Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अपडेटेड ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड बंद करा). दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि जावास्क्रिप्टशिवाय साइट प्रदर्शित करू.
पृष्ठवंशी प्राण्यांच्या विपरीत, कीटकांमध्ये नर-पक्षपाती लैंगिक स्टिरॉइड संप्रेरकांची कमतरता असल्याचे मानले जाते. अ‍ॅनोफिलिस गॅम्बियामध्ये, एक्डीसोन स्टिरॉइड २०-हायड्रॉक्सीएक्डीसोन (२०ई) हे मादी २ द्वारे संश्लेषित केल्यावर अंडी विकास नियंत्रित करण्यासाठी आणि नर ३ द्वारे लैंगिक हस्तांतरण केल्यावर वीण रीफ्रॅक्टरी कालावधी प्रेरित करण्यासाठी विकसित झाले आहे असे दिसते. अंडी विकास आणि वीण हे आवश्यक पुनरुत्पादक गुणधर्म असल्याने, मादी अ‍ॅनोफिलिस डास हे हार्मोनल सिग्नल कसे एकत्रित करतात हे समजून घेतल्याने नवीन मलेरिया नियंत्रण कार्यक्रमांची रचना सुलभ होऊ शकते. येथे, आम्ही उघड करतो की ही पुनरुत्पादक कार्ये एक्डीस्टेरॉइड-सक्रिय/निष्क्रिय करणाऱ्या एन्झाईम्सच्या जटिल नेटवर्कद्वारे विशिष्ट लैंगिक स्टिरॉइड्सद्वारे नियंत्रित केली जातात. आम्ही एक नर-विशिष्ट ऑक्सिडाइज्ड एक्डीसोन, ३-डिहायड्रो-२०ई (३डी२०ई) ओळखले, जे लैंगिक हस्तांतरणानंतर मादी लैंगिक ग्रहणक्षमता बंद करून पालकत्वाचे संरक्षण करते आणि डिफॉस्फोरायलेशनद्वारे सक्रिय होते. उल्लेखनीय म्हणजे, ३डी२०ई हस्तांतरणामुळे प्लाझमोडियम संसर्गादरम्यान अंडी विकास राखणाऱ्या पुनरुत्पादक जनुकांची अभिव्यक्ती देखील प्रेरित झाली, ज्यामुळे संक्रमित मादींचे आरोग्य सुनिश्चित होते. मादी-व्युत्पन्न २०ई लैंगिक प्रतिसाद देत नाही, परंतु २०ई-प्रतिरोधक काइनेसेस प्रतिबंधित झाल्यानंतर वीण करणाऱ्या व्यक्तींना अंडी घालण्याची परवानगी देते. या नर-विशिष्ट कीटक स्टिरॉइड संप्रेरकाची ओळख आणि महिला लैंगिक ग्रहणक्षमता, प्रजनन क्षमता आणि प्लाझमोडियमशी परस्परसंवाद नियंत्रित करण्यात त्याची भूमिका मलेरिया पसरवणाऱ्या डासांच्या पुनरुत्पादन यश कमी करण्याची क्षमता सूचित करते.
मानवी मलेरिया परजीवींचा एकमेव वाहक असलेल्या अ‍ॅनोफिलीस डासांमध्ये कीटकनाशकांच्या व्यापक प्रतिकारामुळे मलेरियाचे रुग्ण आणि मृत्यू पुन्हा वाढत आहेत. या डासांचे मिलन जीवशास्त्र हे नवीन मलेरिया नियंत्रण हस्तक्षेपांसाठी विशेषतः आकर्षक लक्ष्य आहे कारण माद्या फक्त एकदाच सोबती करतात5; या एकाच वीण घटनेला निर्जंतुकीकरण केल्याने शेतातील डासांची संख्या कमी करण्याची मोठी क्षमता असेल.
पुरुषांकडून उच्च-टायटर स्टिरॉइड संप्रेरक घेतल्यानंतर महिला लैंगिकदृष्ट्या अक्षम होतात. अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की पुढील वीणात अडचणी येण्याचे कारण 20-हायड्रॉक्सीएकडायसोन (20E) आहे, जो लार्व्हा अवस्थेत वितळण्याच्या चक्राचे नियामक म्हणून ओळखला जाणारा स्टिरॉइड संप्रेरक आहे. 20E चे संश्लेषण आणि हस्तांतरण करण्याची पुरुषांची क्षमता विशेषतः अॅनोफिलिस प्रजातींमध्ये विकसित झाली आहे जी उपजीनस सेलिया7 चा भाग आहेत, जी आफ्रिकेत वितरीत केली जाते आणि त्यात मलेरियाचे सर्वात धोकादायक वाहक समाविष्ट आहेत, ज्यामध्ये अॅनोफिलिस गॅम्बियाचा समावेश आहे. हे विशेषतः उल्लेखनीय आहे कारण या प्रजातींमध्ये मादी प्रत्येक रक्ताच्या जेवणानंतर 20E देखील तयार करतात आणि 20E ओजेनेसिस सायकल चालवते (संदर्भ 8 पहा). तथापि, मादी त्यांच्या स्वतःच्या वीण क्षमतेशी तडजोड न करता एकडायसोनच्या दोन वेगवेगळ्या स्त्रोतांमधून (पुरुष हस्तांतरण आणि रक्त आहार प्रेरण) सिग्नल कसे एकत्रित करतात याबद्दल फारसे माहिती नाही. खरं तर, जर मादींनी तयार केलेले 20E लैंगिक असहिष्णुता निर्माण करते, तर यामुळे कुमारी-आहार देणाऱ्या व्यक्तींमध्ये वंध्यत्व येईल, यांमध्ये एक अतिशय सामान्य वर्तन आहे. डास ५.
एक संभाव्य स्पष्टीकरण असे आहे की A. gambiae नर एक सुधारित नर-विशिष्ट एकडायसोन हस्तांतरित करतात, जे मादी प्रजनन मार्गात सिग्नलिंग कॅस्केड सक्रिय करते, परिणामी वीण अस्थिरता निर्माण होते. तथापि, जरी पृष्ठवंशीय प्राण्यांमध्ये इस्ट्रोजेन आणि अँड्रोजन (संदर्भ 9 मध्ये पुनरावलोकन केलेले) सारखे अनेक स्टिरॉइड हार्मोन्स असतात, तरी आमच्या माहितीनुसार, कीटकांमध्ये अँड्रोजेनिक-पक्षपाती स्टिरॉइड्स ओळखले गेले नाहीत.
आम्ही लैंगिकदृष्ट्या प्रौढ A. gambiae च्या पुरुष अॅक्सेसरी ग्रंथी (MAG) मध्ये स्टिरॉइड संप्रेरकांचे संग्रह निश्चित करण्यासाठी निघालो, जेणेकरून स्टिरॉइड्समध्ये बदल होऊ शकतील. पूर्वी वापरल्या जाणाऱ्या कमी विशिष्ट पद्धतीऐवजी उच्च कार्यक्षमता द्रव क्रोमॅटोग्राफी आणि टँडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HPLC-MS/MS) वापरून, आम्हाला या ऊतीमध्ये एक्डायसोन (E) आणि 20E आढळले, ज्यामुळे मागील निकालाची पुष्टी झाली. तथापि, नमुन्यात ऑक्सिडाइज्ड फॉस्फोरिलेटेड स्टिरॉइड्सचे वर्चस्व होते, जे सूत्र 3-डिहायड्रो-20E-22-फॉस्फेट (3D20E22P)12 (आकृती 1) शी सुसंगत होते. इतर स्वरूपात 3-डिहायड्रो-20E (3D20E) आणि 20E-22-फॉस्फेट (20E22P) समाविष्ट आहेत. 3D20E22P ची HPLC-MS/MS सिग्नल तीव्रता त्याच्या डिफॉस्फोरिलेटेड स्वरूपापेक्षा दोन ऑर्डर जास्त होती आणि E आणि 20E पेक्षा तीन ऑर्डर जास्त होती (आकृती १). जरी शरीराच्या इतर भागांमध्ये आणि खालच्या प्रजनन मार्गात (LRT; विस्तारित डेटा आकृती १अ). आम्ही नवीन बंद (<१ दिवस जुन्या) पुरुष आणि महिलांमध्ये एकडिस्टेरॉईड्सचे विश्लेषण केले आणि फक्त MAG मध्ये 3D20E आणि 3D20E22P आढळले; दोन्ही लिंगांमध्ये E, 20E आणि 20E22P उपस्थित होते (विस्तारित डेटा आकृती १ब). हे डेटा सूचित करतात की A. gambiae प्रौढ नर त्यांच्या MAG मध्ये सुधारित हार्मोन्सचे उच्च टायटर्स तयार करतात जे मादींद्वारे संश्लेषित केले जात नाहीत.
MAG आणि मादी LRT (अ‍ॅट्रिया, सेमिनल वेसिकल्स आणि पॅरोव्हेरियमसह) 4-दिवसांच्या (4-दिवसांच्या) कुमारी नर आणि कुमारी आणि समागमित मादी (0.5, 3, आणि 12 hpm) पासून विच्छेदित करण्यात आले. या ऊतींमधील एक्डायसोनचे विश्लेषण HPLC-MS/MS (सरासरी ± sem; अनपेअर्ड टी-टेस्ट, द्वि-बाजूचा, खोटा शोध दर (FDR) दुरुस्त करून केले गेले; NS, लक्षणीय नाही; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 तास विरुद्ध 0.5 तास, P = 0.035; 12 तास विरुद्ध 3 तास, P = 0.0015; 12 तास विरुद्ध 0.5 तास, P = 0.030. 3D20E22P: 3 तास विरुद्ध 0.5 तास, P = 0.25; 12 तास विरुद्ध. ३ तास, P = ०.००३२; १२ तास विरुद्ध ०.५ तास, P = ०.०१५). डेटा तीन जैविक प्रतिकृतींमधून घेतला आहे. प्रत्येक आवडीच्या एक्डायसोनसाठी शिखर क्षेत्र डासांच्या संख्येने मोजले गेले आणि सामान्य केले गेले. एक्डायसोन खालीलप्रमाणे रंगाने दर्शविला जातो: E, हिरवा; २०E, नारंगी; २०E२२P, जांभळा; ३D२०E, निळा; ३D२०E२२P, गुलाबी. कमी एक्डायसोन पातळी दर्शविण्यासाठी इनसेट y-अक्षावर स्केल वाढवते.
3D20E22P आणि 3D20E हे वीण दरम्यान हस्तांतरित होतात का हे तपासण्यासाठी, आम्ही वीणानंतर वेगवेगळ्या वेळी मादी LRT चे विच्छेदन केले. जरी कुमारींमध्ये ecdysone आढळले नाही, तरी आम्हाला वीणानंतर लगेचच LRT मध्ये 3D20E22P चे प्रमाण लक्षणीयरीत्या कमी होत असल्याचे आढळले (वीणानंतर 0.5 तास, hpm), कालांतराने कमी होत गेले, तर 3D20E चे प्रमाण लक्षणीयरीत्या वाढले (आकृती 1). रासायनिक संश्लेषित 3D20E चा मानक म्हणून वापर करून, आम्ही असे निर्धारित केले की वीण LRT मध्ये या स्टिरॉइड संप्रेरकाची पातळी 20E पेक्षा कमीत कमी 100 पट जास्त होती (विस्तारित डेटा टेबल 1). अशाप्रकारे, 3D20E22P हा प्रमुख नर ecdysone आहे जो वीण दरम्यान मादी LRT मध्ये हस्तांतरित होतो आणि त्याचे डिफॉस्फोरिलेटेड स्वरूप, 3D20E, वीणानंतर लवकरच खूप मुबलक होते. हे महिला वीणानंतरच्या जीवशास्त्रात नंतरच्या ecdysone साठी महत्त्वाची भूमिका सूचित करते.
कस्टम-बिल्ट बायोइन्फॉरमॅटिक्स पाइपलाइन वापरून नवीन आरएनए सिक्वेन्सिंग (आरएनए-सेक) डेटासेट (आकृती 2a) तयार केल्यानंतर, आम्ही एकडीसोन किनेज (EcK), एकडीसोन ऑक्सिडेस (EO) आणि एकडीसोन एन्कोडिंग 20E-सुधारित फॉस्फेटेस जनुक शोधले. EPP) पुनरुत्पादक ऊतींमध्ये व्यक्त केले जाते. आम्ही एक उमेदवार EPP जनुक आणि दोन संभाव्य EcK जनुक (EcK1 आणि EcK2) ओळखले, परंतु आम्हाला एक चांगला उमेदवार EO जनुक सापडला नाही. उल्लेखनीय म्हणजे, वैयक्तिक EPP जनुके गॅम्बियन MAGs मध्ये उच्च पातळीवर (98.9 व्या पर्सेंटाइल) व्यक्त केली गेली परंतु महिला LRTs मध्ये नाही (आकृती 2b), या मादी ऊतीमध्ये 3D20E22P चे डिफॉस्फोरायलेशन झाल्यापासून आमच्या अपेक्षांच्या विरुद्ध. म्हणून, आमचा असा विश्वास आहे की नर EPP वीण दरम्यान हस्तांतरित केले जाऊ शकते. खरंच, आम्ही वीणानंतर मादी प्रथिन मास्क करण्यासाठी इन विवो स्टेबल आयसोटोप लेबलिंग वापरले, मादी कर्णिकामध्ये MS द्वारे ओळखले जाणारे एंजाइम (आकृती 2c आणि पूरक) तक्ता १). MAG आणि मॅटेड (परंतु व्हर्जिन नाही) महिला LRT मध्ये EPP ची उपस्थिती देखील विशिष्ट अँटीबॉडीज वापरून पुष्टी करण्यात आली (आकृती २d).
a, प्रत्येक लिंगाच्या पुनरुत्पादक ऊतींमध्ये EcKs, EOs आणि EPPs एन्कोड करणाऱ्या जीन्स शोधण्यासाठी एक कस्टम-बिल्ट बायोइन्फॉरमॅटिक्स पाइपलाइन. बाणांच्या पुढील संख्या प्रत्येक टप्प्यावर पुरुष आणि महिला उमेदवारांची संख्या दर्शवतात. या विश्लेषणात एक EPP जनुक (EPP) आणि एक EcK जनुक (EcK1) ओळखले गेले जे पुरुषांमध्ये व्यक्त केले जाते आणि एक EcK जनुक (EcK2) जे दोन्ही लिंगांमध्ये व्यक्त केले जाते परंतु उमेदवार EO जनुक देत नाही.b, हीटमॅप व्हर्जिन (V) आणि वीण (M) अ‍ॅनोफिलिस गॅम्बिया आणि अ‍ॅनोफिलिस अल्बिकन्स ऊतींमध्ये उमेदवार जनुक अभिव्यक्तीची तुलना करतो.Spca, गर्भाधान; MAGs, पुरुषांमध्ये सहायक ग्रंथी; शरीराचे इतर भाग, ज्यामध्ये स्तन, पंख, पाय, चरबीयुक्त शरीरे आणि दोन्ही लिंगांमधील अंतर्गत अवयव आणि महिलांमध्ये अंडाशय यांचा समावेश आहे. EcK2 हे गॅम्बियाच्या MAG आणि अॅट्रिया दोन्हीमध्ये उच्च प्रमाणात व्यक्त केले जाते, तर EPP फक्त MAG मध्ये आढळते.c, पुरुष स्खलन गटाचे मादी अॅट्रियामध्ये स्थानांतरणाचे प्रोटिओमिक विश्लेषण 3, 12 आणि 24 hpm वर, जे 67 सर्वात मुबलक प्रथिने दर्शविते. सर्व प्रथिने लेबल करण्यासाठी (आणि मास्क करण्यासाठी) 15N असलेल्या आहारावर महिलांना वाढवण्यात आले. टॅग नसलेल्या पुरुषांना टॅग केलेल्या मादींसोबत वीण करण्यात आले आणि प्रोटिओमिक विश्लेषणासाठी मादी LRTs 3, 12 आणि 24 hpm वर विच्छेदित करण्यात आले (स्खलन प्रथिनांच्या संपूर्ण यादीसाठी पूरक तक्ता 1 पहा). या ऊतींच्या प्रोटिओमिक विश्लेषणाद्वारे कुमारी पुरुषांच्या MAG मध्ये इनसेट, EPP, Eck1 आणि EcK2 आढळले.d, EPP MAG मध्ये वेस्टर्न ब्लॉट आणि वीण झालेल्या मादींच्या LRT द्वारे शोधले गेले, परंतु कुमारी महिला किंवा पुरुष किंवा उर्वरित मध्ये नाही. महिला शरीर. पडद्यांची एकाच वेळी अँटी-अ‍ॅक्टिन (लोडिंग कंट्रोल) आणि अँटी-ईपीपी अँटीबॉडीजने तपासणी करण्यात आली. सर्व पुरुष कुमारी आहेत. जेल सोर्स डेटासाठी पूरक आकृती १ पहा. समान परिणामांसह वेस्टर्न ब्लॉट्स दोनदा केले गेले.
MAG पासून वेगळे केलेल्या 3D20E22P सह HPLC-MS/MS द्वारे उष्मायनानंतर EPP ची एकडिस्टेरॉइड फॉस्फोफॉस्फेटेस क्रियाकलाप सत्यापित करण्यात आला (विस्तारित डेटा आकृती 2a). शिवाय, जेव्हा आम्ही RNA-मध्यस्थ हस्तक्षेप (RNAi) द्वारे EPP शांत केले, तेव्हा आम्हाला या नरांच्या पुनरुत्पादक ऊतींमध्ये फॉस्फेटेस क्रियाकलापात मोठी घट आढळली (आकृती 3a), आणि EPP-मौन पुरुषांसोबत संभोग केलेल्या मादींनी आंशिक जीन शांत असूनही (विस्तारित डेटा आकृती 2b,c) डीफॉस्फोरिलेटेड 3D20E (आकृती 3b) चे प्रमाण लक्षणीयरीत्या कमी दर्शविले. याउलट, आम्हाला त्याच डासांमध्ये 20E22P/20E गुणोत्तरात लक्षणीय बदल आढळले नाहीत, जे सूचित करू शकते की एंजाइम 3D20E22P साठी विशिष्ट आहे (आकृती 3b).
a, डबल-स्ट्रँडेड EPP RNA (dsEPP) किंवा डबल-स्ट्रँडेड GFP RNA (dsGFP) नियंत्रणे वापरून EPP सायलेन्सिंगमुळे MAG मध्ये फॉस्फेटेस क्रियाकलाप कमी झाला. प्रत्येक प्रतिकृतीमध्ये (P = 0.0046, पेअर्ड टी-टेस्ट, द्वि-बाजू) वीस MAG पूल वापरले गेले, जे स्वतंत्र बिंदूंनी दर्शविले गेले. b, EPP-सायलेन्स्ड पुरुषांसोबत मिलन केलेल्या महिलांमध्ये 3 hpm वर डिफॉस्फोरिलेटेड 3D20E चे प्रमाण लक्षणीयरीत्या कमी होते (P = 0.0043, अनपेअर्ड टी-टेस्ट, द्वि-बाजू), तर 20E पातळी अप्रभावित होत्या (P = 0.063, अनपेअर्ड). टी-चाचणी, द्वि-बाजूंनी). १३, १६ आणि १९ मादींच्या प्रत्येकी तीन गटांमधून डेटा सरासरी ± सेम म्हणून सादर केला आहे. c, EPP-शांत पुरुषांसोबत वीण केलेल्या मादींमध्ये पुनर्वीण होण्याचे प्रमाण लक्षणीयरीत्या जास्त होते (P = ०.०००२, फिशरची अचूक चाचणी, द्वि-बाजूंनी). त्यांच्या वीण स्थितीची खात्री करण्यासाठी प्रथम त्यांना वीण करण्यास भाग पाडले गेले; २ दिवसांनंतर, ट्रान्सजेनिक शुक्राणू असलेल्या इतर पुरुषांशी संपर्क साधून ट्रान्सजीनच्या परिमाणात्मक पीसीआर तपासणीद्वारे पुनर्मिलन दरांचे मूल्यांकन करण्यात आले. डी, ईपीपी-सायलेन्स्ड नरांसोबत रक्ताने भरलेल्या मादींनी प्रजननक्षमता लक्षणीयरीत्या कमी केली होती (पी < ०.०००१; मान-व्हिटनी चाचणी, द्वि-बाजू) आणि अंड्यांची संख्या थोडीशी कमी केली होती (पी = ०.०८८, मान-व्हिटनी चाचणी, द्वि-बाजू) , तर अंडी उगवण्याच्या दरावर परिणाम झाला नाही (पी = ०.९४, फिशरची अचूक चाचणी, द्वि-बाजू). सर्व पॅनेलमध्ये, n हा जैविकदृष्ट्या स्वतंत्र डासांच्या नमुन्यांची संख्या दर्शवितो.NS, लक्षणीय नाही.*पी < ०.०५, **पी < ०.०१, ***पी < ०.००१, ****पी < ०.००१.
पुढे, आम्ही मूल्यांकन केले की मादींमध्ये वीण प्रतिकार निर्माण करण्यासाठी एक्डायसोन डिफॉस्फोरायलेशन महत्वाचे आहे का. विशेष म्हणजे, EPP-कमी झालेल्या नरांसोबत वीण केलेल्या मादी अतिरिक्त (ट्रान्सजेनिक) नरांच्या संपर्कात आल्यावर नियंत्रण मादी (१०.४%) पेक्षा खूप जास्त वारंवारतेने (४४.९%) पुन्हा वीण होतात (आकृती ३क). आम्हाला प्रजननक्षमतेत लक्षणीय घट (आकृती ३ड, डावीकडे) आणि या मादींनी घातलेल्या अंड्यांच्या संख्येत थोडीशी घट देखील दिसून आली (आकृती ३ड, मध्यभागी), तर मादींनी घातलेल्या अंड्यांच्या टक्केवारीवर (वीणामुळे मादींमध्ये निर्माण होणारा दुसरा प्रतिसाद) परिणाम झाला नाही (आकृती ३ड, उजवीकडे). 3D20E22P साठी EPP ची निरीक्षण केलेली विशिष्टता पाहता, हे निकाल सूचित करतात की वीण दरम्यान हस्तांतरित केलेल्या EPP द्वारे 3D20E चे सक्रियकरण पुढील वीणासाठी महिलांची ग्रहणक्षमता बंद करण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावू शकते, पूर्वी 20E च्या लैंगिक हस्तांतरणाचे श्रेय दिले जाणारे वर्तन. म्हणून, हे नर-विशिष्ट संप्रेरक देखील महिलांच्या प्रजननक्षमतेवर जोरदार परिणाम करते.
पुढे, आम्ही रासायनिक संश्लेषित 3D20E (आकृती 4a-c) आणि व्यावसायिकरित्या उपलब्ध 20E वापरून लैंगिकदृष्ट्या प्रौढ कुमारींमध्ये इंजेक्शन प्रयोगांमध्ये 20E आणि 3D20E च्या क्रियाकलापांची तुलना केली. आम्हाला आढळले की 3D20E दोन्ही सांद्रतांवर (आकृती 4d) महिलांच्या संभोगाची संवेदनशीलता बंद करण्यात 20E पेक्षा लक्षणीयरीत्या अधिक प्रभावी होते. उल्लेखनीय म्हणजे, LRT मध्ये 3D20E च्या अर्ध्या शारीरिक पातळीने (1,066 pg पोस्ट-इंजेक्शन विरुद्ध 2,022 pg पोस्ट-इंजेक्शन) रीफ्रॅक्टरी मादींचे प्रमाण प्रेरित केले जे इंजेक्शननंतर 24 तासांनी 20E (361 pg पोस्ट-इंजेक्शन) च्या शारीरिक पातळीपेक्षा 20 पट जास्त होते. 18 pg पोस्ट-इंजेक्शनवर इंजेक्शननंतर; विस्तारित डेटा टेबल १). हा निकाल २०E च्या लैंगिक हस्तांतरणामुळे वीण रीफ्रॅक्टरी पीरियड्स होत नाहीत या कल्पनेशी सुसंगत आहे आणि पालक-मुलाच्या नातेसंबंधाची खात्री करण्यासाठी ३D२०E हा एक प्रमुख घटक म्हणून पुढे निर्देश करतो. कुमारी मादींमध्ये अंडी घालण्याच्या चाचण्यांमध्ये ३D२०E २०E पेक्षा लक्षणीयरीत्या अधिक सक्रिय होता (आकृती ४e), असे सूचित करते की आंशिक EPP सायलेन्सिंगनंतर आम्ही पाहिलेला सामान्य अंडी घालण्याचा दर वीण-प्रेरित महिला घटकांद्वारे तयार केलेल्या अवशिष्ट ३D२०E क्रियाकलापांच्या उपस्थितीमुळे होता.
(a,b) 3D20E रासायनिकरित्या 20E पासून संश्लेषित केले गेले (a) खूप उच्च रूपांतरण/कार्यक्षमतेसह (तीन स्वतंत्र संश्लेषण अभिक्रियांमधून सरासरी ± sem म्हणून सादर केलेला डेटा) (b).c, वस्तुमान स्पेक्ट्रम (खालचा अर्धा) जुळलेल्या मादी LRT (वरचा अर्धा) मध्ये आढळणाऱ्या ecdysone शी अगदी जुळतो.d, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; फिशरची अचूक चाचणी, द्वि-बाजूची) आणि 10% इथेनॉल (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; फिशरची अचूक चाचणी, 2-बाजूची) च्या तुलनेत, तर 20E केवळ उच्च डोसमध्ये नियंत्रणापेक्षा लक्षणीयरीत्या जास्त होते (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; फिशरची अचूक चाचणी, 2-बाजूंनी).e, 3D20E इंजेक्शनमुळे कुमारी मादींमध्ये 10% इथेनॉल नियंत्रणांपेक्षा लक्षणीयरीत्या जास्त अंडी निर्माण करण्याचे प्रमाण वाढले (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; फिशरची अचूक चाचणी, द्वि-बाजूंनी), तर 20E नियंत्रणांच्या तुलनेत फक्त जास्त डोसमध्ये (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; फिशरची अचूक चाचणी, द्वि-बाजूंनी).3D20E ने उच्च डोसमध्ये 20E पेक्षा लक्षणीयरीत्या जास्त अंडी निर्माण करण्याचे प्रमाण वाढवले ​​(0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; फिशरची अचूक चाचणी, द्वि-बाजूंनी). सर्व पॅनेलमध्ये, n जैविकदृष्ट्या स्वतंत्र डासांच्या नमुन्यांची संख्या दर्शवते.NS, लक्षणीय नाही.*P < 0.05, **P ०.०१, ***P < ०.००१, ****P < ०.००१. डेटा तीन प्रतिकृतींमधून घेतला आहे.
मागील अभ्यासात, आम्ही असे निर्धारित केले की स्टिरॉइड संप्रेरकांचे लैंगिक हस्तांतरण MISO (Mating-Indused Stimulator of Oogenesis 11) ची अभिव्यक्ती प्रेरित करते, एक महिला पुनरुत्पादक जनुक जो A. gambiae महिलांना P. falciparum संसर्गापासून संरक्षण करतो. सर्वात घातक मानवी मलेरिया परजीवी 13 मुळे होणारे आरोग्य खर्च. मलेरिया-स्थानिक भागात अ‍ॅनोफिलीसच्या पुनरुत्पादक तंदुरुस्तीसाठी MISO चे महत्त्व लक्षात घेता, आम्ही हे निश्चित करण्याचा निर्णय घेतला की कोणता संप्रेरक 3D20E किंवा 20E या जनुकाच्या अभिव्यक्तीला चालना देतो. आम्हाला आढळले की 20E इंजेक्शन विशिष्ट किंवा अधिक शक्तिशालीपणे काही न्यूक्लियर हार्मोन रिसेप्टर्स (HR), जसे की HR3 आणि HR4, आणि ठराविक डाउनस्ट्रीम स्टिरॉइड लक्ष्ये, जसे की योलकोजेनिक जीन्स Vg14, 15, 16, MISO अधिक जोरदारपणे प्रेरित होते 3D20E द्वारे (विस्तारित डेटा आकृती 3). अशाप्रकारे, या एंड्रोजेनिक स्टिरॉइड संप्रेरकाचे लैंगिक हस्तांतरण अशा यंत्रणांना प्रेरित करते जे परजीवी संसर्गामुळे होणाऱ्या खर्चापासून महिलांचे संरक्षण करतात. शिवाय, 3D20E हे E रिसेप्टर EcR च्या दोन्ही आयसोफॉर्म्सवर भिन्न प्रकारे परिणाम करते, EcR-A ला प्रेरित करते आणि EcR-B ला दाबते, आणि HPX15 सह इतर वीण-प्रेरित जनुकांना अधिक जोरदारपणे ट्रिगर करते, जे महिला प्रजननक्षमतेवर परिणाम करते. हे EPP-सायलेन्स्ड पुरुषांसोबत वीण झालेल्या महिलांमध्ये आढळलेल्या लक्षणीय वंध्यत्वाचे स्पष्टीकरण देऊ शकते (विस्तारित डेटा आकृती 3). हे डेटा दोन ecdysone हार्मोन्सद्वारे प्राधान्याने सक्रिय केलेल्या डाउनस्ट्रीम मार्गांचे अस्तित्व सूचित करते जे लिंग-विशिष्ट कार्याला आधार देऊ शकतात.
पुढे, आम्ही आमच्या बायोइन्फॉरमॅटिक्स पाइपलाइनमध्ये ओळखल्या गेलेल्या दोन EcK जनुकांच्या कार्याची चाचणी केली. EcK1 किंवा EcK2 ला शांत केल्याने पुरुषांमध्ये लक्षणीय मृत्युदर झाला (विस्तारित डेटा आकृती 4a), असे सूचित करते की एक्डायसोन फॉस्फोरायलेशन आणि अशा प्रकारे निष्क्रियता जगण्यासाठी महत्त्वपूर्ण आहे. कारण EcK2 EcK1 पेक्षा उच्च पातळीवर व्यक्त केले गेले होते आणि प्रोटिओमिक्सद्वारे MAGs मध्ये आढळले होते (आकृती 2b,c आणि पूरक तक्ता 2), आम्ही 20E सह इनक्यूबेट करून त्याची एक्डायस्टेरॉइड किनेज क्रियाकलाप प्रमाणित केला, ज्यामुळे फॉस्फोरायलेशन 20E22P (विस्तारित डेटा आकृती 2) झाला.4b). सब्सट्रेट म्हणून 3D20E वापरताना, आम्ही फॉस्फोरिलेटेड उत्पादन 3D20E22P (विस्तारित डेटा आकृती 4c) शोधू शकलो नाही, असे सूचित करते की 3D20E ऐवजी 20E हे EcK2 चे पसंतीचे लक्ष्य असू शकते.
आमच्या RNA-seq विश्लेषणानुसार, कुमारी मादींच्या LRT मध्ये EcK2 देखील उच्च प्रमाणात व्यक्त केले गेले होते, जिथे ते मिलनानंतर बंद केले गेले होते (आकृती 2b). आम्ही या डेटाची पुष्टी केली आणि असे निश्चित केले की EcK2 अभिव्यक्ती रक्त सेवनाने प्रभावित होत नाही (विस्तारित डेटा आकृती 5a). आमच्या सुरुवातीच्या MS प्रयोगांचा विस्तार करताना, आम्ही निर्धारित केले की 20E22P ची शिखर 20E च्या शिखराशी जवळून संबंधित होती (रक्त जेवणानंतर 22-26 तास; विस्तारित डेटा आकृती 5b). कुमारी मादींमध्ये EcK2 शांत केल्याने रक्त जेवणानंतर 26 तासांनी 20E ते 20E22P च्या सापेक्ष प्रमाणात 3 पट वाढ झाली (विस्तारित डेटा आकृती 2c आणि 5c), हे पुष्टी करते की EcK2 महिलांमध्ये 20E ला फॉस्फोरिलेट देखील करते. उल्लेखनीय म्हणजे, EcK2-कमी झालेल्या कुमारींनी पूर्ण लैंगिक ग्रहणक्षमता राखली (विस्तारित डेटा आकृती 5d,e), पुढे असे सूचित करते की 20E चे महिला उत्पादन समागमाला प्रेरित करत नाही. रीफ्रॅक्टरी पीरियड्स. तथापि, या मादींमध्ये नियंत्रणांच्या तुलनेत अंडी देण्याचे प्रमाण लक्षणीयरीत्या वाढले होते, ज्यामध्ये 30% पेक्षा जास्त कुमारिका अंडी घालतात (विस्तारित डेटा आकृती 5f). जर रक्त सेवनानंतर डबल-स्ट्रँडेड Eck2 RNA (dsEcK2) इंजेक्शन्स केले गेले, तर स्पॉनिंग झाले नाही, ज्या वेळी रक्त सेवनामुळे 20E चे शिखर कमी झाले होते. एकूणच, हे निकाल अशा मॉडेलला समर्थन देतात की रक्त शोषल्यानंतर तयार होणारे 20E स्पॉनिंगला प्रेरित करू शकते, परंतु जेव्हा स्पॉनिंग ब्लॉक (EcK2 आणि कदाचित इतर घटक) वीणाने बंद केले जाते तेव्हाच. 20E किंवा 3D20E इंजेक्शन्सने कुमारिकांमध्ये EcK2 अभिव्यक्तीला प्रतिबंधित केले नाही (विस्तारित डेटा आकृती 5g), असे सूचित करते की इतर घटक या किनेजच्या प्रतिबंधात मध्यस्थी करतात. तथापि, रक्त सेवनानंतर 20E पातळी वीण अस्वस्थता निर्माण करण्यासाठी पुरेसे नव्हते, परंतु लैंगिकरित्या हस्तांतरित 3D20E च्या उच्च टायटर्समुळे प्रभावीपणे ट्रिगर झाले.
आमचे निकाल A. gambiae च्या पुनरुत्पादन यशाचे नियमन करणाऱ्या यंत्रणेबद्दल महत्त्वाची अंतर्दृष्टी प्रदान करतात. एक मॉडेल समोर आले आहे जिथे पुरुषांनी 3D20E च्या उच्च टायटर्सचे संश्लेषण करण्यासाठी उत्क्रांती केली आहे, एक पुरुष-विशिष्ट सुधारित एकडायसोन जो मादींना पुढील संभोगासाठी असंवेदनशील करून पालकत्व सुनिश्चित करतो. त्याच वेळी, या मलेरिया वाहकांनी नर-विशिष्ट EPP च्या लैंगिक हस्तांतरणाच्या प्रतिसादात मादींमध्ये 3D20E सक्रिय करण्यासाठी एक कार्यक्षम प्रणाली देखील विकसित केली आहे. आमच्या माहितीनुसार, कीटकांमध्ये एक अद्वितीय आणि महत्त्वपूर्ण कार्य करणारे नर- आणि मादी-प्रभुत्व असलेले स्टिरॉइड संप्रेरक प्रणालीचे हे पहिले उदाहरण आहे. नर-विशिष्ट एकडायसोन कार्य मांडले गेले आहे परंतु निश्चितपणे प्रदर्शित केलेले नाही. उदाहरणार्थ, मोठ्या प्रमाणात खोटे सिद्ध झालेले गृहीतक 18 असे आहे की ही कार्ये 20E पूर्वसूचक E1 द्वारे केली जाऊ शकतात. हे सर्वज्ञात आहे की ड्रोसोफिलामध्ये, मोनँड्री लहान लिंग पेप्टाइड्स 19,20 च्या लैंगिक हस्तांतरणामुळे सुरू होते जे विशिष्ट लिंग पेप्टाइड रिसेप्टर्सद्वारे मादी प्रजनन मार्गात प्रवेश करणाऱ्या न्यूरॉन्सशी संवाद साधतात21,22. पुढील कार्य A. gambiae मादींमध्ये 3D20E द्वारे नियंत्रित होणारे डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कॅस्केड्स निश्चित करण्यासाठी आणि डास आणि ड्रोसोफिला दरम्यान हे कॅस्केड्स संरक्षित केले जाऊ शकतात का हे निर्धारित करण्यासाठी आवश्यक आहे.
आमच्या अभ्यासात ओळखल्या गेलेल्या महिलांच्या प्रजननक्षमतेवर आणि वर्तनावर 3D20E ची महत्त्वाची भूमिका लक्षात घेता, 3D20E संश्लेषण आणि सक्रियतेकडे जाणारे मार्ग भविष्यातील डास नियंत्रण धोरणांसाठी नवीन संधी देतात, जसे की निर्जंतुकीकरण कीटक तंत्रज्ञानाच्या धोरणांमध्ये स्पर्धात्मक निर्जंतुकीकरण नरांची निर्मिती जंगली सोडण्यासाठी किंवा व्हर्जिन प्लेमध्ये 3D20E चे अनुकरण करण्यासाठी. 3D20E चे नर-विशिष्ट कार्य कदाचित तेव्हा विकसित झाले असेल जेव्हा A. gambiae आणि इतर Cellia प्रजातींनी त्यांचे वीर्य वीण प्लगमध्ये जमा करण्याची क्षमता प्राप्त केली, कारण यामुळे मोठ्या संख्येने हार्मोन्स आणि हार्मोन-सक्रिय करणारे एन्झाईम्सचे कार्यक्षम हस्तांतरण शक्य होते. या बदल्यात, 3D20E उत्क्रांती अंमलबजावणी करणारी मोनँड्री उच्च मलेरियाच्या प्रादुर्भावाच्या क्षेत्रांमध्ये त्यांच्या पुनरुत्पादक तंदुरुस्तीला अनुकूल करण्यासाठी मादींना (MISO च्या उच्च अभिव्यक्तीद्वारे) एक यंत्रणा प्रदान करते, जी अप्रत्यक्षपणे प्लाझमोडियम प्रसारणास हातभार लावते. मादी 20E चा मादी अ‍ॅनोफिलीस डासांमध्ये पी. फाल्सीपेरमच्या अस्तित्वावर आणि वाढीवर खोलवर परिणाम होत असल्याचे दिसून आले आहे, 24 नर आणि मादी दोन्ही स्टिरॉइड संप्रेरक मार्ग आता डास-परजीवीचे प्रमुख पैलू आहेत. परस्परसंवाद.
A. gambiae G3 जातींचे संगोपन मानक कीटक परिस्थितीत (२६-२८ °C, ६५-८०% सापेक्ष आर्द्रता, १२:१२ तास प्रकाश/गडद प्रकाश कालावधी) करण्यात आले. लार्वांना पावडर माशांचे अन्न (टेट्रामिन ट्रॉपिकल फ्लेक्स, कोई पेलेट्स आणि टेट्रा पॉन्ड स्टिक्स ७:७:२ च्या प्रमाणात) देण्यात आले. प्रौढ डासांना १०% डेक्स्ट्रोज द्रावण आणि साप्ताहिक मानवी रक्त (रक्त घटकांचा अभ्यास) देण्यात आले. सूक्ष्मदर्शकाद्वारे टोकांची तपासणी केल्यानंतर प्यूपल टप्प्यावर लिंग वेगळे करून व्हर्जिन डास मिळवण्यात आले. DsRed ट्रान्सजीन वाहणाऱ्या नरांचे वर्णन पूर्वी केले आहे.
आधी वर्णन केलेल्या प्रोटोकॉलनुसार जबरदस्तीने वीण करण्याचे प्रयोग करण्यात आले. नैसर्गिक वीणासाठी, ४ दिवसांच्या कुमारी मादींना लैंगिकदृष्ट्या प्रौढ कुमारी नरांसह १:३ च्या प्रमाणात दोन रात्री ठेवण्यात आले. ज्या प्रयोगांमध्ये नरांना dsEPP इंजेक्शन देण्यात आले होते, त्या प्रयोगांमध्ये इंजेक्शननंतर ३-४ दिवसांनी को-केजिंग केले गेले, जेव्हा फॉस्फेटेस क्रियाकलाप जास्तीत जास्त शांत केला गेला (विस्तारित डेटा आकृती २ब).
डासांच्या ऊती, उर्वरित मृतदेह (शरीराचा उर्वरित भाग), किंवा संपूर्ण शरीर १००% मिथेनॉलमध्ये विच्छेदित केले गेले आणि बीडर (२ मिमी काचेचे मणी, २,४०० आरपीएम, ९० सेकंद) वापरून एकसंध केले गेले. ऊतींचे प्रमाण आणि मिथेनॉलचे प्रमाण खालीलप्रमाणे होते: शरीराचा उर्वरित भाग, १,००० µl मध्ये ५०; MAG, ५०-१०० ८० µl; मादी LRT, २५-५० ८० µl. त्याच प्रमाणात मिथेनॉलसह अवक्षेपण दुसऱ्यांदा मिथेनॉल काढण्याच्या अधीन होते. पेशींचा कचरा सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे काढून टाकण्यात आला. दोन्ही निष्कर्षांमधून मिथेनॉल एकत्र केले गेले आणि नायट्रोजन प्रवाहाखाली वाळवले गेले, नंतर पाण्यात ८०% मिथेनॉलच्या पुढील खंडांमध्ये पुन्हा निलंबित केले गेले: शरीराचा उर्वरित भाग, ५० µl; MAG आणि मादी LRT, ३० µl.
नमुन्यांचे विश्लेषण एका मास स्पेक्ट्रोमीटर (ID-X, थर्मो फिशर) वर LC उपकरणाशी जोडून (Vanquish, थर्मो फिशर) करण्यात आले. 5 µl नमुना 3 µm, 100 × 4.6 मिमी स्तंभावर (इन्स्पायर C8, डिक्मा) इंजेक्ट करण्यात आला जो 25 °C वर ठेवला गेला. LC साठी मोबाइल टप्पे A (पाणी, 0.1% फॉर्मिक अॅसिड) आणि B (एसीटोनिट्राइल, 0.1% फॉर्मिक अॅसिड) होते. LC ग्रेडियंट खालीलप्रमाणे होता: 1 मिनिटासाठी 5% B, नंतर 11 मिनिटांत 100% B पर्यंत वाढवला. 100% वर 8 मिनिटांनंतर, 4 मिनिटांसाठी 5% B वर स्तंभ पुन्हा संतुलित करा. प्रवाह दर 0.3 मिली किमान-1 होता. MS स्त्रोतामध्ये आयोनीकरण सकारात्मक आणि नकारात्मक मोडमध्ये गरम केलेल्या इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरणाद्वारे पूर्ण केले जाते.
मास स्पेक्ट्रोमीटर पूर्ण MS मोडमध्ये 60,000 रिझोल्यूशनवर 350 ते 680 पर्यंत m/z श्रेणीतील डेटा मोजतो. [M + H]+ (सर्व लक्ष्ये), [M - H2O + H]+ (सर्व लक्ष्ये) आणि [M - H]- (फॉस्फोरिलेटेड लक्ष्ये) वर MS/MS डेटा मिळवण्यात आला. ज्या लक्ष्यांसाठी कोणतेही मानक उपलब्ध नव्हते त्यांच्या ecdysone गुणधर्मांची पुष्टी करण्यासाठी MS/MS डेटा वापरण्यात आला. नॉन-लक्ष्यित ecdysteroids ओळखण्यासाठी, 15% पेक्षा जास्त सापेक्ष विपुलता असलेल्या सर्व HPLC शिखरांसाठी MS/MS डेटाचे विश्लेषण करण्यात आले. एका विशिष्ट नमुन्याच्या (इतर सर्व लक्ष्ये) परिपूर्ण प्रमाणात किंवा पातळीकरणाची गणना करण्यासाठी शुद्ध मानके (20E, 3D20E) पासून तयार केलेल्या मानक वक्रांचा वापर करून प्रमाण निश्चित करा जेणेकरून एका पुरुषात आढळणाऱ्या प्रमाणात त्यांची समतुल्यता मोजता येईल. 3D20E साठी, खालील अॅडक्ट्सच्या बेरजेचा वापर करून परिमाण निश्चित केले गेले: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.ट्रेसफाइंडर (आवृत्ती ४.१) वापरून डेटा काढला आणि त्याचे प्रमाण निश्चित केले. Xcalibur (आवृत्ती ४.४) वापरून MS/MS डेटाचे विश्लेषण केले. E, 20E आणि 3D20E च्या MS स्पेक्ट्राची संबंधित मानकांशी तुलना करण्यात आली. 3D20E22P चे विश्लेषण गिरार्डच्या अभिकर्मकासह डेरिव्हेटायझेशनद्वारे केले गेले. 20E22P चे विश्लेषण m/z गुणोत्तराने केले गेले.
3D20E22P हे MAG पासून शुद्ध करण्यात आले. HPLC-MS/MS विश्लेषणाप्रमाणेच LC परिस्थितीत क्वाड्रपोल मास-आधारित डिटेक्टर (QDa, Acquity, Waters) सह अल्ट्रा-परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफ (Acquity, Waters) वापरून विश्लेषणात्मक स्केलवर शुद्धीकरण करण्यात आले. पूर्वी निर्धारित केलेल्या धारणा वेळेत 3D20E22P शी संबंधित m/z आढळल्याने फ्रॅक्शन कलेक्शन ट्रिगर झाले. नंतर वर वर्णन केल्याप्रमाणे HPLC-MS/MS द्वारे काढलेल्या संयुगांची शुद्धता तपासण्यात आली.
उत्पादकाच्या सूचनांनुसार TRI अभिकर्मक (थर्मो फिशर) वापरून १०-१२ प्रजनन ऊती किंवा शरीराच्या इतर भागांमधून (डोके नसलेले) एकूण RNA काढले गेले. TURBO DNase (थर्मो फिशर) ने RNA वर उपचार केले गेले. उत्पादकाच्या सूचनांनुसार मोलोनी म्युरिन ल्युकेमिया विषाणू रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस (M-MLV RT; थर्मो फिशर) वापरून cDNA चे संश्लेषण केले गेले. रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन क्वांटिटेटिव्ह PCR (RT-qPCR; एक्सटेंडेड डेटा टेबल २) साठी प्राइमर्स पूर्वी प्रकाशित केले गेले होते24 किंवा प्राइमर-BLAST26 वापरून डिझाइन केले गेले होते, ज्यामध्ये ७०-१५० bp आकाराच्या आणि एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन किंवा प्राइमर पेअर प्राइमर वेगळे एक्सॉन असलेल्या उत्पादनांना प्राधान्य दिले गेले होते. RT-qPCR साठी तीन ते चार जैविक प्रतिकृतींमधील cDNA नमुने पाण्यात चार पट पातळ केले गेले. १× पॉवरअप SYBR ग्रीन मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर), प्राइमर आणि ५ µl पातळ केलेले cDNA असलेल्या १५ µl प्रतिकृती प्रतिक्रियांमध्ये क्वांटिफिकेशन केले गेले. प्रतिक्रिया एका वर चालवल्या गेल्या क्वांटस्टुडिओ 6 प्रो रिअल-टाइम पीसीआर सिस्टम (थर्मो फिशर) आणि डेटा डिझाइन आणि विश्लेषण (आवृत्ती 2.4.3) वापरून गोळा आणि विश्लेषण करण्यात आला. या अभ्यासात दाखवल्याप्रमाणे, सापेक्ष प्रमाण राइबोसोमल जीन RpL19 (AGAP004422) मध्ये सामान्यीकृत केले गेले, ज्याची अभिव्यक्ती रक्त आहार 27 किंवा वीण 3 सह लक्षणीय बदलली नाही.
Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) वापरून RNA गुणवत्ता तपासण्यात आली. Illumina paired-end लायब्ररी तयार करून MIT आणि Harvard च्या ब्रॉड इन्स्टिट्यूटमध्ये चालवण्यात आल्या. HISAT2 (आवृत्ती 2.0.5) वापरून अनुक्रम वाचन A. gambiae जीनोम (PEST स्ट्रेन, आवृत्ती 4.12) शी संरेखित केले गेले. Samtools (आवृत्ती 1.3.1) वापरून मॅपिंग गुणवत्ता (MAPQ) स्कोअर <30 असलेले वाचन काढून टाकण्यात आले. Htseq-count (आवृत्ती 0.9.1) वापरून डीफॉल्ट पॅरामीटर्ससह जनुकांमध्ये मॅप केलेल्या वाचनांची संख्या मोजण्यात आली. सामान्यीकृत वाचन संख्या मोजण्यात आल्या आणि R (आवृत्ती 4.0.3) मध्ये DESeq2 पॅकेज (आवृत्ती 1.28.1) वापरून विभेदक जनुक अभिव्यक्तीचे विश्लेषण केले गेले.
PSI-BLAST अल्गोरिदम (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) वापरून A. gambiae जीनोम शोधून Ecdysone-सुधारित जनुक उमेदवारांची ओळख पटवण्यात आली. डिफॉल्ट मूल्ये वापरून खालील क्वेरी प्रोटीन अनुक्रमांसह पॅरामीटर्स: Bombyx mori (अ‍ॅक्सेशन क्र. NP_001038956.1), Musca domestica (अ‍ॅक्सेशन क्र. XP_005182020.1, XP_005175332.1 आणि XP_011294434.1) आणि Microplitis demolitor (अ‍ॅक्सेशन क्र. XP_008552646.1 आणि XP_008552645.1) कडून EcK B. mori (अ‍ॅक्सेशन क्र. NP_001036900), Drosophila melanogaster (अ‍ॅक्सेशन क्र. NP_651202), एपिस मेलिफेरा (अ‍ॅक्सेशन क्र. XP_394838) आणि अ‍ॅसिर्थोसिफॉन पिसम (अ‍ॅक्सेशन क्र. XP_001947166); आणि बी. मोरी (अ‍ॅक्सेशन क्र. XP_001177919.1 आणि NP_001243996.1) मधील EPP आणि डी. मेलानोगास्टर (अ‍ॅक्सेशन क्र. NP_572986.1) चे EO (पायरी 1). पुढे, गॅम्बियामध्ये प्रजनन ऊतींमध्ये (महिला LRT किंवा MAG) उच्च mRNA अभिव्यक्ती (>100 तुकडे/किलोबेस एक्सॉन प्रति दशलक्ष मॅप केलेले वाचन (FPKM) किंवा >85%) वर आधारित फिल्टर हिट (पायरी 2). विशिष्टता सुधारण्यासाठी, आम्ही उमेदवार एन्झाइम निवडले जे ए. अल्बिमनसच्या पुनरुत्पादक ऊतींमध्ये देखील व्यक्त केले जातात, एक अ‍ॅनोफिलीस प्रजाती जी वीण दरम्यान एक्डायसोन संश्लेषित किंवा हस्तांतरित करत नाही. उमेदवार जनुके ए. अल्बिमनस पुनरुत्पादक ऊतीमध्ये (पायरी 3) कमी अभिव्यक्ती (<100 FPKM किंवा <85 व्या पर्सेंटाइल) वर आधारित फिल्टर केली गेली. अंतिम फिल्टर (पायरी 4) म्हणून, उमेदवार जनुके खालीलपैकी किमान एक पूर्ण करणे आवश्यक आहे: (1) विभेदकपणे व्यक्त केलेल्या जनुकांच्या विश्लेषणानुसार वीणानंतर लक्षणीयरीत्या अप-रेग्युलेटेड (P < 0.05) आणि (2) गैर-पुनरुत्पादक ऊतींमध्ये (<85% किंवा <100 FPKM).
संपूर्ण जीवांचे समस्थानिक लेबलिंग साध्य करण्यासाठी आम्ही पूर्वी वर्णन केलेल्या पद्धती 28,29,30 मध्ये बदल केले. थोडक्यात, वन्य-प्रकारचे सॅकॅरोमायसेस सेरेव्हिसिया प्रकार II (YSC2, सिग्मा) हे यीस्ट नायट्रोजन बेस (BD Difco, DF0335) मध्ये चाचणी करण्यात आले ज्यामध्ये (wt/vol) 2% ग्लुकोज (G7528, सिग्मा), 1.7% अमीनो आम्ल-मुक्त आणि अमोनियम सल्फेट. कल्चर माध्यम) आणि 5% 15N अमोनियम सल्फेट (NLM-713, >99%, केंब्रिज समस्थानिक प्रयोगशाळा) नायट्रोजनचा एकमेव स्रोत म्हणून होते. यीस्ट सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे पुनर्प्राप्त केले गेले आणि डासांच्या अळ्यांना प्युपेशन होईपर्यंत उत्तेजनार्थ खायला दिले गेले. चौथ्या टप्प्यातील मृत्युदर रोखण्यासाठी फिशमील (प्रति 300 अळ्यांमध्ये 0.5 मिग्रॅ) सह पूरक. त्यानंतर लेबल नसलेल्या नरांसह वीण प्रयोगांमध्ये फक्त मादींचा वापर केला गेला.
४-६ दिवसांच्या १५N-टॅग केलेल्या कुमारी माद्यांना वयाशी जुळणाऱ्या अनटॅग केलेल्या कुमारी नरांसोबत समागम करण्यास भाग पाडले गेले. एपिफ्लोरेसेन्स मायक्रोस्कोपी अंतर्गत समागम प्लग शोधून यशस्वी समागम सत्यापित करण्यात आला. ३, १२ आणि २४ hpm वर, ४५-५५ समागम केलेल्या माद्यांचे एट्रिया ५० µl अमोनियम बायकार्बोनेट बफर (pH ७.८) मध्ये विच्छेदित केले गेले आणि पेस्टलने एकरूप केले गेले. होमोजेनेट सेंट्रीफ्यूज केले गेले आणि सुपरनॅटंट ५० µl ०.१% रॅपीजेस्ट (१८६००१८६०, वॉटर्स) ५० mM अमोनियम बायकार्बोनेटमध्ये मिसळले गेले. प्रत्येक नमुन्यातील सुपरनॅटंट आणि पेलेट कोरड्या बर्फावर स्नॅप फ्रोझ केले गेले आणि रात्री वॉशिंग्टन विद्यापीठातील मॅककॉस प्रयोगशाळेत पाठवले गेले, जिथे LC-MS/MS साठी नमुना तयार करणे पूर्ण झाले. ५० mM मध्ये ०.१% रॅपीजेस्टच्या ५० µl मध्ये पेलेट पुन्हा निलंबित करा. पाण्याच्या बाथमध्ये अमोनियम बायकार्बोनेट आणि सोनिकेट. बीसीए परखाने पेलेट आणि सुपरनॅटंटची प्रथिने एकाग्रता मोजली गेली, नमुने 5 एमएम डायथिओथ्रेइटॉल (डीटीटी; सिग्मा) ने कमी केले गेले, 15 एमएम आयोडोएसीटामाइड (सिग्मा) सह अल्काइलेटेड केले गेले आणि ट्रिप्सिनायझेशनसह 1 तासासाठी 37 °C (1:0 50) वर इनक्यूबेट केले गेले: ट्रिप्सिन: सब्सट्रेट रेशो). रॅपिगेस्टला 200 एमएम एचसीएल जोडून लायझ केले गेले, त्यानंतर 37 °C वर 45 मिनिटांसाठी इनक्यूबेशन केले गेले आणि मलबा काढून टाकण्यासाठी 4 °C वर 10 मिनिटांसाठी 14,000 rpm वर सेंट्रीफ्यूगेशन केले गेले. नमुने ड्युअल-मोड सॉलिड-फेज एक्स्ट्रॅक्शन (ओएसिस एमसीएक्स कार्ट्रिज, वॉटर्स) द्वारे धुतले गेले आणि 0.33 µg µl-1 च्या अंतिम प्रथिने एकाग्रतेसाठी 0.1% फॉर्मिक अॅसिडमध्ये पुन्हा सस्पेंड केले गेले. लेबल नसलेल्या MAG प्रोटीओम्सचे कुमारी पुरुषांकडून असेच विश्लेषण केले गेले.दोन प्रत्येक नमुन्यासाठी विश्लेषणात्मक प्रतिकृतींचे विश्लेषण करण्यात आले. पुढे, प्रत्येकी १ µg चे विश्लेषण २५-सेमी फ्यूज्ड सिलिका ७५-मायक्रोमीटर कॉलम वापरून करण्यात आले ज्यामध्ये ४-सेमी फ्यूज्ड सिलिका कासिल१ (PQ) फ्रिट ट्रॅप ज्युपिटर C१२ रिव्हर्स्ड-फेज रेझिन (फेनोमेनेक्स) आणि १८०-मिनिट लिक्विड क्रोमॅटोग्राफीने भरलेला होता. नमुना डायजेस्ट - MS/MS हे नॅनोअ‍ॅक्विटी UPLC सिस्टम (वॉटर्स) सह Q-Exactive HF मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर) वर चालवले गेले. प्रत्येक रनसाठी तयार केलेला डेटा-संबंधित अधिग्रहण डेटा प्रोटिओविझार्ड (आवृत्ती 3.0.20287) वापरून आणि कॉमेट31 (आवृत्ती 3.2) वापरून अॅनोफिलिस गॅम्बिया (व्हेक्टरबेस आवृत्ती 54), अॅनोफिलिस कोलुझी मधील प्रथिने अनुक्रम असलेल्या FASTA डेटाबेसच्या विरूद्ध mzML स्वरूपात रूपांतरित केला गेला. माली-एनआयएच (व्हेक्टरबेस आवृत्ती 54), सॅकॅरोमायसेस सेरेव्हिसिया (युनिप्रोट, मार्च 2021), ए. गॅम्बिया आरएनए-सेक आणि ज्ञात मानवी दूषित घटकांच्या तीन-फ्रेम भाषांतरांवर शोध घेण्यात आला. पेप्टाइड नकाशाशी जुळणारे FDR 0.01 च्या थ्रेशोल्डसह Percolator32 (आवृत्ती 3.05) वापरून निश्चित केले गेले आणि प्रोटीन पार्सिमनी वापरून पेप्टाइड्स प्रथिने ओळखांमध्ये एकत्र केले गेले. लाईमलाईट३३ (आवृत्ती २.२.०). पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे प्रत्येक रनमध्ये प्रत्येक प्रथिनासाठी मोजलेल्या सामान्यीकृत स्पेक्ट्रल अ‍ॅब्युडन्सी फॅक्टर (NSAF) वापरून सापेक्ष प्रथिनांच्या विपुलतेचा अंदाज लावण्यात आला. प्रत्येक प्रथिनाच्या सापेक्ष NSAF चे सरासरी दोन वेगवेगळ्या जैविक प्रतिकृतींमधून नमुन्यांमध्ये केले गेले. १५N लेबलिंगने मादी प्रोटीओमला यशस्वीरित्या मास्क केले, जरी लेबल केलेल्या कुमारींमधून लेबल नसलेले प्रथिन थोड्या प्रमाणात आढळले. आम्ही केवळ तांत्रिक रनमध्ये मादी कच्च्या नमुन्यांमध्ये पुरुष प्रथिन कपात (१-५ स्पेक्ट्रा) शोधण्याची नोंद केली, जिथे कच्चे नमुने पुरुष/मिलन नमुन्यांनंतर चालवले गेले, HPLC "कॅरी ओव्हर" च्या परिणामी. लेबल केलेल्या कुमारींमधून 'दूषित' म्हणून आढळणारे अधूनमधून प्रथिने पूरक तक्ता १ मध्ये सूचीबद्ध आहेत.
जेनस्क्रिप्टमध्ये दोन अँटीजेनिक पेप्टाइड्स, QTTDRVAPAPDQQQ (आयसोटाइप PA मध्ये) आणि MESDGTTPSGDSEQ (आयसोटाइप PA आणि PB मध्ये). दोन्ही पेप्टाइड्स एकत्र केले गेले, नंतर वाहक प्रथिने KLH मध्ये संयुग्मित केले गेले आणि न्यूझीलंडच्या सशांमध्ये इंजेक्शन दिले गेले. चौथ्या इंजेक्शननंतर सशांचा बळी देण्यात आला आणि एकूण IgG अ‍ॅफिनिटी शुद्धीकरणाद्वारे वेगळे केले गेले. सर्वात EPP-विशिष्ट सशाचे IgG पुढील वेस्टर्न ब्लॉटिंगसाठी वापरले गेले.
वेस्टर्न ब्लॉट्ससाठी, MAG (n = 10, जिथे n जैविकदृष्ट्या स्वतंत्र डासांच्या नमुन्यांची संख्या दर्शवते) आणि 4 दिवसांच्या कुमारी नर आणि कुमारी किंवा जबरदस्तीने समागम केलेल्या मादी (<10 पोस्ट-मॅटिंग), प्रथिने निष्कर्षण बफर (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% सोडियम डीऑक्सिकोलेट; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल (रोचे)) वेगळे जोडले गेले. नमुने बीडर (2 मिमी ग्लास बीड्स, 2,400 rpm, 90 सेकंद) वापरून विच्छेदनानंतर लगेच एकसंध केले गेले. 4 °C वर 20,000 ग्रॅम वर सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे अघुलनशील कचरा काढून टाकण्यात आला. ब्रॅडफोर्ड अॅसे (बायो-रॅड) द्वारे प्रथिने मोजली गेली. नंतर, 20 µg MAG प्रथिने, 40 µg LRT प्रथिने, आणि MOPS बफर वापरून 10% Bis-Tris NuPAGE द्वारे 20 µg अवशिष्ट बल्क प्रथिने विकृत केली गेली आणि वेगळे केली गेली. iBlot2 ट्रान्सफर सिस्टम (थर्मो फिशर) वापरून प्रथिने पॉलीव्हिनिलिडीन फ्लोराइड मेम्ब्रेनमध्ये हस्तांतरित केली गेली. 1× PBS-T (PBS मध्ये 0.1% Tween-20) मध्ये पडदा दोनदा धुतले गेले आणि नंतर 22°C वर 1 तासासाठी ओडिसी ब्लॉकिंग बफर (Li-Cor) मध्ये ब्लॉक केले गेले. कस्टम रॅबिट अँटी-EPP पॉलीक्लोनल प्रायमरी अँटीबॉडी (ब्लॉकिंग बफरमध्ये 1:700) आणि रॅट अँटी-अ‍ॅक्टिन मोनोक्लोनल प्रायमरी अँटीबॉडी MAC237 (Abeam; 1:4,000) सह 4 °C वर पडदा रात्रभर हलवला गेला. पडदा PBS-T ने धुतले गेले आणि नंतर दुय्यम अँटीबॉडीज (गाढव अँटी-रॅबिट 800CW आणि शेळी अँटी-रॅट 680LT (Li-Cor), दोन्ही 1:20,000) सह इनक्युबेट केले गेले ज्यामध्ये 0.01% SDS आणि २२ डिग्री सेल्सिअस तापमानात १ तासासाठी ०.२% ट्वीन -२०. पडदा PBS-T ने धुतले गेले आणि ओडिसी CLx स्कॅनरने प्रतिमा काढल्या गेल्या. प्रतिमा इमेज स्टुडिओमध्ये (आवृत्ती ५.२) गोळा केल्या गेल्या आणि त्यावर प्रक्रिया केली गेली. EPP-RA आयसोफॉर्म (८२ kDa) शी संबंधित विशिष्ट बँड आढळला नाही.
EPP चे कोडिंग क्षेत्र (हिस्टिडाइन फॉस्फेटेस डोमेन असलेले आयसोफॉर्म AGAP002463-RB म्हणून, NCBI संरक्षित डोमेन शोध 34) आणि EcK2 (AGAP002181) pET-21a(+) प्लास्मिड (नोव्हाजेन मिलिपोर सिग्मा) मध्ये क्लोन केले गेले; प्राइमर विस्तारित डेटा टेबल २ मध्ये सूचीबद्ध आहेत. pET-21a(+)-EcK2 कन्स्ट्रक्टच्या C-टर्मिनल 6xHis टॅगच्या आधी आठ GS4 लिंकर्स (टँडममध्ये) घातले गेले. NEBExpress सेल-फ्री E. coli प्रोटीन सिंथेसिस रिएक्शन (न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स) वापरून रीकॉम्बीनंट प्रथिने तयार केली गेली. NEBExpress Ni स्पिन कॉलम्स (न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स) वापरून रीकॉम्बीनंट प्रथिने शुद्ध केली गेली. NEBExpress सेल-फ्री E. coli प्रोटीन सिंथेसिस किटमधील DNA टेम्पलेट वापरून डायहाइड्रोफोलेट रिडक्टेस (DHFR) कंट्रोल प्रोटीन तयार केले गेले. प्रथिने PBS मध्ये -20 °C वर 3 महिन्यांपर्यंत 50% ग्लिसरॉलमध्ये साठवली गेली.
४-नायट्रोफेनिल फॉस्फेट (pNPP; सिग्मा-अल्ड्रिच) वापरून EPP आणि ऊतींच्या अर्कांची फॉस्फेटेस क्रिया मोजण्यात आली. अभिक्रिया बफरमध्ये २५ mM Tris, ५० mM acetic acid, २५ mM Bis-Tris, १५० mM NaCl, ०.१ mM EDTA आणि १ mM DTT होते. अभिक्रिया बफरमध्ये ऊतींचे एकरूपीकरण करण्यात आले आणि पेशींचा मलबा सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे काढून टाकण्यात आला. २.५ mg ml-१ pNPP असलेल्या अभिक्रिया बफरमध्ये एंजाइम किंवा ऊतींचे अर्क जोडून अभिक्रिया सुरू करा. अभिक्रिया मिश्रण अंधारात खोलीच्या तपमानावर उष्मायन केले गेले आणि pNPP मधून रूपांतरित झालेल्या pNP चे प्रमाण वेगवेगळ्या वेळी ४०५ nm वर शोषण मोजून मोजण्यात आले.
इन विट्रो EcK क्रियाकलापांसाठी, प्रथिने 0.2 mg 20E किंवा 3D20E सह 200 µl बफर (pH 7.5) मध्ये 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP आणि 10 mM MgCl2 असलेले 27 °C तापमानावर 2 तासांसाठी उष्मायन केले गेले. 800 µl मिथेनॉल घालून अभिक्रिया थांबवण्यात आली, नंतर -20 °C वर 1 तासासाठी थंड केले गेले, नंतर 4 °C वर 10 मिनिटांसाठी 20,000 ग्रॅम वर सेंट्रीफ्यूज केले गेले. त्यानंतर HPLC-MS/MS द्वारे सुपरनॅटंटचे विश्लेषण केले गेले. नियंत्रण गटात वापरल्या जाणाऱ्या प्रथिनांना उष्णता-निष्क्रिय करण्यासाठी, प्रथिनांना 95°C वर 20 मिनिटांसाठी PBS मध्ये 50% ग्लिसरॉलमध्ये उष्मायन केले गेले.
इन विट्रो EPP क्रियाकलापांसाठी, प्रथिने 3D20E22P (HPLC-MS/MS द्वारे शुद्ध केलेल्या MAG च्या 18 जोड्यांमध्ये आढळलेल्या प्रमाणाच्या समतुल्य) 100 μl बफर (pH 7.5) मध्ये उष्मायन केले गेले ज्यामध्ये 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA आणि 1 mM DTT होते जे 27 °C वर 3 तासांसाठी होते. 400 μl मिथेनॉल घालून अभिक्रिया थांबवण्यात आली आणि -20 °C वर 1 तासासाठी थंड करण्यात आली, नंतर 4 °C वर 10 मिनिटांसाठी 20,000 ग्रॅम वर सेंट्रीफ्यूज करण्यात आली. HPLC-MS/MS द्वारे सुपरनॅटंटचे विश्लेषण करण्यात आले.
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) आणि EcK2 (556 bp) साठी PCR तुकड्यांचे मिश्रण-लिंग डोके नसलेल्या डासांच्या मृतदेहांपासून तयार केलेल्या cDNA वरून वाढवले ​​गेले. eGFP नियंत्रणाचा PCR तुकडा (495 bp) पूर्वी वर्णन केलेल्या pCR2.1-eGFP वरून वाढवले ​​गेला; PCR प्राइमर्स एक्सटेंडेड डेटा टेबल २ मध्ये सूचीबद्ध आहेत. PCR फ्रॅगमेंट pL4440 प्लाझमिडवरील उलटे T7 प्रमोटर्समध्ये घातला गेला. NEB 5-α सक्षम E. coli (न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स) मधून प्लाझमिड रचना पुनर्प्राप्त केल्या गेल्या आणि वापरण्यापूर्वी DNA सिक्वेन्सिंगद्वारे सत्यापित केल्या गेल्या (इन्सर्ट सीक्वेन्ससाठी सप्लिमेंटरी डेटा 1 पहा). T7 प्रमोटरशी जुळणारे प्राइमर्स (विस्तारित डेटा टेबल 2) pL4440-आधारित प्लाझमिडमधून इन्सर्ट वाढवण्यासाठी वापरले गेले. PCR उत्पादन आकाराची पुष्टी अॅगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे करण्यात आली. dsRNA मेगास्क्रिप्ट T7 ट्रान्सक्रिप्शन किट (थर्मो फिशर) वापरून PCR टेम्पलेट्समधून लिप्यंतरित केले गेले आणि पूर्वी वर्णन केलेल्या सुधारणांसह उत्पादकाच्या सूचनांनुसार शुद्ध केले गेले.
dsRNA इंजेक्शनसाठी, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) प्रौढ नर किंवा मादी (Nanoject III, Drummond) च्या छातीत 10 ng nl-1 च्या एकाग्रतेवर एक्क्लोजननंतर 1 दिवसाच्या आत इंजेक्ट केले गेले. RNA एक्सट्रॅक्शन, cDNA संश्लेषण आणि RT-qPCR द्वारे किमान तीन जैविक प्रतिकृतींमध्ये जीन नॉकडाउन पातळी निश्चित केली गेली. ecdysone इंजेक्शनसाठी, 4 दिवसांच्या कुमारी किंवा 6 दिवसांच्या कुमारी रक्ताने भरलेल्या मादींना 0.13, 0.21, किंवा 0.63 µg 20E किंवा 3D20E (Nanoject III, Drummond) अनुक्रमे 1.3, 2.1 च्या एकाग्रतेवर इंजेक्ट केले गेले, जे प्रायोगिक डिझाइन किंवा 6.3 ng nl-1 वर अवलंबून आहे. 100 nl 10% (vol/vol) इंजेक्ट करा. पाण्यात इथेनॉल; १०% इथेनॉलमध्ये १०० nl 3D20E22P (MAGs च्या जोडीमध्ये आढळणाऱ्या प्रमाणाच्या ७५% समतुल्य). डासांना यादृच्छिकपणे इंजेक्शन गटात नियुक्त केले गेले.
अंडी उबविण्यासाठी, ३ दिवसांच्या मादींना मानवी रक्ताचे सेवन करून दिले जात असे. अर्धवट भरलेले किंवा न भरलेले डास काढून टाकले जात होते. उपचारांवर अवलंबून, रक्त खाल्ल्यानंतर किमान ४८ तासांनी चार रात्री मादींना वेगळ्या अंडी उबविण्यासाठी कपमध्ये ठेवण्यात आले. स्टिरिओस्कोप अंतर्गत अंडी मोजण्यात आली (स्टेमी ५०८, झीस); संभोग केलेल्या मादींसाठी, अळ्यांमध्ये उबलेली अंडी सुपीक मानली जात होती.
वीण चाचण्यांसाठी, मादींना वीण प्रतिकार विकसित करण्यासाठी उपचारांवर अवलंबून किमान 2 दिवसांची परवानगी देण्यात आली होती आणि त्यानंतर वन्य-प्रकारच्या वयाशी जुळणारे नर त्याच पिंजऱ्यात आणण्यात आले. दोन रात्रींनंतर, मादी फलित पुटिका विच्छेदित करण्यात आल्या आणि फ्रीझ-थॉ आणि सोनिकेशनद्वारे 10 mM ट्रायस-एचसीएल, 1 mM ईडीटीए आणि 25 mM NaCl (पीएच 8.2) असलेल्या बफरमध्ये जीनोमिक डीएनए सोडण्यात आला. नमुने प्रोटीनेज के (0.86 µg µl-1) सह 55 °C वर 15 मिनिटांसाठी उष्मायन केले गेले, त्यानंतर 95 °C वर 10 मिनिटे. क्रूड जीनोमिक डीएनए तयारी 10 पट पातळ केली गेली आणि Y गुणसूत्र अनुक्रमांचे qPCR शोध अधीन केले गेले; प्राइमर्स विस्तारित डेटा टेबल 2 मध्ये सूचीबद्ध आहेत. Y गुणसूत्र अनुक्रमाची अनुपस्थिती वीण नसल्याचे दर्शवते.
री-मेटिंग अॅसेजसाठी, फोर्स-मेटेड मादींची मेटिंग प्लगच्या उपस्थितीसाठी तपासणी करण्यात आली जेणेकरून मेटिंग स्थितीची पुष्टी होईल आणि पुरुषांच्या अनुपस्थितीत मेटिंगसाठी अपवर्तकता विकसित करण्यासाठी 2 दिवसांची मुदत देण्यात आली, जसे आधी वर्णन केले आहे 36. त्यानंतर DsRed ट्रान्सजेनिक शुक्राणू वाहून नेणाऱ्या नरांना मादी पिंजऱ्यात आणण्यात आले. दोन रात्रींनंतर, मादींमधून फलित करणारे वेसिकल्स वेगळे करण्यात आले आणि वर वर्णन केल्याप्रमाणे जीनोमिक डीएनए तयार करण्यात आला आणि DsRed ट्रान्सजीनचा qPCR शोध घेण्यात आला; प्राइमर्स विस्तारित डेटा टेबल 2 मध्ये सूचीबद्ध आहेत. DsRed ट्रान्सजीनच्या अनुपस्थितीमुळे असे दिसून आले की री-मेटिंग झाले नाही.
3D20E हे आधी वर्णन केल्याप्रमाणे संश्लेषित केले गेले 37. थोडक्यात, 10 मिली पाण्यात 20E (सिग्मा-अल्ड्रिच) चे 10 मिलीग्राम विरघळवले गेले, त्यानंतर 30 मिलीग्राम प्लॅटिनम ब्लॅक (पावडर स्वरूपात, सिग्मा-अल्ड्रिच) जोडले गेले. प्रतिक्रिया मिश्रणात O2 चा सौम्य प्रवाह सतत बुडबुडाला गेला, जो खोलीच्या तपमानावर ढवळला गेला. 6 तासांनंतर, प्रतिक्रिया थांबवण्यासाठी 30 मिली मिथेनॉल जोडले गेले. उत्प्रेरक कण काढून टाकण्यासाठी मिश्रण सेंट्रीफ्यूज केले गेले. खोलीच्या तपमानावर व्हॅक्यूओमध्ये कोरडेपणा येईपर्यंत सुपरनॅटंटचे बाष्पीभवन केले गेले. HPLC-MS/MS विश्लेषणासाठी इंजेक्शनसाठी वाळलेल्या अभिक्रिया उत्पादनाला 10% इथेनॉल आणि मिथेनॉलमध्ये विरघळवले गेले. रूपांतरण दर (20E ते 3D20E पर्यंत) अंदाजे 97% होता (आकृती 4b), आणि संश्लेषित 3D20E चा MS स्पेक्ट्रम संभोग केलेल्या मादींमध्ये आढळलेल्या स्पेक्ट्रमशी जुळला (आकृती 4c).
या दंतकथेत केलेल्या सांख्यिकीय चाचण्यांचे विशिष्ट तपशील आहेत. फिशरची अचूक चाचणी, मँटेल-कॉक्स चाचणी आणि विद्यार्थ्यांची टी-चाचणी करण्यासाठी ग्राफपॅड (आवृत्ती 9.0) वापरण्यात आली. कोचरन-मँटेल-हेन्सेल चाचण्या कस्टम आर स्क्रिप्ट वापरून केल्या गेल्या (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test वर उपलब्ध). ०.०५ च्या महत्त्वाच्या थ्रेशोल्डसह शापिरो-विल्क चाचणी वापरून डेटा वितरणाची सामान्यतेसाठी चाचणी करण्यात आली. जेव्हा डेटा सामान्यता चाचणीत अयशस्वी झाला, तेव्हा मान-व्हिटनी चाचणी करण्यात आली. मँटेल-कॉक्स चाचणी वापरून जगण्याच्या डेटाचे विश्लेषण करण्यात आले. RNA-seq जीन-स्तरीय विभेदक अभिव्यक्ती विश्लेषण करण्यासाठी DESeq2 पॅकेज (आवृत्ती 1.28.1) वापरण्यात आले. आलेखावरील क्षैतिज पट्टी मध्यकाचे प्रतिनिधित्व करते. सर्व चाचण्यांसाठी थ्रेशोल्ड म्हणून P = 0.05 चे महत्त्व मूल्य वापरले गेले.
अभ्यासाच्या रचनेबद्दल अधिक माहितीसाठी, या लेखाशी जोडलेला निसर्ग संशोधन अहवालाचा सारांश पहा.
एमएस प्रोटीओमिक डेटा प्रोटीओमएक्सचेंज कन्सोर्टियम (http://proteomecentral.proteomexchange.org) मध्ये PRIDE पार्टनर रिपॉझिटरी (https://www.ebi.ac.uk/pride/) द्वारे डेटासेट आयडेंटिफायर PXD032157 सह जमा करण्यात आला.
आरएनए-सेक डेटासेट जीन एक्सप्रेशन कॉम्प्रिहेन्सिव्ह लायब्ररीमध्ये (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) सिरीयल रेकॉर्ड GSE198665 अंतर्गत जमा केला आहे.
सध्याच्या अभ्यासादरम्यान तयार केलेले आणि/किंवा विश्लेषण केलेले अतिरिक्त डेटासेट संबंधित लेखकांकडून वाजवी विनंतीनुसार मिळू शकतात. हा लेख स्रोत डेटा प्रदान करतो.
डी लूफ, ए. एक्डिस्टेरॉईड्स: दुर्लक्षित कीटक सेक्स स्टिरॉइड्स? पुरुष: ब्लॅक बॉक्स. कीटक विज्ञान.१३, ३२५–३३८ (२००६).
रेडफर्न, सीपीएफ २०-हायड्रॉक्सीएकडायसोन आणि अंडाशय विकास अ‍ॅनोफिलीस स्टीफन्स.जे. कीटक शरीरविज्ञान.२८, ९७–१०९ (१९८२).