Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमधील कंपॅटिबिलिटी मोड बंद करा). यादरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही ही साइट स्टाईल्स आणि जावास्क्रिप्टशिवाय प्रदर्शित करू.
पृष्ठवंशी प्राण्यांच्या विपरीत, कीटकांमध्ये नर-प्रवण लैंगिक स्टेरॉइड संप्रेरकांचा अभाव असतो, असे सर्वसाधारणपणे मानले जाते. ॲनोफिलीस गॅम्बियामध्ये, इकडेसोन स्टेरॉइड २०-हायड्रॉक्सीकडेसोन (२०E) हे माद्यांद्वारे संश्लेषित झाल्यावर अंड्यांच्या विकासावर नियंत्रण ठेवण्यासाठी² आणि नरांद्वारे लैंगिकरित्या हस्तांतरित झाल्यावर मिलन-प्रतिबंधक कालावधी प्रेरित करण्यासाठी³ विकसित झाले असल्याचे दिसते. अंड्यांचा विकास आणि मिलन ही आवश्यक प्रजनन वैशिष्ट्ये असल्याने, मादी ॲनोफिलीस डास हे संप्रेरकीय संकेत कसे एकत्रित करतात हे समजून घेतल्यास नवीन मलेरिया नियंत्रण कार्यक्रमांची रचना करणे सोपे होऊ शकते. येथे, आम्ही हे उघड करतो की ही प्रजनन कार्ये इकडेस्टेरॉइड-सक्रिय/निष्क्रिय करणाऱ्या एन्झाइम्सच्या जटिल नेटवर्कद्वारे विशिष्ट लैंगिक स्टेरॉइड्सद्वारे नियंत्रित केली जातात. आम्ही एक नर-विशिष्ट ऑक्सिडाइज्ड इकडेसोन, ३-डीहायड्रो-२०E (३D२०E) ओळखला, जो लैंगिक हस्तांतरणानंतर आणि डीफॉस्फोरिलेशनद्वारे सक्रिय झाल्यानंतर मादीची लैंगिक ग्रहणक्षमता बंद करून पालकत्वाचे संरक्षण करतो. विशेष म्हणजे, ३D२०E हस्तांतरणामुळे प्रजनन जनुकांची अभिव्यक्ती देखील प्रेरित झाली, जी प्रजनन काळात अंड्यांचा विकास टिकवून ठेवतात. प्लाज्मोडियम संसर्ग, संक्रमित माद्यांचे आरोग्य सुनिश्चित करणे. मादीपासून मिळणारे 20E लैंगिक प्रतिसाद निर्माण करत नाही, परंतु 20E-प्रतिबंधक कायनेजेस प्रतिबंधित झाल्यानंतर मिलन करणाऱ्या कीटकांना अंडी घालण्याची परवानगी देते. या नर-विशिष्ट कीटक स्टिरॉइड हार्मोनची ओळख आणि मादीची लैंगिक ग्रहणक्षमता, प्रजननक्षमता आणि प्लाज्मोडियमसोबतची आंतरक्रिया नियंत्रित करण्यातील त्याची भूमिका, मलेरिया पसरवणाऱ्या डासांचे प्रजनन यश कमी करण्याची क्षमता दर्शवते.
मानवी मलेरिया परजीवींचा एकमेव वाहक असलेल्या ॲनोफिलीस डासांमध्ये कीटकनाशक प्रतिकारशक्ती मोठ्या प्रमाणावर पसरल्यामुळे मलेरियाची प्रकरणे आणि मृत्यू पुन्हा वाढत आहेत⁴. या डासांचे प्रजनन जीवशास्त्र हे नवीन मलेरिया नियंत्रण उपायांसाठी एक विशेष आकर्षक लक्ष्य आहे, कारण मादी फक्त एकदाच मिलन करते⁵; या एकाच मिलन क्रियेला वंध्य बनवल्यास प्रत्यक्ष क्षेत्रातील डासांची संख्या कमी करण्याची मोठी क्षमता निर्माण होईल.
पुरुषांकडून उच्च-प्रमाणातील स्टिरॉइड हार्मोन्स मिळाल्यानंतर स्त्रिया लैंगिकदृष्ट्या अक्षम होतात. अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की, पुढील समागमातील अडचणींचे कारण २०-हायड्रॉक्सीएक्डायसोन (२०E) हे स्टिरॉइड हार्मोन आहे, जे अळीच्या अवस्थेतील कात टाकण्याच्या चक्राचे नियामक म्हणून अधिक ओळखले जाते. नरांमध्ये २०E चे संश्लेषण आणि हस्तांतरण करण्याची क्षमता विशेषतः ॲनोफिलीस प्रजातींमध्ये विकसित झाली आहे, ज्या सेलिया७ या उपप्रजातीचा भाग आहेत. ही उपप्रजाती आफ्रिकेत वितरीत आहे आणि त्यात ॲनोफिलीस गॅम्बियासह मलेरियाचे सर्वात धोकादायक वाहक समाविष्ट आहेत. हे विशेषतः उल्लेखनीय आहे कारण या प्रजातींमध्ये माद्या प्रत्येक रक्तपानानंतर २०E तयार करतात आणि २०E अंडजनन चक्राला चालना देते (संदर्भ ८ पहा). तथापि, माद्या त्यांच्या स्वतःच्या समागम क्षमतेशी तडजोड न करता एक्डायसोनच्या दोन वेगवेगळ्या स्रोतांकडून (नराद्वारे हस्तांतरण आणि रक्तपानाद्वारे प्रेरणा) मिळणारे संकेत कसे एकत्रित करतात याबद्दल फार कमी माहिती आहे. खरं तर, जर माद्यांनी तयार केलेल्या २०E मुळे लैंगिक असहिष्णुता निर्माण झाली, तर त्यामुळे वंध्यत्व येईल. पहिल्यांदाच रक्त पिणाऱ्या व्यक्ती, या डासांमध्ये आढळणारी एक अतिशय सामान्य वर्तणूक आहे5.
एक संभाव्य स्पष्टीकरण असे आहे की ए. गॅम्बियाई प्रजातीचे नर एक सुधारित, नर-विशिष्ट एकडायसोन हस्तांतरित करतात, जे मादीच्या प्रजनन मार्गात सिग्नलिंग कॅस्केड सक्रिय करते, ज्यामुळे मिलनात अस्थिरता येते. तथापि, पृष्ठवंशी प्राण्यांमध्ये इस्ट्रोजेन आणि अँड्रोजनसारखे अनेक स्टिरॉइड हार्मोन्स असले तरी (संदर्भ ९ मध्ये पुनरावलोकन केलेले), आमच्या माहितीनुसार, कीटकांमध्ये अँड्रोजेनिक-प्रवण स्टिरॉइड्स ओळखले गेलेले नाहीत.
संभाव्य सुधारक स्टेरॉइड्सच्या शोधात, आम्ही लैंगिकदृष्ट्या परिपक्व A. gambiae च्या नर सहायक ग्रंथी (MAG) मधील स्टेरॉइड हार्मोन्सचा संच निश्चित करण्यासाठी कामाला लागलो. पूर्वी वापरल्या जाणाऱ्या कमी विशिष्ट पद्धतीऐवजी, टँडम मास स्पेक्ट्रोमेट्रीसह जोडलेल्या उच्च कार्यक्षमता द्रव क्रोमॅटोग्राफीचा (HPLC-MS/MS) वापर करून, आम्ही या ऊतकामध्ये एकडायसोन (E) आणि 20E शोधले, ज्यामुळे पूर्वीच्या निष्कर्षाची पुष्टी झाली. तथापि, नमुन्यामध्ये ऑक्सिडाइज्ड फॉस्फोरिलेटेड स्टेरॉइड्सचे प्राबल्य होते, जे 3-डीहायड्रो-20E-22-फॉस्फेट (3D20E22P)12 या सूत्राशी सुसंगत होते (आकृती 1). इतर स्वरूपांमध्ये 3-डीहायड्रो-20E (3D20E) आणि 20E-22-फॉस्फेट (20E22P) यांचा समावेश आहे. 3D20E22P ची HPLC-MS/MS सिग्नल तीव्रता त्याच्या डीफॉस्फोरिलेटेड स्वरूपापेक्षा, 3D20E पेक्षा दोन पटीने जास्त आणि E व 20E22P पेक्षा तीन पटीने जास्त होती. २०ई (आकृती १). शरीराच्या इतर भागांमध्ये आणि खालच्या प्रजनन मार्गात (एलआरटी; विस्तारित डेटा आकृती १अ). आम्ही नुकत्याच बंद झालेल्या (<१ दिवसाचे) नर आणि माद्यांमध्ये इकडेस्टेरॉईड्सचे विश्लेषण केले आणि 3D20E व 3D20E22P फक्त एमएजीमध्ये आढळले; ई, २०ई आणि २०ई२२पी दोन्ही लिंगांमध्ये उपस्थित होते (विस्तारित डेटा आकृती १ब). या माहितीवरून असे सूचित होते की ए. गॅम्बियाचे प्रौढ नर त्यांच्या एमएजीमध्ये सुधारक संप्रेरकांचे उच्च प्रमाण तयार करतात, जे माद्यांद्वारे संश्लेषित केले जात नाहीत.
4-दिवसांच्या (4-day-old) कुमारी नरांमधून आणि कुमारी व समागम केलेल्या माद्यांमधून (0.5, 3, आणि 12 hpm) MAG आणि मादी LRT (अलिंद, शुक्रकोष आणि पॅरोव्हेरिअमसह) विच्छेदित करण्यात आले. या ऊतींमधील एकडायसोनचे विश्लेषण HPLC-MS/MS द्वारे करण्यात आले (सरासरी ± मानक त्रुटी; अनपेअर्ड टी-टेस्ट, द्विपक्षीय, फॉल्स डिस्कव्हरी रेट (FDR) सुधारित; NS, लक्षणीय नाही; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 तास विरुद्ध 0.5 तास, P = 0.035; 12 तास विरुद्ध 3 तास, P = 0.0015; 12 तास विरुद्ध 0.5 तास, P = 0.030. 3D20E22P: 3 तास विरुद्ध 0.5 तास, P = 0.25; 12 तास विरुद्ध 3 तास, P = 0.0032; 12 तास विरुद्ध 0.5 तास, P = 0.015). डेटा तीन जैविक प्रतिकृतींमधून घेतला आहे. प्रत्येक संबंधित एकडायसोनसाठी पीक एरियाची गणना केली गेली आणि डासांच्या संख्येनुसार सामान्यीकृत केले गेले. एकडायसोन खालीलप्रमाणे रंगांनी दर्शविला आहे: E, हिरवा; 20E, नारंगी; 20E22P, जांभळा; 3D20E, निळा; 3D20E22P, गुलाबी. इन्सेटमध्ये कमी एकडायसोन पातळी दर्शविण्यासाठी y-अक्षावरील स्केल वाढवला आहे.
समागमादरम्यान 3D20E22P आणि 3D20E हस्तांतरित होतात की नाही हे तपासण्यासाठी, आम्ही समागमानंतर वेगवेगळ्या वेळी मादीच्या LRT चे विच्छेदन केले. कुमारी मादीमध्ये इकडेसोन आढळले नसले तरी, समागमानंतर लगेचच (समागमानंतर ०.५ तास, hpm) LRT मध्ये 3D20E22P चे लक्षणीय प्रमाण आढळले, जे कालांतराने कमी झाले, तर 3D20E ची पातळी लक्षणीयरीत्या वाढली (आकृती १). रासायनिकरित्या संश्लेषित 3D20E ला मानक मानून, आम्ही हे निश्चित केले की समागम करणाऱ्या LRT मध्ये या स्टेरॉइड हार्मोनची पातळी 20E पेक्षा किमान १०० पट जास्त होती (विस्तारित डेटा सारणी १). अशाप्रकारे, 3D20E22P हे पुरुषांमधील प्रमुख इकडेसोन आहे जे समागमादरम्यान मादीच्या LRT मध्ये हस्तांतरित होते, आणि त्याचे डीफॉस्फोरिलेटेड स्वरूप, 3D20E, समागमानंतर लगेचच मोठ्या प्रमाणात आढळते. यावरून मादीच्या समागमोत्तर जीवशास्त्रात या दुसऱ्या इकडेसोनची एक महत्त्वाची भूमिका असल्याचे सूचित होते.
एका खास तयार केलेल्या बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइनचा वापर करून, नवीन आरएनए सिक्वेन्सिंग (RNA-seq) डेटासेट (आकृती २अ) तयार केल्यानंतर, आम्ही एकडायसोन कायनेज (EcK), एकडायसोन ऑक्सिडेज (EO), आणि एकडायसोन एन्कोडिंग २०ई-मॉडिफाइड फॉस्फेटेज जीन (EPP) यांचा शोध घेतला. हे प्रजनन ऊतींमध्ये व्यक्त होते. आम्हाला एक संभाव्य EPP जीन आणि दोन संभाव्य EcK जीन्स (EcK1 आणि EcK2) आढळले, परंतु आम्हाला एक चांगला संभाव्य EO जीन सापडला नाही. विशेष म्हणजे, गॅम्बियन MAGs मध्ये वैयक्तिक EPP जीन्स उच्च पातळीवर (९८.९ वे पर्सेन्टाइल) व्यक्त झाले, परंतु मादी LRTs मध्ये नाही (आकृती २ब). हे आमच्या अपेक्षेच्या विरुद्ध होते, कारण या मादी ऊतीमध्ये 3D20E22P चे डीफॉस्फोरिलेशन झाले होते. म्हणून, आमचा विश्वास आहे की मिलनाच्या वेळी नर EPP हस्तांतरित होऊ शकते. खरंच, मिलनानंतर मादी प्रोटीनला मास्क करण्यासाठी आम्ही इन व्हिवो स्टेबल आयसोटोप लेबलिंगचा वापर केला, जे मादीच्या अलिंदात एमएसद्वारे ओळखले गेलेले एक एन्झाइम होते (आकृती २क). आणि पूरक तक्ता 1). विशिष्ट अँटीबॉडीज वापरून MAG आणि मिलन झालेल्या (परंतु कुमारी नसलेल्या) मादी LRT मध्ये EPP ची उपस्थिती देखील निश्चित करण्यात आली (आकृती 2d).
a, प्रत्येक लिंगाच्या प्रजनन ऊतींमध्ये EcKs, EOs, आणि EPPs एन्कोड करणाऱ्या जनुकांचा शोध घेण्यासाठी खास तयार केलेली बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइन. बाणांच्या पुढील संख्या प्रत्येक टप्प्यावर नर आणि मादी उमेदवारांची संख्या दर्शवतात. या विश्लेषणाने एक EPP जनुक (EPP) आणि एक EcK जनुक (EcK1) ओळखले, जे नरांमध्ये व्यक्त होतात, आणि एक EcK जनुक (EcK2) ओळखले, जे दोन्ही लिंगांमध्ये व्यक्त होते परंतु त्यातून उमेदवार EO जनुक मिळत नाही. b, कुमारी (V) आणि समागम करणाऱ्या (M) ॲनोफिलीस गॅम्बिया आणि ॲनोफिलीस अल्बिकन्स ऊतींमधील उमेदवार जनुकांच्या अभिव्यक्तीची तुलना करणारा हीटमॅप. Spca, फलन; MAGs, नरांमधील सहायक ग्रंथी; शरीराचे इतर भाग, ज्यात दोन्ही लिंगांमध्ये स्तन, पंख, पाय, चरबीयुक्त पिंड आणि अंतर्गत अवयव, आणि माद्यांमध्ये अंडाशय यांचा समावेश होतो. EcK2 हे गॅम्बियाच्या MAG आणि अलिंद या दोन्हीमध्ये उच्च प्रमाणात व्यक्त होते, तर EPP फक्त MAG मध्ये आढळते. c, 3, 12 आणि 24 hpm वर नराच्या वीर्य गटाच्या मादीच्या अलिंदात होणाऱ्या स्थानांतरणाचे प्रोटीओमिक विश्लेषण, ज्यात 67 सर्वाधिक प्रमाणात आढळणारी प्रथिने दर्शविली आहेत. सर्व प्रथिनांना लेबल (आणि मास्क) करण्यासाठी माद्यांना 15N असलेल्या आहारावर वाढवण्यात आले. टॅग न केलेल्या नरांचे टॅग केलेल्या माद्यांसोबत मिलन घडवून आणले गेले, आणि प्रोटीओमिक विश्लेषणासाठी 3, 12 आणि 24 hpm वर माद्यांच्या LRT चे विच्छेदन करण्यात आले (वीर्यस्खलनातील प्रथिनांच्या संपूर्ण यादीसाठी परिशिष्ट सारणी 1 पहा). अंतर्भाग, या ऊतींच्या प्रोटीओमिक विश्लेषणाद्वारे कुमारी नरांच्या MAG मध्ये EPP, Eck1 आणि EcK2 आढळले. d, वेस्टर्न ब्लॉटद्वारे EPP हे मिलन झालेल्या माद्यांच्या MAG आणि LRT मध्ये आढळले, परंतु कुमारी माद्यांमध्ये किंवा नर किंवा मादीच्या शरीराचा उर्वरित भाग. पटलांची एकाच वेळी अँटी-ॲक्टिन (लोडिंग कंट्रोल) आणि अँटी-ईपीपी अँटीबॉडीजने तपासणी करण्यात आली. सर्व नर कुमारी आहेत. जेल सोर्स डेटासाठी पूरक आकृती १ पहा. वेस्टर्न ब्लॉट दोनदा केले गेले आणि त्यांचे परिणाम सारखेच होते.
MAG मधून वेगळे केलेल्या 3D20E22P सोबत इनक्यूबेशन केल्यानंतर, EPP च्या एकडायस्टेरॉइड फॉस्फोफॉस्फेटेज क्रियाशीलतेची HPLC-MS/MS द्वारे पडताळणी करण्यात आली (विस्तारित डेटा आकृती 2a). पुढे, जेव्हा आम्ही RNA-मध्यस्थ हस्तक्षेप (RNAi) द्वारे EPP ला निष्क्रिय केले, तेव्हा आम्हाला या नरांच्या प्रजनन ऊतींमध्ये फॉस्फेटेज क्रियाशीलतेमध्ये तीव्र घट आढळली (आकृती 3a), आणि अंशतः जनुकीय निष्क्रियीकरण असूनही (विस्तारित डेटा आकृती 2b,c), EPP-निष्क्रिय नरांसोबत समागम केलेल्या माद्यांमध्ये डीफॉस्फोरिलेटेड 3D20E चे प्रमाण लक्षणीयरीत्या कमी दिसून आले (आकृती 3b). याउलट, आम्हाला त्याच डासांमध्ये 20E22P/20E गुणोत्तरात लक्षणीय बदल आढळले नाहीत, ज्यामुळे असे सूचित होऊ शकते की हे एन्झाइम 3D20E22P साठी विशिष्ट आहे (आकृती 3b).
a, डबल-स्ट्रँडेड EPP RNA (dsEPP) किंवा डबल-स्ट्रँडेड GFP RNA (dsGFP) नियंत्रकांचा वापर करून EPP सायलेन्सिंगमुळे MAG मध्ये फॉस्फेटेज क्रिया कमी झाली. प्रत्येक प्रतिकृतीमध्ये वीस MAG पूल्स वापरले गेले (P = 0.0046, पेयर्ड टी-टेस्ट, द्विपक्षीय), जे स्वतंत्र ठिपक्यांनी दर्शविले आहेत. b, EPP-सायलेन्स्ड नरांसोबत समागम केलेल्या माद्यांमध्ये 3 hpm ला डीफॉस्फोरिलेटेड 3D20E चे प्रमाण लक्षणीयरीत्या कमी होते (P = 0.0043, अनपेयर्ड टी-टेस्ट, द्विपक्षीय), तर 20E च्या पातळीवर कोणताही परिणाम झाला नाही (P = 0.063, अनपेयर्ड). टी-टेस्ट, द्विपक्षीय). प्रत्येकी 13, 16 आणि 19 माद्यांच्या तीन गटांमधून मिळालेला डेटा सरासरी ± एसईएम म्हणून सादर केला आहे.क, ईपीपी-शांत केलेल्या नरांसोबत समागम केलेल्या माद्यांमध्ये पुन्हा समागम करण्याचे प्रमाण लक्षणीयरीत्या जास्त होते (पी = 0.0002, फिशरची अचूक चाचणी, द्विपक्षीय).माद्यांची समागम स्थिती सुनिश्चित करण्यासाठी त्यांना प्रथम समागम करण्यास भाग पाडले गेले; दोन दिवसांनंतर, ट्रान्सजीनच्या क्वांटिटेटिव्ह पीसीआर डिटेक्शनद्वारे पुनर्मिलन दरांचे मूल्यांकन करण्यासाठी, ट्रान्सजेनिक शुक्राणू असलेल्या इतर नरांशी त्यांचा संपर्क साधण्यात आला. रक्त-भक्षण केलेल्या माद्यांचे EPP-सायलेन्स्ड नरांशी मिलन झाल्यावर त्यांची प्रजननक्षमता लक्षणीयरीत्या कमी झाली (P < 0.0001; मॅन-व्हिटनी चाचणी, द्विपक्षीय) आणि अंड्यांची संख्या किंचित कमी झाली (P = 0.088, मॅन-व्हिटनी चाचणी, द्विपक्षीय), तर अंडी घालण्याच्या दरावर कोणताही परिणाम झाला नाही (P = 0.94, फिशरची अचूक चाचणी, द्विपक्षीय). सर्व पॅनेलमध्ये, n जैविकदृष्ट्या स्वतंत्र डासांच्या नमुन्यांची संख्या दर्शवते. NS, लक्षणीय नाही. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
पुढे, आम्ही हे तपासले की माद्यांमध्ये समागम प्रतिरोध निर्माण करण्यासाठी एकडायसोन डीफॉस्फोरिलेशन महत्त्वाचे आहे का. विशेष म्हणजे, EPP-विरहित नरांसोबत समागम केलेल्या माद्यांनी, अतिरिक्त (ट्रान्सजेनिक) नरांच्या संपर्कात आल्यावर, नियंत्रण गटातील माद्यांपेक्षा (१०.४%) खूप जास्त वारंवारतेने (४४.९%) पुन्हा समागम केला (आकृती ३क). आम्ही प्रजननक्षमतेत लक्षणीय घट (आकृती ३ड, डावीकडे) आणि या माद्यांनी घातलेल्या अंड्यांच्या संख्येत किंचित घट (आकृती ३ड, मध्यभागी) देखील पाहिली, तर माद्यांनी घातलेल्या अंड्यांच्या टक्केवारीवर (समागमामुळे माद्यांमध्ये निर्माण होणारा आणखी एक प्रतिसाद) कोणताही परिणाम झाला नाही (आकृती ३ड, उजवीकडे). 3D20E22P साठी EPP ची दिसून आलेली विशिष्टता पाहता, हे परिणाम सूचित करतात की समागमादरम्यान हस्तांतरित झालेल्या EPP द्वारे 3D20E चे सक्रियकरण, मादीची पुढील समागमासाठीची ग्रहणशीलता बंद करण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावू शकते; हे वर्तन पूर्वी 20E च्या लैंगिक हस्तांतरणाशी जोडले गेले होते. म्हणून, हे नर-विशिष्ट संप्रेरक देखील तीव्र परिणाम करते. स्त्री प्रजननक्षमता.
पुढे, आम्ही रासायनिकरित्या संश्लेषित 3D20E (आकृती 4a–c) आणि व्यावसायिकरित्या उपलब्ध 20E वापरून लैंगिकदृष्ट्या परिपक्व कुमारींमध्ये इंजेक्शन प्रयोगांमध्ये 20E आणि 3D20E च्या क्रियाकलापांची तुलना केली. आमच्या लक्षात आले की दोन्ही सांद्रतांवर मादीची मिलनाची संवेदनशीलता बंद करण्यामध्ये 3D20E हे 20E पेक्षा लक्षणीयरीत्या अधिक प्रभावी होते (आकृती 4d). विशेष म्हणजे, LRT मध्ये 3D20E च्या अर्ध्या शारीरिक पातळीने (इंजेक्शननंतर 1,066 pg विरुद्ध मिलननंतर 2,022 pg) प्रतिकारक्षम माद्यांचे प्रमाण प्रेरित केले, जे मिलननंतर 18 pg या सर्वोच्च सांद्रतेवर इंजेक्शन दिल्यानंतर 24 तासांनी 20E च्या शारीरिक पातळीपेक्षा (इंजेक्शननंतर 361 pg) 20 पट जास्त होते; विस्तारित डेटा सारणी १). हा निकाल या कल्पनेशी सुसंगत आहे की 20E चे लैंगिक हस्तांतरण मिलन प्रतिरोधक कालावधी निर्माण करत नाही, आणि पुढे पालक-अपत्य संबंध सुनिश्चित करण्यात 3D20E हा एक प्रमुख घटक असल्याचे सूचित करतो. कुमारी माद्यांमधील अंडी घालण्याच्या चाचण्यांमध्ये 3D20E हे 20E पेक्षा लक्षणीयरीत्या अधिक सक्रिय होते (आकृती ४इ), यावरून असे सूचित होते की आंशिक EPP नि:शब्दीकरणानंतर आम्ही पाहिलेला सामान्य अंडी घालण्याचा दर हा मिलन-प्रेरित मादी घटकांमुळे अजूनही निर्माण होणाऱ्या अवशिष्ट 3D20E सक्रियतेच्या उपस्थितीमुळे होता.
(अ, ब) 20E पासून रासायनिकरित्या संश्लेषित केलेले 3D20E (अ) अत्यंत उच्च रूपांतरण/कार्यक्षमतेसह (तीन स्वतंत्र संश्लेषण अभिक्रियांमधून मिळालेला डेटा सरासरी ± मानक त्रुटी म्हणून सादर केला आहे) (ब). क, मास स्पेक्ट्रम (खालचा अर्धा भाग) मिलन झालेल्या मादी LRT मध्ये आढळणाऱ्या एकडायसोनशी (वरचा अर्धा भाग) तंतोतंत जुळतो. ड, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; फिशरची अचूक चाचणी, द्विपक्षीय) आणि 10% इथेनॉल (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; फिशरची अचूक चाचणी, द्विपक्षीय) यांच्या तुलनेत, 20E फक्त उच्च डोसवर नियंत्रणापेक्षा लक्षणीयरीत्या जास्त होते (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; फिशरची अचूक चाचणी, २-बाजू).e, 3D20E इंजेक्शनमुळे १०% इथेनॉल नियंत्रणांच्या तुलनेत कुमारी माद्यांमध्ये लक्षणीयरीत्या जास्त प्रजनन दर प्रेरित झाला (०.२१ µg, P < ०.०००१; ०.१३ µg, P = ०.०००३; फिशरची अचूक चाचणी, दोन-बाजू), तर 20E ची नियंत्रणांशी तुलना करता केवळ उच्च डोसवरच (०.२१ µg, P = ०.०२२; ०.१३ µg, P = ०.०८२३; फिशरची अचूक चाचणी, दोन-बाजू). 3D20E ने उच्च डोसवर 20E पेक्षा लक्षणीयरीत्या जास्त प्रजनन दर प्रेरित केला (०.२१ µg, P = ०.००१९; ०.१३ µg, P = ०.०७५; फिशरची अचूक चाचणी, दोन-बाजू). सर्व पॅनेलमध्ये, n जैविकदृष्ट्या स्वतंत्र डासांच्या नमुन्यांची संख्या दर्शवते. NS, लक्षणीय नाही. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. डेटा तीन प्रतिकृतींमधून आहे.
मागील अभ्यासांमध्ये, आम्ही हे निश्चित केले की स्टेरॉइड हार्मोन्सचे लैंगिक हस्तांतरण MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) या मादी प्रजनन जनुकाची अभिव्यक्ती प्रेरित करते, जे A. gambiae माद्यांना P. falciparum संसर्गापासून वाचवते, जो मानवी मलेरियाचा सर्वात प्राणघातक परजीवी आहे. मलेरिया-ग्रस्त भागांमध्ये ॲनोफिलीसच्या प्रजनन क्षमतेसाठी MISO चे महत्त्व लक्षात घेता, आम्ही 3D20E किंवा 20E यांपैकी कोणता हार्मोन या जनुकाची अभिव्यक्ती सुरू करतो हे निश्चित करण्याचे ठरवले. आम्हाला असे आढळले की, 20E इंजेक्शनने विशेषतः किंवा अधिक तीव्रतेने काही न्यूक्लियर हार्मोन रिसेप्टर्स (HR), जसे की HR3 आणि HR4, आणि सामान्य डाउनस्ट्रीम स्टेरॉइड लक्ष्ये, जसे की योकजेनिक जनुके Vg14, 15, 16, प्रेरित केली, तर 3D20E द्वारे MISO अधिक तीव्रतेने प्रेरित झाले (विस्तारित डेटा आकृती ३). अशाप्रकारे, या अँड्रोजेनिक स्टेरॉइड हार्मोनचे लैंगिक हस्तांतरण अशा यंत्रणांना प्रेरित करते असे दिसते, जे माद्यांना परजीवीमुळे होणाऱ्या त्रासापासून वाचवतात. संसर्ग. याव्यतिरिक्त, 3D20E हे E रिसेप्टर EcR च्या दोन्ही आयसोफॉर्मवर भिन्नपणे परिणाम करते, EcR-A ला प्रेरित करते आणि EcR-B ला दडपते, तसेच HPX15 सह इतर संभोग-प्रेरक जनुकांना अधिक तीव्रतेने सक्रिय करते, जे मादीच्या प्रजननक्षमतेवर परिणाम करते. यामुळे EPP-शांत केलेल्या नरांसोबत संभोग केलेल्या माद्यांमध्ये दिसून आलेल्या लक्षणीय वंध्यत्वाचे स्पष्टीकरण मिळू शकते (विस्तारित डेटा आकृती ३). हा डेटा सूचित करतो की दोन एकडायसोन हार्मोन्सद्वारे प्राधान्याने सक्रिय होणारे डाउनस्ट्रीम मार्ग अस्तित्वात आहेत, जे लिंग-विशिष्ट कार्यासाठी आधारभूत असू शकतात.
पुढे, आम्ही आमच्या बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइनमध्ये ओळखलेल्या दोन EcK जनुकांच्या कार्याची चाचणी केली. EcK1 किंवा EcK2 निष्क्रिय केल्याने नरांमध्ये लक्षणीय मृत्यूदर दिसून आला (विस्तारित डेटा आकृती 4a), यावरून असे सूचित होते की इकडेसोनचे फॉस्फोरिलेशन, आणि त्यामुळे त्याचे निष्क्रियीकरण, जगण्यासाठी महत्त्वाचे आहे. कारण EcK2 हे EcK1 पेक्षा उच्च पातळीवर व्यक्त झाले होते आणि प्रोटिओमिक्सद्वारे MAGs मध्ये आढळले होते (आकृती 2b,c आणि पूरक सारणी 2), आम्ही 20E सोबत इनक्यूबेट करून त्याच्या इकडेस्टेरॉइड कायनेज क्रियाकलापाची पडताळणी केली, ज्यामुळे 20E22P चे फॉस्फोरिलेशन झाले (विस्तारित डेटा आकृती 2.4b). जेव्हा 3D20E सब्सट्रेट म्हणून वापरले, तेव्हा आम्हाला फॉस्फोरिलेटेड उत्पादन 3D20E22P शोधता आले नाही (विस्तारित डेटा आकृती 4c), यावरून असे सूचित होते की 3D20E ऐवजी 20E हे EcK2 चे पसंतीचे लक्ष्य असू शकते.
आमच्या RNA-seq विश्लेषणानुसार, कुमारी माद्यांच्या LRT मध्ये EcK2 ची अभिव्यक्ती देखील उच्च होती, जिथे समागमानंतर ती बंद झाली (आकृती 2b). आम्ही या डेटाची पुष्टी केली आणि निश्चित केले की रक्तपानामुळे EcK2 अभिव्यक्तीवर परिणाम होत नाही (विस्तारित डेटा आकृती 5a). आमच्या सुरुवातीच्या MS प्रयोगांचा विस्तार करून, आम्ही निश्चित केले की 20E22P चे शिखर 20E च्या शिखराशी जवळून संबंधित होते (रक्तपानानंतर 22-26 तास; विस्तारित डेटा आकृती 5b). कुमारी माद्यांमध्ये EcK2 निष्क्रिय केल्यामुळे रक्तपानानंतर 26 तासांनी 20E ते 20E22P च्या सापेक्ष गुणोत्तरात 3-पट वाढ झाली (विस्तारित डेटा आकृती 2c आणि 5c), यावरून पुष्टी होते की EcK2 माद्यांमध्ये 20E चे फॉस्फोरिलेशन देखील करते. विशेष म्हणजे, EcK2-विरहित कुमारी माद्यांनी पूर्ण लैंगिक ग्रहणक्षमता टिकवून ठेवली (विस्तारित डेटा आकृती 5d,e), यावरून असे सूचित होते की मादीद्वारे 20E चे उत्पादन प्रेरित करत नाही. मिलन प्रतिरोधक कालावधी. तथापि, नियंत्रणांच्या तुलनेत या माद्यांमध्ये अंडी घालण्याचा दर लक्षणीयरीत्या वाढला होता, ज्यात ३०% पेक्षा जास्त कुमारी माद्यांनी अंडी घातली (विस्तारित डेटा आकृती ५फ). जर रक्तपान केल्यानंतर डबल-स्ट्रँडेड Eck2 RNA (dsEcK2) चे इंजेक्शन दिले गेले, तर अंडी घालण्याची क्रिया झाली नाही, ज्यावेळी रक्त सेवनामुळे आलेली 20E ची उच्च पातळी कमी झाली होती. एकंदरीत, हे परिणाम अशा मॉडेलला समर्थन देतात की रक्त शोषल्यानंतर तयार होणारे 20E अंडी घालण्यास प्रवृत्त करू शकते, परंतु केवळ तेव्हाच जेव्हा मिलन क्रियेमुळे अंडी घालण्यास अडथळा आणणारा घटक (EcK2 आणि शक्यतो इतर घटक) बंद होतो. 20E किंवा 3D20E या दोन्ही इंजेक्शनमुळे कुमारी माद्यांमध्ये EcK2 अभिव्यक्ती रोखली गेली नाही (विस्तारित डेटा आकृती ५ग), यावरून असे सूचित होते की इतर घटक या कायनेजच्या प्रतिबंधात मध्यस्थी करतात. तथापि, रक्तपान केल्यानंतर 20E ची पातळी मिलन अस्वस्थता निर्माण करण्यासाठी पुरेशी नव्हती, परंतु लैंगिकरित्या हस्तांतरित केलेल्या 3D20E च्या उच्च प्रमाणामुळे ती प्रभावीपणे सुरू झाली.
आमचे निष्कर्ष ए. गॅम्बियाच्या प्रजनन यशाचे नियमन करणाऱ्या यंत्रणांबद्दल महत्त्वपूर्ण अंतर्दृष्टी प्रदान करतात. एक प्रारूप समोर आले आहे, ज्यात नरांनी 3D20E चे उच्च प्रमाण संश्लेषित करण्यासाठी उत्क्रांती केली आहे. हे एक नर-विशिष्ट सुधारित एकडायसोन आहे, जे माद्यांना पुढील मिलनातून असंवेदनशील बनवून पालकत्वाची खात्री देते. त्याच वेळी, या मलेरिया वाहकांनी नर-विशिष्ट EPP च्या लैंगिक हस्तांतरणाच्या प्रतिसादात माद्यांमध्ये 3D20E सक्रिय करण्यासाठी एक कार्यक्षम प्रणाली देखील विकसित केली आहे. आमच्या माहितीनुसार, कीटकांमध्ये एक अद्वितीय आणि महत्त्वपूर्ण कार्य करणारी नर- आणि मादी-प्रबळ स्टिरॉइड हार्मोन प्रणालीचे हे पहिले उदाहरण आहे. नर-विशिष्ट एकडायसोन कार्याची कल्पना मांडली गेली आहे, परंतु ते निश्चितपणे सिद्ध झालेले नाही. उदाहरणार्थ, एक मोठ्या प्रमाणात खोडून काढलेली गृहीतक १८ अशी आहे की ही कार्ये 20E पूर्वसूचक E1 द्वारे केली जाऊ शकतात. हे सर्वज्ञात आहे की ड्रोसोफिलामध्ये, एकपतित्व हे लहान लैंगिक पेप्टाइड्सच्या लैंगिक हस्तांतरणाद्वारे सुरू होते, जे विशिष्ट लैंगिक पेप्टाइडद्वारे मादीच्या प्रजनन मार्गाला चेतापुरवठा करणाऱ्या चेतापेशींशी संवाद साधतात. रिसेप्टर्स21,22. ए. गॅम्बिया माद्यांमध्ये 3D20E द्वारे नियंत्रित डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कॅस्केड्स निश्चित करण्यासाठी आणि हे कॅस्केड्स डास आणि ड्रोसोफिलामध्ये संरक्षित केले जाऊ शकतात की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी पुढील कामाची आवश्यकता आहे.
आमच्या अभ्यासात मादीच्या प्रजननक्षमतेवर आणि वर्तनावर 3D20E ची महत्त्वाची भूमिका ओळखली गेली आहे, हे लक्षात घेता, 3D20E संश्लेषण आणि सक्रियतेकडे नेणारे मार्ग भविष्यातील डास नियंत्रण धोरणांसाठी नवीन संधी उपलब्ध करून देतात. जसे की, निर्जंतुक कीटक तंत्रज्ञान धोरणांमध्ये स्पर्धात्मक निर्जंतुक नरांची निर्मिती करणे, त्यांचा वापर नैसर्गिक अधिवासात सोडण्यासाठी किंवा कुमारी अवस्थेतील खेळांमध्ये 3D20E चे अनुकरण करण्यासाठी करणे. 3D20E चे नर-विशिष्ट कार्य कदाचित तेव्हा विकसित झाले असावे, जेव्हा ए. गॅम्बिया आणि इतर सेलिया प्रजातींनी त्यांचे वीर्य गोठवून संभोग प्लग बनवण्याची क्षमता प्राप्त केली, कारण यामुळे मोठ्या संख्येने संप्रेरके आणि संप्रेरक-सक्रिय करणारे एन्झाइम्स यांचे कार्यक्षम हस्तांतरण शक्य होते. याउलट, एकपंक्ति लागू करणारी 3D20E ची उत्क्रांती माद्यांना (MISO च्या उच्च अभिव्यक्तीद्वारे) मलेरियाचा उच्च प्रादुर्भाव असलेल्या भागात त्यांची प्रजनन क्षमता वाढवण्यासाठी एक यंत्रणा प्रदान करते, जे अप्रत्यक्षपणे प्लास्मोडियमच्या संक्रमणात योगदान देते. मादी ॲनोफिलीस डासांमध्ये पी. फाल्सीपेरमच्या जगण्यावर आणि वाढीवर मादी 20E चे सखोल परिणाम दिसून आले आहेत, हे लक्षात घेता,24 नर आणि मादी दोन्ही स्टेरॉइड संप्रेरक मार्ग. आता डास-परजीवी आंतरक्रियांचे प्रमुख पैलू आहेत.
ए. गॅम्बिया G3 स्ट्रेन्सचे संगोपन मानक कीटक परिस्थितीत (26-28 °C, 65-80% सापेक्ष आर्द्रता, 12:12 तास प्रकाश/अंधार प्रकाश-अंधार कालावधी) करण्यात आले. अळ्यांना माशांच्या खाद्याची पावडर (टेट्रामिन ट्रॉपिकल फ्लेक्स, कोई पेलेट्स आणि टेट्रा पॉन्ड स्टिक्स 7:7:2 या प्रमाणात) खाऊ घालण्यात आली. प्रौढ डासांना 10% डेक्स्ट्रोज द्रावण आणि साप्ताहिक मानवी रक्त (अभ्यासासाठी रक्ताचे घटक) मुक्तपणे खाऊ घालण्यात आले. सूक्ष्मदर्शकाद्वारे टोकांची तपासणी करून कोष अवस्थेत नर आणि मादी वेगळे करून कुमारी डास मिळवण्यात आले. DsRed ट्रान्सजीन असलेल्या नरांचे वर्णन पूर्वी करण्यात आले आहे.
पूर्वी वर्णन केलेल्या प्रोटोकॉलनुसार सक्तीच्या मिलनाचे प्रयोग करण्यात आले. नैसर्गिक मिलनासाठी, ४ दिवसांच्या कुमारी माद्यांना लैंगिकदृष्ट्या प्रौढ कुमारी नरांसोबत १:३ या प्रमाणात दोन रात्री ठेवण्यात आले. ज्या प्रयोगांमध्ये नरांना dsEPP चे इंजेक्शन देण्यात आले, त्या प्रयोगांमध्ये त्यांना एकत्र पिंजऱ्यात ठेवण्याचा कालावधी इंजेक्शननंतर ३-४ दिवसांनी होता, जेव्हा फॉस्फेटेजची क्रियाशीलता सर्वाधिक प्रमाणात शांत झाली होती (विस्तारित डेटा आकृती २ब).
डासांच्या ऊती, मृतदेहाचे उर्वरित भाग किंवा संपूर्ण शरीर १००% मिथेनॉलमध्ये विच्छेदित करून बीडरने (२ मिमी काचेचे मणी, २,४०० आरपीएम, ९० सेकंद) एकजीव करण्यात आले. ऊतींचे प्रमाण आणि मिथेनॉलचे प्रमाण खालीलप्रमाणे होते: उर्वरित शरीर, १,००० µl मध्ये ५०; एमएजी, ८० µl मध्ये ५०-१००; मादी एलआरटी, ८० µl मध्ये २५-५०. अवक्षेपावर त्याच प्रमाणात मिथेनॉल वापरून दुसरी मिथेनॉल निष्कर्षण प्रक्रिया करण्यात आली. सेंट्रीफ्युगेशनद्वारे पेशींचे अवशेष काढून टाकण्यात आले. दोन्ही निष्कर्षणांमधील मिथेनॉल एकत्र करून नायट्रोजन प्रवाहाखाली वाळवण्यात आले, आणि नंतर पाण्यात ८०% मिथेनॉलच्या खालील प्रमाणात पुन्हा विरघळवण्यात आले: उर्वरित शरीर, ५० µl; एमएजी आणि मादी एलआरटी, ३० µl.
एलसी उपकरणाला (व्हॅनक्विश, थर्मो फिशर) जोडलेल्या मास स्पेक्ट्रोमीटरवर (आयडी-एक्स, थर्मो फिशर) नमुन्यांचे विश्लेषण करण्यात आले. २५ °C तापमानावर ठेवलेल्या ३ µm, १०० × ४.६ मिमी कॉलमवर (इन्स्पायर सी८, डिकमा) ५ µl नमुना इंजेक्ट करण्यात आला. एलसीसाठी मोबाइल फेज ए (पाणी, ०.१% फॉर्मिक ॲसिड) आणि बी (ॲसिटोनायट्राइल, ०.१% फॉर्मिक ॲसिड) होते. एलसी ग्रेडियंट खालीलप्रमाणे होता: १ मिनिटासाठी ५% बी, त्यानंतर ११ मिनिटांत १००% बी पर्यंत वाढवले. १००% वर ८ मिनिटांनंतर, ४ मिनिटांसाठी ५% बी वर कॉलम पुन्हा इक्विलिब्रेट करा. फ्लो रेट ०.३ मिली/मिनिट होता. एमएस सोर्समधील आयनीकरण पॉझिटिव्ह आणि निगेटिव्ह मोडमध्ये हीटेड इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरणाद्वारे साधले जाते.
मास स्पेक्ट्रोमीटर पूर्ण MS मोडमध्ये 60,000 रिझोल्यूशनवर 350 ते 680 m/z श्रेणीतील डेटा मोजतो. MS/MS डेटा [M + H]+ (सर्व लक्ष्य), [M - H2O + H]+ (सर्व लक्ष्य), आणि [M - H]- (फॉस्फोरिलेटेड लक्ष्य) वर मिळवला गेला. ज्या लक्ष्यांसाठी कोणतेही मानक उपलब्ध नव्हते, त्यांच्या इकडेसोन गुणधर्मांची पुष्टी करण्यासाठी MS/MS डेटा वापरला गेला. नॉन-टार्गेटेड इकडेस्टेरॉईड्स ओळखण्यासाठी, >15% सापेक्ष विपुलता असलेल्या सर्व HPLC पीक्सच्या MS/MS डेटाचे विश्लेषण केले गेले. शुद्ध मानकांपासून (20E, 3D20E) तयार केलेल्या मानक वक्रांचा वापर करून परिपूर्ण प्रमाण मोजण्यासाठी किंवा एका विशिष्ट नमुन्याच्या (इतर सर्व लक्ष्य) विरलतेचा वापर करून एका नरामध्ये आढळलेल्या प्रमाणांशी त्यांची समतुल्यता मोजण्यासाठी परिमापन केले गेले. 3D20E साठी, खालील अॅडक्ट्सच्या बेरजेचा वापर करून परिमापन केले गेले: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.ट्रेसफाइंडर (आवृत्ती ४.१) वापरून डेटा काढण्यात आला आणि त्याचे प्रमाण निश्चित करण्यात आले.एक्सकॅलिबर (आवृत्ती ४.४) वापरून एमएस/एमएस डेटाचे विश्लेषण करण्यात आले.ई, २०ई आणि ३डी२०ई यांच्या एमएस स्पेक्ट्राची तुलना संबंधित मानकांशी करण्यात आली.गिरार्डच्या अभिकर्मकासह डेरिव्हटायझेशनद्वारे ३डी२०ई२२पी चे विश्लेषण करण्यात आले.एम/झेड गुणोत्तराद्वारे २०ई२२पी चे विश्लेषण करण्यात आले.
3D20E22P हे MAG पासून शुद्ध केले गेले. HPLC-MS/MS विश्लेषणाप्रमाणेच त्याच LC परिस्थितीत, क्वाड्रपोल मास-आधारित डिटेक्टर (QDa, Acquity, Waters) असलेल्या अल्ट्रा-परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफ (Acquity, Waters) चा वापर करून विश्लेषणात्मक स्तरावर शुद्धीकरण केले गेले. जेव्हा 3D20E22P शी संबंधित m/z, पूर्वी निर्धारित केलेल्या त्याच रिटेन्शन टाइमवर आढळले, तेव्हा फ्रॅक्शन संकलन सुरू झाले. त्यानंतर, वर वर्णन केल्याप्रमाणे HPLC-MS/MS द्वारे निष्कर्षित संयुगांची शुद्धता तपासली गेली.
उत्पादकाच्या सूचनांनुसार, ट्राय रिएजंट (थर्मो फिशर) वापरून १०-१२ प्रजनन ऊती किंवा शरीराच्या इतर भागांमधून (डोके नसलेले) एकूण आरएनए काढण्यात आले. आरएनएवर टर्बो डीएनएज (थर्मो फिशर) वापरून प्रक्रिया करण्यात आली. उत्पादकाच्या सूचनांनुसार, मोलोनी म्युरिन ल्युकेमिया व्हायरस रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेज (एम-एमएलव्ही आरटी; थर्मो फिशर) वापरून सीडीएनए संश्लेषित करण्यात आले. रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन क्वांटिटेटिव्ह पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर; विस्तारित डेटा सारणी २) साठीचे प्रायमर्स पूर्वी प्रकाशित केलेले होते²⁴ किंवा प्रायमर-ब्लास्ट²⁶ वापरून डिझाइन केलेले होते, ज्यामध्ये ७०-१५० बीपी आकाराच्या आणि एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन व्यापणाऱ्या उत्पादनांना किंवा एक्सॉन वेगळे करणाऱ्या प्रायमर जोडीला प्राधान्य देण्यात आले. आरटी-क्यूपीसीआरसाठी तीन ते चार जैविक प्रतिकृतींमधील सीडीएनए नमुने पाण्यात चारपट पातळ करण्यात आले. परिमापन १५ µl प्रतिकृती अभिक्रियांमध्ये करण्यात आले, ज्यात १× पॉवरअप सायबर ग्रीन मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर), प्रायमर्स आणि ५ µl पातळ केलेले द्रावण होते. cDNA.क्वांटस्टुडिओ 6 प्रो रिअल-टाइम पीसीआर सिस्टम (थर्मो फिशर) वर प्रतिक्रिया चालवल्या गेल्या आणि डिझाइन आणि विश्लेषण (आवृत्ती 2.4.3) वापरून डेटा गोळा आणि विश्लेषण केला गेला. या अभ्यासात दाखवल्याप्रमाणे, सापेक्ष प्रमाण राइबोसोमल जीन RpL19 (AGAP004422) शी सामान्यीकृत केले गेले, ज्याची अभिव्यक्ती रक्त सेवन 27 किंवा संभोग 3 ने लक्षणीयरीत्या बदलली नाही.
RNA ची गुणवत्ता Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) वापरून तपासण्यात आली. Illumina paired-end libraries MIT आणि Harvard च्या Broad Institute मध्ये तयार करून चालवण्यात आल्या. HISAT2 (आवृत्ती 2.0.5) वापरून डीफॉल्ट पॅरामीटर्ससह सिक्वेन्सिंग रीड्स A. gambiae जीनोम (PEST स्ट्रेन, आवृत्ती 4.12) शी संरेखित करण्यात आले. Samtools (आवृत्ती 1.3.1) वापरून <30 मॅपिंग गुणवत्ता (MAPQ) स्कोअर असलेले रीड्स काढून टाकण्यात आले. htseq-count (आवृत्ती 0.9.1) वापरून डीफॉल्ट पॅरामीटर्ससह जीन्सवर मॅप केलेल्या रीड्सची संख्या मोजण्यात आली. R (आवृत्ती 4.0.3) मधील DESeq2 पॅकेज (आवृत्ती 1.28.1) वापरून नॉर्मलाइज्ड रीड काउंट्सची गणना करण्यात आली आणि भिन्न जीन अभिव्यक्तीचे विश्लेषण करण्यात आले.
एक्डायसोन-सुधारित करणारे संभाव्य जनुके ओळखण्यासाठी, सर्वप्रथम A. gambiae जीनोममध्ये PSI-BLAST अल्गोरिदम (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) वापरून शोध घेण्यात आला. यासाठी पॅरामीटर्सची डीफॉल्ट मूल्ये आणि खालील क्वेरी प्रोटीन सिक्वेन्सेस वापरण्यात आले: Bombyx mori (अ‍ॅक्सेशन क्र. NP_001038956.1), Musca domestica (अ‍ॅक्सेशन क्र. XP_005182020.1, XP_005175332.1 आणि XP_011294434.1) आणि Microplitis demolitor (अ‍ॅक्सेशन क्र. XP_008552646.1 आणि XP_008552645.1) पासून; B. mori (अ‍ॅक्सेशन क्र. NP_001036900), Drosophila melanogaster (अ‍ॅक्सेशन क्र. NP_651202), Apis पासून. मेलिफेरा (अ‍ॅक्सेशन क्र. XP_394838) आणि अ‍ॅसिर्थोसायफोन पिसम (अ‍ॅक्सेशन क्र. XP_001947166); आणि बी. मोरी (अ‍ॅक्सेशन क्र. XP_001947166) NP_001177919.1 आणि NP_001243996.1) पासून EPP आणि डी. मेलानोगास्टर (अ‍ॅक्सेशन क्र. NP_572986.1) चे EO (पायरी 1). पुढे, गांबियामधील प्रजनन ऊतींमध्ये (मादी LRT किंवा MAG) उच्च mRNA अभिव्यक्तीवर (>100 फ्रॅगमेंट्स/किलोबेस एक्सॉन प्रति दशलक्ष मॅप्ड रीड्स (FPKM) किंवा >85%) आधारित हिट्स फिल्टर करा (पायरी 2). विशिष्टता सुधारण्यासाठी, आम्ही असे उमेदवार एन्झाइम्स निवडले जे ए. अल्बिमानसच्या प्रजनन ऊतींमध्ये देखील व्यक्त होतात. ही ॲनोफिलीसची एक प्रजाती आहे जी मिलनादरम्यान एकडायसोनचे संश्लेषण किंवा हस्तांतरण करत नाही. ए. अल्बिमानसच्या प्रजनन ऊतींमध्ये कमी अभिव्यक्तीच्या (<100 FPKM किंवा <85 वे पर्सेन्टाइल) आधारावर उमेदवार जीन्स फिल्टर केले गेले (पायरी ३). अंतिम फिल्टर म्हणून (पायरी ४), उमेदवार जीन्सनी खालीलपैकी किमान एक अट पूर्ण करणे आवश्यक आहे: (१) भिन्नपणे व्यक्त झालेल्या जीन्सच्या विश्लेषणानुसार मिलनानंतर लक्षणीयरीत्या अप-रेग्युलेटेड (P < 0.05) आणि (२) गैर-प्रजनन ऊतींमध्ये (< 85 % किंवा <100 FPKM).
संपूर्ण जीवाचे आयसोटोपिक लेबलिंग साध्य करण्यासाठी आम्ही पूर्वी वर्णन केलेल्या पद्धती २८,२९,३० मध्ये बदल केले. थोडक्यात, वाइल्ड-टाइप सॅकरोमायसेस सेरेव्हिसिया प्रकार II (YSC2, सिग्मा) ची चाचणी यीस्ट नायट्रोजन बेस (BD Difco, DF0335) मध्ये करण्यात आली, ज्यामध्ये (वजन/घनफळ) २% ग्लुकोज (G7528, सिग्मा), १.७% अमिनो ॲसिड-मुक्त आणि अमोनियम सल्फेट होते. नायट्रोजनचा एकमेव स्रोत म्हणून कल्चर माध्यम आणि ५% १५N अमोनियम सल्फेट (NLM-713, >९९%, केंब्रिज आयसोटोप लॅबोरेटरीज) वापरण्यात आले. सेंट्रीफ्युगेशनद्वारे यीस्ट वेगळे करण्यात आले आणि डासांच्या अळ्यांना कोष बनण्यापर्यंत मुक्तपणे खाद्य देण्यात आले. चौथ्या अवस्थेतील मृत्यू टाळण्यासाठी फिशमील (३०० अळ्यांमागे ०.५ मिग्रॅ) पूरक म्हणून देण्यात आले. त्यानंतर, मिलनादरम्यान हस्तांतरित झालेल्या नर प्रोटिओमचे विश्लेषण करण्यासाठी, लेबल न लावलेल्या नरांसोबत मिलन प्रयोगांमध्ये फक्त माद्यांचा वापर करण्यात आला.
४-६ दिवसांच्या १५एन-टॅग लावलेल्या कुमारी माद्यांना त्यांच्याच वयाच्या टॅग न लावलेल्या कुमारी नरांसोबत समागम करण्यास भाग पाडले गेले. एपिफ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोपीखाली समागमाचे प्लग शोधून यशस्वी समागमाची पडताळणी करण्यात आली. समागमानंतर ३, १२ आणि २४ तासांनी, समागम झालेल्या ४५-५५ माद्यांचे अलिंद ५० µl अमोनियम बायकार्बोनेट बफर (पीएच ७.८) मध्ये विच्छेदित करून मुसळाने एकजीव करण्यात आले. एकजीव केलेल्या मिश्रणाला सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले आणि वरचा द्रव ५० mM अमोनियम बायकार्बोनेटमधील ०.१% रॅपीजेस्ट (१८६००, वॉटर्स) च्या ५० µl मध्ये मिसळण्यात आला. प्रत्येक नमुन्यातील वरचा द्रव आणि गोळा ड्राय आईसवर त्वरित गोठवण्यात आले आणि रातोरात वॉशिंग्टन विद्यापीठातील मॅककॉस प्रयोगशाळेत पाठवण्यात आले, जिथे एलसी-एमएस/एमएस साठी नमुन्याची तयारी पूर्ण करण्यात आली. गोळा ५० µl ०.१% मध्ये पुन्हा विरघळवा. रॅपीजेस्ट ५० mM अमोनियम बायकार्बोनेटमध्ये विरघळवून वॉटर बाथमध्ये सोनिकेट केले. पेललेट आणि सुपरनॅटंटमधील प्रथिनांची घनता BCA अ‍ॅसेद्वारे मोजण्यात आली, नमुने ५ mM डायथियोथ्रिटॉल (DTT; सिग्मा) ने रिड्यूस केले, १५ mM आयोडोॲसिटामाइड (सिग्मा) ने अल्किलेट केले आणि ३७ °C (१:५०) तापमानावर १ तासासाठी ट्रिप्सिनायझेशन: ट्रिप्सिन:सबस्ट्रेट गुणोत्तरासह इनक्युबेट केले. २०० mM HCl टाकून रॅपीजेस्टचे लायसिस केले, त्यानंतर ३७ °C तापमानावर ४५ मिनिटांसाठी इनक्युबेट केले आणि कचरा काढण्यासाठी ४ °C तापमानावर १४,००० rpm वेगाने १० मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्युगेशन केले. नमुने ड्युअल-मोड सॉलिड-फेज एक्सट्रॅक्शन (ओॲसिस MCX कार्ट्रिज, वॉटर्स) द्वारे धुतले गेले आणि ०.३३ µg µl-1 च्या अंतिम प्रथिन घनतेसाठी ०.१% फॉर्मिक ॲसिडमध्ये पुन्हा सस्पेंड केले गेले. अनलेबल MAG त्याचप्रमाणे कुमारी नरांच्या प्रोटीओमचे विश्लेषण करण्यात आले. प्रत्येक नमुन्यासाठी दोन विश्लेषणात्मक प्रतिकृतींचे विश्लेषण करण्यात आले. पुढे, ज्युपिटर C12 रिव्हर्स्ड-फेज रेझिन (फेनोमेनेक्स) ने भरलेल्या 4-सेमी फ्यूज्ड सिलिका कासिल1 (PQ) फ्रिट ट्रॅपसह 25-सेमी फ्यूज्ड सिलिका 75-μm कॉलम आणि 180-मिनिटांच्या लिक्विड क्रोमॅटोग्राफीचा वापर करून प्रत्येकी 1 µg चे विश्लेषण करण्यात आले. नमुना डायजेस्ट – एमएस/एमएस (MS/MS) हे नॅनोएसीक्विटी यूपीएलसी सिस्टीम (वॉटर्स) सह क्यू-एक्झॅक्टिव्ह एचएफ मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर) वर चालवले गेले. प्रत्येक रनसाठी तयार केलेला डेटा-संबंधित अधिग्रहण डेटा, प्रोटिओविझार्ड (आवृत्ती 3.0.20287) आणि कॉमेट31 (आवृत्ती 3.2) वापरून, अनोफेलेस गॅम्बिया (व्हेक्टरबेस आवृत्ती 54), अनोफेलेस कोलुझी यांच्या प्रथिन अनुक्रमांचा समावेश असलेल्या फास्टा (FASTA) डेटाबेसमध्ये एमझेडएमएल (mzML) फॉरमॅटमध्ये रूपांतरित केला गेला. माली-एनआयएच (व्हेक्टरबेस आवृत्ती 54), सॅकरोमायसेस सेरेव्हिसिया (युनिप्रोट, मार्च 2021), ए. गॅम्बिया आरएनए-सीक (A. gambiae RNA-seq) आणि ज्ञात मानवी दूषित घटकांच्या थ्री-फ्रेम भाषांतरांवर शोध घेण्यात आला. पेप्टाइड मॅप-मॅच्ड एफडीआर (FDRs) पर्कोलेटर32 (आवृत्ती 3.05) वापरून 0.01 च्या थ्रेशोल्डसह निर्धारित केले गेले आणि प्रथिन पार्सिमनी वापरून पेप्टाइड्सना प्रथिन ओळखींमध्ये एकत्र केले गेले. लाइमलाइट३३ (आवृत्ती २.२.०). पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे, प्रत्येक रनमधील प्रत्येक प्रथिनासाठी गणना केलेल्या सामान्यीकृत स्पेक्ट्रल अबंडन्स फॅक्टर (NSAF) चा वापर करून सापेक्ष प्रथिन विपुलतेचा अंदाज लावण्यात आला. प्रत्येक प्रथिनाच्या सापेक्ष NSAF ची सरासरी दोन वेगवेगळ्या जैविक प्रतिकृतींमधील नमुन्यांमधून काढण्यात आली. १५N लेबलिंगने स्त्री प्रोटिओम यशस्वीरित्या लपवले, तरीही लेबल केलेल्या कुमारींमधून थोड्या प्रमाणात लेबल न केलेले प्रथिन शोधता आले. HPLC "कॅरी ओव्हर" चा परिणाम म्हणून, आम्ही स्त्री कच्च्या नमुन्यांमध्ये पुरुष प्रथिनांची घट (१-५ स्पेक्ट्रा) फक्त तांत्रिक रनमध्ये नोंदवली, जिथे कच्चे नमुने पुरुष/संभोग नमुन्यांनंतर चालवले गेले. लेबल केलेल्या कुमारींमधून 'दूषित घटक' म्हणून अधूनमधून आढळलेल्या प्रथिनांची यादी परिशिष्ट सारणी १ मध्ये दिली आहे.
जेनस्क्रिप्टमधील दोन अँटीजेनिक पेप्टाइड्स, QTTDRVAPAPDQQQ (PA आयसोटाइपमधील) आणि MESDGTTPSGDSEQ (PA आणि PB आयसोटाइपमधील). हे दोन पेप्टाइड्स एकत्र करून, KLH या वाहक प्रथिनाशी संयुग्मित करण्यात आले आणि न्यूझीलंड सशांमध्ये इंजेक्ट करण्यात आले. चौथ्या इंजेक्शननंतर सशांना मारण्यात आले आणि ॲफिनिटी प्युरिफिकेशनद्वारे एकूण IgG वेगळे करण्यात आले. सर्वात जास्त EPP-विशिष्ट सशाकडून मिळालेले IgG पुढील वेस्टर्न ब्लॉटिंगसाठी वापरण्यात आले.
वेस्टर्न ब्लॉटसाठी, ४ दिवसांच्या कुमारी नर आणि कुमारी किंवा जबरदस्तीने समागम केलेल्या माद्या (<१० समागमानंतर) यांच्यापासून घेतलेले MAG (n = १०, जिथे n जैविकदृष्ट्या स्वतंत्र डासांच्या नमुन्यांची संख्या दर्शवते) आणि मादी LRT (n = ३०) नमुने घेण्यात आले. प्रोटीन एक्सट्रॅक्शन बफर (५० mM ट्रिस, pH ८.०; १% NP-४०; ०.२५% सोडियम डीऑक्सीकोलेट; १५० mM NaCl; १ mM EDTA; १× प्रोटीएज इनहिबिटर कॉकटेल (रोश)) स्वतंत्रपणे टाकण्यात आले. विच्छेदन केल्यानंतर लगेचच बीडरने (२ मिमी काचेचे मणी, २,४०० rpm, ९० सेकंद) नमुने एकजीव करण्यात आले. ४ °C तापमानावर २०,००० g वेगाने सेंट्रीफ्यूगेशन करून अविद्राव्य कचरा काढून टाकण्यात आला. ब्रॅडफोर्ड चाचणी (बायो-रॅड) द्वारे प्रथिनांचे प्रमाण निश्चित करण्यात आले. त्यानंतर, २० µg MAG प्रोटीन, ४० µg LRT प्रोटीन, आणि २० µg LRT प्रोटीन टाकण्यात आले. µg अवशिष्ट बल्क प्रोटीनचे MOPS बफर वापरून 10% बिस-ट्रिस NuPAGE द्वारे विकृतीकरण करून विलगीकरण करण्यात आले. iBlot2 ट्रान्सफर सिस्टीम (थर्मो फिशर) वापरून प्रोटीन्स पॉलिव्हिनिलिडेन फ्लोराइड मेम्ब्रेन्सवर हस्तांतरित करण्यात आले. मेम्ब्रेन्स 1× PBS-T (PBS मध्ये 0.1% ट्विन-20) मध्ये दोनदा धुतले गेले आणि नंतर 22°C तापमानावर 1 तासासाठी ओडिसी ब्लॉकिंग बफर (ली-कॉर) मध्ये ब्लॉक केले गेले. मेम्ब्रेन्स 4°C तापमानावर रात्रभर कस्टम रॅबिट अँटी-EPP पॉलीक्लोनल प्रायमरी अँटीबॉडी (ब्लॉकिंग बफरमध्ये 1:700) आणि रॅट अँटी-ॲक्टिन मोनोक्लोनल प्रायमरी अँटीबॉडी MAC237 (एबीम; 1:4,000) सोबत हलवले गेले. मेम्ब्रेन्स PBS-T ने धुतले गेले आणि नंतर ब्लॉकिंग बफरमध्ये असलेल्या सेकंडरी अँटीबॉडीज (डोंकी अँटी-रॅबिट 800CW आणि गोट अँटी-रॅट 680LT (ली-कॉर), दोन्ही 1:20,000) सोबत इनक्यूबेट केले गेले. २२°C तापमानावर १ तासासाठी ०.०१% SDS आणि ०.२% Tween-20 वापरण्यात आले. मेम्ब्रेन्स PBS-T ने धुतले गेले आणि ओडिसी CLx स्कॅनरने त्यांची प्रतिमा घेतली गेली. इमेज स्टुडिओ (आवृत्ती ५.२) मध्ये प्रतिमा गोळा करून त्यावर प्रक्रिया करण्यात आली. EPP-RA आयसोफॉर्मशी (८२ kDa) संबंधित असलेला एक विशिष्ट बँड आढळला नाही.
EPP (हिस्टिडिन फॉस्फेटेज डोमेन असलेल्या AGAP002463-RB आयसोफॉर्म म्हणून, NCBI संरक्षित डोमेन शोध 34) आणि EcK2 (AGAP002181) चे कोडिंग क्षेत्र pET-21a(+) प्लास्मिड (नोव्हाजेन मिलिपोर सिग्मा) मध्ये क्लोन केले गेले; प्रायमर्स विस्तारित डेटा सारणी २ मध्ये सूचीबद्ध आहेत. pET-21a(+)-EcK2 कन्स्ट्रक्टच्या C-टर्मिनल 6xHis टॅगच्या आधी आठ GS4 लिंकर्स (एकामागोमाग एक) समाविष्ट केले गेले. NEBExpress सेल-फ्री ई. कोलाय प्रोटीन संश्लेषण रिअॅक्शन (न्यू इंग्लंड बायो लॅब्स) वापरून रिकॉम्बिनंट प्रथिने तयार केली गेली. NEBExpress Ni स्पिन कॉलम्स (न्यू इंग्लंड बायो लॅब्स) वापरून रिकॉम्बिनंट प्रथिने शुद्ध केली गेली. NEBExpress सेल-फ्री ई. कोलाय प्रोटीन संश्लेषण किटमधील DNA टेम्प्लेट वापरून डायहायड्रोफोलेट रिडक्टेज (DHFR) कंट्रोल प्रोटीन तयार केले गेले. प्रथिने PBS मधील ५०% ग्लिसरॉलमध्ये -२० °C तापमानावर ३ महिन्यांपर्यंत साठवली गेली.
ईपीपी (EPP) आणि ऊतींच्या अर्काची फॉस्फेटेज क्रियाशीलता ४-नायट्रोफेनिल फॉस्फेट (pNPP; सिग्मा-अल्ड्रिच) वापरून मोजण्यात आली. रिॲक्शन बफरमध्ये २५ mM ट्रिस, ५० mM ॲसेटिक ॲसिड, २५ mM बिस-ट्रिस, १५० mM NaCl, ०.१ mM EDTA, आणि १ mM DTT होते. ऊतींना रिॲक्शन बफरमध्ये एकजीव करण्यात आले आणि सेंट्रीफ्युगेशनद्वारे पेशींचे अवशेष काढून टाकण्यात आले. २.५ mg ml-1 pNPP असलेल्या रिॲक्शन बफरमध्ये एन्झाइम किंवा ऊतींचा अर्क घालून अभिक्रिया सुरू करा. अभिक्रियेचे मिश्रण खोलीच्या तापमानावर अंधारात ठेवण्यात आले आणि वेगवेगळ्या वेळी ४०५ nm वर शोषणक्षमता मोजून pNPP पासून रूपांतरित झालेल्या pNP चे प्रमाण निश्चित करण्यात आले.
इन विट्रो EcK क्रियाशीलतेसाठी, प्रोटीनला 0.2 mg 20E किंवा 3D20E सोबत 200 µl बफर (pH 7.5) मध्ये 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP आणि 10 mM MgCl2 सह 27 °C तापमानावर 2 तास उबवण्यात आले. 800 µl मिथेनॉल टाकून अभिक्रिया थांबवण्यात आली, नंतर -20 °C तापमानावर 1 तास थंड करण्यात आले, आणि त्यानंतर 4 °C तापमानावर 20,000 g वेगाने 10 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले. त्यानंतर सुपरनॅटंटचे HPLC-MS/MS द्वारे विश्लेषण करण्यात आले. नियंत्रण गटामध्ये वापरलेल्या प्रोटीन्सना उष्णतेने निष्क्रिय करण्यासाठी, प्रोटीन्सना PBS मधील 50% ग्लिसरॉलमध्ये 95°C तापमानावर 20 मिनिटांसाठी उबवण्यात आले.
इन विट्रो EPP क्रियाशीलतेसाठी, प्रोटीनला 3D20E22P (HPLC-MS/MS द्वारे शुद्ध केलेल्या, MAG च्या 18 जोड्यांमध्ये आढळणाऱ्या प्रमाणाएवढे) सोबत 100 µl बफर (pH 7.5) मध्ये 27 °C तापमानावर 3 तासांसाठी इनक्युबेट करण्यात आले. या बफरमध्ये 25 mM ट्रिस, 50 mM ऍसिटिक ऍसिड, 25 mM बिस-ट्रिस, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, आणि 1 mM DTT यांचा समावेश होता. 400 µl मिथेनॉल टाकून अभिक्रिया थांबवण्यात आली आणि -20 °C तापमानावर 1 तासासाठी थंड करण्यात आले, त्यानंतर 4 °C तापमानावर 20,000 g वेगाने 10 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले. सुपरनॅटंटचे विश्लेषण HPLC-MS/MS द्वारे करण्यात आले.
मिश्र-लिंगी शिरहीन डासांच्या मृतदेहांपासून तयार केलेल्या cDNA मधून EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) आणि EcK2 (556 bp) साठी PCR फ्रॅगमेंट्स ॲम्प्लिफाय करण्यात आले. eGFP कंट्रोलचा PCR फ्रॅगमेंट (495 bp) पूर्वी वर्णन केलेल्या pCR2.1-eGFP मधून ॲम्प्लिफाय करण्यात आला; PCR प्राइमर्स विस्तारित डेटा सारणी २ मध्ये सूचीबद्ध आहेत. PCR फ्रॅगमेंट pL4440 प्लास्मिडवरील इन्व्हर्टेड T7 प्रमोटर्सच्या मध्ये समाविष्ट करण्यात आला. प्लास्मिड कन्स्ट्रक्ट्स NEB 5-α कॉम्पिटंट E. coli (न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स) मधून मिळवण्यात आले आणि वापरण्यापूर्वी DNA सिक्वेन्सिंगद्वारे सत्यापित करण्यात आले (इन्सर्ट सिक्वेन्ससाठी पूरक डेटा १ पहा). pL4440-आधारित प्लास्मिडमधून इन्सर्ट ॲम्प्लिफाय करण्यासाठी T7 प्रमोटरशी जुळणारे प्राइमर्स (विस्तारित डेटा सारणी २) वापरण्यात आले. PCR उत्पादनाचा आकार ॲगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसद्वारे निश्चित करण्यात आला. मेगास्क्रिप्ट T7 ट्रान्सक्रिप्शन किट (थर्मो फिशर) वापरून PCR टेम्प्लेट्समधून dsRNA चे ट्रान्सक्रिप्शन करण्यात आले आणि पूर्वी वर्णन केलेल्या सुधारणांसह निर्मात्याच्या सूचनांनुसार ते शुद्ध करण्यात आले.
dsRNA इंजेक्शनसाठी, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) हे प्रौढ नर किंवा मादीच्या वक्षस्थळात (नॅनोजेक्ट III, ड्रमंड) अंड्यातून बाहेर पडल्यानंतर 1 दिवसाच्या आत 10 ng nl-1 या सांद्रतेने इंजेक्ट केले गेले. जीन नॉकडाउनची पातळी RNA निष्कर्षण, cDNA संश्लेषण आणि RT-qPCR द्वारे किमान तीन जैविक प्रतिकृतींमध्ये निर्धारित केली गेली. एकडायसोन इंजेक्शनसाठी, 4-दिवसांच्या कुमारी किंवा 6-दिवसांच्या कुमारी, रक्त-भक्षण केलेल्या माद्यांना प्रायोगिक रचनेनुसार अनुक्रमे 1.3, 2.1 या सांद्रतेने 0.13, 0.21, किंवा 0.63 µg 20E किंवा 3D20E (नॅनोजेक्ट III, ड्रमंड) किंवा 6.3 ng nl-1 या सांद्रतेने इंजेक्ट केले गेले. पाण्यात 10% (vol/vol) इथेनॉलचे 100 nl इंजेक्ट करा; १०% इथेनॉलमधील १०० एनएल 3D20E22P (MAG च्या जोडीमध्ये आढळणाऱ्या प्रमाणाच्या ७५% च्या समतुल्य). डासांना इंजेक्शन गटात यादृच्छिकपणे नियुक्त केले गेले.
प्रजनन चाचण्यांसाठी, ३ दिवसांच्या माद्यांना मानवी रक्त मुक्तपणे खाऊ घालण्यात आले. अर्धवट खाल्लेले किंवा न खाल्लेले डास काढून टाका. उपचारानुसार, माद्यांना रक्तपान केल्यानंतर किमान ४८ तासांनी चार रात्रींसाठी वेगळ्या प्रजनन कपांमध्ये ठेवण्यात आले. स्टिरिओस्कोप (स्टेमी ५०८, झाईस) खाली अंड्यांची गणना करण्यात आली; मिलन झालेल्या माद्यांच्या बाबतीत, ज्या अंड्यांमधून अळ्या बाहेर आल्या, ती अंडी सुपीक मानली गेली.
प्रजनन चाचण्यांसाठी, उपचारानुसार माद्यांना प्रजननास प्रतिकारशक्ती विकसित करण्यासाठी किमान २ दिवसांचा अवधी देण्यात आला आणि त्यानंतर त्याच वयाचे वन्य-प्रकारचे नर त्याच पिंजऱ्यात सोडण्यात आले. दोन रात्रींनंतर, मादीच्या फलित पुटिकांचे विच्छेदन करण्यात आले आणि १० mM ट्रिस-एचसीएल, १ mM ईडीटीए, आणि २५ mM एनएसीएल (पीएच ८.२) असलेल्या बफरमध्ये गोठवून-वितळवून आणि सोनिकेशनद्वारे जीनोमिक डीएनए वेगळा करण्यात आला. नमुन्यांना ५५ °C तापमानावर १५ मिनिटांसाठी प्रोटीनेज के (०.८६ µg µl-1) सोबत, त्यानंतर ९५ °C तापमानावर १० मिनिटांसाठी उबवण्यात आले. कच्च्या जीनोमिक डीएनए तयारीला १०-पट पातळ करून वाय गुणसूत्र अनुक्रमांच्या क्यूपीसीआर शोधासाठी वापरण्यात आले; प्रायमर्स विस्तारित डेटा सारणी २ मध्ये सूचीबद्ध आहेत. वाय गुणसूत्र अनुक्रमाची अनुपस्थिती प्रजनन झाले नाही हे दर्शवते.
पुनर्मिलन चाचण्यांसाठी, जबरदस्तीने समागम केलेल्या माद्यांची समागम स्थितीची पुष्टी करण्यासाठी त्यांच्यामध्ये 'मेटिंग प्लग'ची उपस्थिती तपासण्यात आली आणि नरांच्या अनुपस्थितीत त्यांना समागमासाठी प्रतिकारक्षमता विकसित करण्यासाठी २ दिवसांचा अवधी देण्यात आला, जसे पूर्वी वर्णन केले आहे ३६. त्यानंतर DsRed ट्रान्सजेनिक शुक्राणू असलेले नर माद्यांच्या पिंजऱ्यांमध्ये सोडण्यात आले. दोन रात्रींनंतर, माद्यांमधून फलन करणारे पुटिका (fertilizing vesicles) वेगळे करण्यात आले, आणि वर वर्णन केल्याप्रमाणे जीनोमिक डीएनए तयार करून DsRed ट्रान्सजीनच्या qPCR शोधासाठी वापरण्यात आला; प्रायमर्सची यादी विस्तारित डेटा सारणी २ मध्ये दिली आहे. DsRed ट्रान्सजीनच्या अनुपस्थितीने हे सूचित झाले की कोणतेही पुनर्मिलन झाले नाही.
3D20E चे संश्लेषण पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे 37 केले गेले. थोडक्यात, 10 मिलीग्राम 20E (सिग्मा-अल्ड्रिच) 10 मिली पाण्यात विरघळवले, त्यानंतर 30 मिलीग्राम प्लॅटिनम ब्लॅक (पावडर स्वरूपात, सिग्मा-अल्ड्रिच) त्यात टाकले. अभिक्रिया मिश्रणात O2 चा एक सौम्य प्रवाह सतत बुडबुडवला गेला, जे खोलीच्या तापमानावर ढवळले जात होते. 6 तासांनंतर, अभिक्रिया थांबवण्यासाठी 30 मिली मिथेनॉल टाकले गेले. उत्प्रेरक कण काढून टाकण्यासाठी मिश्रण सेंट्रीफ्यूज केले गेले. सुपरनॅटंट खोलीच्या तापमानावर व्हॅक्युओमध्ये पूर्णपणे कोरडे होईपर्यंत बाष्पीभवन केले गेले. कोरडे झालेले अभिक्रिया उत्पादन HPLC-MS/MS विश्लेषणासाठी इंजेक्शनकरिता 10% इथेनॉल आणि मिथेनॉलमध्ये विरघळवले गेले. रूपांतरण दर (20E पासून 3D20E पर्यंत) अंदाजे 97% होता (आकृती 4b), आणि संश्लेषित 3D20E चा MS स्पेक्ट्रम समागम केलेल्या माद्यांमध्ये आढळलेल्या स्पेक्ट्रमशी जुळला (आकृती 4c).
केलेल्या सांख्यिकीय चाचण्यांचा विशिष्ट तपशील लीजेंडमध्ये दिलेला आहे. फिशरची अचूक चाचणी, मॅन्टेल-कॉक्स चाचणी आणि स्टुडंटची टी-चाचणी करण्यासाठी ग्राफपॅड (आवृत्ती ९.०) वापरण्यात आले. कॉकरन-मॅन्टेल-हेन्झेल चाचण्या एका कस्टम आर स्क्रिप्टचा वापर करून करण्यात आल्या (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test येथे उपलब्ध). डेटा वितरणाची सामान्यता शॅपिरो-विल्क चाचणीद्वारे तपासण्यात आली, ज्यासाठी ०.०५ ची सार्थकता मर्यादा होती. जेव्हा डेटा सामान्यता चाचणीत अयशस्वी झाला, तेव्हा मॅन-व्हिटनी चाचणी करण्यात आली. सर्व्हायव्हल डेटाचे विश्लेषण मॅन्टेल-कॉक्स चाचणीद्वारे करण्यात आले. आरएनए-सीक जीन-स्तरीय भिन्न अभिव्यक्ती विश्लेषण करण्यासाठी डीईएसईक्यू२ पॅकेज (आवृत्ती १.२८.१) वापरण्यात आले. आलेखावरील आडवी पट्टी मध्यक दर्शवते. सर्व चाचण्यांसाठी P = ०.०५ ही सार्थकता मर्यादा वापरण्यात आली.
अभ्यासाच्या रचनेबद्दल अधिक माहितीसाठी, या लेखाशी जोडलेला नेचर रिसर्च रिपोर्टचा सारांश पहा.
MS प्रोटीओमिक डेटा PRIDE पार्टनर रिपॉझिटरी (https://www.ebi.ac.uk/pride/) द्वारे PXD032157 या डेटासेट आयडेंटिफायरसह प्रोटीओमएक्सचेंज कन्सोर्टियम (http://proteomecentral.proteomexchange.org) मध्ये जमा करण्यात आला.
RNA-seq डेटासेट जीन एक्सप्रेशन कॉम्प्रिहेन्सिव्ह लायब्ररी (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) मध्ये GSE198665 या अनुक्रमांकाखाली जमा करण्यात आला आहे.
या अभ्यासादरम्यान तयार केलेला आणि/किंवा विश्लेषण केलेला अतिरिक्त डेटासेट, वाजवी विनंतीनुसार संबंधित लेखकांकडून मिळवता येईल. या लेखात स्रोत डेटा दिलेला आहे.
डी लूफ, ए. एक्डायस्टेरॉईड्स: दुर्लक्षित कीटक लैंगिक स्टेरॉइड्स? पुरुष: ब्लॅक बॉक्स. कीटक विज्ञान. 13, 325–338 (2006).
रेडफर्न, सीपीएफ 20-हायड्रॉक्सीएक्डिसोन आणि अ‍ॅनोफिलीस स्टीफन्समध्ये अंडाशयाचा विकास. जे. इन्सेक्ट फिजिओलॉजी. 28, 97–109 (1982).