प्रोपिओनिक ॲसिड (PPA), एक बुरशीनाशक घटक आणि आहारातील एक सामान्य पूरक, उंदरांमध्ये असामान्य चेताविकासास कारणीभूत ठरते असे दिसून आले आहे, ज्यासोबत जठरांत्र कार्याचे कार्य बिघडते, आणि हे आतड्यांतील सूक्ष्मजीवांच्या असंतुलनामुळे (gut dysbiosis) होऊ शकते. आहारातील PPA च्या संपर्काचा आणि आतड्यांतील सूक्ष्मजीवांच्या असंतुलनाचा संबंध असल्याचे सुचवले गेले आहे, परंतु त्यावर थेट संशोधन झालेले नाही. येथे, आम्ही आतड्यांतील सूक्ष्मजीवांच्या रचनेत PPA-संबंधित होणाऱ्या बदलांचा अभ्यास केला, ज्यामुळे असंतुलन होऊ शकते. सूक्ष्मजीवांच्या रचनेतील आणि जिवाणूंच्या चयापचय मार्गांमधील फरक तपासण्यासाठी, कोणताही उपचार न केलेल्या आहारावर (n=9) आणि PPA-युक्त आहारावर (n=13) पोसलेल्या उंदरांच्या आतड्यांतील सूक्ष्मजीवांचे (gut microbiomes) लाँग-रेंज मेटाजेनोमिक सिक्वेन्सिंग वापरून अनुक्रमण (sequencing) करण्यात आले. आहारातील PPA मुळे अनेक बॅक्टेरॉइड्स, प्रिव्होटेला आणि रुमिनोकोकस प्रजातींसह महत्त्वपूर्ण टॅक्सांच्या (taxa) संख्येत वाढ झाल्याचे दिसून आले, ज्यांच्या सदस्यांचा पूर्वी PPA उत्पादनाशी संबंध जोडला गेला आहे. PPA च्या संपर्कात आलेल्या उंदरांच्या सूक्ष्मजीवांमध्ये लिपिड चयापचय आणि स्टिरॉइड हार्मोनच्या जैवसंश्लेषणाशी संबंधित मार्ग देखील अधिक प्रमाणात आढळले. आमचे निष्कर्ष सूचित करतात की PPA आतड्यांतील सूक्ष्मजीव आणि त्याच्याशी संबंधित चयापचय मार्गांमध्ये बदल घडवू शकते. निरीक्षणातून दिसून आलेले हे बदल हे अधोरेखित करतात की, खाण्यासाठी सुरक्षित म्हणून वर्गीकृत केलेले संरक्षक पदार्थ आतड्यातील सूक्ष्मजीवांच्या रचनेवर आणि पर्यायाने मानवी आरोग्यावर परिणाम करू शकतात.
मानवी मायक्रोबायोम (सूक्ष्मजीव समुदाय) ला अनेकदा "शरीराचा शेवटचा अवयव" म्हणून संबोधले जाते आणि ते मानवी आरोग्यामध्ये महत्त्वपूर्ण भूमिका बजावते (बाकेरो आणि नोम्बेला, २०१२). विशेषतः, आतड्यातील मायक्रोबायोम त्याच्या संपूर्ण प्रणालीवर होणाऱ्या प्रभावासाठी आणि अनेक आवश्यक कार्यांमधील भूमिकेसाठी ओळखले जाते. आतड्यात सहजीवी जीवाणू मुबलक प्रमाणात असतात, जे अनेक पर्यावरणीय जागा व्यापतात, पोषक तत्वांचा वापर करतात आणि संभाव्य रोगजनकांशी स्पर्धा करतात (जांध्याला इत्यादी, २०१५). आतड्यातील मायक्रोबायोटाचे विविध जीवाणू घटक जीवनसत्त्वांसारखी आवश्यक पोषक तत्वे तयार करण्यास आणि पचनक्रिया सुधारण्यास सक्षम असतात (रोलँड इत्यादी, २०१८). जीवाणूंचे चयापचय पदार्थ ऊतींच्या विकासावर प्रभाव टाकतात आणि चयापचय व रोगप्रतिकारक मार्गांना चालना देतात असेही दिसून आले आहे (हेज्ट्झ इत्यादी, २०११; यू इत्यादी, २०२२). मानवी आतड्यातील मायक्रोबायोमची रचना अत्यंत वैविध्यपूर्ण असते आणि ती आहार, लिंग, औषधे आणि आरोग्य स्थिती यांसारख्या अनुवांशिक आणि पर्यावरणीय घटकांवर अवलंबून असते (कुंभारे इत्यादी, २०१९).
मातेचा आहार हा गर्भाच्या आणि नवजात बालकाच्या विकासाचा एक महत्त्वाचा घटक आहे आणि विकासावर प्रभाव टाकू शकणाऱ्या संयुगांचा एक संभाव्य स्रोत आहे (बेझर इत्यादी, २००४; इनिस, २०१४). असेच एक महत्त्वाचे संयुग म्हणजे प्रोपिओनिक ॲसिड (PPA), जे जिवाणूंच्या किण्वनातून मिळणारे एक शॉर्ट-चेन फॅटी ॲसिडचे उप-उत्पादन आणि अन्न पदार्थातील एक अतिरिक्त घटक आहे (डेन बेस्टेन इत्यादी, २०१३). PPA मध्ये जिवाणूविरोधी आणि बुरशीविरोधी गुणधर्म आहेत आणि म्हणूनच त्याचा उपयोग अन्न संरक्षक म्हणून आणि औद्योगिक क्षेत्रात बुरशी व जिवाणूंची वाढ रोखण्यासाठी केला जातो (वेमेनहोव्ह इत्यादी, २०१६). PPA चे वेगवेगळ्या उतींमध्ये वेगवेगळे परिणाम दिसून येतात. यकृतामध्ये, मॅक्रोफेजमधील सायटोकाइनच्या अभिव्यक्तीवर परिणाम करून PPA दाह-विरोधी प्रभाव दाखवते (कावासो इत्यादी, २०२२). हा नियामक प्रभाव इतर रोगप्रतिकारक पेशींमध्येही दिसून आला आहे, ज्यामुळे दाह कमी होतो (हास इत्यादी, २०२१). तथापि, मेंदूमध्ये याच्या उलट परिणाम दिसून आला आहे. मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की पीपीएच्या संपर्कामुळे उंदरांमध्ये ऑटिझमसारखे वर्तन निर्माण होते (एल-अन्सारी इत्यादी, २०१२). इतर अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की पीपीए मेंदूमध्ये ग्लायोसिस निर्माण करू शकते आणि दाह-समर्थक मार्ग सक्रिय करू शकते (अब्देली इत्यादी, २०१९). पीपीए एक दुर्बल आम्ल असल्यामुळे, ते आतड्यांच्या उपकलेतून रक्तप्रवाहात पसरू शकते आणि अशा प्रकारे रक्त-मेंदू अडथळा तसेच वार यांसारखे प्रतिबंधात्मक अडथळे ओलांडू शकते (स्टिन्सन इत्यादी, २०१९). यावरून जीवाणूंनी तयार केलेले एक नियामक चयापचय म्हणून पीपीएचे महत्त्व अधोरेखित होते. ऑटिझमसाठी एक जोखीम घटक म्हणून पीपीएच्या संभाव्य भूमिकेवर सध्या संशोधन सुरू असले तरी, ऑटिझम असलेल्या व्यक्तींवरील त्याचे परिणाम चेतापेशींच्या विभेदनाला प्रवृत्त करण्यापलीकडेही असू शकतात.
न्यूरोडेव्हलपमेंटल डिसऑर्डर असलेल्या रुग्णांमध्ये अतिसार आणि बद्धकोष्ठता यांसारखी पचनसंस्थेची लक्षणे सामान्यपणे आढळतात (काओ एट अल., २०२१). मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की ऑटिझम स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर (ASD) असलेल्या रुग्णांचे मायक्रोबायोम निरोगी व्यक्तींपेक्षा वेगळे असते, जे आतड्यातील मायक्रोबायोटाच्या असंतुलनाचे (गट मायक्रोबायोटा डायस्बायोसिस) अस्तित्व दर्शवते (फाइनगोल्ड एट अल., २०१०). त्याचप्रमाणे, इन्फ्लॅमेटरी बाऊल डिसीजेस, लठ्ठपणा, अल्झायमर रोग इत्यादी असलेल्या रुग्णांच्या मायक्रोबायोमची वैशिष्ट्ये देखील निरोगी व्यक्तींपेक्षा वेगळी असतात (टर्नबॉट एट अल., २००९; वोग्ट एट अल., २०१७; हेन्के एट अल., २०१९). तथापि, आजपर्यंत, आतड्यातील मायक्रोबायोम आणि न्यूरोलॉजिकल रोग किंवा लक्षणे यांच्यात कोणताही कार्यकारण संबंध प्रस्थापित झालेला नाही (याप एट अल., २०२१), जरी यापैकी काही आजारांमध्ये अनेक जिवाणू प्रजातींची भूमिका असल्याचे मानले जाते. उदाहरणार्थ, ऑटिझम असलेल्या रुग्णांच्या मायक्रोबायोटामध्ये अकरमान्सिया, बॅक्टेरॉइड्स, क्लोस्ट्रिडियम, लॅक्टोबॅसिलस, डेसल्फोव्हिब्रिओ आणि इतर प्रजाती अधिक प्रमाणात आढळतात (टोमोवा एट अल., २०१५; गोलुबेवा एट अल., २०१७; क्रिस्टियानो एट अल., २०१८; झुरिटा एट अल., २०२०). विशेष म्हणजे, यापैकी काही प्रजातींच्या सदस्य प्रजातींमध्ये पीपीए उत्पादनाशी संबंधित जनुके असल्याचे ज्ञात आहे (राइखार्ड्ट एट अल., २०१४; युन आणि ली, २०१६; झांग एट अल., २०१९; बाऊर आणि ड्यूरे, २०२३). पीपीएचे सूक्ष्मजीवविरोधी गुणधर्म लक्षात घेता, त्याचे प्रमाण वाढवणे हे पीपीए-उत्पादक जीवाणूंच्या वाढीसाठी फायदेशीर ठरू शकते (जेकबसन एट अल., २०१८). अशाप्रकारे, PFA-समृद्ध वातावरणामुळे आतड्यातील सूक्ष्मजीवांमध्ये बदल होऊ शकतात, ज्यामध्ये जठरांत्रातील रोगजनकांचा समावेश होतो, जे जठरांत्राच्या लक्षणांना कारणीभूत ठरू शकणारे संभाव्य घटक असू शकतात.
मायक्रोबायोम संशोधनातील एक महत्त्वाचा प्रश्न हा आहे की, सूक्ष्मजीवांच्या रचनेतील फरक हे मूळ आजारांचे कारण आहेत की लक्षण. आहार, आतड्यातील मायक्रोबायोम आणि मज्जासंस्थेचे आजार यांच्यातील गुंतागुंतीचे नाते उलगडण्याच्या दिशेने पहिले पाऊल म्हणजे सूक्ष्मजीवांच्या रचनेवर आहाराच्या परिणामांचे मूल्यांकन करणे. या उद्देशाने, आम्ही पीपीए-समृद्ध किंवा पीपीए-विरहित आहार दिलेल्या उंदरांच्या पिलांच्या आतड्यातील मायक्रोबायोमची तुलना करण्यासाठी लाँग-रीड मेटाजेनोमिक सिक्वेन्सिंगचा वापर केला. पिलांना त्यांच्या आईप्रमाणेच आहार देण्यात आला होता. आमची अशी गृहीत कल्पना होती की, पीपीए-समृद्ध आहारामुळे आतड्यातील सूक्ष्मजीवांच्या रचनेत आणि त्यांच्या कार्यात्मक मार्गांमध्ये बदल होतील, विशेषतः पीपीए चयापचय आणि/किंवा पीपीए उत्पादनाशी संबंधित मार्गांमध्ये.
या अभ्यासात, युनिव्हर्सिटी ऑफ सेंट्रल फ्लोरिडा इन्स्टिट्यूशनल ॲनिमल केअर अँड यूज कमिटी (UCF-IACUC) च्या मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार (प्राणी वापर परवाना क्रमांक: PROTO202000002), ग्लिया-विशिष्ट GFAP प्रमोटरच्या नियंत्रणाखाली ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) चे अति-अभिव्यक्ती करणारे FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J ट्रान्सजेनिक उंदीर (जॅक्सन लॅबोरेटरीज) वापरण्यात आले. दूध सोडल्यानंतर, उंदरांना प्रत्येक पिंजऱ्यात १-५ नर आणि मादी याप्रमाणे स्वतंत्रपणे ठेवण्यात आले. उंदरांना एकतर शुद्ध केलेला नियंत्रण आहार (सुधारित ओपन-लेबल मानक आहार, १६ किलोकॅलरी% चरबी) किंवा सोडियम प्रोपिओनेट-पूरक आहार (सुधारित ओपन-लेबल मानक आहार, १६ किलोकॅलरी% चरबी, ज्यात ५,००० पीपीएम सोडियम प्रोपिओनेट आहे) मुक्तपणे खाऊ घालण्यात आला. वापरलेल्या सोडियम प्रोपिओनेटचे प्रमाण ५,००० मिलीग्राम PFA/किलो एकूण अन्न वजनाच्या समतुल्य होते. अन्न संरक्षक म्हणून वापरण्यासाठी मंजूर असलेली ही PPA ची सर्वोच्च सांद्रता आहे. या अभ्यासाच्या तयारीसाठी, पालक उंदरांना मिलनाच्या ४ आठवडे आधी दोन्ही प्रकारचे आहार देण्यात आले आणि मातेच्या संपूर्ण गर्भावस्थेत ते चालू ठेवण्यात आले. संतती उंदरांना [२२ उंदीर, ९ नियंत्रक (६ नर, ३ मादी) आणि १३ पीपीए (४ नर, ९ मादी)] दूध सोडवल्यानंतर ५ महिने माद्यांप्रमाणेच आहार देण्यात आला. संतती उंदरांना ५ महिन्यांचे झाल्यावर मारण्यात आले आणि त्यांच्या आतड्यांमधील विष्ठेचे घटक गोळा करून सुरुवातीला १.५ मिली मायक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये -२०°C तापमानावर साठवण्यात आले आणि नंतर यजमान डीएनए संपेपर्यंत आणि सूक्ष्मजंतूंचे न्यूक्लिक आम्ल काढले जाईपर्यंत -८०°C फ्रीझरमध्ये स्थानांतरित करण्यात आले.
यजमान डीएनए एका सुधारित प्रोटोकॉलनुसार (Charalampous et al., 2019) काढण्यात आला. थोडक्यात, विष्ठेतील घटक ५०० µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) मध्ये स्थानांतरित करून गोठवून ठेवण्यात आले. प्रत्येक निष्कर्षणामध्ये जास्तीत जास्त १-२ विष्ठेच्या गोळ्यांवर प्रक्रिया करा. त्यानंतर, ट्यूबच्या आत प्लास्टिकच्या मुसळाचा वापर करून विष्ठेतील घटकांना यांत्रिकरित्या एकजीव करून लगदा तयार करण्यात आला. नमुन्यांना १०,००० RCF वर ५ मिनिटांसाठी किंवा नमुने गोळा होईपर्यंत सेंट्रीफ्यूज करा, नंतर वरचा द्रव काढून टाका आणि गोळा झालेल्या भागाला २५० µl १× PBS मध्ये पुन्हा विरघळवा. युकेरियोटिक पेशींचे पडदे सैल करण्यासाठी डिटर्जंट म्हणून नमुन्यात २५० µl ४.४% सॅपोनीन द्रावण (TCI, उत्पादन क्रमांक S0019) घाला. नमुने गुळगुळीत होईपर्यंत हळुवारपणे मिसळले गेले आणि खोलीच्या तापमानावर १० मिनिटांसाठी उबवले गेले. पुढे, युकेरियोटिक पेशी विखंडित करण्यासाठी, नमुन्यात ३५० μl न्यूक्लिएज-मुक्त पाणी घालून ३० सेकंदांसाठी उबवले आणि नंतर १२ μl ५ M NaCl घातले. त्यानंतर नमुने ६००० RCF वर ५ मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले. सुपरनॅटंट काढून टाका आणि पेललेट १०० μl १X PBS मध्ये पुन्हा विरघळवा. होस्ट डीएनए काढून टाकण्यासाठी, १०० μl HL-SAN बफर (१२.८५६८ ग्रॅम NaCl, ४ मिली १M MgCl2, ३६ मिली न्यूक्लिएज-मुक्त पाणी) आणि १० μl HL-SAN एन्झाइम (ArticZymes P/N 70910-202) घाला. पिपेटिंगद्वारे नमुने पूर्णपणे मिसळले गेले आणि एपेंडॉर्फ™ थर्मोमिक्सर सी वर ३७°C तापमानावर ८०० आरपीएम वेगाने ३० मिनिटांसाठी उबवले गेले. उबवल्यानंतर, ६००० आरसीएफ वेगाने ३ मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले आणि ८०० µl व १००० µl १X पीबीएसने दोनदा धुतले गेले. शेवटी, पेललेट १०० µl १X पीबीएसमध्ये पुन्हा विरघळवले गेले.
न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स मोनार्क जीनोमिक डीएनए प्युरिफिकेशन किट (न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स, इप्सविच, एमए, कॅट# T3010L) वापरून एकूण जिवाणू डीएनए वेगळा करण्यात आला. किटसोबत दिलेली प्रमाणित कार्यपद्धती किंचित सुधारित केली आहे. अंतिम इल्युशनसाठी प्रक्रिया करण्यापूर्वी, न्यूक्लिएज-मुक्त पाणी ६०°C तापमानावर उबवून ठेवा आणि त्याची देखभाल करा. प्रत्येक नमुन्यात १० µl प्रोटीनेज के आणि ३ µl आरएनएज ए घाला. त्यानंतर १०० µl सेल लायसिस बफर घालून हळुवारपणे मिसळा. त्यानंतर नमुने एपेंडॉर्फ™ थर्मोमिक्सर सी मध्ये ५६°C तापमानावर आणि १४०० आरपीएम वेगाने किमान १ तास ते ३ तासांपर्यंत उबवण्यात आले. उबवलेले नमुने ३ मिनिटांसाठी १२,००० आरसीएफ वेगाने सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले आणि प्रत्येक नमुन्यातील सुपरनॅटंट (वरचा द्रव) ४०० µL बाइंडिंग सोल्युशन असलेल्या एका वेगळ्या १.५ मिली मायक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये हस्तांतरित करण्यात आला. नंतर ट्यूब्सना १ सेकंदाच्या अंतराने ५-१० सेकंदांसाठी पल्स व्हॉर्टेक्स केले गेले. प्रत्येक नमुन्यातील संपूर्ण द्रव सामग्री (अंदाजे ६००-७०० µL) एका फ्लो-थ्रू कलेक्शन ट्यूबमध्ये ठेवलेल्या फिल्टर कार्ट्रिजमध्ये स्थानांतरित करा. सुरुवातीच्या डीएनए बंधनासाठी ट्यूब्सना १,००० RCF वर ३ मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले आणि नंतर उर्वरित द्रव काढून टाकण्यासाठी १२,००० RCF वर १ मिनिटासाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले. सॅम्पल कॉलम एका नवीन कलेक्शन ट्यूबमध्ये स्थानांतरित केला गेला आणि नंतर दोनदा धुतला गेला. पहिल्या धुलाईसाठी, प्रत्येक ट्यूबमध्ये ५०० µL वॉश बफर घाला. ट्यूब ३-५ वेळा उलटी करा आणि नंतर १२,००० RCF वर १ मिनिटासाठी सेंट्रीफ्यूज करा. कलेक्शन ट्यूबमधील द्रव टाकून द्या आणि फिल्टर कार्ट्रिज त्याच कलेक्शन ट्यूबमध्ये परत ठेवा. दुसऱ्या धुलाईसाठी, ट्यूब न उलटी करता फिल्टरमध्ये ५०० µL वॉश बफर घाला. नमुने 1 मिनिटासाठी 12,000 RCF वर सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले. फिल्टर 1.5 mL LoBind® ट्यूबमध्ये स्थानांतरित करा आणि त्यात 100 µL पूर्व-गरम केलेले न्यूक्लिएज-मुक्त पाणी घाला. फिल्टर्स खोलीच्या तापमानावर 1 मिनिटासाठी इनक्युबेट करण्यात आले आणि नंतर 1 मिनिटासाठी 12,000 RCF वर सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले. इल्युटेड डीएनए -80°C वर साठवण्यात आला.
Qubit™ 4.0 फ्लोरोमीटर वापरून डीएनएची सांद्रता मोजण्यात आली. उत्पादकाच्या सूचनांनुसार Qubit™ 1X dsDNA हाय सेन्सिटिव्हिटी किट (कॅट. नं. Q33231) वापरून डीएनए तयार करण्यात आला. Agilent™ 4150 किंवा 4200 टेपस्टेशन वापरून डीएनए तुकड्यांच्या लांबीचे वितरण मोजण्यात आले. Agilent™ जेनोमिक डीएनए रिएजंट्स (कॅट. नं. 5067-5366) आणि जेनोमिक डीएनए स्क्रीनटेप (कॅट. नं. 5067-5365) वापरून डीएनए तयार करण्यात आला. उत्पादकाच्या सूचनांनुसार ऑक्सफर्ड नॅनोपोर टेक्नॉलॉजीज™ (ONT) रॅपिड पीसीआर बारकोडिंग किट (SQK-RPB004) वापरून लायब्ररी तयार करण्यात आली. Min106D फ्लो सेल (R 9.4.1) असलेल्या ONT GridION™ Mk1 सिक्वेन्सरचा वापर करून डीएनएचे सिक्वेन्सिंग करण्यात आले. सिक्वेन्सिंग सेटिंग्ज पुढीलप्रमाणे होत्या: उच्च अचूकतेचे बेस कॉलिंग, किमान q मूल्य ९, बारकोड सेटअप आणि बारकोड ट्रिम. नमुन्यांचे ७२ तास सिक्वेन्सिंग करण्यात आले, त्यानंतर पुढील प्रक्रिया आणि विश्लेषणासाठी बेस कॉल डेटा सादर करण्यात आला.
बायोइन्फॉर्मेटिक्स प्रक्रिया पूर्वी वर्णन केलेल्या पद्धती वापरून केली गेली (ग्रीनमन एट अल., २०२४). सिक्वेन्सिंगमधून मिळालेल्या FASTQ फाइल्स प्रत्येक नमुन्यासाठी डिरेक्टरीजमध्ये विभागल्या गेल्या. बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषणापूर्वी, खालील पाइपलाइन वापरून डेटावर प्रक्रिया केली गेली: प्रथम, नमुन्यांच्या FASTQ फाइल्स एकाच FASTQ फाइलमध्ये विलीन केल्या गेल्या. त्यानंतर, Filtlong v. 0.2.1 वापरून १००० bp पेक्षा लहान रीड्स फिल्टर केले गेले, ज्यामध्ये फक्त –min_length 1000 हा पॅरामीटर बदलला गेला (विक, २०२४). पुढील फिल्टरिंग करण्यापूर्वी, NanoPlot v. 1.41.3 वापरून खालील पॅरामीटर्ससह रीडची गुणवत्ता नियंत्रित केली गेली: –fastq –plots dot –N50 -o(डी कोस्टर आणि राडेमेकर्स, २०२३). होस्ट-दूषित रीड्स काढून टाकण्यासाठी, खालील पॅरामीटर्स वापरून minimap2 v. 2.24-r1122 द्वारे रीड्स माऊस रेफरन्स जीनोम GRCm39 (GCF_000001635.27) शी अलाइन केले गेले: -L -ax map-ont(ली, २०१८). तयार झालेल्या अलाइनमेंट फाइल्स samtools v. 1.16.1 मध्ये samtools view -b (डानेसेक एट अल., २०२१) वापरून BAM फॉरमॅटमध्ये रूपांतरित करण्यात आल्या. त्यानंतर samtools view -b -f 4 वापरून अनअलाइन्ड रीड्स ओळखण्यात आल्या, ज्यामुळे हे रीड्स होस्ट जीनोमचे नाहीत हे सूचित झाले. अनअलाइन्ड रीड्स samtools bam2fq वापरून डिफॉल्ट पॅरामीटर्ससह पुन्हा FASTQ फॉरमॅटमध्ये रूपांतरित करण्यात आल्या. पूर्वी वर्णन केलेल्या सेटिंग्ज वापरून, आणखी फिल्टर केलेल्या रीड्सवर नॅनोप्लॉट (NanoPlot) पुन्हा चालवण्यात आले. फिल्टरिंगनंतर, मेटाजेनोमिक डेटा metaflye v. 2.8.2-b1689 वापरून खालील पॅरामीटर्ससह असेम्बल करण्यात आला: –nano-raw–meta (कोल्मोगोरोव्ह आणि इतर, २०२०). उर्वरित पॅरामीटर्स त्यांच्या डीफॉल्ट मूल्यांवर ठेवा. असेंब्लीनंतर, फिल्टर केलेले रीड्स minimap2 वापरून असेंब्लीवर मॅप केले गेले आणि SAM फॉरमॅटमध्ये अलाइनमेंट फाइल तयार करण्यासाठी -ax map-ont पॅरामीटर वापरला गेला. असेंब्ली प्रथम racon v. 1.4.20 वापरून खालील पॅरामीटर्ससह परिष्कृत केली गेली: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (व्हेसर आणि इतर, २०१७). racon पूर्ण झाल्यावर, medaka_consesus वापरून medaka v. 1.7.2 सह ती पुढे परिष्कृत केली गेली, ज्यात -m पॅरामीटर वगळता सर्व पॅरामीटर्स त्यांच्या डीफॉल्ट मूल्यांवर ठेवले होते. आमच्या डेटासाठी वापरलेली फ्लो सेल केमिस्ट्री आणि उच्च-अचूकता बेस कॉलिंग निर्दिष्ट करण्यासाठी -m पॅरामीटर r941_min_hac_g507 वर सेट केला आहे (नॅनोपोरेटेक/मेडाका, २०२४). फिल्टर केलेला डेटा (यापुढे 'सूक्ष्मजैविक डेटा' म्हणून संबोधला जाईल) आणि अंतिम स्वच्छ केलेला संच पुढील विश्लेषणासाठी वापरण्यात आला.
टॅक्सोनॉमिक वर्गीकरणासाठी, Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019) वापरून रीड्स आणि असेम्बल केलेल्या कॉन्टिग्सचे वर्गीकरण करण्यात आले. रीड्स आणि असेम्ब्लीजसाठी अनुक्रमे रिपोर्ट्स आणि आउटपुट फाइल्स तयार करा. रीड्स आणि असेम्ब्लीजचे विश्लेषण करण्यासाठी –use-names हा पर्याय वापरा. ​​रीड सेगमेंट्ससाठी –gzip-compressed आणि –paired हे पर्याय निर्दिष्ट केले आहेत. मेटाजिनोम्समधील टॅक्साची सापेक्ष विपुलता Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017) वापरून अंदाजित करण्यात आली. आम्ही प्रथम खालील पॅरामीटर्ससह bracken-build वापरून १००० बेसेस असलेला एक kmer डेटाबेस तयार केला: -d-k 35 -l 1000 एकदा तयार झाल्यावर, ब्रॅकेन (bracken) हे क्रॅकेन२ (kraken2) ने तयार केलेल्या अहवालाच्या आधारे चालते आणि खालील पर्यायांचा वापर करून डेटा फिल्टर करते: -d -I -O-पी १००० -एल

त्यांपैकी, विश्लेषण केल्या जाणाऱ्या वर्गीकरण पातळीनुसार P, G किंवा S निवडले जाते. खोट्या सकारात्मक वर्गीकरणांचा प्रभाव कमी करण्यासाठी, 1e-4 (1/10,000 रीड्स) ची किमान सापेक्ष विपुलता मर्यादा स्वीकारण्यात आली. सांख्यिकीय विश्लेषणापूर्वी, ब्रॅकेनने नोंदवलेली सापेक्ष विपुलता (फ्रॅक्शन_टोटल_रीड्स) सेंटर्ड लॉग-रेशो (CLR) रूपांतरण (एचीसन, १९८२) वापरून रूपांतरित करण्यात आली. डेटा रूपांतरणासाठी CLR पद्धत निवडण्यात आली कारण ती स्केल-इनव्हॅरिएंट आहे आणि नॉन-स्पार्स डेटासेटसाठी पुरेशी आहे (ग्लोर इत्यादी, २०१७). CLR रूपांतरण नैसर्गिक लॉगरिदम वापरते. ब्रॅकेनने नोंदवलेला काउंट डेटा रिलेटिव्ह लॉग एक्सप्रेशन (RLE) (अँडर्स आणि ह्युबर, २०१०) वापरून सामान्यीकृत करण्यात आला. मॅटप्लॉटलिब v. 3.7.1, सीबॉर्न v. 3.7.2 आणि सिक्वेन्शियल लॉगरिदम (ग्लोर इत्यादी, २०१७) यांच्या संयोजनाने आकृत्या तयार करण्यात आल्या. ०.१२.२ आणि स्टॅन्टानोटेशन्स v. ०.५.० (हंटर, २००७; वास्कॉम, २०२१; चार्लियर इत्यादी, २०२२). सामान्यीकृत जिवाणू संख्या वापरून प्रत्येक नमुन्यासाठी बॅसिलस/बॅक्टेरॉइडेट्स गुणोत्तराची गणना करण्यात आली. तक्त्यांमध्ये दिलेली मूल्ये ४ दशांश स्थळांपर्यंत पूर्णांकित केली आहेत. क्रॅकेनटूल्स v. १.२ पॅकेजमध्ये (लू इत्यादी, २०२२) दिलेल्या alpha_diversity.py स्क्रिप्टचा वापर करून सिम्पसन विविधता निर्देशांकाची गणना करण्यात आली. ब्रॅकेन अहवाल स्क्रिप्टमध्ये दिलेला आहे आणि -an पॅरामीटरसाठी सिम्पसन निर्देशांक “Si” दिलेला आहे. विपुलतेमधील लक्षणीय फरक सरासरी CLR फरक ≥ १ किंवा ≤ -१ असे परिभाषित केले गेले. ±१ चा सरासरी CLR फरक नमुना प्रकाराच्या विपुलतेमध्ये २.७-पट वाढ दर्शवतो. चिन्ह (+/-) हे अनुक्रमे PPA नमुन्यात आणि नियंत्रण नमुन्यात टॅक्सॉन अधिक प्रमाणात आहे की नाही हे दर्शवते. सार्थकता मॅन-व्हिटनी यू चाचणी (व्हर्टानेन इत्यादी, २०२०) वापरून निश्चित करण्यात आली. स्टॅट्समॉडेल्स v. ०.१४ (बेंजामिनी आणि होचबर्ग, १९९५; सीबोल्ड आणि पर्कटोल्ड, २०१०) वापरण्यात आले आणि एकाधिक चाचणीसाठी सुधारणा करण्याकरिता बेंजामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया लागू करण्यात आली. सांख्यिकीय सार्थकता निश्चित करण्यासाठी समायोजित पी-व्हॅल्यू ≤ ०.०५ ही मर्यादा म्हणून वापरण्यात आली.
जीन ॲनोटेशन आणि सापेक्ष विपुलतेचा अंदाज मारंगा एट अल. (मारंगा एट अल., २०२३) यांनी वर्णन केलेल्या प्रोटोकॉलच्या सुधारित आवृत्तीचा वापर करून करण्यात आला. सर्वप्रथम, SeqKit v. 2.5.1 (शेन एट अल., २०१६) वापरून सर्व असेंब्लींमधून ५०० bp पेक्षा लहान कॉन्टिग्स काढून टाकण्यात आले. त्यानंतर निवडलेल्या असेंब्लींना एकत्र करून एक पॅन-मेटाजिनोम तयार करण्यात आला. ओपन रीडिंग फ्रेम्स (ORFs) खालील पॅरामीटर्ससह Prodigal v. 1.0.1 (Prodigal v. 2.6.3 ची एक समांतर आवृत्ती) वापरून ओळखण्यात आल्या: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024). त्यानंतर, सर्व अपूर्ण जीन्स काढून टाकण्यासाठी पायथॉन वापरून परिणामी न्यूक्लिओटाइड फाइल्स फिल्टर केल्या गेल्या. त्यानंतर खालील पॅरामीटर्ससह जीन्सचे क्लस्टरिंग करण्यासाठी CD-HIT v. 4.8.1 वापरण्यात आले: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (फू एट अल., २०१२). तयार केलेल्या नॉन-रिडंडंट जीन कॅटलॉगचा वापर जीनची विपुलता आणि एनोटेशनचा अंदाज घेण्यासाठी केला गेला. KMA v. 1.4.9 (क्लॉसेन एट अल., २०१८) वापरून सापेक्ष जीन विपुलतेचा अंदाज लावण्यात आला. प्रथम, खालील पॅरामीटर्ससह KMA इंडेक्स वापरून एक इंडेक्स फाइल तयार करा: -i -Oत्यानंतर, बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइन विभागात वर्णन केल्यानुसार प्रत्येक नमुन्यासाठी मायक्रोबियल रीड्ससह तयार केलेल्या इंडेक्सचा वापर करून, KMA खालील पॅरामीटर्ससह चालवले गेले: -i -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. त्यानंतर, CLR वापरून जीन काउंट्स नॉर्मलाइझ करण्यात आले आणि साय-किट लर्नचा प्रिन्सिपल कंपोनेंट ॲनालिसिस (PCA) क्लास वापरण्यात आला (पेड्रेगोसा इत्यादी, २०११). eggNOG v. 2.1.12 च्या emapper.py स्क्रिप्ट आणि eggNOG डेटाबेस आवृत्ती 5.0.2 वापरून नॉन-रिडंडंट जीन कॅटलॉगवर प्रेडिक्टेड जीन ॲनोटेशन करण्यात आले, ज्यासाठी खालील पॅरामीटर्स वापरले गेले: –itype CDS –cpu 24 -i– डेटा कॅटलॉग–गो_एव्हिडन्स नॉन-इलेक्ट्रॉनिक – आउटपुट– आउटपुट डिरेक्टरी–target_orthologs all –seed_ortholog_evalue 0.001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(कँटालपिएड्रा एट अल., २०२१). पुरेसे टेम्पलेट कव्हरेज आणि टेम्पलेट आयडेंटिटी (≥ ९०%) तसेच विपुलता (डेप्थ ≥ ३) असलेले जीन्स निवडण्यासाठी KMA निकालांची छाननी करण्यात आली. वर वर्णन केल्याप्रमाणे CLR वापरून KMA डेप्थ निकालांचे रूपांतर करण्यात आले. त्यानंतर, प्रत्येक जीनसाठी कॉन्टिग सोर्स वापरून, कार्यात्मक एनोटेशन आणि वर्गीकरण निकालांमधील कॉन्टिग आयडींसोबत KMA निकालांची तुलना करण्यात आली. टॅक्साप्रमाणेच, जीनच्या विपुलतेमधील लक्षणीय फरक म्हणजे असे जीन्स ज्यांच्यामध्ये सरासरी CLR फरक ≥ १ किंवा ≤ -१ होता, आणि (+/-) हे चिन्ह अनुक्रमे PPA किंवा कंट्रोल सॅम्पल्समध्ये जीन अधिक प्रमाणात असल्याचे दर्शवते.
जीन पाथवेच्या विपुलतेची तुलना करण्यासाठी, eggNOG द्वारे नियुक्त केलेल्या क्योटो एन्सायक्लोपीडिया ऑफ जीन्स अँड जीनोम्स (KEGG) ऑर्थोलॉग (KO) आयडेंटिफायर्सनुसार प्रथम जीन्सचे गट पाडण्यात आले. विश्लेषणापूर्वी, नॉकआउट नसलेले किंवा एकापेक्षा जास्त नॉकआउट असलेले जीन्स काढून टाकण्यात आले. त्यानंतर प्रत्येक नमुन्यातील प्रत्येक KO ची सरासरी विपुलता मोजण्यात आली आणि सांख्यिकीय विश्लेषण करण्यात आले. PPA चयापचय जीन्स म्हणजे असे कोणतेही जीन ज्यांना KEGG_Pathway कॉलममध्ये ko00640 ही ओळ दिली होती, जे KEGG नुसार प्रोपिओनेट चयापचयातील भूमिका दर्शवते. PPA उत्पादनाशी संबंधित म्हणून ओळखले गेलेले जीन्स परिशिष्ट सारणी १ मध्ये सूचीबद्ध आहेत (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). प्रत्येक नमुना प्रकारात लक्षणीयरीत्या अधिक विपुल असलेले PPA चयापचय आणि उत्पादन जीन्स ओळखण्यासाठी परम्युटेशन चाचण्या करण्यात आल्या. विश्लेषण केलेल्या प्रत्येक जीनसाठी एक हजार परम्युटेशन्स करण्यात आले. सांख्यिकीय महत्त्व निश्चित करण्यासाठी ०.०५ ची पी-व्हॅल्यू कटऑफ म्हणून वापरण्यात आली. क्लस्टरमधील प्रतिनिधी जनुकांच्या ॲनोटेशन्सच्या आधारावर, क्लस्टरमधील प्रत्येक जनुकाला कार्यात्मक ॲनोटेशन्स देण्यात आले. Kraken2 आउटपुट फाइल्समधील कॉन्टिग आयडींना, eggNOG वापरून कार्यात्मक ॲनोटेशन दरम्यान ठेवलेल्या त्याच कॉन्टिग आयडींशी जुळवून, PPA चयापचय आणि/किंवा PPA उत्पादनाशी संबंधित टॅक्सा ओळखता आले. पूर्वी वर्णन केलेल्या मॅन-व्हिटनी यू चाचणीचा वापर करून सार्थकता चाचणी करण्यात आली. बेंजामिनी-होचबर्ग प्रक्रियेचा वापर करून एकाधिक चाचणीसाठी सुधारणा करण्यात आली. सांख्यिकीय सार्थकता निश्चित करण्यासाठी ≤ 0.05 ची पी-व्हॅल्यू कटऑफ म्हणून वापरण्यात आली.
सिम्पसन विविधता निर्देशांकाचा वापर करून उंदरांच्या आतड्यांतील सूक्ष्मजीव समुदायाच्या विविधतेचे मूल्यांकन करण्यात आले. प्रजाती आणि जातींच्या विविधतेच्या बाबतीत नियंत्रण आणि पीपीए नमुन्यांमध्ये कोणतेही महत्त्वपूर्ण फरक आढळले नाहीत (प्रजातींसाठी पी-व्हॅल्यू: ०.१८, जातींसाठी पी-व्हॅल्यू: ०.१६) (आकृती १). त्यानंतर प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) वापरून सूक्ष्मजैविक रचनेची तुलना करण्यात आली. आकृती २ नमुन्यांचे त्यांच्या संघांनुसार (phyla) झालेले गट दर्शवते, जे सूचित करते की पीपीए आणि नियंत्रण नमुन्यांमधील सूक्ष्मजीव समुदायाच्या जातींच्या रचनेत फरक होते. प्रजाती स्तरावर हे गट कमी स्पष्ट होते, जे सूचित करते की पीपीए विशिष्ट जीवाणूंवर परिणाम करते (पूरक आकृती १).
आकृती १. उंदराच्या आतड्यातील मायक्रोबायोममधील प्रजातींची अल्फा विविधता आणि जातींची रचना. PPA आणि नियंत्रण नमुन्यांमधील प्रजातींचे (A) आणि जातींचे (B) सिम्पसन विविधता निर्देशांक दर्शवणारे बॉक्स प्लॉट. सार्थकता मॅन-व्हिटनी यू चाचणी वापरून निश्चित केली गेली आणि बेंजामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया वापरून एकाधिक सुधारणा केली गेली. ns, p-मूल्य महत्त्वपूर्ण नव्हते (p>0.05).
आकृती २. प्रजाती स्तरावर उंदराच्या आतड्यातील मायक्रोबायोम रचनेच्या मुख्य घटक विश्लेषणाचे परिणाम. मुख्य घटक विश्लेषणाचा आलेख नमुन्यांचे त्यांच्या पहिल्या दोन मुख्य घटकांमधील वितरण दर्शवतो. रंग नमुन्याचा प्रकार दर्शवतात: पीपीए-संस्पर्शित उंदीर जांभळे आणि नियंत्रण उंदीर पिवळे आहेत. मुख्य घटक १ आणि २ अनुक्रमे एक्स-अक्ष आणि वाय-अक्षावर दर्शवले आहेत आणि ते त्यांच्या स्पष्ट केलेल्या प्रसरण गुणोत्तराच्या स्वरूपात व्यक्त केले आहेत.
आरएलई रूपांतरित गणना डेटा वापरून, नियंत्रण आणि पीपीए उंदरांमध्ये बॅक्टेरॉइडेट्स/बॅसिली गुणोत्तराच्या मध्यकामध्ये लक्षणीय घट दिसून आली (नियंत्रण: ९.६६, पीपीए: ३.०२; पी-व्हॅल्यू = ०.००११). हा फरक नियंत्रणांच्या तुलनेत पीपीए उंदरांमध्ये बॅक्टेरॉइडेट्सच्या जास्त प्रमाणामुळे होता, जरी हा फरक लक्षणीय नव्हता (नियंत्रण सरासरी सीएलआर: ५.५१, पीपीए सरासरी सीएलआर: ६.६२; पी-व्हॅल्यू = ०.०५४), तर बॅक्टेरॉइडेट्सचे प्रमाण समान होते (नियंत्रण सरासरी सीएलआर: ७.७६, पीपीए सरासरी सीएलआर: ७.६०; पी-व्हॅल्यू = ०.१८).
आतड्यातील सूक्ष्मजीवांच्या वर्गीकरणात्मक सदस्यांच्या विपुलतेच्या विश्लेषणातून असे दिसून आले की PPA आणि नियंत्रण नमुन्यांमध्ये 1 संघ आणि 77 प्रजातींमध्ये लक्षणीय फरक होता (पूरक सारणी 2). PPA नमुन्यांमध्ये 59 प्रजातींची विपुलता नियंत्रण नमुन्यांपेक्षा लक्षणीयरीत्या जास्त होती, तर नियंत्रण नमुन्यांमध्ये केवळ 16 प्रजातींची विपुलता PPA नमुन्यांपेक्षा जास्त होती (आकृती 3).
आकृती ३. पीपीए आणि नियंत्रण उंदरांच्या आतड्यांतील मायक्रोबायोममधील टॅक्साच्या विपुलतेतील फरक. व्होल्कॅनो प्लॉट पीपीए आणि नियंत्रण नमुन्यांमधील वंश (अ) किंवा जाती (ब) यांच्या विपुलतेतील फरक दर्शवतात. राखाडी ठिपके टॅक्साच्या विपुलतेमध्ये कोणताही लक्षणीय फरक नसल्याचे दर्शवतात. रंगीत ठिपके विपुलतेमधील लक्षणीय फरक (पी-व्हॅल्यू ≤ ०.०५) दर्शवतात. नमुन्यांच्या प्रकारांनुसार विपुलतेमध्ये सर्वात मोठा फरक असलेले शीर्ष २० टॅक्सा अनुक्रमे लाल आणि फिकट निळ्या रंगात (नियंत्रण आणि पीपीए नमुने) दर्शवले आहेत. पिवळे आणि जांभळे ठिपके नियंत्रण नमुन्यांपेक्षा नियंत्रण किंवा पीपीए नमुन्यांमध्ये किमान २.७ पट अधिक विपुल होते. काळे ठिपके लक्षणीयरीत्या भिन्न विपुलता असलेले टॅक्सा दर्शवतात, ज्यांच्या सरासरी सीएलआर फरकाचे प्रमाण -१ ते १ दरम्यान आहे. पी-व्हॅल्यू मॅन-व्हिटनी यू चाचणी वापरून मोजण्यात आल्या आणि बेंजामिनी-होचबर्ग प्रक्रियेचा वापर करून एकाधिक चाचणीसाठी दुरुस्त करण्यात आल्या. ठळक सरासरी सीएलआर फरक विपुलतेमधील लक्षणीय फरक दर्शवतात.
आतड्यातील सूक्ष्मजीवांच्या रचनेचे विश्लेषण केल्यानंतर, आम्ही मायक्रोबायोमचे कार्यात्मक विश्लेषण केले. कमी दर्जाचे जनुके वगळल्यानंतर, सर्व नमुन्यांमध्ये एकूण ३७८,३५५ अद्वितीय जनुके ओळखण्यात आली. या जनुकांच्या रूपांतरित विपुलतेचा वापर मुख्य घटक विश्लेषणासाठी (PCA) करण्यात आला आणि निकालांनी त्यांच्या कार्यात्मक प्रोफाइलच्या आधारावर नमुन्यांच्या प्रकारांचे उच्च प्रमाणात क्लस्टरिंग दर्शवले (आकृती ४).
आकृती ४. उंदराच्या आतड्यातील मायक्रोबायोमच्या कार्यात्मक प्रोफाइलचा वापर करून मिळालेले पीसीए (PCA) परिणाम. पीसीए प्लॉट नमुन्यांचे त्यांच्या पहिल्या दोन मुख्य घटकांमधील वितरण दर्शवतो. रंग नमुन्याचा प्रकार दर्शवतात: पीपीए-च्या संपर्कात आलेले उंदीर जांभळ्या रंगात आणि नियंत्रण गटातील उंदीर पिवळ्या रंगात दर्शवले आहेत. मुख्य घटक १ आणि २ अनुक्रमे एक्स-अक्ष आणि वाय-अक्षावर दर्शवले आहेत आणि ते त्यांच्या स्पष्ट केलेल्या प्रसरण गुणोत्तराच्या स्वरूपात व्यक्त केले आहेत.
पुढे आम्ही वेगवेगळ्या नमुना प्रकारांमध्ये KEGG नॉकआउट्सच्या विपुलतेचे परीक्षण केले. एकूण ३६४८ अद्वितीय नॉकआउट्स ओळखले गेले, त्यापैकी १९६ नियंत्रण नमुन्यांमध्ये आणि १०६ PPA नमुन्यांमध्ये लक्षणीयरीत्या अधिक प्रमाणात आढळले (आकृती ५). नियंत्रण नमुन्यांमध्ये एकूण १४५ जीन्स आणि PPA नमुन्यांमध्ये ६१ जीन्स आढळले, ज्यांच्या विपुलतेमध्ये लक्षणीय फरक होता. लिपिड आणि अमिनोशुगर चयापचयाशी संबंधित मार्ग PPA नमुन्यांमध्ये लक्षणीयरीत्या अधिक समृद्ध होते (पूरक सारणी ३). नायट्रोजन चयापचय आणि सल्फर रिले प्रणालींशी संबंधित मार्ग नियंत्रण नमुन्यांमध्ये लक्षणीयरीत्या अधिक समृद्ध होते (पूरक सारणी ३). अमिनोशुगर/न्यूक्लिओटाइड चयापचय (ko:K21279) आणि इनोसिटॉल फॉस्फेट चयापचय (ko:K07291) यांच्याशी संबंधित जीन्सची विपुलता PPA नमुन्यांमध्ये लक्षणीयरीत्या जास्त होती (आकृती ५). नियंत्रण नमुन्यांमध्ये बेंझोएट चयापचय (ko:K22270), नायट्रोजन चयापचय (ko:K00368) आणि ग्लायकोलिसिस/ग्लुकोनिओजेनेसिस (ko:K00131) शी संबंधित जनुके लक्षणीयरीत्या जास्त होती (आकृती 5).
आकृती ५. पीपीए आणि नियंत्रण उंदरांच्या आतड्यांतील मायक्रोबायोममधील केओंची भिन्न विपुलता. व्होल्कॅनो प्लॉट कार्यात्मक गटांच्या (केओंच्या) विपुलतेमधील फरक दर्शवतो. राखाडी ठिपके असे केओ दर्शवतात ज्यांची विपुलता नमुन्यांच्या प्रकारांमध्ये लक्षणीयरीत्या भिन्न नव्हती (पी-व्हॅल्यू > ०.०५). रंगीत ठिपके विपुलतेमधील लक्षणीय फरक दर्शवतात (पी-व्हॅल्यू ≤ ०.०५). नमुन्यांच्या प्रकारांमध्ये विपुलतेमध्ये सर्वात मोठा फरक असलेले २० केओ लाल आणि फिकट निळ्या रंगात दर्शवले आहेत, जे अनुक्रमे नियंत्रण आणि पीपीए नमुन्यांशी संबंधित आहेत. पिवळे आणि जांभळे ठिपके असे केओ दर्शवतात जे अनुक्रमे नियंत्रण आणि पीपीए नमुन्यांमध्ये किमान २.७ पट अधिक विपुल होते. काळे ठिपके लक्षणीयरीत्या भिन्न विपुलता असलेले केओ दर्शवतात, ज्यांच्या सरासरी सीएलआर फरकाचे प्रमाण -१ ते १ दरम्यान आहे. पी-व्हॅल्यू मॅन-व्हिटनी यू चाचणी वापरून मोजण्यात आल्या आणि बेंजामिनी-होचबर्ग प्रक्रियेचा वापर करून अनेक तुलनांसाठी समायोजित करण्यात आल्या. NaN हे दर्शवते की केओ KEGG मधील कोणत्याही पाथवेशी संबंधित नाही. ठळक सरासरी CLR फरक मूल्ये विपुलतेमधील लक्षणीय फरक दर्शवतात. सूचीबद्ध KOs ज्या मार्गांशी संबंधित आहेत त्याबद्दल तपशीलवार माहितीसाठी, परिशिष्ट सारणी ३ पहा.
नोंद केलेल्या जनुकांमधील, १६०१ जनुकांचे प्रमाण नमुन्यांच्या प्रकारांमध्ये लक्षणीयरीत्या भिन्न होते (p ≤ ०.०५), आणि प्रत्येक जनुक किमान २.७ पट अधिक प्रमाणात आढळले. या जनुकांपैकी, ४ जनुके नियंत्रण नमुन्यांमध्ये अधिक प्रमाणात होती आणि १५९७ जनुके पीपीए नमुन्यांमध्ये अधिक प्रमाणात होती. पीपीए मध्ये सूक्ष्मजीवविरोधी गुणधर्म असल्यामुळे, आम्ही नमुन्यांच्या प्रकारांनुसार पीपीए चयापचय आणि उत्पादन जनुकांच्या प्रमाणाची तपासणी केली. पीपीए चयापचयाशी संबंधित १३३२ जनुकांपैकी, २७ जनुके नियंत्रण नमुन्यांमध्ये लक्षणीयरीत्या अधिक प्रमाणात होती आणि १२ जनुके पीपीए नमुन्यांमध्ये अधिक प्रमाणात होती. पीपीए उत्पादनाशी संबंधित २२३ जनुकांपैकी, १ जनुक पीपीए नमुन्यांमध्ये लक्षणीयरीत्या अधिक प्रमाणात आढळले. आकृती ६अ पीपीए चयापचयामध्ये सामील असलेल्या जनुकांचे अधिक प्रमाण अधिक स्पष्टपणे दर्शवते, ज्यात नियंत्रण नमुन्यांमध्ये लक्षणीयरीत्या जास्त प्रमाण आणि मोठे परिणाम दिसून येतात, तर आकृती ६ब पीपीए नमुन्यांमध्ये आढळलेल्या लक्षणीयरीत्या जास्त प्रमाणातील वैयक्तिक जनुकांना अधोरेखित करते.
आकृती ६. उंदराच्या आतड्यातील मायक्रोबायोममधील पीपीए-संबंधित जनुकांची भिन्न विपुलता. व्होल्कॅनो प्लॉट पीपीए चयापचय (अ) आणि पीपीए उत्पादन (ब) यांच्याशी संबंधित जनुकांच्या विपुलतेमधील फरक दर्शवतात. राखाडी ठिपके अशी जनुके दर्शवतात ज्यांची विपुलता नमुन्यांच्या प्रकारांमध्ये लक्षणीयरीत्या भिन्न नव्हती (पी-व्हॅल्यू > ०.०५). रंगीत ठिपके विपुलतेमधील लक्षणीय फरक दर्शवतात (पी-व्हॅल्यू ≤ ०.०५). विपुलतेमध्ये सर्वात मोठा फरक असलेली २० जनुके अनुक्रमे लाल आणि फिकट निळ्या रंगात (नियंत्रित आणि पीपीए नमुने) दर्शविली आहेत. पिवळ्या आणि जांभळ्या ठिपक्यांची विपुलता नियंत्रित नमुन्यांपेक्षा नियंत्रित आणि पीपीए नमुन्यांमध्ये किमान २.७ पट जास्त होती. काळे ठिपके लक्षणीयरीत्या भिन्न विपुलता असलेली जनुके दर्शवतात, ज्यांच्या सरासरी सीएलआर फरकाचे प्रमाण -१ ते १ दरम्यान आहे. पी-व्हॅल्यू मॅन-व्हिटनी यू चाचणी वापरून मोजण्यात आल्या आणि बेंजामिनी-होचबर्ग प्रक्रियेचा वापर करून अनेक तुलनांसाठी दुरुस्त करण्यात आल्या. जनुके नॉन-रिडंडंट जीन कॅटलॉगमधील प्रातिनिधिक जनुकांशी संबंधित आहेत. जनुकांच्या नावांमध्ये KO जनुक दर्शवणारे KEGG चिन्ह असते. ठळक अक्षरांतील सरासरी CLR फरक लक्षणीय भिन्न विपुलता दर्शवतात. डॅश (-) हे चिन्ह दर्शवते की KEGG डेटाबेसमध्ये त्या जनुकासाठी कोणतेही चिन्ह नाही.
PPA चयापचय आणि/किंवा उत्पादनाशी संबंधित जनुके असलेले टॅक्सा, कॉन्टिग्सची टॅक्सोनॉमिक ओळख जनुकाच्या कॉन्टिग आयडीशी जुळवून ओळखले गेले. प्रजाती स्तरावर, १३० प्रजातींमध्ये PPA चयापचयाशी संबंधित जनुके आणि ६१ प्रजातींमध्ये PPA उत्पादनाशी संबंधित जनुके आढळली (पूरक सारणी ४). तथापि, कोणत्याही प्रजातीमध्ये विपुलतेमध्ये लक्षणीय फरक दिसून आला नाही (p > 0.05).
प्रजाती स्तरावर, १४४ जिवाणू प्रजातींमध्ये पीपीए चयापचयाशी संबंधित जनुके आणि ६८ जिवाणू प्रजातींमध्ये पीपीए उत्पादनाशी संबंधित जनुके आढळली (पूरक सारणी ५). पीपीए चयापचय करणाऱ्या जिवाणूंपैकी, आठ जिवाणूंनी नमुन्यांच्या प्रकारांमध्ये संख्येमध्ये लक्षणीय वाढ दर्शविली आणि सर्वांनी परिणामात लक्षणीय बदल दर्शविले (पूरक सारणी ६). संख्येमध्ये लक्षणीय फरक असलेले सर्व ओळखलेले पीपीए चयापचय करणारे जिवाणू पीपीए नमुन्यांमध्ये अधिक प्रमाणात आढळले. प्रजाती-स्तरीय वर्गीकरणातून अशा प्रजातींचे प्रतिनिधी समोर आले ज्यांच्या संख्येत नमुन्यांच्या प्रकारांमध्ये लक्षणीय फरक नव्हता, ज्यात अनेक बॅक्टेरॉइड्स आणि रुमिनोकोकस प्रजाती, तसेच डंकनिया डुबॉइस, मायक्सोबॅक्टेरियम एंटेरिका, मोनोकोकस पेक्टिनोलिटिकस आणि अल्कालिजेनेस पॉलिमोर्फा यांचा समावेश होता. पीपीए-उत्पादक जिवाणूंपैकी, चार जिवाणूंनी नमुन्यांच्या प्रकारांमध्ये संख्येमध्ये लक्षणीय फरक दर्शविला. संख्येमध्ये लक्षणीय फरक असलेल्या प्रजातींमध्ये बॅक्टेरॉइड्स नोवोरोसी, डंकनिया डुबॉइस, मायक्सोबॅक्टेरियम एंटेरिटिडिस आणि रुमिनोकोकस बोविस यांचा समावेश होता.
या अभ्यासात, आम्ही उंदरांच्या आतड्यांतील सूक्ष्मजीवांवर (gut microbiota) पीपीएच्या संपर्कामुळे होणाऱ्या परिणामांचे परीक्षण केले. पीपीए जीवाणूंमध्ये विविध प्रतिक्रिया निर्माण करू शकते, कारण ते काही प्रजातींद्वारे तयार केले जाते, इतर प्रजातींद्वारे अन्न स्रोत म्हणून वापरले जाते किंवा त्याचे प्रतिजैविक परिणाम असतात. त्यामुळे, आहारातील पूरकतेद्वारे आतड्यांच्या वातावरणात त्याचा समावेश केल्यास, सहनशीलता, संवेदनशीलता आणि पोषक स्त्रोत म्हणून त्याचा उपयोग करण्याच्या क्षमतेनुसार वेगवेगळे परिणाम होऊ शकतात. संवेदनशील जीवाणू प्रजाती नष्ट होऊ शकतात आणि त्यांच्या जागी पीपीएला अधिक प्रतिरोधक किंवा अन्न स्रोत म्हणून त्याचा उपयोग करण्यास सक्षम असलेल्या प्रजाती येऊ शकतात, ज्यामुळे आतड्यांतील सूक्ष्मजीवांच्या रचनेत बदल होतात. आमच्या निष्कर्षांनुसार सूक्ष्मजीवांच्या रचनेत लक्षणीय फरक दिसून आला, परंतु एकूण सूक्ष्मजैविक विविधतेवर कोणताही परिणाम झाला नाही. सर्वात मोठे परिणाम प्रजाती स्तरावर दिसून आले, ज्यात पीपीए आणि नियंत्रण नमुन्यांमध्ये ७० पेक्षा जास्त टॅक्सांच्या (taxa) संख्येत लक्षणीय फरक होता (पूरक सारणी २). पीपीएच्या संपर्कात आलेल्या नमुन्यांच्या रचनेच्या पुढील मूल्यांकनातून, संपर्कात न आलेल्या नमुन्यांच्या तुलनेत सूक्ष्मजैविक प्रजातींमध्ये अधिक विषमता दिसून आली, ज्यामुळे असे सूचित होते की पीपीए जीवाणूंच्या वाढीची वैशिष्ट्ये वाढवू शकते आणि पीपीए-समृद्ध वातावरणात टिकून राहू शकणाऱ्या जीवाणूंच्या संख्येला मर्यादित करू शकते. अशाप्रकारे, पीपीए आतड्यातील सूक्ष्मजीवांच्या विविधतेमध्ये व्यापक व्यत्यय आणण्याऐवजी निवडकपणे बदल घडवून आणू शकते.
पीपीए (PPA) सारखे अन्न संरक्षक आतड्यांतील सूक्ष्मजीवांच्या एकूण विविधतेवर परिणाम न करता त्यांच्या संख्येमध्ये बदल करतात, असे पूर्वी दाखवून दिले गेले आहे (नागपाल आणि इतर, २०२१). येथे, आम्ही बॅक्टेरॉइडेट्स (Bacteroidetes) संघातील (पूर्वी बॅक्टेरॉइडेट्स म्हणून ओळखले जाणारे) बॅक्टेरॉइडेट्स प्रजातींमध्ये सर्वात लक्षणीय फरक पाहिला, जे पीपीएच्या संपर्कात आलेल्या उंदरांमध्ये लक्षणीयरीत्या समृद्ध होते. बॅक्टेरॉइड्स प्रजातींची वाढलेली संख्या श्लेष्माच्या (mucus) विघटनात वाढीशी संबंधित आहे, ज्यामुळे संसर्गाचा धोका वाढू शकतो आणि दाह (inflammation) वाढू शकतो (कॉर्निक आणि इतर, २०१५; देसाई आणि इतर, २०१६; पेन्झोल आणि इतर, २०१९). एका अभ्यासात असे आढळले की बॅक्टेरॉइड्स फ्रॅजिलिस (Bacteroides fragilis) दिलेल्या नवजात नर उंदरांनी ऑटिझम स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर (ASD) सारखे सामाजिक वर्तन दर्शविले (कार्मेल आणि इतर, २०२३), आणि इतर अभ्यासांनी दाखवले आहे की बॅक्टेरॉइड्स प्रजाती रोगप्रतिकारक शक्तीमध्ये बदल करू शकतात आणि ऑटोइम्यून इन्फ्लेमेटरी कार्डिओमायोपॅथीला कारणीभूत ठरू शकतात (गिल-क्रूझ आणि इतर, २०१९). PPA च्या संपर्कात आलेल्या उंदरांमध्ये रुमिनोकोकस, प्रिव्होटेला आणि पॅराबॅक्टेरॉइड्स या प्रजातींची संख्या देखील लक्षणीयरीत्या वाढली होती (कोरेटी एट अल., २०१८). काही रुमिनोकोकस प्रजाती प्रो-इन्फ्लेमेटरी सायटोकाइन्सच्या निर्मितीद्वारे क्रोहन रोगासारख्या आजारांशी संबंधित आहेत (हेन्के एट अल., २०१९), तर प्रिव्होटेला ह्युमानीसारख्या प्रिव्होटेला प्रजाती उच्च रक्तदाब आणि इन्सुलिन संवेदनशीलता यांसारख्या चयापचय रोगांशी संबंधित आहेत (पेडरसन एट अल., २०१६; ली एट अल., २०१७). शेवटी, आम्हाला असे आढळले की बॅक्टेरॉइडेट्स प्रजातींची एकूण संख्या जास्त असल्यामुळे, PPA च्या संपर्कात आलेल्या उंदरांमध्ये बॅक्टेरॉइडेट्स (पूर्वी फर्मिक्युट्स म्हणून ओळखले जाणारे) आणि पॅराबॅक्टेरॉइड्स यांचे गुणोत्तर नियंत्रण गटातील उंदरांपेक्षा लक्षणीयरीत्या कमी होते. हे गुणोत्तर आतड्यांच्या होमियोस्टॅसिसचे (संतुलनाचे) एक महत्त्वाचे सूचक असल्याचे पूर्वी सिद्ध झाले आहे, आणि या गुणोत्तरातील बिघाड विविध आजारांशी संबंधित असल्याचे आढळले आहे (टर्पिन इत्यादी, २०१६; ताकेझावा इत्यादी, २०२१; ॲन इत्यादी, २०२३), ज्यामध्ये इन्फ्लेमेटरी बाऊल डिसीजेसचा (आतड्यांच्या दाहक रोगांचा) समावेश आहे (स्टोजानोव्ह इत्यादी, २०२०). एकत्रितपणे, बॅक्टेरॉइडेट्स फायलमच्या प्रजातींवर आहारातील वाढलेल्या पीपीएचा सर्वात तीव्र परिणाम होतो असे दिसते. हे पीपीए सहन करण्याच्या उच्च क्षमतेमुळे किंवा पीपीएचा ऊर्जेचा स्रोत म्हणून वापर करण्याच्या क्षमतेमुळे असू शकते, जे कमीतकमी एका प्रजातीसाठी, होयलेसेला एनोसियासाठी, खरे असल्याचे सिद्ध झाले आहे (हिच इत्यादी, २०२२). दुसरा पर्याय म्हणून, मातेच्या पीपीए संपर्कामुळे उंदरांच्या पिलांची आतडी बॅक्टेरॉइडेट्सच्या वसाहतीसाठी अधिक संवेदनशील बनून गर्भाचा विकास वाढू शकतो; तथापि, आमच्या अभ्यासाच्या रचनेमुळे असे मूल्यांकन करणे शक्य झाले नाही.
मेटाजेनोमिक सामग्रीच्या मूल्यांकनातून पीपीए चयापचय आणि उत्पादनाशी संबंधित जनुकांच्या विपुलतेमध्ये लक्षणीय फरक दिसून आले. पीपीएच्या संपर्कात आलेल्या उंदरांमध्ये पीपीए उत्पादनासाठी जबाबदार असलेल्या जनुकांची विपुलता जास्त होती, तर पीपीएच्या संपर्कात न आलेल्या उंदरांमध्ये पीएए चयापचयासाठी जबाबदार असलेल्या जनुकांची विपुलता जास्त होती (आकृती ६). या परिणामांवरून असे सूचित होते की सूक्ष्मजीवांच्या रचनेवर पीपीएचा होणारा परिणाम केवळ त्याच्या वापरामुळे नसावा, अन्यथा पीपीएच्या संपर्कात आलेल्या उंदरांच्या आतड्यांतील मायक्रोबायोममध्ये पीपीए चयापचयाशी संबंधित जनुकांची विपुलता अधिक दिसली असती. याचे एक स्पष्टीकरण असे आहे की, पीपीए जीवाणूंद्वारे पोषक तत्व म्हणून वापरला जाण्याऐवजी, प्रामुख्याने त्याच्या सूक्ष्मजीवविरोधी प्रभावांद्वारे जीवाणूंची विपुलता नियंत्रित करतो. पूर्वीच्या अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की पीपीए डोस-आधारित पद्धतीने साल्मोनेला टायफिम्युरियमच्या वाढीस प्रतिबंध करतो (जेकबसन इत्यादी, २०१८). पीपीएच्या उच्च सांद्रतेच्या संपर्कामुळे असे जीवाणू निवडले जाऊ शकतात जे त्याच्या सूक्ष्मजीवविरोधी गुणधर्मांना प्रतिरोधक आहेत आणि कदाचित त्याचे चयापचय किंवा उत्पादन करण्यास सक्षम नसतील. उदाहरणार्थ, पॅराबॅक्टेरॉइड्सच्या अनेक प्रजाती पीपीए नमुन्यांमध्ये लक्षणीयरीत्या जास्त प्रमाणात आढळल्या, परंतु पीपीए चयापचय किंवा उत्पादनाशी संबंधित कोणतेही जनुके आढळले नाहीत (पूरक सारण्या २, ४ आणि ५). शिवाय, किण्वन उप-उत्पादन म्हणून पीपीएचे उत्पादन विविध जीवाणूंमध्ये मोठ्या प्रमाणावर आढळते (गोंझालेझ-गार्सिया इत्यादी, २०१७). नियंत्रण नमुन्यांमध्ये पीपीए चयापचयाशी संबंधित जनुकांच्या जास्त प्रमाणामागे उच्च जीवाणू विविधता हे कारण असू शकते (अवेरिना इत्यादी, २०२०). शिवाय, १३३२ जनुकांपैकी केवळ २७ (२.१४%) जनुके केवळ पीपीए चयापचयाशी संबंधित असल्याचे भाकीत केले गेले होते. पीपीए चयापचयाशी संबंधित अनेक जनुके इतर चयापचय मार्गांमध्ये देखील सामील असतात. यावरून हे अधिक स्पष्ट होते की नियंत्रण नमुन्यांमध्ये पीपीए चयापचयात सामील असलेल्या जनुकांचे प्रमाण जास्त होते; ही जनुके अशा मार्गांमध्ये कार्य करू शकतात ज्यामुळे उप-उत्पादन म्हणून पीपीएचा वापर किंवा निर्मिती होत नाही. या प्रकरणात, पीपीए निर्मितीशी संबंधित केवळ एका जनुकाने नमुन्यांच्या प्रकारांमध्ये प्रमाणात लक्षणीय फरक दर्शविला. PPA चयापचयाशी संबंधित जनुकांच्या विपरीत, PPA उत्पादनासाठी मार्कर जनुके निवडण्यात आली, कारण ती PPA उत्पादनाच्या जिवाणू मार्गात थेट सहभागी असतात. PPA च्या संपर्कात आलेल्या उंदरांमध्ये, सर्व प्रजातींची विपुलता आणि PPA तयार करण्याची क्षमता लक्षणीयरीत्या वाढलेली आढळली. हे या अंदाजाला पुष्टी देते की PPA हे PPA उत्पादकांना निवडतील आणि त्यामुळे PPA उत्पादन क्षमता वाढेल. तथापि, जनुकांची विपुलता आणि त्यांची अभिव्यक्ती यांच्यात सहसंबंध असेलच असे नाही; त्यामुळे, जरी नियंत्रण नमुन्यांमध्ये PPA चयापचयाशी संबंधित जनुकांची विपुलता जास्त असली तरी, अभिव्यक्तीचा दर वेगळा असू शकतो (शी इत्यादी, २०१४). PPA-उत्पादक जनुकांच्या प्राबल्य आणि PPA उत्पादन यांच्यातील संबंधाची पुष्टी करण्यासाठी, PPA उत्पादनात सहभागी असलेल्या जनुकांच्या अभिव्यक्तीचा अभ्यास करणे आवश्यक आहे.
पीपीए आणि कंट्रोल मेटाजिनोम्सच्या कार्यात्मक एनोटेशनमधून काही फरक दिसून आले. जीन सामग्रीच्या पीसीए विश्लेषणातून पीपीए आणि कंट्रोल नमुन्यांमध्ये स्वतंत्र क्लस्टर्स दिसून आले (आकृती ५). नमुन्यांतर्गत क्लस्टरिंगमधून असे दिसून आले की कंट्रोल जीन सामग्री अधिक वैविध्यपूर्ण होती, तर पीपीए नमुने एकत्र क्लस्टर झाले होते. जीन सामग्रीनुसार केलेले क्लस्टरिंग प्रजातींच्या रचनेनुसार केलेल्या क्लस्टरिंगशी तुलनात्मक होते. अशाप्रकारे, पाथवेच्या विपुलतेमधील फरक हे त्यांमधील विशिष्ट प्रजाती आणि स्ट्रेन्सच्या विपुलतेमधील बदलांशी सुसंगत आहेत. पीपीए नमुन्यांमध्ये, लक्षणीयरीत्या जास्त विपुलता असलेले दोन पाथवे अमिनोशुगर/न्यूक्लिओटाइड शुगर चयापचय (ko:K21279) आणि अनेक लिपिड चयापचय पाथवे (ko:K00647, ko:K03801; पूरक सारणी ३) यांच्याशी संबंधित होते. ko:K21279 शी संबंधित जीन्स बॅक्टेरॉइड्स प्रजातीशी संबंधित असल्याचे ज्ञात आहे, जी पीपीए नमुन्यांमध्ये लक्षणीयरीत्या जास्त प्रजाती संख्या असलेल्या प्रजातींपैकी एक आहे. हे एन्झाइम कॅप्सुलर पॉलिसॅकराइड्स व्यक्त करून रोगप्रतिकारक शक्तीला चकमा देऊ शकते (Wang et al., 2008). यामुळे पीपीएच्या संपर्कात आलेल्या उंदरांमध्ये आढळलेल्या बॅक्टेरॉइडेट्सच्या वाढीचे स्पष्टीकरण मिळू शकते. हे पीपीए मायक्रोबायोममध्ये आढळलेल्या वाढीव फॅटी ॲसिड संश्लेषणाला पूरक आहे. बॅक्टेरिया फॅटी ॲसिड तयार करण्यासाठी FASIIko:K00647 (fabB) मार्गाचा वापर करतात, जे यजमानाच्या चयापचय मार्गांवर प्रभाव टाकू शकतात (याओ आणि रॉक, २०१५; जॉन्सन इत्यादी, २०२०), आणि लिपिड चयापचयातील बदल मज्जासंस्थेच्या विकासात भूमिका बजावू शकतात (यू इत्यादी, २०२०). पीपीए नमुन्यांमध्ये वाढीव प्रमाणात आढळणारा दुसरा मार्ग म्हणजे स्टेरॉइड हार्मोन जैवसंश्लेषण (ko:K12343). असे वाढते पुरावे आहेत की आतड्यातील मायक्रोबायोटाची हार्मोनच्या पातळीवर प्रभाव टाकण्याची आणि हार्मोनद्वारे प्रभावित होण्याची क्षमता यांच्यात व्यस्त संबंध आहे, ज्यामुळे वाढलेल्या स्टेरॉइडच्या पातळीचे आरोग्यावर दूरगामी परिणाम होऊ शकतात (टेटेल इत्यादी, २०१८).
हा अभ्यास मर्यादा आणि विचार करण्याजोग्या बाबींपासून मुक्त नाही. एक महत्त्वाचा फरक हा आहे की आम्ही प्राण्यांचे शारीरिक मूल्यांकन केले नाही. त्यामुळे, मायक्रोबायोममधील बदल कोणत्याही रोगाशी संबंधित आहेत की नाही, याबद्दल थेट निष्कर्ष काढणे शक्य नाही. आणखी एक विचार करण्याजोगा मुद्दा हा आहे की या अभ्यासातील उंदरांना त्यांच्या आईप्रमाणेच आहार दिला गेला होता. पीपीए-समृद्ध आहारावरून पीपीए-मुक्त आहाराकडे वळल्याने मायक्रोबायोमवरील त्याचे परिणाम सुधारतात की नाही, हे भविष्यातील अभ्यास ठरवू शकतील. आमच्या अभ्यासाची एक मर्यादा, इतर अनेक अभ्यासांप्रमाणेच, मर्यादित नमुना आकार आहे. जरी योग्य निष्कर्ष काढता येत असले तरी, परिणामांचे विश्लेषण करताना मोठा नमुना आकार अधिक सांख्यिकीय शक्ती प्रदान करेल. आम्ही आतड्यांतील मायक्रोबायोममधील बदल आणि कोणताही रोग यांच्यातील संबंधाबद्दल निष्कर्ष काढण्याबाबतही सावध आहोत (Yap et al., 2021). वय, लिंग आणि आहार यांसारखे गोंधळात टाकणारे घटक सूक्ष्मजीवांच्या रचनेवर लक्षणीय परिणाम करू शकतात. हे घटक आतड्यांतील मायक्रोबायोम आणि गुंतागुंतीचे रोग यांच्यातील संबंधाबद्दल साहित्यात आढळलेल्या विसंगतींचे स्पष्टीकरण देऊ शकतात (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). उदाहरणार्थ, ASD असलेल्या प्राणी आणि मानवांमध्ये बॅक्टेरॉइडेट्स (Bacteroidetes) प्रजातीच्या सदस्यांची संख्या वाढलेली किंवा कमी झालेली दिसून आली आहे (अँजेलिस एट अल., २०१३; कुशक एट अल., २०१७). त्याचप्रमाणे, इन्फ्लेमेटरी बाऊल डिसीजेस असलेल्या रुग्णांमधील आतड्यांच्या रचनेच्या अभ्यासात त्याच टॅक्सामध्ये वाढ आणि घट दोन्ही आढळल्या आहेत (वॉल्टर्स एट अल., २०१४; फोर्ब्स एट अल., २०१८; उपाध्याय एट अल., २०२३). लिंगभेदाचा प्रभाव मर्यादित करण्यासाठी, आम्ही दोन्ही लिंगांचे समान प्रतिनिधित्व सुनिश्चित करण्याचा प्रयत्न केला, जेणेकरून हे फरक बहुधा आहारामुळेच असावेत. कार्यात्मक एनोटेशनमधील एक आव्हान म्हणजे अनावश्यक जनुकीय क्रम काढून टाकणे. आमच्या जनुकीय क्लस्टरिंग पद्धतीला चुकीचे क्लस्टरिंग टाळण्यासाठी ९५% सिक्वेन्स आयडेंटिटी आणि ८५% लेंथ सिमिलॅरिटी, तसेच ९०% अलाइनमेंट कव्हरेजची आवश्यकता असते. तथापि, काही प्रकरणांमध्ये, आम्हाला समान एनोटेशन्स असलेले COGs (उदा., MUT) आढळले (आकृती ६). हे ऑर्थोलॉग्स भिन्न आहेत का, विशिष्ट प्रजातींशी संबंधित आहेत का, किंवा ही जीन क्लस्टरिंग पद्धतीची मर्यादा आहे का, हे निश्चित करण्यासाठी पुढील अभ्यासाची आवश्यकता आहे. कार्यात्मक एनोटेशनची दुसरी मर्यादा म्हणजे संभाव्य चुकीचे वर्गीकरण; बॅक्टेरियातील mmdA जीन हे प्रोपिओनेट संश्लेषणात सामील असलेले एक ज्ञात एन्झाइम आहे, परंतु KEGG त्याला प्रोपिओनेट चयापचय मार्गाशी जोडत नाही. याउलट, scpB आणि mmcD ऑर्थोलॉग्स संबंधित आहेत. नॉकआउट्स नसलेल्या मोठ्या संख्येने असलेल्या जीन्समुळे, जीनच्या विपुलतेचे मूल्यांकन करताना PPA-संबंधित जीन्स ओळखण्यात असमर्थता येऊ शकते. भविष्यातील अभ्यासांना मेटाट्रान्सक्रिप्टोम विश्लेषणाचा फायदा होईल, जे आतड्यांतील मायक्रोबायोटाच्या कार्यात्मक वैशिष्ट्यांची सखोल माहिती देऊ शकते आणि जीन अभिव्यक्तीला संभाव्य परिणामांशी जोडू शकते. विशिष्ट न्यूरोडेव्हलपमेंटल डिसऑर्डर्स किंवा इन्फ्लेमेटरी बाऊल डिसीजेसशी संबंधित अभ्यासांसाठी, मायक्रोबायोम रचनेतील बदलांना या विकारांशी जोडण्यासाठी प्राण्यांचे शारीरिक आणि वर्तणुकीशी संबंधित मूल्यांकन आवश्यक आहे. मायक्रोबायोम हा रोगाचा चालक आहे की त्याचे वैशिष्ट्य आहे, हे निश्चित करण्यासाठी जंतू-मुक्त उंदरांमध्ये आतड्यांतील मायक्रोबायोमचे प्रत्यारोपण करणारे अतिरिक्त अभ्यास देखील उपयुक्त ठरतील.
थोडक्यात, आम्ही हे दाखवून दिले आहे की आहारातील पीपीए (PPA) आतड्यातील सूक्ष्मजीवांच्या रचनेत बदल घडवून आणणारा एक घटक म्हणून कार्य करतो. पीपीए हे एफडीए-मान्यताप्राप्त संरक्षक आहे, जे विविध खाद्यपदार्थांमध्ये मोठ्या प्रमाणावर आढळते आणि दीर्घकाळ संपर्कात राहिल्यास आतड्यातील सामान्य जीवाणूंच्या संतुलनात बिघाड होऊ शकतो. आम्हाला अनेक जीवाणूंच्या संख्येत बदल आढळले, जे सूचित करते की पीपीए आतड्यातील सूक्ष्मजीवांच्या रचनेवर प्रभाव टाकू शकतो. सूक्ष्मजीवांमधील बदलांमुळे विशिष्ट चयापचय मार्गांच्या पातळीत बदल होऊ शकतात, ज्यामुळे यजमानाच्या आरोग्यासाठी महत्त्वाचे असलेले शारीरिक बदल घडून येऊ शकतात. आहारातील पीपीएच्या सूक्ष्मजीवांच्या रचनेवरील परिणामांमुळे डायस्बायोसिस किंवा इतर आजार होऊ शकतात का, हे निश्चित करण्यासाठी पुढील अभ्यासाची आवश्यकता आहे. हा अभ्यास, पीपीएचे आतड्यातील रचनेवरील परिणाम मानवी आरोग्यावर कसा परिणाम करू शकतात, यावरील भविष्यातील अभ्यासासाठी पाया घालतो.
या अभ्यासात सादर केलेले डेटासेट ऑनलाइन रिपॉझिटरीजमध्ये उपलब्ध आहेत. रिपॉझिटरीचे नाव आणि अॅक्सेशन क्रमांक पुढीलप्रमाणे आहेत: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
या प्राणी अभ्यासाला युनिव्हर्सिटी ऑफ सेंट्रल फ्लोरिडा इन्स्टिट्यूशनल ॲनिमल केअर अँड यूज कमिटी (UCF-IACUC) ने मान्यता दिली होती (प्राणी वापर परवाना क्रमांक: PROTO202000002). हा अभ्यास स्थानिक कायदे, नियम आणि संस्थात्मक आवश्यकतांचे पालन करतो.
एनजी: संकल्पना, डेटा संकलन, औपचारिक विश्लेषण, तपास, कार्यपद्धती, सॉफ्टवेअर, व्हिज्युअलायझेशन, लेखन (मूळ मसुदा), लेखन (पुनरावलोकन आणि संपादन). एलए: संकल्पना, डेटा संकलन, कार्यपद्धती, संसाधने, लेखन (पुनरावलोकन आणि संपादन). एसएच: औपचारिक विश्लेषण, सॉफ्टवेअर, लेखन (पुनरावलोकन आणि संपादन). एसए: तपास, लेखन (पुनरावलोकन आणि संपादन). मुख्य न्यायाधीश: तपास, लेखन (पुनरावलोकन आणि संपादन). एसएन: संकल्पना, प्रकल्प प्रशासन, संसाधने, पर्यवेक्षण, लेखन (पुनरावलोकन आणि संपादन). टीए: संकल्पना, प्रकल्प प्रशासन, पर्यवेक्षण, लेखन (पुनरावलोकन आणि संपादन).
लेखकांनी जाहीर केले आहे की, या लेखाच्या संशोधन, लेखन आणि/किंवा प्रकाशनासाठी त्यांना कोणताही आर्थिक पाठिंबा मिळाला नाही.
संभाव्य हितसंबंधांचा संघर्ष म्हणून मानल्या जाऊ शकणाऱ्या कोणत्याही व्यावसायिक किंवा आर्थिक संबंधांशिवाय हे संशोधन करण्यात आले, असे लेखक जाहीर करतात. लागू नाही.
या लेखात व्यक्त केलेली सर्व मते केवळ लेखकांची आहेत आणि ती त्यांच्या संस्था, प्रकाशक, संपादक किंवा समीक्षकांच्या मतांचे प्रतिनिधित्व करतातच असे नाही. या लेखात मूल्यमापन केलेल्या कोणत्याही उत्पादनांची किंवा त्यांच्या उत्पादकांनी केलेल्या कोणत्याही दाव्यांची प्रकाशकाकडून हमी दिली जात नाही किंवा त्यांना मान्यता दिली जात नाही.
या लेखासाठी पूरक साहित्य ऑनलाइन येथे उपलब्ध आहे: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
अब्देली एलएस, समसम ए, नासेर एसए (२०१९). प्रोपिओनिक अॅसिड ऑटिझम स्पेक्ट्रम डिसऑर्डरमध्ये PTEN/AKT मार्गाचे नियमन करून ग्लायोसिस आणि न्यूरोइन्फ्लेमेशन प्रेरित करते. सायंटिफिक रिपोर्ट्स ९, ८८२४–८८२४. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
एचिन्सन, जे. (१९८२). रचनात्मक माहितीचे सांख्यिकीय विश्लेषण. जेआर स्टॅट सॉक सेर बी मेथडॉल. ४४, १३९–१६०. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
आन जे, क्वॉन एच, किम वायजे (२०२३). स्तन कर्करोगासाठी एक जोखीम घटक म्हणून फर्मिक्युट्स/बॅक्टेरॉइडेट्स गुणोत्तर. जर्नल ऑफ क्लिनिकल मेडिसिन, १२, २२१६. doi: १०.३३९०/jcm१२०६२२१६
अँडर्स एस., ह्युबर डब्ल्यू. (२०१०). अनुक्रम गणना डेटाचे विभेदक अभिव्यक्ती विश्लेषण. नॅट प्रीव्ह. १–१, १–१०. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
अँजेलिस, एमडी, पिकोलो, एम., वॅनिनी, एल., सिरागुसा, एस., जियाकोमो, एडी, सेराझानेटी, डीआय, आणि इतर. (२०१३). ऑटिझम आणि इतर कोणत्याही प्रकारे निर्दिष्ट नसलेल्या सर्वव्यापी विकासात्मक विकाराने ग्रस्त मुलांमधील विष्ठेतील सूक्ष्मजीव आणि चयापचय. प्लोस वन ८, ई७६९९३. doi: १०.१३७१/जर्नल.पोन.००७६९९३
अवेरिना ओव्ही, कोवतुन एएस, पोल्याकोवा एसआय, सॅव्हिलोवा एएम, रेब्रिकोव्ह डीव्ही, डॅनिलेंको व्हीएन (२०२०). ऑटिझम स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर असलेल्या लहान मुलांमधील आतड्यांतील सूक्ष्मजीवांची जिवाणूजन्य न्यूरोमेटाबोलिक वैशिष्ट्ये. जर्नल ऑफ मेडिकल मायक्रोबायोलॉजी ६९, ५५८–५७१. doi: 10.1099/jmm.0.001178
बाकेरो एफ., नोम्बेला के. (२०१२). मानवी अवयव म्हणून मायक्रोबायोम. क्लिनिकल मायक्रोबायोलॉजी अँड इन्फेक्शन १८, २–४. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
बौर टी., ड्यूरे पी. (२०२३). प्रोपिओनिक आम्ल-उत्पादक जीवाणूंच्या शरीरक्रियाविज्ञानाविषयी नवीन अंतर्दृष्टी: ॲनेरोटिग्नम प्रोपिओनिकम आणि ॲनेरोटिग्नम निओप्रोपिओनिकम (पूर्वीचे क्लोस्ट्रिडियम प्रोपिओनिकम आणि क्लोस्ट्रिडियम निओप्रोपिओनिकम). मायक्रोऑर्गॅनिझम्स ११, ६८५. doi: १०.३३९०/मायक्रोऑर्गॅनिझम्स११०३०६८५
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). माता पोषण आणि गर्भाचा विकास. जे न्यूटर. १३४, २१६९–२१७२. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
बेंजामिनी, वाय., आणि होचबर्ग, जे. (१९९५). खोट्या-सकारात्मक दरावर नियंत्रण: एकाधिक चाचणीसाठी एक व्यावहारिक आणि कार्यक्षम दृष्टिकोन. जेआर स्टॅट सॉक सेर बी मेथडॉल. ५७, २८९–३००. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x