पॅनेल 5 मध्ये दर्शविले आहे की Gas1-GFP आणि Mid2-iRFP कधीकधी एकाच ERES मध्ये आढळतात, परंतु ते वेगवेगळ्या बाजूंनी प्रवेश करतात आणि वेगवेगळ्या COPII वेसिकल्सचे प्रतिनिधित्व करू शकणाऱ्या वेगवेगळ्या प्रदेशांमध्ये केंद्रित असतात. आम्ही असेही पुष्टी केली की C26 सिरामाइड-आधारित GPI-AP Gas1 चे निवडक ERES म्हणून निरीक्षण केलेले पृथक्करण आणि वर्गीकरण विशिष्ट आहे कारण दुसरा ट्रान्समेम्ब्रेन स्राव कार्गो, GFP-टॅग केलेले प्लाझ्मा मेम्ब्रेन प्रोटीन Axl2 (27), Mid2-iRFP सारखेच वर्तन दर्शवित आहे. (चित्र S1 आणि चित्रपट S3). नवीन संश्लेषित Axl2-GFP हे Mid2-iRFP (आकृती S1, A आणि B) सारख्या ER पडद्याद्वारे वितरित केले जाते आणि बहुतेक ERES मध्ये Mid2-iRFP सोबत सह-स्थानिकीकरण केले जाते (आकृती S1, B ते D). आकृती 1 चे पॅनेल 1 आणि 2. S1C ERES ची दोन विशिष्ट उदाहरणे दर्शविते जिथे दोन ट्रान्समेम्ब्रेन कार्गो ओव्हरलॅप होतात. या प्रकरणांमध्ये, दोन्ही वस्तू ERES मध्ये एकत्र प्रवेश करतात (आकृती S1E, पॅनेल 3 आणि मूव्ही S3).
गॅलेक्टोज इनड्युसिबल स्राव व्यक्त करणारे sec31-1 पेशी, Gas1-GFP (GPI-AP, हिरवा) आणि Mid2-iRFP (TMP, निळा) आणि Sec13-mCherry (ERES, मॅजेन्टा) लेबलिंग असलेले घटक ERES 37 वर ठेवण्यात आले. °C वर 30 मिनिटे उष्मायन केल्यानंतर, स्राव ब्लॉक सोडण्यासाठी 24 °C वर हलवा आणि 20 मिनिटांनंतर SCLIM सह प्रतिमा तयार करा. (A ते C) कार्गोच्या प्रतिनिधी 2D प्रोजेक्शन प्रतिमा (A; स्केल बार, 1μm) किंवा 3D सेल गोलार्ध प्रतिमा (B आणि C; स्केल युनिट, 0.456μm) आणि ERES द्वारे चिन्हांकित 10 z-विभाग. (B) मधील खालचा पॅनेल आणि (C) मधील पॅनेल फक्त ERES (मॅजेन्टा) [Gas1-GFP (राखाडी) आणि Mid2-iRFP (हलका निळा)] मध्ये उपस्थित असलेल्या वस्तू प्रदर्शित करण्यासाठी प्रक्रिया केलेल्या प्रतिमा प्रदर्शित करतात. (C) उघडा बाण: ERES मध्ये फक्त एकच माल वाहून नेला जातो (1 ते 4). राखाडी बाण: ERES मध्ये वेगळे केलेले कार्गो असतात (5). पांढरा घन बाण: सह-स्थित कार्गो असलेले ERES. खाली: निवडलेल्या एका ERES मध्ये फक्त Gas1-GFP (1) किंवा Mid2-iRFP (2) आहे. स्केल बार, 100 nm. (D) (C) मध्ये वर्णन केलेल्या फोटोमायक्रोग्राफचे परिमाण. फक्त एकच कार्गो (Gas1-GFP किंवा Mid2-iRFP), वेगळे केलेले कार्गो आणि ओव्हरलॅपिंग कार्गो असलेल्या ERES ची सरासरी टक्केवारी. तीन स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये, 54 पेशींमध्ये n=432. त्रुटी बार = SD. दोन-पुच्छ नसलेला t चाचणी. *** P = 0.0002. (E) (C) ने चिन्हांकित केलेल्या क्वारंटाइन केलेल्या कार्गोच्या निवडलेल्या ERES ची 3D प्रतिमा. Gas1-GFP (हिरवा) (3) किंवा Mid2-iRFP (निळा) (4) एका बाजूने ERES (मॅजेन्टा) मध्ये प्रवेश करते आणि ERES मधील एका लहान क्षेत्रापर्यंत मर्यादित असते. कधीकधी, दोन्ही प्रकारचे माल एकाच बाजूने एकाच ERES (5) मध्ये प्रवेश करतात आणि ERES मधील एका वेगळ्या क्षेत्रात मर्यादित असतात. स्केल बार, १०० एनएम.
पुढे, आम्ही एका गृहीतकाची चाचणी केली की ER पडद्यामध्ये असलेले लांब अ‍ॅसिल चेन सेरामाइड (C26) हे Gas1 चे विशिष्ट क्लस्टरिंग आणि सॉर्टिंग निवडक ERES मध्ये चालवते. यासाठी, आम्ही सुधारित यीस्ट स्ट्रेन GhLag1 वापरला, ज्यामध्ये Lag1 आणि Lac1 चे दोन अंतर्जात सेरामाइड संश्लेषण GhLag1 (कापसाचे Lag1 होमोलॉग) ने बदलले, ज्यामुळे यीस्ट स्ट्रेनमध्ये वाइल्ड प्रकारापेक्षा लहान असलेल्या सेल मेम्ब्रेन सेरामाइड स्ट्रेनचा समावेश झाला (आकृती 3A) (28). मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) विश्लेषणातून असे दिसून आले की वाइल्ड-प्रकारच्या स्ट्रेनमध्ये, एकूण सेरामाइडपैकी 95% खूप लांब (C26) चेन सेरामाइड आहे, तर GhLag1 मध्ये, 85% सेरामाइड खूप लांब (C18 आणि C16) आहे. ), फक्त 2% सेरामाइड खूप लांब (C26) चेन सेरामाइड आहे. जरी आतापर्यंत GhLag1 मेम्ब्रेनमध्ये आढळलेले C18 आणि C16 सेरामाइड हे मुख्य सेरामाइड आहेत, तरीही MS विश्लेषणाने असेही पुष्टी केली आहे की GhLag1 स्ट्रेनमध्ये व्यक्त केलेल्या Gas1-GFP च्या GPI अँकरमध्ये C26 सेरामाइड आहे, जे वाइल्ड-टाइप लिपिड्सशी तुलना करता येते. गुणवत्ता समान आहे (आकृती 3A) (26). म्हणून, याचा अर्थ असा की सेरामाइड रीमॉडेलिंग एन्झाइम Cwh43 हे C26 सेरामाइडसाठी अत्यंत निवडक आहे, जसे की आकृती 26 मध्ये दर्शविले आहे, ते प्राधान्याने GhLag1 स्ट्रेनमधील C26 सेरामाइडच्या थोड्या प्रमाणात GPI अँकर समाविष्ट करते. S2 (29). तरीही, GhLag1 च्या सेल झिल्लीमध्ये मुळात फक्त C18-C16 सेरामाइड असते, तर Gas1-GFP मध्ये अजूनही C26 सेरामाइड असते. ही वस्तुस्थिती ER मध्ये मेम्ब्रेन सेरामाइडच्या अ‍ॅसिल चेन लांबीची समस्या विशेषतः सोडवण्यासाठी या स्ट्रेनला एक आदर्श साधन बनवते. वर्गीकरण आणि वर्गीकरणाची काल्पनिक भूमिका. त्यानंतर, आम्ही प्रथम पारंपारिक फ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोपीद्वारे sec31-1 च्या तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्ती अ‍ॅलीलसह GhLag1 मधील क्लस्टर्समध्ये C26 Gas1-GFP जमा होण्याची क्षमता अभ्यासली, जिथे फक्त लांब (C18-C16) साखळी ER पडदा सेरामाइडमध्ये अस्तित्वात आहे (आकृती 3). आम्ही पाहिले की sec31-1 मध्ये, बहुतेक Gas1-GFP क्लस्टर्समध्ये केंद्रित होते, तर sec31-1 GhLag1 मधील लांब (C18-C16) लांब सिरामाइड ER पडदा असलेल्या Gas1-GFP प्रामुख्याने संपूर्ण ER पडद्यामध्ये क्लस्टर केलेले आणि वितरित केलेले नव्हते. अचूकपणे सांगायचे तर, C26 सिरामाइड-आधारित क्लस्टरिंग विशिष्ट ERES शी जवळून संबंधित असल्याने (आकृती 1), आम्ही पुढे तपासले की ही प्रक्रिया ER निर्यात प्रथिने यंत्रणेचे कार्य देखील समाविष्ट करू शकते का. GPI-AP ER निर्यातीसाठी एक विशेष COPII प्रणाली वापरते, जी GPI अँकरच्या ग्लायकन भागाच्या Ted1 च्या स्ट्रक्चरल रीमॉडेलिंगद्वारे सक्रियपणे नियंत्रित केली जाते (30, 31). त्यानंतर ट्रान्समेम्ब्रेन कार्गो रिसेप्टर p24 कॉम्प्लेक्सद्वारे रीकॉम्बीनंट GPI-ग्लायकन ओळखले जाते, जे निवडकपणे Lst1 भरती करते, जे प्रमुख COPII कार्गो बाइंडिंग सबयुनिट Sec24 चे एक विशिष्ट आयसोफॉर्म आहे, ज्यामुळे GPI-AP-युक्त COPII व्हेसिकल्स आवश्यक असतात (31-33). म्हणून, आम्ही एक दुहेरी उत्परिवर्तन तयार केले ज्याने या एकल प्रथिनांचे (p24 कॉम्प्लेक्स घटक Emp24, GPI-ग्लायकन रीमॉडेलिंग एंजाइम Ted1 आणि विशिष्ट COPII सबयुनिट Lst1) डिलीशन sec31-1 उत्परिवर्तन स्ट्रेनसह एकत्रित केले आणि त्यांचा अभ्यास केला की Gas1-क्लस्टर GFP तयार करणे शक्य आहे का (आकृती 3). आम्ही निरीक्षण केले की sec31-1emp24Δ आणि sec31-1ted1Δ मध्ये, Gas1-GFP प्रामुख्याने अनक्लस्टर केलेले असते आणि संपूर्ण ER मेम्ब्रेनमध्ये वितरित केले जाते, जसे की पूर्वी sec31-1 GhLag1 मध्ये पाहिले होते, तर sec31-1lst1Δ मध्ये, Gas1-GFP sec31-1 सारखे. हे निकाल सूचित करतात की ER पडद्यामध्ये C26 सिरामाइडच्या उपस्थितीव्यतिरिक्त, Gas1-GFP च्या क्लस्टरिंगला p24 कॉम्प्लेक्सशी बांधणे देखील आवश्यक आहे आणि त्यासाठी विशिष्ट Lst1 भरतीची आवश्यकता नाही. त्यानंतर, आम्ही ER पडद्यामधील सिरामाइडची साखळी लांबी Gas1-GFP चे p24 ला बंधन नियंत्रित करू शकते याची शक्यता शोधली. तथापि, आम्हाला आढळले की पडद्यामध्ये C18-C16 सिरामाइडची उपस्थिती p24 कॉम्प्लेक्सद्वारे पुनर्निर्मित GPI-ग्लायकन्सवर (आकृती S3 आणि S4, A आणि B) किंवा GPI-AP ला बंधन आणि GPI-AP निर्यात करण्याच्या क्षमतेवर परिणाम करत नाही. भरती COPII उपप्रकार Lst1 (आकृती S4C). म्हणून, C26 सिरामाइड-आश्रित क्लस्टरिंगला वेगवेगळ्या ER निर्यात प्रथिने यंत्रणेसह प्रथिने परस्परसंवादाची आवश्यकता नाही, परंतु लिपिड लांबीद्वारे चालविल्या जाणाऱ्या पर्यायी सॉर्टिंग यंत्रणेला समर्थन देते. त्यानंतर, आम्ही विश्लेषण केले की ER पडद्यामधील सिरामाइड अ‍ॅसिल साखळी लांबी Gas1-GFP चे निवडक ERES म्हणून प्रभावी वर्गीकरण करण्यासाठी महत्त्वाची आहे का. शॉर्ट-चेन सिरामाइड असलेल्या GhLag1 स्ट्रेनमधील Gas1 ER सोडतो आणि प्लाझ्मा मेम्ब्रेनमध्ये प्रवेश करतो (आकृती S5), आमचा असा विश्वास आहे की जर सिरामाइड अ‍ॅसिल चेनच्या लांबीने सॉर्टिंग चालविले गेले तर GhLag1 स्ट्रेनमधील Gas1 पुनर्निर्देशित आणि ओलांडला जाऊ शकतो. त्याच मेम्ब्रेनसह ERES वस्तू.
(अ) GhLag1 च्या पेशी पडद्यामध्ये प्रामुख्याने लहान C18-C16 सिरामाइड असतात, तर Gas1-GFP च्या GPI अँकरमध्ये अजूनही वाइल्ड-टाइप पेशींइतकेच C26 IPC असते. वरील: मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) द्वारे वाइल्ड-टाइप (Wt) आणि GhLag1p स्ट्रेनच्या सेल पडद्यामध्ये सिरामाइडचे अ‍ॅसिल चेन लांबी विश्लेषण. डेटा एकूण सिरामाइडची टक्केवारी दर्शवितो. तीन स्वतंत्र प्रयोगांची सरासरी. एरर बार = SD. टू-टेल अनपेअर्ड टी चाचणी. **** P ＜0.0001. तळाशी पॅनेल: वाइल्ड-टाइप आणि GhLag1p स्ट्रेनमध्ये व्यक्त केलेल्या गॅस1-GFP (GPI-IPC) GPI अँकरमध्ये उपस्थित असलेल्या IPC च्या अ‍ॅसिल चेन लांबीचे MS विश्लेषण. डेटा एकूण IPC सिग्नलची टक्केवारी दर्शवितो. पाच स्वतंत्र प्रयोगांची सरासरी. एरर बार = SD. टू-टेल अनपेअर्ड टी चाचणी. ns, महत्त्वाचे नाही. P = 0.9134. (ब) गॅलेक्टोज-प्रेरित Gas1-GFP व्यक्त करणाऱ्या sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ आणि sec31-1lst1Δ पेशींचे फ्लोरोसेन्स मायक्रोग्राफ 30 मिनिटांसाठी 37°C वर इनक्युबेट केले गेले आणि 24°C नंतर नियमित फ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोपी करण्यासाठी खाली पाठवले गेले. पांढरा बाण: ER Gas1-GFP क्लस्टर. उघडा बाण: अनक्लस्टर्ड Gas1-GFP संपूर्ण ER पडद्यावर वितरित केला जातो, जो ER वैशिष्ट्यपूर्ण न्यूक्लियर रिंग स्टेनिंग दर्शवितो. स्केल बार, 5μm. (क) (ब) मध्ये वर्णन केलेल्या फोटोमायक्रोग्राफचे परिमाणीकरण. विरामचिन्हे असलेल्या Gas1-GFP रचना असलेल्या पेशींची सरासरी टक्केवारी. तीन स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये, n≥300 पेशी. त्रुटी बार = SD. दोन-पुच्छ अनपेअर t चाचणी. **** P ＜0.0001.
या समस्येचे थेट निराकरण करण्यासाठी, आम्ही sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्ती अ‍ॅलील (आकृती 4 आणि चित्रपट S4) वापरून GhLag1 मध्ये Gas1-GFP आणि Mid2-iRFP चे SCLIM व्हिज्युअलायझेशन केले. ER ला 37°C वर ठेवल्यानंतर आणि त्यानंतर 24°C वर सोडल्यानंतर, पारंपारिक सूक्ष्मदर्शकांनी पाहिल्याप्रमाणे, बहुतेक नवीन संश्लेषित Gas1-GFP संपूर्ण ER पडद्यात क्लस्टर आणि वितरित केले गेले नाही (आकृती 4, A आणि B). याव्यतिरिक्त, ERES च्या मोठ्या टक्केवारीत (67%) दोन प्रकारचे कार्गो समाविष्ट आहेत जे त्यात सह-स्थित आहेत (आकृती 4D). आकृती 4C चे पॅनेल 1 आणि 2 Gas1-GFP आणि Mid2-GFP ओव्हरलॅपिंगसह ERES ची दोन सामान्य उदाहरणे दर्शवितात. याव्यतिरिक्त, दोन्ही वस्तू एकाच ERES मध्ये भरती केल्या गेल्या (आकृती 4E, पॅनेल 3 आणि चित्रपट S4). म्हणून, आमचे निकाल सूचित करतात की ER पडद्यामधील सिरॅमाइड अ‍ॅसिल साखळीची लांबी ER प्रथिने एकत्रीकरण आणि वर्गीकरणाचा एक महत्त्वाचा निर्धारक आहे.
गॅलेक्टोज-प्रेरित स्राव व्यक्त करणारे Sec31-1 GhLag1 पेशी, Gas1-GFP (GPI-AP, हिरवा) आणि Mid2-iRFP (TMP, निळा) आणि घटक ERES-लेबल असलेले Sec13-mCherry (ERES, मॅजेन्टा) 37°C वर उष्मायन करतात. 30 मिनिटे सुरू ठेवा, स्राव सोडण्यासाठी 24°C पर्यंत खाली करा आणि 20 मिनिटांनंतर SCLIM सह प्रतिमा तयार करा. (A ते C) कार्गो आणि ERES द्वारे चिन्हांकित 10 z-विभागांच्या प्रतिनिधी 2D प्रोजेक्शन प्रतिमा (A; स्केल बार, 1μm) किंवा 3D सेल गोलार्ध प्रतिमा (B आणि C; स्केल युनिट, 0.45μm). (B) मधील खालचा पॅनेल आणि (C) मधील पॅनेल फक्त ERES (मॅजेन्टा) [Gas1-GFP (राखाडी) आणि Mid2-iRFP (हलका निळा)] मध्ये उपस्थित असलेल्या वस्तू प्रदर्शित करण्यासाठी प्रक्रिया केलेल्या प्रतिमा प्रदर्शित करतात. (C) पांढरा भरलेला बाण: ERES, वस्तू ओव्हरलॅप. उघडा बाण: ERES मध्ये फक्त एक आयटम आहे. खालचा पॅनल: निवडलेल्या ERES मध्ये (C) मध्ये चिन्हांकित केलेल्या ओव्हरलॅपिंग वस्तू (1 आणि 2) आहेत. स्केल बार, 100 nm. (D) (C) मध्ये वर्णन केलेल्या फोटोमायक्रोग्राफचे परिमाणीकरण. sec31-1 आणि sec31-1 GhLag1 युनिट्समध्ये, फक्त एक कार्गो (Gas1-GFP किंवा Mid2-iRFP) समाविष्ट आहे आणि वेगळ्या कार्गो आणि ओव्हरलॅपिंग कार्गोसाठी ERES ची सरासरी टक्केवारी. तीन स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये, 54 पेशींमध्ये n = 432 (sec31-1) आणि 47 पेशींमध्ये n = 430 (sec31-1 GhLag1). त्रुटी बार = SD. दोन-पुच्छ अनपेअर टी चाचणी. *** P = 0.0002 (sec31-1) आणि ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) (C) मध्ये चिन्हांकित केलेल्या ओव्हरलॅपिंग कार्गो (3) सह निवडलेल्या ERES ची 3D प्रतिमा. Gas1-GFP (हिरवा) आणि Mid2-iRFP (निळा) एकाच बाजूने ERES (मॅजेन्टा) कडे येतात आणि त्याच ERES प्रतिबंधित क्षेत्रात राहतात. स्केल बार, 100 nm.
या अभ्यासातून लिपिड-आधारित प्रथिने कार्गो स्राव मार्गातील निवडक निर्यात स्थळांमध्ये वर्गीकृत केल्याचे प्रत्यक्ष इन व्हिव्हो पुरावे मिळतात आणि वर्गीकरण निवडकतेसाठी अ‍ॅसिल साखळी लांबीचे महत्त्व उघड होते. SCLIM नावाच्या शक्तिशाली आणि अत्याधुनिक मायक्रोस्कोपी तंत्राचा वापर करून, आम्ही यीस्टमध्ये नवीन संश्लेषित Gas1-GFP (खूप लांब अ‍ॅसिल साखळी (C26) सिरामाइड लिपिड भागासह एक प्रमुख प्लाझ्मा मेम्ब्रेन GPI-AP) दाखवले. डिस्क्रिट ER मध्ये क्लस्टर केलेले प्रदेश विशिष्ट ERES शी संबंधित आहेत, तर ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रथिने संपूर्ण ER मेम्ब्रेनमध्ये वितरीत केली जातात (आकृती 1). याव्यतिरिक्त, हे दोन प्रकारचे माल वेगवेगळ्या ERES मध्ये निवडकपणे प्रवेश करतात (आकृती 2). झिल्लीमधील सेल्युलर सिरामाइडची अ‍ॅसिल साखळी लांबी C26 वरून C18-C16 पर्यंत कमी केली जाते, Gas1-GFP क्लस्टर डिस्क्रिट ER प्रदेशात विस्कळीत केला जातो आणि Gas1-GFP त्याच ERES द्वारे ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीनसह ER सोडण्यासाठी पुन्हा मार्गस्थ केला जातो (आकृती 3 आणि आकृती 3). 4).
जरी GPI-AP ER मधून बाहेर पडण्यासाठी एक विशेष प्रथिने यंत्रणा वापरत असले तरी, आम्हाला आढळले की C26 सिरामाइड-आश्रित पृथक्करण हे ERES स्पेशलायझेशन (आकृती S4 आणि S5) होऊ शकणार्‍या विभेदक प्रथिने परस्परसंवादांवर अवलंबून नाही. त्याऐवजी, आमचे निष्कर्ष लिपिड-आधारित प्रोटीन क्लस्टरिंग आणि त्यानंतर इतर कार्गो वगळण्याद्वारे चालविल्या जाणाऱ्या पर्यायी वर्गीकरण यंत्रणेला समर्थन देतात. आमचे निरीक्षण असे दर्शविते की विशिष्ट ERES शी संबंधित Gas1-GFP प्रदेश किंवा क्लस्टरमध्ये ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन Mid2-iRFP चा अभाव आहे, जे सूचित करते की C26 सिरामाइड-आश्रित GPI-AP क्लस्टर संबंधित ERES मध्ये त्यांचा प्रवेश सुलभ करेल आणि त्याच वेळी, ट्रान्समेम्ब्रेन वगळेल. स्राव या विशिष्ट ERES मध्ये प्रवेश करतात (आकृती 1 आणि 2). याउलट, ER झिल्लीमध्ये C18-C16 सिरामाइड्सची उपस्थिती GPI-AP ला प्रदेश किंवा क्लस्टर तयार करण्यास कारणीभूत ठरत नाही, म्हणून ते ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावित प्रथिनांना त्याच ERES मध्ये वगळत नाहीत किंवा बदलत नाहीत (आकृती 3 आणि 4). म्हणून, आम्ही असा प्रस्ताव मांडतो की C26 सिरॅमाइड विशिष्ट ERES शी जोडलेल्या प्रथिनांचे क्लस्टरिंग सुलभ करून पृथक्करण आणि वर्गीकरण वाढवते.
विशिष्ट ER क्षेत्रात C26 सिरामाइड-आधारित क्लस्टरिंग कसे साध्य करायचे? मेम्ब्रेन सिरामाइडच्या पार्श्वभागी वेगळे होण्याच्या प्रवृत्तीमुळे GPI-AP आणि C26 सिरामाइड लहान आणि असंतृप्त ग्लिसरोलिपिड्स असलेल्या ER झिल्लीच्या अधिक अनियमित लिपिड वातावरणात लहान आणि तात्काळ क्रमबद्ध लिपिड तयार करू शकतात. दर्जेदार क्लस्टर (17, 18). p24 कॉम्प्लेक्स (34) ला बांधल्यानंतर हे लहान तात्पुरते क्लस्टर मोठ्या, अधिक स्थिर क्लस्टरमध्ये जोडले जाऊ शकतात. याच्याशी सुसंगत, आम्ही दाखवून दिले की C26 Gas1-GFP ला मोठे दृश्यमान क्लस्टर तयार करण्यासाठी p24 कॉम्प्लेक्सशी संवाद साधण्याची आवश्यकता आहे (आकृती 3). p24 कॉम्प्लेक्स हा यीस्ट (35) मधील चार वेगवेगळ्या p24 ट्रान्समेम्ब्रेन प्रथिनांनी बनलेला एक विषमज्वर ऑलिगोमर आहे, जो मल्टीव्हॅलेंट बाइंडिंग प्रदान करतो, ज्यामुळे लहान GPI-AP क्लस्टरचे क्रॉस-लिंकिंग होऊ शकते, ज्यामुळे मोठे स्थिर क्लस्टर (34) तयार होतात. सस्तन प्राण्यांच्या ध्रुवीकृत उपकला पेशींमध्ये त्यांच्या गोल्गी वाहतुकीदरम्यान दाखवल्याप्रमाणे, GPI-APs च्या प्रथिन एक्टोडोमेन्समधील परस्परसंवाद देखील त्यांच्या एकत्रीकरणात योगदान देऊ शकतो (36). तथापि, जेव्हा C18-C16 सिरामाइड ER पडद्यामध्ये असते, तेव्हा p24 कॉम्प्लेक्स Gas1-GFP ला बांधला जातो, तेव्हा मोठे वेगळे क्लस्टर तयार होणार नाहीत. अंतर्निहित यंत्रणा लांब अ‍ॅसिल चेन सिरामाइडच्या विशिष्ट भौतिक आणि रासायनिक गुणधर्मांवर अवलंबून असू शकते. कृत्रिम पडद्यांच्या बायोफिजिकल अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की जरी लांब (C24) आणि लहान (C18-C16) अ‍ॅसिल चेन सिरामाइड दोन्ही फेज वेगळे करू शकतात, परंतु फक्त लांब अ‍ॅसिल चेन सिरामाइड्स (C24) फिल्मला आकार देण्यासाठी उच्च वक्रता आणि फिल्म बेंडिंगला प्रोत्साहन देऊ शकतात. परस्पर संदर्भाद्वारे (17, 37, 38). असे दिसून आले आहे की TMED2 चे ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्स, Emp24 चे मानवी समरूप, सायटोप्लाज्मिक लोब्यूल्समध्ये C18 सिरामाइड-आधारित स्फिंगोमायलिनशी निवडकपणे संवाद साधते (39). आण्विक गतिशीलता (MD) सिम्युलेशन वापरून, आम्हाला आढळले की C18 आणि C26 दोन्ही सिरामाइड्स Emp24 ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्सच्या सायटोप्लाज्मिक लोब्यूल्सभोवती जमा होतात आणि त्यांच्या आवडी समान आहेत (आकृती S6). हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की हे सूचित करते की Emp24 चे ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्स पडद्यामध्ये लिपिड्सचे असममित वितरण करू शकते. हे सस्तन प्राण्यांच्या पेशींवर आधारित अलीकडील निकाल आहे. तत्सम MD सिम्युलेशनमध्ये इथर लिपिड्सची उपस्थिती देखील दर्शविली जाते (40). म्हणून, आम्ही असा अंदाज लावतो की ER26 च्या दोन लोब्यूल्समध्ये C26 सिरामाइड स्थानिक पातळीवर समृद्ध आहे. जेव्हा ल्युमिनल लोब्यूल्समधील GPI-AP थेट मल्टीव्हॅलेंट p24 शी बांधले जाते आणि सायटोप्लाज्मिक लोब्यूल्समध्ये p24 च्या आसपास C26 सिरामाइड जमा होते, तेव्हा ते बोटांद्वारे प्रोटीन एकत्रीकरण आणि पडदा वक्रता निर्माण करण्यास प्रोत्साहन देऊ शकते (41), ज्यामुळे GPI-AP ERES ला लागून असलेल्या स्वतंत्र प्रदेशांमध्ये वेगळे होते, जे ER पडद्याच्या अत्यंत वक्र प्रदेशांना देखील अनुकूल आहे (42). मागील अहवालांनी प्रस्तावित यंत्रणेला समर्थन दिले (43, 44). प्लाझ्मा पडद्यावरील सिरामाइड-आधारित ग्लायकोस्फिंगोलिपिड्स (GSL) ला ऑलिगोलेक्टिन, रोगजनक किंवा अँटीबॉडीजचे मल्टीव्हॅलेंट बंधन मोठ्या GSL एकत्रीकरणाला चालना देते, फेज वेगळेपणा वाढवते आणि पडदा विकृतीकरण आणि अंतर्गतीकरणास कारणीभूत ठरते (44). इवाबुची इत्यादी. (४३) असे आढळून आले की लांब (C24) परंतु लहान नसलेल्या (C16) अ‍ॅसिल साखळ्यांच्या उपस्थितीत, GSL लैक्टोसिलसेरामाइडशी बांधलेल्या मल्टीव्हॅलेंट लिगँडमुळे मोठे क्लस्टर्स आणि झिल्ली इनव्हॅगिनेशन तयार होते आणि पानांवरील सायटोप्लाझम लिन-मध्यस्थ सिग्नल ट्रान्सडक्शन जोडलेल्या न्यूट्रोफिल्समध्ये अ‍ॅसिल साखळ्यांद्वारे इंटरडिजिट केले जाते.
सस्तन प्राण्यांच्या ध्रुवीकृत उपकला पेशींमध्ये, अँटी-गोल्गी नेटवर्क (TGN) ची एपिकल प्लाझ्मा झिल्लीच्या पातळीपर्यंतची एकाग्रता GPI-AP चे पृथक्करण आणि वर्गीकरण नियंत्रित करते (10, 45). हे एकत्रीकरण GPI-AP ऑलिगोमेरायझेशन (36) द्वारे चालते, परंतु ते यीस्टमध्ये आढळणाऱ्या सिरामाइड साखळीच्या लांबीवर देखील अवलंबून असू शकते. सस्तन प्राण्यांच्या GPI-AP मध्ये इथर लिपिड-आधारित अँकर आहे आणि त्याची रासायनिक रचना खूप लांब अ‍ॅसिल साखळी सिरामाइडपेक्षा खूप वेगळी आहे, परंतु अलीकडील अभ्यासात असे आढळून आले आहे की दोन्ही लिपिडमध्ये उत्क्रांतीदृष्ट्या समान भौतिक आणि रासायनिक गुणधर्म आणि कार्य आहे (40). म्हणून, सस्तन प्राण्यांच्या पेशींमधील इथर लिपिड भाग यीस्टमधील C26 सिरामाइड सारखा असू शकतो आणि त्याची भूमिका GPI-AP एकत्रीकरण आणि वर्गीकरणाला प्रोत्साहन देण्यासाठी पडद्यामधील लाँग-चेन सिरामाइडशी जोडणे आहे. जरी ही शक्यता अद्याप थेट तपासण्याची आवश्यकता असली तरी, मागील निष्कर्ष असे समर्थन करतात की गोल्गी बॉडीमध्ये लांब अ‍ॅसिल चेन सिरामाइडचे वाहतूक सायटोप्लाज्मिक ट्रान्सफर प्रथिनांद्वारे केली जात नाही, तर यीस्टसारख्या GPI अँकरच्या संश्लेषणावर अवलंबून असते. म्हणून, उत्क्रांतीवादी रूढीवादी यंत्रणा एकाच वाहतूक वेसिकलमध्ये खूप लांब अ‍ॅसिल चेन सिरामाइड आणि GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) निवडकपणे सह-वाहतूक करण्यास सक्षम असल्याचे दिसते.
यीस्ट आणि सस्तन प्राण्यांच्या ध्रुवीकृत उपकला पेशी प्रणालींमध्ये, GPI-AP एकत्रीकरण आणि इतर प्लाझ्मा मेम्ब्रेन प्रथिनांपासून वेगळे होणे हे सर्व पेशींच्या पृष्ठभागावर पोहोचण्यापूर्वीच घडते. पॅलाडिनो आणि इतर (48) यांना आढळले की सस्तन प्राण्यांच्या ध्रुवीकृत उपकला पेशींच्या TGN वर, GPI-AP क्लस्टरिंग केवळ GPI-APs च्या एपिकल प्लाझ्मा मेम्ब्रेनच्या निवडक वर्गीकरणासाठी आवश्यक नाही तर GPI-APs च्या क्लस्टरिंग संघटनेचे आणि त्याच्या जैविक क्रियाकलापांचे नियमन देखील करते. पेशी पृष्ठभाग. यीस्टमध्ये, या अभ्यासातून असे दिसून आले की ER वरील C26 सिरामाइड-आश्रित GPI-AP क्लस्टर प्लाझ्मा मेम्ब्रेनवरील GPI-AP च्या क्लस्टर संघटनेचे आणि कार्यात्मक क्रियाकलापांचे नियमन करू शकते (24, 49). या मॉडेलशी सुसंगत, GhLag1 पेशींना GPI इनहिबिटर किंवा सेल वॉल अखंडतेवर परिणाम करणाऱ्या औषधांची ऍलर्जी असते (28), आणि यीस्ट पेशींच्या मिलनात प्रक्षेपित केलेल्या टिप सिरामाइडच्या कार्यात्मक Gas1-GFP क्लस्टर (49) ची आवश्यकता G​​​hLag1 पेशींचे संभाव्य शारीरिक परिणाम दर्शवते. GPI-AP त्रुटी. तथापि, लिपिड लांबीवर आधारित वर्गीकरण पद्धतीने पेशी पृष्ठभागाची कार्यात्मक संघटना ER मधून प्रोग्राम केली गेली आहे की नाही याची पुढील चाचणी करणे हा आमच्या भविष्यातील संशोधनाचा विषय असेल.
या कामात वापरलेले Saccharomyces cerevisiae स्ट्रेन टेबल S1 मध्ये सूचीबद्ध आहेत. लाइव्ह सेल इमेजिंगसाठी SCLIM चे MMY1583 आणि MMY1635 स्ट्रेन W303 च्या पार्श्वभूमीवर तयार केले गेले. फ्लोरोसेंट प्रोटीन टॅगसह Sec13-mCherry व्यक्त करणारे हे स्ट्रेन पॉलिमरेज चेन रिएक्शन (PCR)-आधारित पद्धतीने pFA6a प्लाझ्मिड टेम्पलेट म्हणून वापरून तयार केले गेले (23). GAL1 प्रमोटरच्या नियंत्रणाखाली फ्लोरोसेंट प्रोटीनसह लेबल केलेले Mid2-iRFP व्यक्त करणारे स्ट्रेन खालीलप्रमाणे तयार केले गेले. pKTiRFP-KAN वेक्टर (E. O'Shea ची भेट, Addgene plasmid क्रमांक 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; संशोधन संसाधन ओळखकर्ता (RRID): Addgene_64687) पासून iRFP-KanMx अनुक्रमाचे PCR प्रवर्धन आणि अंतर्जात Mid2 च्या C-टर्मिनसमध्ये समाविष्ट केले गेले. Mid2-iRFP जीनोम क्रम वाढवून GAL1 प्रमोटरमध्ये क्लोन केल्यानंतर, तो एकत्रीकरण प्लाझमिड pRS306 च्या Not I-Sac I साइटमध्ये एकत्रित करण्यात आला. परिणामी प्लाझमिड pRGS7 ला URA3 लोकसमध्ये एकत्रित करण्यासाठी Pst I सह रेषीय करण्यात आले.
सेंट्रोमेअर (CEN) प्लाझमिडमध्ये GAL1 प्रमोटरच्या नियंत्रणाखाली GAS1-GFP फ्यूजन जीन व्यक्त केला जातो, जो खालीलप्रमाणे तयार केला जातो. PRS416-GAS1-GFP प्लाझमिड (24) (L. Popolo ची भेट) मधून PCR द्वारे Gas1-GFP अनुक्रम वाढवला गेला आणि CEN प्लाझमिड pBEVY-GL LEU2 (C ची भेट) च्या Xma I–Xho I साइटमध्ये क्लोन केला गेला. मिलर; अॅडजीन प्लाझमिड क्रमांक 51225; http://n2t.net/adddene: 51225; RRID: Adddene_51225). परिणामी प्लाझमिडला pRGS6 असे नाव देण्यात आले. Axl2-GFP फ्यूजन जीन देखील pBEVY-GL LEU2 वेक्टरच्या GAL1 प्रमोटरच्या नियंत्रणाखाली व्यक्त केला जातो आणि त्याची रचना खालीलप्रमाणे आहे. Axl2-GFP अनुक्रम pRS304-p2HSE-Axl2-GFP प्लाझमिड (23) वरून PCR द्वारे वाढवला गेला आणि pBEVY-GL LEU2 वेक्टरच्या Bam HI-Pst I साइटवर क्लोन केला गेला. परिणामी प्लाझमिडला pRGS12 असे नाव देण्यात आले. या अभ्यासात वापरल्या जाणाऱ्या ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्सचा अनुक्रम टेबल S2 मध्ये सूचीबद्ध आहे.
या स्ट्रेनला ०.२% एडेनिन आणि २% ग्लुकोज [YP-डेक्स्ट्रोज (YPD)], २% रॅफिनोज [YP-रॅफिनोज] समृद्ध यीस्ट अर्क प्रोटीन p (YP) माध्यम (१% यीस्ट अर्क आणि २% प्रथिने ept). (YPR)] किंवा २% गॅलेक्टोज [YP-गॅलेक्टोज (YPG)] कार्बन स्रोत म्हणून किंवा सिंथेटिक किमान माध्यमात (०.१५% यीस्ट नायट्रोजन बेस आणि ०.५% अमोनियम सल्फेट) पोषणासाठी आवश्यक असलेल्या योग्य अमीनो आम्ल आणि बेसची पूर्तता करण्यासाठी पूरक केले गेले, आणि त्यात २% ग्लुकोज (सिंथेटिक ग्लुकोज किमान माध्यम) किंवा २% गॅलेक्टोज (सिंथेटिक गॅलेक्टोज किमान माध्यम) कार्बन स्रोत म्हणून समाविष्ट केले गेले.
रिअल-टाइम इमेजिंगसाठी, GAL1 प्रमोटर अंतर्गत रचना व्यक्त करणारे तापमान-संवेदनशील sec31-1 उत्परिवर्ती पेशी YPR माध्यमात रात्रभर 24°C ते मध्य-लॉग टप्प्यात वाढवल्या गेल्या. YPG मध्ये 1 तासासाठी 24°C वर इंडक्शन दिल्यानंतर, पेशींना SG मध्ये 30 मिनिटांसाठी 37°C वर इनक्युबेट केले गेले आणि नंतर स्राव ब्लॉकमधून बाहेर पडण्यासाठी 24°C वर स्थानांतरित केले गेले. काचेच्या स्लाईडवर पेशी निश्चित करण्यासाठी Concanavalin A चा वापर केला गेला आणि SCLIM द्वारे प्रतिमा काढली गेली. SCLIM हे Olympus IX-71 इन्व्हर्टेड फ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोप आणि UPlanSApo 100×1.4 न्यूमेरिकल अपर्चर ऑइल लेन्स (ऑलिंपस), हाय-स्पीड आणि हाय-सिग्नल-टू-नॉईज रेशो रोटेटिंग डिस्क कॉन्फोकल स्कॅनर (योकोगावा इलेक्ट्रिक), कस्टम स्पेक्ट्रोमीटर आणि कस्टम कूलिंग यांचे संयोजन आहे. सिस्टमचा इमेज इंटेन्सिफायर (हामामात्सु फोटोनिक्स) ×266.7 च्या अंतिम मॅग्निफिकेशनसह मॅग्निफायिंग लेन्स सिस्टम आणि इलेक्ट्रॉनचा गुणाकार करणारा चार्ज-कपल्ड डिव्हाइस कॅमेरा प्रदान करू शकतो (हामामात्सु फोटोनिक्स) (21). इमेज अॅक्विझिशन कस्टम सॉफ्टवेअर (योकोगावा इलेक्ट्रिक) द्वारे केले जाते. 3D इमेजेससाठी, आम्ही ऑब्जेक्टिव्ह लेन्सला उभ्या कंपन करण्यासाठी कस्टम-मेड पायझोइलेक्ट्रिक अॅक्ट्युएटर वापरला आणि स्टॅकमध्ये 100 nm अंतरावर ऑप्टिकल भाग गोळा केले. Z-स्टॅक इमेज 3D व्हॉक्सेल डेटामध्ये रूपांतरित केली जाते आणि रोटेटिंग डिस्क कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपसाठी वापरलेले सैद्धांतिक पॉइंट स्प्रेड फंक्शन व्होलॉसिटी सॉफ्टवेअर (पर्किनएल्मर) द्वारे डीकॉनव्होल्यूशन प्रक्रियेसाठी वापरले जाते. सह-स्थान विश्लेषणासाठी स्वयंचलित थ्रेशोल्डसाठी व्होलोसिटी सॉफ्टवेअर वापरून, कार्गोसह ERES मोजले गेले. मेटामॉर्फ सॉफ्टवेअर (आण्विक उपकरणे) वापरून लाइन स्कॅन विश्लेषण केले गेले.
सांख्यिकीय महत्त्व निश्चित करण्यासाठी ग्राफपॅड प्रिझम सॉफ्टवेअर वापरा. ​​टू-टेल्ड स्टुडंटची टी-टेस्ट आणि सामान्य एकतर्फी विश्लेषण ऑफ व्हेरिअन्स (ANOVA) चाचणीसाठी, गटांमधील फरकांचा P <0.05 (*) वर महत्त्वपूर्ण प्रभाव पडतो असे मानले जाते.
Gas1-GFP च्या फ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोपीसाठी, लॉग फेज पेशी YPD मध्ये रात्रभर वाढवल्या गेल्या आणि सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे गोळा केल्या गेल्या, फॉस्फेट बफर केलेल्या सलाईनने दोनदा धुतल्या गेल्या आणि किमान 15 मिनिटे बर्फावर उबवल्या गेल्या आणि नंतर पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे सूक्ष्मदर्शकाखाली पुढे गेल्या. चेक (24). ऑब्जेक्टिव्ह लेन्स, L5 (GFP) फिल्टर, हमामात्सु कॅमेरा आणि अॅप्लिकेशन सूट X (LAS X) सॉफ्टवेअरसह सुसज्ज Leica DMi8 सूक्ष्मदर्शक (HCX PL APO 1003/1.40 ऑइल PH3 CS) संपादनासाठी वापरण्यात आला. .
नमुने 65°C तापमानावर SDS नमुना बफरने 10 मिनिटांसाठी विकृत केले गेले आणि नंतर SDS-पॉलीअ‍ॅक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (PAGE) द्वारे वेगळे केले गेले. इम्युनोब्लोटिंग विश्लेषणासाठी, प्रति लेन 10 μl नमुना लोड केला गेला. प्राथमिक अँटीबॉडी: 1:3000 च्या सौम्यतेवर रॅबिट पॉलीक्लोनल अँटी-गॅस1, 1:500 च्या सौम्यतेवर रॅबिट पॉलीक्लोनल अँटी-एम्प24 आणि 1:3000 च्या सौम्यतेवर रॅबिट पॉलीक्लोनल अँटी-GFP (H. Riezman कडून भेट) वापरा. ​​माऊस मोनोक्लोनल अँटी-Pgk1 अँटीबॉडी 1:5000 च्या सौम्यतेवर (जे. डे ला क्रूझ कडून भेट) वापरण्यात आली. दुय्यम अँटीबॉडी: हॉर्सराडिश पेरोक्सिडेस (HRP) संयुग्मित शेळी अँटी-रॅबिट इम्युनोग्लोबुलिन G (IgG) 1:3000 (पियर्स) च्या सौम्यतेवर वापरण्यात आली. एचआरपी-कंज्युगेटेड शेळी अँटी-माऊस आयजीजी १:३००० (पियर्स) च्या डायल्युमेंटेशनवर वापरण्यात आला. सुपरसिग्नल वेस्ट पिको अभिकर्मक (थर्मो फिशर सायंटिफिक) च्या केमिल्युमिनेसेन्स पद्धतीद्वारे रोगप्रतिकारक प्रतिसाद क्षेत्राचे निरीक्षण करण्यात आले.
(३१) मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, समृद्ध ER अंशावर एक नैसर्गिक इम्युनोप्रिसिपिटेशन प्रयोग करण्यात आला. थोडक्यात, १०० ऑप्टिकल घनतेवर ६०० एनएम (OD600) वर TNE बफर [५० एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच ७.५), १५० एमएम NaCl, ५ एमएम EDTA, १ एमएम फेनिलमेथिलसल्फोनिल फ्लोराईड आणि प्रोटीज इनहिबिटर मिश्रण) सह यीस्ट पेशी धुवा. ते काचेच्या मण्यांनी तोडले गेले आणि नंतर पेशींचे मलबे आणि काचेचे मणी सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे काढून टाकले गेले. त्यानंतर सुपरनॅटंटला १७,००० ग्रॅमवर ​​१५ मिनिटांसाठी ४°C वर सेंट्रीफ्यूज केले गेले. गोळी TNE मध्ये पुन्हा सस्पेंड करण्यात आली आणि डिजिटलिस सॅपोनिन १% च्या अंतिम एकाग्रतेमध्ये जोडण्यात आले. सस्पेंशन ४°C वर रोटेशनसह १ तासासाठी इनक्यूबेट करण्यात आले आणि नंतर अघुलनशील घटक १३,००० ग्रॅमवर ​​४°C वर ६० मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूजेशनद्वारे काढून टाकले गेले. Gas1-GFP इम्युनोप्रिसिपिटेशनसाठी, प्रथम नमुना ४°C वर रिकाम्या अ‍ॅगारोज बीड्स (ChromoTek) सह १ तासासाठी पूर्व-उष्मायन करा आणि नंतर ४°C वर GFP-Trap_A (ChromoTek) सह ३ तासांसाठी उष्मायन करा. इम्युनोप्रिसिपिटेटेड बीड्स ०.२% डायगॉक्सिजेनिन असलेल्या TNE ने पाच वेळा धुतले गेले, SDS नमुना बफरने एल्युट केले गेले, SDS-PAGE वर वेगळे केले गेले आणि इम्युनोब्लोटिंगद्वारे विश्लेषण केले गेले.
(३१) मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, समृद्ध ER अंशावर क्रॉस-लिंकिंग निर्धारण केले गेले. थोडक्यात, समृद्ध ER अंश ०.५ मिमी डायथिओबिस (सक्सीनिमिडाइल प्रोपियोनेट) (पियर्स, थर्मो फिशर सायंटिफिक, रॉकफोर्ड, आयएल, यूएसए; २०°C, २० मिनिटे) सह उष्मायन केले गेले. ग्लाइसिन (५० मिमी अंतिम सांद्रता, ५ मिनिटे, २०°C) जोडून क्रॉसलिंकिंग अभिक्रिया शांत केली गेली.
आधी वर्णन केल्याप्रमाणे (५०), वाइल्ड-टाइप आणि GhLag1 स्ट्रेनमधील सिरामाइडचे MS विश्लेषण करण्यात आले. थोडक्यात, पेशींना YPD मध्ये 30°C तापमानावर घातांकीय टप्प्यात (3 ते 4 OD600 युनिट्स/मिली) वाढवण्यात आले आणि 25×107 पेशींची कापणी करण्यात आली. त्यांचे चयापचय ट्रायक्लोरोएसेटिक आम्लाने शमन केले जाते. एक्सट्रॅक्शन सॉल्व्हेंट [इथेनॉल, पाणी, इथर, पायरीडाइन आणि 4.2 N अमोनियम हायड्रॉक्साइड (15:15:5:1:0.018 v/v)] आणि अंतर्गत मानक C17 सिरामाइड (860517, अवंती पोलर लिपिड) गुणवत्तेचे 1.2 nmol वापरा. ​​अर्काचे सौम्य अल्कधर्मी हायड्रॉलिसिस करण्यासाठी मोनोमेथिलामाइन अभिकर्मक [मिथेनॉल, पाणी, n-ब्यूटॅनॉल आणि मिथाइलमाइन द्रावण (4:3:1:5 v/v)] वापरा आणि नंतर डिसॉल्ट करण्यासाठी पाणी-संतृप्त n-ब्यूटॅनॉल वापरा. शेवटी, अर्क पॉझिटिव्ह मोड सॉल्व्हेंट [क्लोरोफॉर्म/मिथेनॉल/पाणी (२:७:१) + ५ एमएम अमोनियम एसीटेट] मध्ये पुन्हा सस्पेंड करण्यात आला आणि मास स्पेक्ट्रोमीटरमध्ये इंजेक्ट करण्यात आला. स्फिंगोलिपिड रेणूंची ओळख आणि परिमाण निश्चित करण्यासाठी मल्टी-रिअॅक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) करण्यात आले. टीएसक्यू व्हँटेज टर्शरी क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर सायंटिफिक) लिपिड विश्लेषणासाठी रोबोटिक नॅनोफ्लो आयन सोर्स नॅनोमेट एचडी (अ‍ॅडव्हियन बायोसायन्सेस, इथाका, एनवाय) ने सुसज्ज आहे. प्रत्येक सिरामाइड श्रेणीसाठी टक्कर ऊर्जा ऑप्टिमाइझ केली जाते. एमएस डेटा पॉझिटिव्ह मोडमध्ये मिळवला गेला. प्रत्येक जैविक प्रतिकृतीसाठी, लिपिड सिग्नल हा तीन स्वतंत्र मोजमापांचा मध्यक असतो.
(31) मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, Gas1-GFP व्यक्त करणाऱ्या पेशींना (800×107) नैसर्गिक इम्युनोप्रिसिपिटेशनच्या अधीन केले गेले. शुद्ध केलेले Gas1-GFP SDS-PAGE द्वारे वेगळे केले गेले आणि पॉलीव्हिनिलिडीन फ्लोराइड (PVDF) पडद्यामध्ये हस्तांतरित केले गेले. PVDF ला अमाइड ब्लॅकने रंगवून प्रथिने दृश्यमान केली गेली. Gas1-GFP बँड PVDF मधून कापला गेला आणि मिथेनॉलने 5 वेळा आणि एकदा लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-MS (LC-MS) ग्रेड पाण्याने धुतला गेला. झिल्लीच्या पट्टीला 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), बफर आणि 500μl ताजे विरघळलेले 1 M सोडियम नायट्रेट मिश्रण 37°C वर 3 तासांसाठी उष्मायन करून, लिपिड अंश Gas1-GFP मधून सोडला जातो आणि ग्लुकोसामाइन आणि इनोसिटॉल (51) दरम्यान इनोसिन फॉस्फेट सिरामाइड सोडले जाते. त्यानंतर, पडदा पट्टी LC-MS ग्रेड पाण्याने चार वेळा धुतली गेली, खोलीच्या तपमानावर वाळवली गेली आणि विश्लेषण होईपर्यंत -80°C वर नायट्रोजन वातावरणात साठवली गेली. नियंत्रण म्हणून, प्रत्येक प्रयोगासाठी PVDF पडद्याचा एक रिक्त नमुना वापरला गेला. नंतर वर्णन केल्याप्रमाणे Gas1-GFP मधून काढलेले लिपिड MS द्वारे विश्लेषण केले गेले (50). थोडक्यात, GPI-लिपिड असलेल्या PVDF पट्ट्या 75μl निगेटिव्ह मोल्ड सॉल्व्हेंट [क्लोरोफॉर्म/मिथेनॉल (1:2) + 5 mM अमोनियम एसीटेट] मध्ये पुन्हा सस्पेंड केल्या गेल्या आणि स्फिंगोलिपिड प्रजातींचे इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI)-MRM/MS विश्लेषण (TSQ व्हँटेज) पास केले. या प्रकरणात, MS डेटा नकारात्मक आयन मोडमध्ये प्राप्त झाला.
आधी सांगितल्याप्रमाणे, GPI अँकरचा लिपिड भाग [3H]-इनोसिटॉल-लेबल केलेल्या GPI-AP (16) पासून वेगळा करण्यात आला. लिपिड पातळ-थर क्रोमॅटोग्राफीद्वारे सॉल्व्हेंट सिस्टम (55:45:10 क्लोरोफॉर्म-मेथॅनॉल-0.25% KCl) वापरून वेगळे केले गेले आणि FLA-7000 (फुजीफिल्म) वापरून दृश्यमान केले गेले.
Gas1-GFP (600×107) व्यक्त करणाऱ्या पेशींना TNE बफरने TNE बफरने दोनदा धुतले गेले आणि काचेच्या मण्यांनी तोडले गेले आणि नंतर पेशींचे अवशेष आणि काचेचे मणी काढून टाकण्यासाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले. त्यानंतर सुपरनॅटंटला 4°C वर 1 तासासाठी 17,000 ग्रॅमवर ​​सेंट्रीफ्यूज केले गेले. गोळी TNE मध्ये धुतली गेली आणि 37°C वर 1 तासासाठी 0.2% डिजिटलिस सॅपोनिन असलेल्या TNE मध्ये 1 U PI-PLC (Invitrogen) ने इनक्यूबेट केले गेले. एंजाइम उपचारानंतर, 17,000 ग्रॅमवर ​​4°C वर 1 तासासाठी सेंट्रीफ्यूजेशनद्वारे पडदा काढून टाकला गेला. Gas1-GFP इम्युनोप्रिसिपिटेट करण्यासाठी, सुपरनॅटंटला 4°C वर GFP-Trap_A (ChromoTek) ने रात्रभर इनक्यूबेट केले गेले. SDS-PAGE द्वारे वेगळे केलेले शुद्ध केलेले Gas1-GFP Coomassie ब्रिलियंट ब्लू ने रंगवले गेले. जलवाहिनीभोवतीच्या राखाडी रंगापासून गॅस१-जीएफपी स्टेनिंग बँड कापला गेला आणि नंतर आयोडोएसीटामाइडसह अल्किलेशन आणि डायथिओथ्रेइटॉलसह रिडक्शन केल्यानंतर, ट्रिप्सिनसह इन-जेल पचन केले गेले. ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स आणि पेप्टाइड्स GPI-ग्लायकन्ससह अर्क आणि वाळवा. वाळलेले पेप्टाइड २० μl पाण्यात विरघळले गेले. LC मध्ये एक भाग (८μl) इंजेक्ट करा. विशिष्ट ग्रेडियंट परिस्थितीत पेप्टाइड्स वेगळे करण्यासाठी ऑक्टाडेसिसिलेन (ODS) कॉलम (डेव्हेलोसिल ३००ODS-HG-५; आतील व्यास १५० मिमी×१.० मिमी; नोमुरा केमिकल, आयची प्रीफेक्चर, जपान) वापरण्यात आला. मोबाइल फेज म्हणजे सॉल्व्हेंट ए (०.०८% फॉर्मिक अॅसिड) आणि सॉल्व्हेंट बी (८०% एसीटोनिट्राइलमध्ये ०.१५% फॉर्मिक अॅसिड). ५० μl किमान-१ या प्रवाह दराने ५५ मिनिटांच्या आत स्तंभाला सॉल्व्हेंट A ने एल्युट करण्यासाठी अ‍ॅक्सेला एचपीएलसी प्रणाली (थर्मो फिशर सायंटिफिक, बोस्टन, मॅसॅच्युसेट्स) वापरली गेली आणि नंतर सॉल्व्हेंट B ची सांद्रता ४०% पर्यंत वाढवली गेली. , युनायटेड स्टेट्स). एल्युएट सतत ESI आयन स्त्रोतामध्ये आणले गेले आणि GPI-ग्लायकन्ससह ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स आणि पेप्टाइड्सचे विश्लेषण LTQ ऑर्बिट्रेप XL (हायब्रिड रेषीय आयन ट्रॅप-ऑर्बिट्रेप मास स्पेक्ट्रोमीटर; थर्मो फिशर सायंटिफिक) द्वारे केले गेले. MS सेटअपमध्ये, केशिका स्त्रोताचा व्होल्टेज ४.५ kV वर सेट करण्यात आला आणि ट्रान्सफर केशिकाचे तापमान ३००°C वर ठेवण्यात आले. केशिका व्होल्टेज आणि ट्यूब लेन्स व्होल्टेज अनुक्रमे १५ V आणि ५० V वर सेट करण्यात आले. MS डेटा पॉझिटिव्ह आयन मोडमध्ये (60,000 रिझोल्यूशन; प्रति दशलक्ष 10 भागांची वस्तुमान अचूकता) 300/m/z वस्तुमान/चार्ज गुणोत्तर (m/z) 3000 च्या वस्तुमान श्रेणीमध्ये प्राप्त केला गेला. MS/MS डेटा LTQ ऑर्बिट्रेप XL [पहिले 3 अंक ज्यावर डेटा अवलंबून असतो, टक्कर प्रेरित पृथक्करण (CID)] मधील आयन ट्रॅपद्वारे प्राप्त केला जातो.
GROMACS (52) सॉफ्टवेअर आणि MARTINI 2 फोर्स फील्ड (53-55) वापरून MD सिम्युलेशन केले गेले. नंतर CHARMM GUI मेम्ब्रेन बिल्डर (56, 57) चा वापर डायओलॉयल्फोस्फेटिडायलकोलीन (DOPC) आणि Cer C18 किंवा DOPC आणि Cer C26 असलेले बायलेयर तयार करण्यासाठी केला गेला. स्फिंगोसिन शेपटीचे अतिरिक्त मणी काढून टाकून Cer C26 चे टोपोलॉजी आणि निर्देशांक DXCE मधून घेतले जातात. दुहेरी थर संतुलित करण्यासाठी आणि ते चालविण्यासाठी खाली वर्णन केलेल्या प्रक्रियेचा वापर करा, नंतर Emp24 असलेली प्रणाली तयार करण्यासाठी सिस्टमच्या शेवटच्या निर्देशांकांचा वापर करा. यीस्ट Emp24 चे ट्रान्समेम्ब्रेन डोमेन (अवशेष 173 ते 193) व्हिज्युअल MD (VMD) टूल आण्विक रचना (58) वापरून α-हेलिक्स म्हणून तयार केले गेले. नंतर, ओव्हरलॅपिंग लिपिड्स काढून टाकल्यानंतर, प्रथिने खडबडीत दाणेदार केली गेली आणि CHARMM GUI वापरून बायलेयरमध्ये घातली गेली. अंतिम प्रणालीमध्ये १२०२ DOPC आणि ३०२ Cer C26 किंवा ११९७ DOPC आणि २९५ Cer C18 आणि Emp24 आहेत. प्रणालीला ०.१५०M च्या एकाग्रतेपर्यंत आयोनाइझ करा. दोन द्विस्तरीय रचनांसाठी चार स्वतंत्र प्रतिकृती बनवण्यात आल्या.
लिपिड बायलेयर CHARMM GUI प्रक्रियेचा वापर करून संतुलित केले जाते, ज्यामध्ये 405,000 पायऱ्या कमी करणे आणि नंतर संतुलित करणे समाविष्ट असते, जिथे स्थिती मर्यादा हळूहळू कमी केल्या जातात आणि काढून टाकल्या जातात आणि वेळेची पायरी 0.005 ps वरून 0.02 ps पर्यंत वाढवली जाते. समतोलीकरणानंतर, ते 0.02 ps च्या वेळेच्या पायरीसह 6 µs निर्माण करते. Emp24 घालल्यानंतर, सिस्टम कमी करण्यासाठी आणि संतुलित करण्यासाठी समान CHARMM GUI प्रक्रिया वापरा आणि नंतर उत्पादनात 8 सेकंद चालवा.
सर्व प्रणालींसाठी, संतुलन प्रक्रियेदरम्यान, दाब बेरेंडसेन बॅरोस्टॅट (59) द्वारे नियंत्रित केला जातो आणि उत्पादन प्रक्रियेदरम्यान, दबाव पॅरिनेलो-रहमान बॅरोस्टॅट (60) द्वारे नियंत्रित केला जातो. सर्व प्रकरणांमध्ये, सरासरी दाब 1 बार असतो आणि अर्ध-आयसोट्रॉपिक दाब जोडणी योजना वापरली जाते. संतुलन आणि उत्पादन प्रक्रियेत, प्रथिने, लिपिड आणि सॉल्व्हेंट कणांचे तापमान अनुक्रमे जोडण्यासाठी स्पीड रिकॅलिब्रेशनसह थर्मोस्टॅट (61) वापरला जातो. संपूर्ण ऑपरेशन दरम्यान, लक्ष्य तापमान 310K असते. 0.005 बफर टॉलरन्ससह व्हर्लेट स्कीम वापरून पेअरिंग लिस्ट तयार करून नॉन-बॉन्डिंग परस्परसंवादाची गणना केली जाते. कूलॉम्ब टर्मची गणना प्रतिक्रिया क्षेत्र आणि 1.1 एनएमच्या कट-ऑफ अंतराचा वापर करून केली जाते. व्हँडर वाल्स टर्म 1.1 एनएमच्या कट-ऑफ अंतरासह कट-ऑफ स्कीम वापरते आणि व्हर्लेट कट-ऑफ स्कीम संभाव्य ड्रिफ्टसाठी वापरली जाते (62).
VMD वापरून, DOPC फॉस्फेट बीड्स किंवा सिरामाइड AM1 बीड्स आणि प्रथिन यांच्यातील कटऑफ तरंगलांबी 0.7 nm आहे आणि प्रथिनांशी संवाद साधणाऱ्या लिपिड्सची संख्या मोजली जाते. खालील सूत्रानुसार, (63) मध्ये दिल्याप्रमाणे डिप्लेशन-एनरिचमेंट (DE) फॅक्टरची गणना करा: DE फॅक्टर = (प्रथिन 0.7 मधील एकूण लिपिड्सचे प्रमाण) प्रथिन 0.7 मधील (एकूण लिपिड्समध्ये Cer चे प्रमाण)
नोंदवलेले मूल्य सरासरी म्हणून मिळवले जाते आणि त्रुटी बार SE च्या चार स्वतंत्र प्रती आहेत. DE घटकाचे सांख्यिकीय महत्त्व t चाचणी [(averageDE-factor-1)/SE] द्वारे मोजले जाते. एक-पुच्छ वितरणातून P मूल्याची गणना करा.
GROMACS टूलचा वापर ट्रेसच्या शेवटच्या 250 ns मध्ये Emp24 असलेल्या सिस्टमच्या 2D पार्श्व घनता नकाशाची गणना करण्यासाठी केला गेला. सिरामाइडचा समृद्धीकरण/अवसाद नकाशा मिळविण्यासाठी, Cer चा घनता नकाशा Cer आणि DOPC च्या नकाशाच्या बेरजेने भागला जातो आणि नंतर शरीरातील Cer च्या एकाग्रतेने भागला जातो. समान रंग नकाशा स्केल वापरला जातो.
या लेखासाठी पूरक साहित्यासाठी, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 पहा.
हा एक मुक्त प्रवेश लेख आहे जो क्रिएटिव्ह कॉमन्स अॅट्रिब्यूशन-नॉन-कमर्शियल लायसन्सच्या अटींनुसार वितरित केला जातो, जो कोणत्याही माध्यमात वापर, वितरण आणि पुनरुत्पादन करण्यास परवानगी देतो, जोपर्यंत अंतिम वापर व्यावसायिक फायद्यासाठी नाही आणि मूळ काम योग्य आहे असा आधार आहे. संदर्भ.
टीप: आम्ही तुम्हाला फक्त तुमचा ईमेल पत्ता देण्यास सांगतो जेणेकरून तुम्ही पेजवर शिफारस केलेल्या व्यक्तीला कळेल की तुम्हाला ईमेल त्यांना दाखवायचा आहे आणि तो स्पॅम नाही. आम्ही कोणतेही ईमेल पत्ते कॅप्चर करणार नाही.
तुम्ही अभ्यागत आहात की नाही हे तपासण्यासाठी आणि स्वयंचलित स्पॅम सबमिशन रोखण्यासाठी हा प्रश्न वापरला जातो.
सोफिया रॉड्रिग्ज-गॅलार्डो, काझुओ कुरोकावा, सुसाना सबीडो-बोझो, अलेजांद्रो कॉर्टेझ · गोमेझ (अलेजांद्रो कॉर्टेस-गोमेझ), अत्सुको इकेडा (अत्सुको इकेडा), व्हॅलेरिया झोनी (व्हॅलेरिया झोनी), ऑक्सिलिएडोरा अगुइलेरा-रोमेरो, अनालोजी पेरोजी, ॲनालोगिरो, ॲना झोनी लोपेझ), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकिरा, स्टेफानो फॅनी, अकिहिको नाकानो, मॅन्युएल मुनिझ
निवडक आउटपुट साइट्समध्ये प्रथिने वर्गीकरणासाठी सिरॅमाइड साखळी लांबीचे महत्त्व 3D उच्च-रिझोल्यूशन रिअल-टाइम इमेजिंगद्वारे स्पष्ट केले जाते.
सोफिया रॉड्रिग्ज-गॅलार्डो, काझुओ कुरोकावा, सुसाना सबीडो-बोझो, अलेजांद्रो कॉर्टेझ · गोमेझ (अलेजांद्रो कॉर्टेस-गोमेझ), अत्सुको इकेडा (अत्सुको इकेडा), व्हॅलेरिया झोनी (व्हॅलेरिया झोनी), ऑक्सिलिएडोरा अगुइलेरा-रोमेरो, अनालोजी पेरोजी, ॲनालोगिरो, ॲना झोनी लोपेझ), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकिरा, स्टेफानो फॅनी, अकिहिको नाकानो, मॅन्युएल मुनिझ
निवडक आउटपुट साइट्समध्ये प्रथिने वर्गीकरणासाठी सिरॅमाइड साखळी लांबीचे महत्त्व 3D उच्च-रिझोल्यूशन रिअल-टाइम इमेजिंगद्वारे स्पष्ट केले जाते.
©2020 अमेरिकन असोसिएशन फॉर द ॲडव्हान्समेंट ऑफ सायन्स. सर्व हक्क राखीव. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef आणि COUNTER चे भागीदार आहे. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.