इम्युनोमॉड्युलेटरी मेटाबोलाइट्स हे ट्यूमर मायक्रोएन्व्हायर्नमेंटचे (TME) एक प्रमुख वैशिष्ट्य आहे, परंतु काही अपवाद वगळता, त्यांची ओळख मोठ्या प्रमाणावर अज्ञात आहे. येथे, आम्ही हाय-ग्रेड सेरस कार्सिनोमा (HGSC) असलेल्या रुग्णांच्या ट्यूमर आणि अॅसाइटिसमधील ट्यूमर आणि टी पेशींचे विश्लेषण केले, जेणेकरून या वेगवेगळ्या TME विभागांमधील मेटाबोलॉम उघड करता येईल. अॅसाइटिस आणि ट्यूमर पेशींमध्ये मेटाबोलाइट्समध्ये मोठे फरक आढळतात. अॅसाइटिसच्या तुलनेत, ट्यूमरमध्ये घुसलेल्या टी पेशींमध्ये १-मिथाइलनिकोटिनामाइड (MNA) चे प्रमाण लक्षणीयरीत्या जास्त असते. जरी टी पेशींमध्ये MNA ची पातळी वाढलेली असली तरी, निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रान्सफरेज (एस-अ‍ॅडेनोसिलमेथिओनिनमधून निकोटिनामाइडमध्ये मिथाइल गटांचे हस्तांतरण उत्प्रेरित करणारे एन्झाइम) ची अभिव्यक्ती केवळ फायब्रोब्लास्ट्स आणि ट्यूमर पेशींपुरती मर्यादित असते. कार्यात्मकदृष्ट्या, MNA टी पेशींना ट्यूमर नेक्रोसिस फॅक्टर अल्फा नावाचे ट्यूमरला प्रोत्साहन देणारे सायटोकाइन स्रवण्यासाठी प्रवृत्त करते. म्हणून, TME-व्युत्पन्न MNA टी पेशींच्या रोगप्रतिकारक नियमनात योगदान देते आणि मानवी कर्करोगाच्या उपचारांसाठी एक संभाव्य इम्युनोथेरपी लक्ष्य दर्शवते.
ट्यूमरमधून मिळणारे मेटाबोलाइट्स ट्यूमर-विरोधी प्रतिकारशक्तीवर तीव्र प्रतिबंधात्मक परिणाम करू शकतात, आणि अधिकाधिक पुरावे दर्शवतात की ते रोगाच्या प्रगतीसाठी एक प्रमुख प्रेरक शक्ती म्हणून देखील काम करू शकतात (1). वॉरबर्ग परिणामाव्यतिरिक्त, अलीकडील संशोधनात ट्यूमर पेशींच्या चयापचय स्थितीचे आणि ट्यूमर मायक्रोएन्व्हायर्नमेंटच्या (TME) रोगप्रतिकारक स्थितीशी असलेल्या तिच्या संबंधाचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यास सुरुवात झाली आहे. उंदरांच्या मॉडेल्स आणि मानवी टी पेशींवरील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की ग्लुटामाइन चयापचय (2), ऑक्सिडेटिव्ह चयापचय (3) आणि ग्लुकोज चयापचय (4) विविध रोगप्रतिकारक पेशी उपसमूहांवर स्वतंत्रपणे कार्य करू शकतात. या मार्गांमधील अनेक मेटाबोलाइट्स टी पेशींच्या ट्यूमर-विरोधी कार्याला प्रतिबंधित करतात. हे सिद्ध झाले आहे की कोएन्झाइम टेट्राहायड्रोबायोप्टेरिन (BH4) ला अवरोधित केल्याने टी पेशींच्या प्रसाराला हानी पोहोचू शकते, आणि शरीरातील BH4 ची वाढ CD4 आणि CD8 द्वारे मध्यस्थी केलेल्या ट्यूमर-विरोधी रोगप्रतिकारक प्रतिसादाला वाढवू शकते. याव्यतिरिक्त, किन्युरेनाइनचा रोगप्रतिकारक शक्ती कमी करणारा परिणाम BH4 च्या प्रशासनाद्वारे पूर्ववत केला जाऊ शकतो (5). आयसोसिट्रेट डिहायड्रोजनेज (IDH) म्युटंट ग्लिओब्लास्टोमामध्ये, एनॅन्टीओमेटाबोलिक (R)-2-हायड्रॉक्सिग्लुटारेट (R-2-HG) चा स्राव टी-सेल सक्रियकरण, प्रसार आणि सायटोलिसिस क्रियाकलाप प्रतिबंधित करतो (6). अलीकडेच, असे दिसून आले आहे की मिथाइलग्लायऑक्सल, ग्लायकोलिसिसचा एक उप-उत्पादन, मायलॉइड मूळच्या सप्रेसर पेशींद्वारे तयार होतो आणि मिथाइलग्लायऑक्सलचे टी-सेल हस्तांतरण इफेक्टर टी-सेल कार्याला प्रतिबंधित करू शकते. उपचारांमध्ये, मिथाइलग्लायऑक्सलचे निष्प्रभीकरण मायलॉइड-व्युत्पन्न सप्रेसर पेशींच्या (MDSC) क्रियाकलापांवर मात करू शकते आणि माऊस मॉडेल्समध्ये चेकपॉइंट ब्लॉकेड थेरपीला सहक्रियात्मकरित्या वाढवू शकते (7). हे अभ्यास एकत्रितपणे टी-सेल कार्य आणि क्रियाकलाप नियंत्रित करण्यात TME-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्सच्या मुख्य भूमिकेवर जोर देतात.
अंडाशयाच्या कर्करोगात टी-सेल डिसफंक्शन मोठ्या प्रमाणावर नोंदवले गेले आहे (8). हे अंशतः हायपोक्सिया आणि असामान्य ट्यूमर व्हॅस्क्युलेचरमध्ये अंतर्निहित असलेल्या चयापचय वैशिष्ट्यांमुळे आहे (9), ज्यामुळे ग्लुकोज आणि ट्रिप्टोफॅनचे रूपांतर लॅक्टिक ऍसिड आणि किन्युरेनाइन सारख्या उप-उत्पादनांमध्ये होते. अतिरिक्त एक्स्ट्रासेल्युलर लॅक्टेट इंटरफेरॉन-γ (IFN-γ) चे उत्पादन कमी करते आणि मायलोसप्रेसिव्ह उपसमूहांच्या विभेदनाला चालना देते (10, 11). ट्रिप्टोफॅनचा वापर थेट टी-सेल प्रोलिफरेशनला प्रतिबंधित करतो आणि टी-सेल रिसेप्टर सिग्नलिंगला प्रतिबंधित करतो (12-14). या निरीक्षणांनंतरही, रोगप्रतिकारक चयापचयाशी संबंधित बरेच काम ऑप्टिमाइझ्ड मीडिया वापरून इन विट्रो टी-सेल कल्चरमध्ये केले गेले, किंवा इन विवोमध्ये समरूप माऊस मॉडेल्सपुरते मर्यादित होते, यापैकी कोणतेही मानवी कर्करोगांची भिन्नता आणि शारीरिक स्थूल आणि सूक्ष्म पर्यावरणाचे पूर्णपणे प्रतिबिंब दर्शवत नाही.
अंडाशयाच्या कर्करोगाचे एक सामान्य वैशिष्ट्य म्हणजे पेरिटोनियल प्रसार आणि जलोदराचा (ascites) उदय. जलोदरात पेशी द्रवाचा संचय हा प्रगत रोग आणि खराब रोगनिदानाशी संबंधित आहे (15). अहवालानुसार, हा विशिष्ट भाग हायपॉक्सिक (hypoxic) असतो, त्यात व्हॅस्क्युलर एंडोथेलियल ग्रोथ फॅक्टर (VEGF) आणि इंडोलॅमिन 2,3-डायऑक्सिजेनेज (IDO) चे प्रमाण जास्त असते, आणि त्यात टी रेग्युलेटरी पेशी व मायलॉइड इनहिबिटरी पेशींचा शिरकाव झालेला असतो (15-18). जलोदराचे चयापचय वातावरण हे ट्यूमरच्या स्वतःच्या वातावरणापेक्षा वेगळे असू शकते, त्यामुळे पेरिटोनियल जागेतील टी पेशींचे रिप्रोग्रामिंग अस्पष्ट आहे. याव्यतिरिक्त, जलोदर आणि ट्यूमरच्या वातावरणात असलेल्या मेटाबोलाइट्समधील मुख्य फरक आणि भिन्नता रोगप्रतिकारक पेशींच्या शिरकावात आणि ट्यूमरवरील त्यांच्या कार्यात अडथळा आणू शकतात, आणि यासाठी पुढील संशोधनाची आवश्यकता आहे.
या समस्या सोडवण्यासाठी, आम्ही विविध प्रकारच्या पेशींचा (CD4+ आणि CD8+ टी पेशींसह) तसेच ट्यूमरच्या आत आणि दरम्यानच्या चयापचय घटकांचा अभ्यास करण्यासाठी एक संवेदनशील पेशी विलगीकरण आणि लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी टँडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS/MS) पद्धत तयार केली. हे घटक रुग्णाच्या त्याच जलोदर आणि ट्यूमर परिसरातील पेशींमध्ये आढळतात. या प्रमुख पेशी समूहांच्या चयापचय स्थितीचे अत्यंत सुस्पष्ट चित्र मिळवण्यासाठी आम्ही ही पद्धत उच्च-मितीय फ्लो सायटोमेट्री आणि सिंगल-सेल आरएनए सिक्वेन्सिंग (scRNA-seq) सोबत वापरतो. या पद्धतीमुळे ट्यूमर टी पेशींमध्ये १-मिथाइलनिकोटिनमाइड (MNA) च्या पातळीत लक्षणीय वाढ झाल्याचे दिसून आले, आणि इन विट्रो प्रयोगांनी दाखवले की टी पेशींच्या कार्यावर MNA चा रोगप्रतिकारक-नियंत्रक परिणाम पूर्वी अज्ञात होता. सर्वसाधारणपणे, ही पद्धत ट्यूमर आणि रोगप्रतिकारक पेशींमधील परस्पर चयापचय क्रिया उघड करते आणि रोगप्रतिकारक नियमन करणाऱ्या चयापचय घटकांविषयी अद्वितीय अंतर्दृष्टी प्रदान करते, जी टी-पेशी-आधारित अंडाशयाच्या कर्करोगाच्या इम्युनोथेरपी उपचारांच्या संधींसाठी उपयुक्त ठरू शकते.
आम्ही ग्लुकोज ग्रहण [2-(N-(7-नायट्रोफेनिल-2-ऑक्सा-1,3-डायझा-4-वायएल)अमिनो)-2-डीऑक्सीग्लुकोज (2-NBDG)] आणि मायटोकाँड्रियल क्रियाकलाप [मायटोट्रॅकर डीप रेड (MT DR)] (7, 19, 20) यांचे एकाच वेळी परिमाण निश्चित करण्यासाठी उच्च-आयामी फ्लो सायटोमेट्रीचा वापर केला. हे दोन्ही घटक रोगप्रतिकारक पेशी आणि ट्यूमर पेशींच्या समूहांमध्ये फरक करणारे वैशिष्ट्यपूर्ण मार्कर आहेत (तक्ता S2 आणि आकृती S1A). या विश्लेषणातून असे दिसून आले की, टी पेशींच्या तुलनेत, अॅसाइटिस आणि ट्यूमर पेशींमध्ये ग्लुकोज ग्रहणाची पातळी जास्त असते, परंतु मायटोकाँड्रियल क्रियाकलापांमध्ये कमी फरक असतो. ट्यूमर पेशींचे [CD45-EpCAM (EpCAM)+] सरासरी ग्लुकोज ग्रहण टी पेशींपेक्षा तीन ते चार पट जास्त आहे, आणि CD4 + टी पेशींचे सरासरी ग्लुकोज ग्रहण CD8 + टी पेशींपेक्षा 1.2 पट जास्त आहे, जे दर्शवते की ट्यूमरमध्ये घुसलेल्या लिम्फोसाइट्सच्या (TIL) चयापचयाच्या गरजा एकाच TME मध्ये देखील वेगवेगळ्या असतात (आकृती 1A). याउलट, ट्यूमर पेशींमधील मायटोकाँड्रियल क्रियाशीलता CD4+ T पेशींसारखीच असते, आणि दोन्ही प्रकारच्या पेशींची मायटोकाँड्रियल क्रियाशीलता CD8+ T पेशींपेक्षा जास्त असते (आकृती 1B). सर्वसाधारणपणे, हे परिणाम चयापचय पातळी दर्शवतात. ट्यूमर पेशींची चयापचय क्रियाशीलता CD4+ T पेशींपेक्षा जास्त असते, आणि CD4+ T पेशींची चयापचय क्रियाशीलता CD8+ T पेशींपेक्षा जास्त असते. पेशींच्या प्रकारांमध्ये हे परिणाम दिसून येत असले तरी, ट्यूमरच्या तुलनेत ॲसाइटिसमधील CD4+ आणि CD8+ T पेशींच्या चयापचय स्थितीमध्ये किंवा त्यांच्या सापेक्ष प्रमाणांमध्ये कोणताही सुसंगत फरक आढळत नाही (आकृती 1C). याउलट, CD45-पेशींच्या अंशामध्ये, ॲसाइटिसच्या तुलनेत ट्यूमरमधील EpCAM+ पेशींचे प्रमाण वाढले (आकृती 1D). आम्हाला EpCAM+ आणि EpCAM- पेशी घटकांमध्ये एक स्पष्ट चयापचय फरक देखील दिसून आला. EpCAM+ (ट्यूमर) पेशींमध्ये EpCAM- पेशींपेक्षा ग्लुकोजचे ग्रहण आणि मायटोकाँड्रियल क्रियाशीलता जास्त असते, जी TME मधील ट्यूमर पेशींमधील फायब्रोब्लास्ट्सच्या चयापचय क्रियाशीलतेपेक्षा खूपच जास्त आहे (आकृती 1, E आणि F).
(अ आणि ब) ग्लुकोज शोषणाची (2-NBDG) मध्यक प्रतिदीप्ती तीव्रता (MFI) (अ) आणि CD4 + T पेशींची मायटोकाँड्रियल क्रियाशीलता (मायटोट्रॅकर गडद लाल) (ब) प्रातिनिधिक आलेख (डावीकडे) आणि सारणीबद्ध माहिती (उजवीकडे), जलोदर आणि ट्यूमरमधील CD8 + T पेशी आणि EpCAM + CD45-ट्यूमर पेशी. (क) जलोदर आणि ट्यूमरमधील CD4 + आणि CD8 + पेशींचे (CD3 + T पेशींचे) गुणोत्तर. (ड) जलोदर आणि ट्यूमरमधील EpCAM + ट्यूमर पेशींचे प्रमाण (CD45−). (इ आणि फ) EpCAM + CD45-ट्यूमर आणि EpCAM-CD45-मॅट्रिक्स ग्लुकोज शोषण (2-NBDG) (इ) आणि मायटोकाँड्रियल क्रियाशीलता (मायटोट्रॅकर गडद लाल) (फ) प्रातिनिधिक आलेख (डावीकडे) आणि सारणीबद्ध माहिती (उजवीकडे) जलोदर आणि ट्यूमर पेशी. (ग) फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे CD25, CD137 आणि PD1 अभिव्यक्तीचे प्रातिनिधिक आलेख. (H आणि I) CD4 + T पेशींवरील (H) आणि CD8 + T पेशींवरील (I) CD25, CD137 आणि PD1 ची अभिव्यक्ती. (J आणि K) CCR7 आणि CD45RO च्या अभिव्यक्तीवर आधारित नेव्ह, सेंट्रल मेमरी (Tcm), इफेक्टर (Teff) आणि इफेक्टर मेमरी (Tem) फेनोटाइप. जलोदर आणि ट्यूमरमधील CD4 + T पेशी (J) आणि CD8 + T पेशी (K) यांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा (डावीकडे) आणि सारणीबद्ध डेटा (उजवीकडे). जोडीदार टी-चाचणीद्वारे निर्धारित केलेली पी मूल्ये (*P<0.05, **P<0.01 आणि ***P<0.001). रेषा जुळवलेल्या रुग्णांना (n = 6) दर्शवते. FMO, फ्लुरोसन्स मायनस वन; MFI, मीडियन फ्लुरोसन्स इंटेन्सिटी.
पुढील विश्लेषणातून अत्यंत सुस्पष्ट टी-सेल फेनोटाइपिक स्थितीमधील इतर महत्त्वपूर्ण फरक समोर आले. ट्यूमरमधील सक्रिय (आकृती १, G ते I) आणि इफेक्टर मेमरी (आकृती १, J आणि K) पेशी, जलोदराच्या तुलनेत (CD3 + टी-पेशींचे प्रमाण) खूप जास्त प्रमाणात आढळतात. त्याचप्रमाणे, सक्रियता मार्कर (CD25 आणि CD137) आणि क्षय मार्कर [प्रोग्राम्ड सेल डेथ प्रोटीन १ (PD1)] यांच्या अभिव्यक्तीद्वारे फेनोटाइपचे विश्लेषण केल्यावर असे दिसून आले की, जरी या पेशीसमूहांची चयापचय वैशिष्ट्ये भिन्न असली तरी (आकृती S1, B ते E), नेव्ह, इफेक्टर किंवा मेमरी उपसमूहांमध्ये कोणतेही महत्त्वपूर्ण चयापचय फरक सातत्याने दिसून आले नाहीत (आकृती S1, F ते I). पेशींचे फेनोटाइप स्वयंचलितपणे नियुक्त करण्यासाठी मशीन लर्निंग पद्धती वापरून या निष्कर्षांची पुष्टी करण्यात आली (21), ज्यामुळे रुग्णाच्या जलोदरात मोठ्या संख्येने अस्थिमज्जा पेशींची (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) उपस्थिती असल्याचेही उघड झाले (आकृती S2A). ओळखल्या गेलेल्या सर्व पेशी प्रकारांपैकी, या मायलॉइड पेशी समूहाने सर्वाधिक ग्लुकोज ग्रहण आणि मायटोकाँड्रियल क्रियाशीलता दर्शविली (आकृती S2, B ते G). हे परिणाम HGSC रुग्णांमधील जलोदर आणि ट्यूमरमध्ये आढळणाऱ्या विविध पेशी प्रकारांमधील तीव्र चयापचयविषयक फरक अधोरेखित करतात.
ट्यूमर-प्रेरित लिम्फोसाइट्सची (TIL) मेटाबोनॉमिक वैशिष्ट्ये समजून घेण्यामधील मुख्य आव्हान म्हणजे ट्यूमरमधून पुरेशा शुद्धतेचे, गुणवत्तेचे आणि प्रमाणाचे टी-सेल नमुने वेगळे करण्याची गरज. अलीकडील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की फ्लो सायटोमेट्रीवर आधारित सॉर्टिंग आणि बीड एनरिचमेंट पद्धतींमुळे पेशीय मेटाबोलाइट प्रोफाइलमध्ये बदल होऊ शकतात (22-24). या समस्येवर मात करण्यासाठी, आम्ही LC-MS/MS द्वारे विश्लेषणापूर्वी शस्त्रक्रियेने काढलेल्या मानवी अंडाशयाच्या कर्करोगातून TIL वेगळे करण्यासाठी बीड एनरिचमेंट पद्धत ऑप्टिमाइझ केली (सामग्री आणि पद्धती पहा; आकृती 2A). मेटाबोलाइट बदलांवर या प्रोटोकॉलच्या एकूण परिणामाचे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही वरील बीड विलगीकरण चरणानंतर निरोगी दात्यांद्वारे सक्रिय केलेल्या टी-सेल्सच्या मेटाबोलाइट प्रोफाइलची तुलना अशा पेशींशी केली ज्यांना बीडने वेगळे केले नाही परंतु बर्फावर ठेवले होते. या गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषणात असे आढळले की या दोन परिस्थितींमध्ये उच्च सहसंबंध आहे (r = 0.77), आणि 86 मेटाबोलाइट्सच्या गटाची तांत्रिक पुनरावृत्तीक्षमता उच्च आहे (आकृती 2B). म्हणून, या पद्धती पेशी प्रकार संवर्धनातून जाणाऱ्या पेशींमध्ये अचूक मेटाबोलाइट विश्लेषण करू शकतात, ज्यामुळे HGSC मधील विशिष्ट मेटाबोलाइट्स ओळखण्यासाठी पहिले उच्च-रिझोल्यूशन प्लॅटफॉर्म उपलब्ध होते, आणि त्याद्वारे लोकांना पेशी विशिष्टता लैंगिक चयापचय कार्यक्रमाची सखोल माहिती मिळवणे शक्य होते.
(अ) चुंबकीय मणी संवर्धनाची योजनाबद्ध आकृती. LC-MS/MS द्वारे विश्लेषण करण्यापूर्वी, पेशींवर चुंबकीय मणी संवर्धनाच्या तीन सलग फेऱ्या केल्या जातील किंवा त्या बर्फावर ठेवल्या जातील. (ब) मेटाबोलाइट्सच्या विपुलतेवर संवर्धनाच्या प्रकाराचा होणारा परिणाम. प्रत्येक संवर्धन प्रकारासाठी तीन मोजमापांची सरासरी ± SE. राखाडी रेषा १:१ संबंध दर्शवते. पुनरावृत्त मोजमापांचा इंट्रा-क्लास कोरिलेशन (ICC) अक्षाच्या लेबलमध्ये दर्शविला आहे. NAD, निकोटिनामाइड एडेनाइन डायन्यूक्लिओटाइड. (क) रुग्णाच्या मेटाबोलाइट विश्लेषणाच्या कार्यप्रवाहाची योजनाबद्ध आकृती. रुग्णांकडून जलोदर किंवा ट्यूमर गोळा केले जातात आणि क्रायोप्रिझर्व्ह केले जातात. प्रत्येक नमुन्याच्या एका लहान भागाचे फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे विश्लेषण केले गेले, तर उर्वरित नमुन्यांवर CD4+, CD8+ आणि CD45- पेशींसाठी संवर्धनाच्या तीन फेऱ्या केल्या गेल्या. या पेशींच्या भागांचे LC-MS/MS वापरून विश्लेषण केले गेले. (ड) प्रमाणित मेटाबोलाइट विपुलतेचा हीट मॅप. डेंड्रोग्राम नमुन्यांमधील युक्लिडियन अंतरांचे वॉर्ड क्लस्टरिंग दर्शवतो. (इ) नमुन्याच्या मेटाबोलाइट नकाशाचे मुख्य घटक विश्लेषण (PCA), ज्यामध्ये प्रत्येक नमुन्याच्या तीन प्रतिकृती दर्शविल्या आहेत; एकाच रुग्णाचे नमुने एका रेषेने जोडलेले आहेत. (फ) रुग्णावर आधारित नमुन्याच्या मेटाबोलाइट प्रोफाइलचे PCA (म्हणजेच, आंशिक रिडंडन्सी वापरून); नमुन्याचा प्रकार कॉन्व्हेक्स हलद्वारे मर्यादित आहे. PC1, मुख्य घटक १; PC2, मुख्य घटक २.
पुढे, आम्ही सहा HGSC रुग्णांच्या प्राथमिक जलोदर आणि ट्यूमरमधील CD4+, CD8+ आणि CD45- पेशींच्या गटांमधील ९९ मेटाबोलाइट्सचे विश्लेषण करण्यासाठी ही संवर्धन पद्धत वापरली (आकृती २C, आकृती S3A आणि तक्ता S3 आणि S4). अभ्यासासाठी निवडलेला पेशीसमूह जिवंत पेशींच्या मूळ मोठ्या नमुन्याच्या २% ते ७०% असतो आणि रुग्णांचे प्रमाण खूप भिन्न असते. बीड्स वेगळे केल्यानंतर, अभ्यासासाठी निवडलेला संवर्धित गट (CD4+, CD8+ किंवा CD45-) नमुन्यातील सर्व जिवंत पेशींच्या सरासरी ८५% पेक्षा जास्त असतो. ही संवर्धन पद्धत आम्हाला मानवी ट्यूमर ऊतींच्या चयापचयातील पेशीसमूहांचे विश्लेषण करण्यास अनुमती देते, जे मोठ्या नमुन्यांमधून करणे अशक्य आहे. या प्रोटोकॉलचा वापर करून, आम्ही निश्चित केले की एल-किन्युरेनाइन आणि ॲडेनोसिन, हे दोन सुप्रसिद्ध इम्युनोसप्रेसिव्ह मेटाबोलाइट्स ट्यूमर टी पेशी किंवा ट्यूमर पेशींमध्ये वाढलेले होते (आकृती S3, B आणि C). म्हणून, हे निकाल रुग्णांच्या ऊतींमधील जैविक दृष्ट्या महत्त्वाचे चयापचय घटक शोधण्यासाठी आमच्या पेशी विलगीकरण आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री तंत्रज्ञानाची अचूकता आणि क्षमता दर्शवतात.
आमच्या विश्लेषणातून रुग्णांमध्ये आणि रुग्णांनुसार पेशींच्या प्रकारांमध्ये एक तीव्र चयापचयविषयक विभाजन दिसून आले (आकृती २डी आणि आकृती एस४ए). विशेषतः, इतर रुग्णांच्या तुलनेत, रुग्ण ७० ने वेगळी चयापचयविषयक वैशिष्ट्ये दर्शविली (आकृती २ई आणि आकृती एस४बी), जे सूचित करते की रुग्णांमध्ये लक्षणीय चयापचयविषयक भिन्नता असू शकते. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की इतर रुग्णांच्या तुलनेत (१.२ ते २ लिटर; तक्ता एस१), रुग्ण ७० मध्ये गोळा केलेल्या जलोदराचे एकूण प्रमाण (८० मिली) कमी होते. मुख्य घटक विश्लेषणादरम्यान (उदाहरणार्थ, आंशिक अतिरिक्तता विश्लेषण वापरून) आंतर-रुग्ण भिन्नतेचे नियंत्रण केल्यास पेशींच्या प्रकारांमध्ये सुसंगत बदल दिसून येतात, आणि चयापचय प्रोफाइलनुसार पेशींचे प्रकार आणि/किंवा सूक्ष्म-पर्यावरण स्पष्टपणे एकत्रित होतात (आकृती २एफ). एकल चयापचय घटकांच्या विश्लेषणाने या परिणामांवर जोर दिला आणि पेशींचे प्रकार व सूक्ष्म-पर्यावरणामध्ये महत्त्वपूर्ण फरक उघड केले. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की सर्वात टोकाचा फरक एमएनए (MNA) मध्ये दिसून आला, जो सामान्यतः CD45- पेशींमध्ये आणि ट्यूमरमध्ये घुसलेल्या CD4+ आणि CD8+ पेशींमध्ये समृद्ध असतो (आकृती ३ए). CD4+ पेशींमध्ये हा परिणाम सर्वात स्पष्ट दिसतो, आणि CD8+ पेशींमधील MNA वर देखील पर्यावरणाचा तीव्र परिणाम होत असल्याचे दिसते. तथापि, हे महत्त्वाचे नाही, कारण सहापैकी केवळ तीन रुग्णांच्या ट्यूमर CD8+ स्कोअरचे मूल्यांकन केले जाऊ शकते. MNA व्यतिरिक्त, जलोदर आणि ट्यूमरमधील विविध प्रकारच्या पेशींमध्ये, TIL मध्ये ज्यांचे स्वरूप नीट स्पष्ट झालेले नाही असे इतर मेटाबोलाइट्स देखील वेगवेगळ्या प्रमाणात मुबलक प्रमाणात आढळतात (आकृत्या S3 आणि S4). त्यामुळे, ही माहिती पुढील संशोधनासाठी इम्युनोमॉड्युलेटरी मेटाबोलाइट्सचा एक आशादायक संच प्रकट करते.
(अ) जलोदर आणि ट्यूमरमधील CD4+, CD8+ आणि CD45- पेशींमधील MNA चे सामान्यीकृत प्रमाण. बॉक्स प्लॉटमध्ये मध्यक (रेषा), आंतरचतुर्थक श्रेणी (फ्रेम हिंज) आणि आंतरचतुर्थक श्रेणीच्या १.५ पट पर्यंतची डेटा श्रेणी (फ्रेम व्हिस्कर) दर्शविली आहे. 'रुग्ण साहित्य आणि पद्धती' मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, P मूल्य निश्चित करण्यासाठी रुग्णाच्या लिम्मा मूल्याचा वापर करा (*P<0.05 आणि **P<0.01). (ब) MNA चयापचयाची योजनाबद्ध आकृती (60). चयापचय उत्पादने: S-अ‍ॅडेनोसिल-१-मेथिओनिन; SAH, S-अ‍ॅडेनोसिन-१-होमोसिस्टीन; NA, निकोटिनामाइड; MNA, १-मिथाइलनिकोटिनामाइड; 2-PY, १-मिथाइल-२-पायरीडोन-५-कार्बोक्सामाइड; 4-PY, १-मिथाइल-४-पायरीडोन-५-कार्बोक्सामाइड; NR, निकोटिनामाइड रायबोज; NMN, निकोटिनामाइड मोनोन्यूक्लिओटाइड. एन्झाइम्स (हिरवे): NNMT, निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रान्सफरेज; SIRT, सिर्टुइन्स; NAMPT, निकोटिनामाइड फॉस्फोराइबोसिल ट्रान्सफरेज; AOX1, अल्डिहाइड ऑक्सिडेज 1; NRK, निकोटिनामाइड राइबोसाइड कायनेज; NMNAT, निकोटिनामाइड मोनो न्यूक्लियोटाइड अ‍ॅडेनायलेट ट्रान्सफरेज; Pnp1, प्युरिन न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरिलेज. (C) अ‍ॅसाइटिस (राखाडी) आणि ट्यूमर (लाल; n = 3 रुग्ण) यांच्या scRNA-seq चे t-SNE. (D) scRNA-seq वापरून ओळखलेल्या विविध पेशी समूहांमधील NNMT ची अभिव्यक्ती. (E) SK-OV-3, मानवी भ्रूण मूत्रपिंड (HEK) 293T, टी पेशी आणि MNA-उपचारित टी पेशींमध्ये NNMT आणि AOX1 ची अभिव्यक्ती. फोल्डेड अभिव्यक्ती SK-OV-3 च्या सापेक्ष दर्शविली आहे. SEM सह अभिव्यक्तीचा नमुना दर्शविला आहे (n = 6 निरोगी दाते). 35 पेक्षा जास्त Ct मूल्ये शोधण्यायोग्य नाहीत (UD) असे मानले जाते. (F) SK-OV-3, HEK293T, T पेशी आणि 8mM MNA ने उपचार केलेल्या T पेशींमध्ये SLC22A1 आणि SLC22A2 ची अभिव्यक्ती. पटीत अभिव्यक्ती SK-OV-3 च्या सापेक्ष दर्शविली आहे. SEM सह अभिव्यक्तीचा नमुना दर्शविला आहे (n = 6 निरोगी दाते). 35 पेक्षा जास्त Ct मूल्ये शोधण्यायोग्य नाहीत (UD) असे मानले जाते. (G) MNA सह 72 तासांच्या उष्मायनानंतर सक्रिय निरोगी दात्याच्या T पेशींमधील MNA चे प्रमाण. SEM सह अभिव्यक्तीचा नमुना दर्शविला आहे (n = 4 निरोगी दाते).
निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रान्सफरेज (NNMT; आकृती 3B) द्वारे एस-अ‍ॅडेनोसिल-1-मेथिओनाइन (SAM) मधून मिथाइल गट निकोटिनामाइड (NA) मध्ये हस्तांतरित केल्याने एमएनए (MNA) तयार होते. NNMT विविध मानवी कर्करोगांमध्ये जास्त प्रमाणात व्यक्त होते आणि ते प्रसार, आक्रमण आणि मेटास्टेसिसशी संबंधित आहे (25-27). ट्यूमर मायक्रोएन्व्हायर्नमेंट (TME) मधील टी पेशींमध्ये एमएनएचा स्रोत अधिक चांगल्या प्रकारे समजून घेण्यासाठी, आम्ही तीन एचजीएससी (HGSC) रुग्णांच्या अ‍ॅसाइटिस आणि ट्यूमरमधील विविध पेशी प्रकारांमध्ये NNMT च्या अभिव्यक्तीचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी scRNA-seq चा वापर केला (तक्ता S5). सुमारे 6,500 पेशींच्या विश्लेषणातून असे दिसून आले की अ‍ॅसाइटिस आणि ट्यूमरच्या वातावरणात, NNMT ची अभिव्यक्ती संभाव्य फायब्रोब्लास्ट आणि ट्यूमर पेशींच्या समूहांपुरती मर्यादित होती (आकृती 3, C आणि D). हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की PTPRC (CD45+) व्यक्त करणाऱ्या कोणत्याही समूहामध्ये NNMT ची कोणतीही स्पष्ट अभिव्यक्ती नाही (आकृती 3D आणि आकृती S5A), जे सूचित करते की मेटाबोलाइट स्पेक्ट्रममध्ये आढळलेले एमएनए टी पेशींमध्ये दाखल झाले आहे. अल्डिहाइड ऑक्सिडेस 1 (AOX1) ची अभिव्यक्ती, जी MNA चे 1-मिथाइल-2-पायरीडोन-5-कार्बोक्सामाइड (2-PYR) किंवा 1-मिथाइल-4-पायरीडोन-5-कार्बोक्सामाइड (4-PYR) मध्ये रूपांतर करते; (आकृती 3B), ही COL1A1 व्यक्त करणाऱ्या फायब्रोब्लास्ट्सच्या समूहापुरतीच मर्यादित आहे (आकृती S5A). यावरून असे दिसून येते की टी पेशींमध्ये पारंपरिक MNA चयापचय करण्याची क्षमता नसते. या MNA-संबंधित जनुकांच्या अभिव्यक्तीच्या पद्धतीची पडताळणी HGSC रुग्णांच्या जलोदरातील दुसऱ्या स्वतंत्र पेशी डेटा सेटचा वापर करून करण्यात आली (आकृती S5B; n = 6) (16). याव्यतिरिक्त, MNA ने उपचार केलेल्या निरोगी दाता टी पेशींच्या क्वांटिटेटिव्ह पॉलिमरेज चेन रिॲक्शन (qPCR) विश्लेषणातून असे दिसून आले की, नियंत्रण SK-OV-3 अंडाशयाच्या ट्यूमर पेशींच्या तुलनेत, NNMT किंवा AOX1 जवळजवळ व्यक्त झाले नव्हते (आकृती 3E). हे अनपेक्षित परिणाम सूचित करतात की MNA हे फायब्रोब्लास्ट्स किंवा ट्यूमरमधून TME मधील लगतच्या टी पेशींमध्ये स्रवले जाऊ शकते.
जरी उमेदवारांमध्ये सोल्युबल कॅरियर 22 (SLC22) फॅमिली (SLC22A1, SLC22A2 आणि SLC22A3) द्वारे एन्कोड केलेल्या ऑरगॅनिक कॅटायन ट्रान्सपोर्टर्स 1 ते 3 (OCT1, OCT2 आणि OCT3) च्या कुटुंबाचा समावेश असला तरी, MNA चे संभाव्य ट्रान्सपोर्टर्स अजूनही अनिश्चित आहेत (28). निरोगी दात्याच्या टी पेशींमधील mRNA च्या QPCR ने SLC22A1 ची कमी अभिव्यक्ती पातळी दर्शविली परंतु SLC22A2 ची पातळी शोधण्यायोग्य नव्हती, ज्यामुळे साहित्यात पूर्वी नोंद झाली होती याची पुष्टी झाली (आकृती 3F) (29). याउलट, SK-OV-3 ओव्हेरियन ट्यूमर सेल लाइनने दोन्ही ट्रान्सपोर्टर्सची उच्च पातळी व्यक्त केली (आकृती 3F).
टी पेशींमध्ये बाह्य MNA शोषून घेण्याची क्षमता आहे की नाही हे तपासण्यासाठी, निरोगी दात्याच्या टी पेशींना MNA च्या वेगवेगळ्या सांद्रतांच्या उपस्थितीत ७२ तास संवर्धित करण्यात आले. बाह्य MNA च्या अनुपस्थितीत, पेशींमधील MNA चे प्रमाण शोधता येत नाही (आकृती ३G). तथापि, बाह्य MNA ने उपचार केलेल्या सक्रिय टी पेशींमध्ये, ६ mM MNA पर्यंत, पेशींमधील MNA च्या प्रमाणात मात्रेनुसार वाढ दिसून आली (आकृती ३G). या परिणामावरून असे दिसून येते की, ट्रान्सपोर्टरची कमी अभिव्यक्ती आणि पेशींमधील MNA चयापचयासाठी जबाबदार असलेल्या मुख्य एन्झाइमची कमतरता असूनही, TIL पेशी MNA ग्रहण करू शकतात.
रुग्णांच्या टी पेशींमधील मेटाबोलाइट्सचा स्पेक्ट्रम आणि इन विट्रो MNA शोषण प्रयोगांवरून ही शक्यता वाढते की, कर्करोगाशी संबंधित फायब्रोब्लास्ट्स (CAF) MNA स्रवतात आणि ट्यूमर पेशी TIL चा फेनोटाइप व कार्य नियंत्रित करू शकतात. टी पेशींवर MNA चा परिणाम निश्चित करण्यासाठी, निरोगी दात्याच्या टी पेशींना MNA च्या उपस्थितीत किंवा अनुपस्थितीत इन विट्रो सक्रिय केले गेले आणि त्यांच्या प्रोलिफरेशन व सायटोकाइन उत्पादनाचे मूल्यांकन केले गेले. सर्वोच्च मात्रेत MNA दिल्यानंतर ७ दिवसांनी, पेशींची संख्या दुप्पट होण्याचा दर मध्यम प्रमाणात कमी झाला, तर सर्व मात्रांमध्ये जोम टिकून राहिला (आकृती ४अ). याव्यतिरिक्त, बाह्य MNA च्या उपचारांमुळे ट्यूमर नेक्रोसिस फॅक्टर-α (TNFα) व्यक्त करणाऱ्या CD4+ आणि CD8+ टी पेशींच्या प्रमाणात वाढ झाली (आकृती ४ब). याउलट, CD4+ टी पेशींमध्ये IFN-γ चे आंतरपेशीय उत्पादन लक्षणीयरीत्या कमी झाले, परंतु CD8+ टी पेशींमध्ये नाही, आणि इंटरल्यूकिन २ (IL-2) मध्ये कोणताही लक्षणीय बदल झाला नाही (आकृती ४, क आणि ड). म्हणून, या MNA-उपचारित टी-सेल कल्चरच्या सुपरनॅटंटच्या एन्झाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉर्बेंट अ‍ॅसे (ELISA) मध्ये TNFα मध्ये लक्षणीय वाढ, IFN-γ मध्ये घट आणि IL-2 मध्ये कोणताही बदल दिसून आला नाही (आकृती ४, E ते G). IFN-γ मधील घट हे दर्शवते की MNA टी-सेल्सच्या अँटी-ट्यूमर क्रियेला रोखण्यात भूमिका बजावू शकते. टी-सेल-मध्यस्थ सायटोटॉक्सिसिटीवर MNA च्या परिणामाचे अनुकरण करण्यासाठी, फोलेट रिसेप्टर α ला लक्ष्य करणारे कायमेरिक अँटीजेन रिसेप्टर टी (FRα-CAR-T) सेल्स आणि ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) द्वारे नियंत्रित CAR-T (GFP) सेल्स, निरोगी दात्याच्या पेरिफेरल ब्लड मोनोन्यूक्लियर सेल्स (PBMC) पासून तयार केले जातात. CAR-T सेल्सना MNA च्या उपस्थितीत २४ तास कल्चर केले गेले, आणि नंतर फोलेट रिसेप्टर α व्यक्त करणाऱ्या मानवी SK-OV-3 ओव्हेरियन ट्यूमर सेल्ससोबत १०:१ च्या इफेक्टर ते टार्गेट गुणोत्तराने को-कल्चर केले गेले. MNA उपचारामुळे FRα-CAR-T पेशींच्या मारक क्षमतेत लक्षणीय घट झाली, जी ॲडेनोसिनने उपचार केलेल्या FRα-CAR-T पेशींसारखीच होती (आकृती 4H).
(अ) सातव्या दिवशी कल्चरमधून थेट घेतलेली एकूण जिवंत पेशींची संख्या आणि पॉप्युलेशन डबलिंग (PD). बार ग्राफ सहा निरोगी दात्यांची सरासरी + SEM दर्शवतो. किमान n = ३ स्वतंत्र प्रयोगांमधील डेटा दर्शवतो. (ब ते ड) CD3/CD28 आणि IL-2 चा वापर T पेशींना त्यांच्या संबंधित MNA सांद्रतेवर ७ दिवसांसाठी सक्रिय करण्यासाठी केला गेला. विश्लेषणापूर्वी, पेशींना गोल्जीस्टॉपसह PMA/आयोनोमायसिनने ४ तासांसाठी उत्तेजित केले गेले. T पेशींमधील TNFα (ब) अभिव्यक्ती. जिवंत पेशींमधील TNFα अभिव्यक्तीचे उदाहरण चित्र (डावीकडे) आणि सारणीबद्ध डेटा (उजवीकडे). T पेशींमधील IFN-γ (क) आणि IL-2 (ड) अभिव्यक्ती. सायटोकाइन्सची अभिव्यक्ती फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे मोजली गेली. बार ग्राफ सरासरी (n = ६ निरोगी दाते) + SEM दर्शवतो. P मूल्य निश्चित करण्यासाठी वन-वे ॲनालिसिस ऑफ व्हेरिएन्स आणि रिपीटेड मेजर्स (*P<0.05 आणि **P<0.01) वापरा. ​​किमान n = ३ स्वतंत्र प्रयोगांमधील डेटा दर्शवतो. (E ते G) CD3/CD28 आणि IL-2 यांचा वापर T पेशींना त्यांच्या संबंधित MNA सांद्रतेवर ७ दिवसांसाठी सक्रिय करण्यासाठी केला गेला. PMA/आयोनोमायसिन उत्तेजनाच्या आधी आणि ४ तासांनंतर माध्यम गोळा केले गेले. TNFα (E), IFN-γ (F) आणि IL-2 (G) यांची सांद्रता ELISA द्वारे मोजली गेली. बार ग्राफ सरासरी (n = ५ निरोगी दाते) + SEM दर्शवतो. P मूल्य एक-मार्गी विचलन विश्लेषण आणि पुनरावृत्त मापनांचा वापर करून निर्धारित केले गेले (*P<0.05). तुटक रेषा शोध मर्यादेचे संकेत देते. (H) पेशी विघटन चाचणी. FRα-CAR-T किंवा GFP-CAR-T पेशींना ॲडेनोसिन (२५०μM) किंवा MNA (१० mM) सह २४ तासांसाठी समायोजित केले गेले, किंवा उपचार न करता तसेच ठेवले गेले (Ctrl). SK-OV-3 पेशींच्या विनाशाची टक्केवारी मोजली गेली. P मूल्य वेल्च टी चाचणीद्वारे निर्धारित केले गेले (*P<0.5 आणि **P<0.01).
MNA-अवलंबित TNFα अभिव्यक्ती नियमनाची यंत्रणात्मक समज मिळवण्यासाठी, MNA-उपचारित टी पेशींमधील TNFα mRNA मधील बदलांचे मूल्यांकन करण्यात आले (आकृती 5A). MNA ने उपचारित निरोगी दाता टी पेशींमध्ये TNFα प्रतिलेखन पातळीत दुप्पट वाढ दिसून आली, जे दर्शवते की MNA हे TNFα प्रतिलेखन नियमनावर अवलंबून आहे. या संभाव्य नियामक यंत्रणेचा तपास करण्यासाठी, TNFα चे नियमन करणारे दोन ज्ञात प्रतिलेखन घटक, म्हणजेच सक्रिय टी पेशी केंद्रकीय घटक (NFAT) आणि विशिष्ट प्रथिन 1 (Sp1), यांचे समीपस्थ TNFα प्रमोटरला MNA च्या बंधनाच्या प्रतिसादात मूल्यांकन करण्यात आले (30). TNFα प्रमोटरमध्ये 6 ओळखलेली NFAT बंधन स्थळे आणि 2 Sp1 बंधन स्थळे आहेत, जी एका स्थळी [5'कॅपपासून -55 बेस पेअर्स (bp)] एकमेकांवर आच्छादित होतात (30). क्रोमॅटिन इम्युनोप्रिसिपिटेशन (ChIP) ने दाखवले की MNA ने उपचारित केल्यावर, TNFα प्रमोटरला Sp1 चे बंधन तिप्पट वाढले. NFAT चा समावेश देखील वाढला आणि महत्त्वाच्या पातळीपर्यंत पोहोचला (आकृती 5B). या माहितीवरून असे दिसून येते की MNA हे Sp1 ट्रान्सक्रिप्शनद्वारे TNFα च्या अभिव्यक्तीचे आणि काही प्रमाणात NFAT च्या अभिव्यक्तीचे नियमन करते.
(अ) MNA शिवाय कल्चर केलेल्या टी पेशींच्या तुलनेत, MNA ने उपचार केलेल्या टी पेशींमधील TNFα अभिव्यक्तीमधील पटीतील बदल. SEM सह अभिव्यक्तीचा नमुना दर्शविला आहे (n = ५ निरोगी दाते). किमान n = ३ स्वतंत्र प्रयोगांमधील डेटा दर्शवतो. (ब) NFAT आणि Sp1 यांना एकत्रित करून (Ctrl) आणि PMA/आयोनोमायसिन उत्तेजनानंतर ४ तासांनी, ८ mM MNA सह किंवा त्याशिवाय उपचार केलेल्या टी पेशींचा TNFα प्रमोटर. इम्युनोप्रेसिपिटेशनसाठी अनुक्रमे नकारात्मक आणि सकारात्मक नियंत्रक म्हणून इम्युनोग्लोबुलिन जी (IgG) आणि H3 वापरले गेले. ChIP च्या प्रमाणीकरणाने दाखवले की नियंत्रकाच्या तुलनेत MNA-उपचारित पेशींमध्ये TNFα प्रमोटरला Sp1 आणि NFAT चे बंधन अनेक पटींनी वाढले. किमान n = ३ स्वतंत्र प्रयोगांमधील डेटा दर्शवतो. P मूल्य मल्टिपल टी-टेस्टद्वारे निर्धारित केले आहे (*** P <०.०१). (क) HGSC च्या ॲसाइटिसच्या तुलनेत, टी पेशींनी (नॉन-सायटोटॉक्सिक) ट्यूमरमध्ये TNF ची वाढलेली अभिव्यक्ती दर्शविली. रंग वेगवेगळे रुग्ण दर्शवतात. प्रदर्शित केलेल्या पेशी ३०० पर्यंत यादृच्छिकपणे नमुना म्हणून घेतल्या आहेत आणि ओव्हरड्रॉइंग मर्यादित करण्यासाठी त्यांना जिटर केले आहे (** Padj = 0.0076). (D) अंडाशयाच्या कर्करोगासाठी MNA चे प्रस्तावित मॉडेल. MNA हे ट्यूमर मायक्रोएन्व्हायर्नमेंट (TME) मधील ट्यूमर पेशी आणि फायब्रोब्लास्ट्समध्ये तयार होते आणि टी पेशींद्वारे घेतले जाते. MNA मुळे TNFα प्रमोटरला Sp1 चे बंधन वाढते, ज्यामुळे TNFα ट्रान्सक्रिप्शन आणि TNFα सायटोकाइन उत्पादन वाढते. MNA मुळे IFN-γ मध्ये घट देखील होते. टी पेशींच्या कार्यावर प्रतिबंध आल्याने मारक क्षमता कमी होते आणि ट्यूमरची वाढ वेगाने होते.
अहवालानुसार, TNFα चे समोर आणि मागे अवलंबून असलेले ट्यूमरविरोधी आणि ट्यूमरविरोधी प्रभाव आहेत, परंतु अंडाशयाच्या कर्करोगाची वाढ आणि मेटास्टॅसिसला प्रोत्साहन देण्यात त्याची एक सुप्रसिद्ध भूमिका आहे (31-33). अहवालानुसार, अंडाशयाच्या कर्करोगाच्या रुग्णांमध्ये ॲसाइटिस आणि ट्यूमर टिश्यूमधील TNFα चे प्रमाण सौम्य टिश्यूपेक्षा जास्त असते (34-36). कार्यप्रणालीच्या दृष्टीने, TNFα पांढऱ्या रक्त पेशींचे सक्रियकरण, कार्य आणि प्रसार नियंत्रित करू शकते आणि कर्करोगाच्या पेशींचा फेनोटाइप बदलू शकते (37, 38). या निष्कर्षांशी सुसंगत, भिन्न जीन अभिव्यक्ती विश्लेषणाने दर्शविले की ॲसाइटिसच्या तुलनेत ट्यूमर टिश्यूमधील टी पेशींमध्ये TNF लक्षणीयरीत्या अप-रेग्युलेटेड होते (आकृती 5C). TNF अभिव्यक्तीमधील वाढ केवळ नॉन-सायटोटॉक्सिक फेनोटाइप असलेल्या टी पेशींच्या गटांमध्येच स्पष्ट होती (आकृती S5A). सारांश, हे आकडेवारी या मताला पुष्टी देते की MNA मध्ये HGSC मध्ये दुहेरी इम्युनोसप्रेसिव्ह आणि ट्यूमरला प्रोत्साहन देणारे प्रभाव आहेत.
फ्लो सायटोमेट्रीवर आधारित फ्लोरोसेंट लेबलिंग ही ट्यूमर लिम्फोसाइट (TIL) चयापचयाचा अभ्यास करण्याची मुख्य पद्धत बनली आहे. या अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की, परिधीय रक्तातील लिम्फोसाइट्स किंवा दुय्यम लिम्फॉइड अवयवांमधील टी पेशींच्या तुलनेत, उंदीर आणि मानवी TIL मध्ये ग्लुकोज शोषून घेण्याची प्रवृत्ती जास्त असते (4, 39) आणि मायटोकॉन्ड्रियल कार्याचा हळूहळू ऱ्हास होतो (19, 40). जरी आम्हाला या अभ्यासात असेच परिणाम आढळले असले तरी, एकाच शस्त्रक्रियेने काढलेल्या ट्यूमर ऊतींमधील ट्यूमर पेशी आणि TIL यांच्या चयापचयाची तुलना करणे हा महत्त्वाचा विकास आहे. यापैकी काही पूर्वीच्या अहवालांशी सुसंगतपणे, ॲसाइटिस आणि ट्यूमरमधील ट्यूमर (CD45-EpCAM +) पेशींमध्ये CD8 + आणि CD4 + टी पेशींपेक्षा जास्त ग्लुकोज शोषण क्षमता असते, जे ट्यूमर पेशींच्या उच्च ग्लुकोज शोषण क्षमतेची तुलना टी पेशींशी करता येते या संकल्पनेला समर्थन देते. ट्यूमर मायक्रोएन्व्हायर्नमेंट (TME). तथापि, ट्यूमर पेशींची मायटोकॉन्ड्रियल क्रियाशीलता CD8 + टी पेशींपेक्षा जास्त आहे, परंतु ती CD4 + टी पेशींसारखीच आहे. हे परिणाम ऑक्सिडेटिव्ह चयापचय ट्यूमर पेशींसाठी महत्त्वाचा आहे या उदयोन्मुख संकल्पनेला बळकटी देतात (41, 42). ते असेही सुचवतात की CD8 + T पेशी CD4 + T पेशींपेक्षा ऑक्सिडेटिव्ह डिसफंक्शनसाठी अधिक संवेदनशील असू शकतात, किंवा CD4 + T पेशी मायटोकाँड्रियल क्रियाकलाप टिकवून ठेवण्यासाठी ग्लुकोज व्यतिरिक्त इतर कार्बन स्त्रोतांचा वापर करू शकतात (43, 44). हे लक्षात घेतले पाहिजे की आम्हाला ॲसाइटिसमधील CD4 + T इफेक्टर्स, T इफेक्टर मेमरी आणि T सेंट्रल मेमरी पेशींमध्ये ग्लुकोज ग्रहण किंवा मायटोकाँड्रियल क्रियाकलापात कोणताही फरक आढळला नाही. त्याचप्रमाणे, ट्यूमरमधील CD8 + T पेशींच्या विभेदन अवस्थेचा ग्लुकोज ग्रहणातील बदलांशी काहीही संबंध नाही, जे इन विट्रोमध्ये कल्चर केलेल्या T पेशी आणि इन विवोमधील मानवी TIL यांच्यातील महत्त्वपूर्ण फरक अधोरेखित करते (22). या निरीक्षणांची पुष्टी निष्पक्ष स्वयंचलित पेशी लोकसंख्या वाटपाच्या वापराद्वारे देखील झाली, ज्यातून पुढे असे दिसून आले की ट्यूमर पेशींपेक्षा जास्त ग्लुकोज ग्रहण आणि मायटोकाँड्रियल क्रियाकलाप असलेल्या CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + पेशी प्रचलित आहेत परंतु त्यांच्यात चयापचय सक्रिय पेशी लोकसंख्या आहे. ही लोकसंख्या scRNA-seq विश्लेषणात ओळखल्या गेलेल्या मायलॉइड सप्रेशर पेशी किंवा प्लाझ्मासाइटॉइड डेंड्रिटिक पेशींच्या संभाव्य उप-लोकसंख्येचे प्रतिनिधित्व करू शकते. जरी या दोन्ही गोष्टी मानवी अंडाशयाच्या ट्यूमरमध्ये नोंदवल्या गेल्या आहेत [45], तरीही या मायलॉइड उप-लोकसंख्येचे वर्णन करण्यासाठी पुढील कामाची आवश्यकता आहे.
जरी फ्लो सायटोमेट्री-आधारित पद्धती पेशींच्या प्रकारांमधील ग्लुकोज आणि ऑक्सिडेटिव्ह चयापचयातील सामान्य फरक स्पष्ट करू शकतात, तरीही ट्यूमर मायक्रोएन्व्हायर्नमेंट (TME) मध्ये मायटोकाँड्रियल चयापचयासाठी ग्लुकोज किंवा इतर कार्बन स्रोतांद्वारे तयार होणारे नेमके मेटाबोलाइट्स अद्याप निश्चित झालेले नाहीत. दिलेल्या TIL उपसंचामध्ये मेटाबोलाइट्सची उपस्थिती किंवा अनुपस्थिती निश्चित करण्यासाठी, कापलेल्या ऊतींमधून पेशींच्या समूहाचे शुद्धीकरण करणे आवश्यक असते. म्हणून, आमची पेशी संवर्धन पद्धत, मास स्पेक्ट्रोमेट्रीसह एकत्रित केल्यास, जुळणाऱ्या रुग्णांच्या नमुन्यांमध्ये टी-पेशी आणि ट्यूमर पेशींच्या समूहांमध्ये भिन्नपणे संवर्धित होणाऱ्या मेटाबोलाइट्सबद्दल माहिती देऊ शकते. जरी या पद्धतीचे फ्लुरोसेन्स-ॲक्टिव्हेटेड सेल सॉर्टिंगपेक्षा फायदे असले तरी, काही मेटाबोलाइट लायब्ररी त्यांच्या अंगभूत स्थिरतेमुळे आणि/किंवा जलद उलाढाल दरामुळे प्रभावित होऊ शकतात (22). तरीही, आमची पद्धत दोन मान्यताप्राप्त इम्युनोसप्रेसिव्ह मेटाबोलाइट्स, ॲडेनोसिन आणि किन्युरेनाइन, ओळखण्यास सक्षम होती, कारण ते नमुन्यांच्या प्रकारानुसार मोठ्या प्रमाणात बदलतात.
ट्यूमर आणि टीआयएल (TIL) उपप्रकारांचे आमचे मेटाबोनॉमिक विश्लेषण अंडाशयाच्या ट्यूमर मायक्रोएन्व्हायर्नमेंट (TME) मध्ये मेटाबोलाइट्सच्या भूमिकेबद्दल अधिक माहिती देते. प्रथम, फ्लो सायटोमेट्रीचा वापर करून, आम्ही हे निश्चित केले की ट्यूमर आणि CD4+ टी पेशींमध्ये मायटोकाँड्रियल क्रियेत कोणताही फरक नव्हता. तथापि, LC-MS/MS विश्लेषणाने या समूहांमध्ये मेटाबोलाइट्सच्या विपुलतेमध्ये लक्षणीय बदल उघड केले, जे सूचित करते की टीआयएल चयापचय आणि त्याच्या एकूण चयापचय क्रियेबद्दलच्या निष्कर्षांसाठी काळजीपूर्वक अर्थ लावणे आवश्यक आहे. दुसरे म्हणजे, MNA हा मेटाबोलाइट आहे ज्यामध्ये CD45-पेशी आणि टी पेशींमध्ये सर्वात जास्त फरक आहे, ट्यूमरमध्ये नाही. म्हणून, कंपार्टमेंटलायझेशन आणि ट्यूमरच्या स्थानाचा टीआयएल चयापचयावर वेगवेगळा परिणाम होऊ शकतो, जे दिलेल्या सूक्ष्म वातावरणातील संभाव्य विषमता अधोरेखित करते. तिसरे म्हणजे, MNA-उत्पादक एन्झाइम NNMT ची अभिव्यक्ती प्रामुख्याने CAF पुरती मर्यादित आहे, जी कमी प्रमाणात ट्यूमर पेशींमध्ये आढळते, परंतु ट्यूमर-व्युत्पन्न टी पेशींमध्ये शोधण्यायोग्य MNA पातळी दिसून येते. अंडाशयाच्या CAF मध्ये NNMT च्या अतिअभिव्यक्तीचा कर्करोग-प्रवर्तक प्रभाव ज्ञात आहे, जो अंशतः CAF चयापचय, ट्यूमर आक्रमण आणि मेटास्टॅसिसच्या प्रोत्साहनामुळे आहे (27). जरी TIL ची एकूण पातळी मध्यम असली तरी, CAF मधील NNMT ची अभिव्यक्ती कॅन्सर जीनोम ॲटलस (TCGA) मेसेन्कायमल उपप्रकाराशी जवळून संबंधित आहे, जी खराब रोगनिदानाशी निगडित आहे (27, 46, 47). शेवटी, MNA च्या विघटनासाठी जबाबदार असलेल्या AOX1 या एन्झाइमची अभिव्यक्ती देखील CAF समूहापुरतीच मर्यादित आहे, जे दर्शवते की टी पेशींमध्ये MNA चे चयापचय करण्याची क्षमता नसते. हे परिणाम या कल्पनेला समर्थन देतात की, जरी या निष्कर्षाची पडताळणी करण्यासाठी पुढील कामाची आवश्यकता असली तरी, टी पेशींमधील MNA ची उच्च पातळी रोगप्रतिकारशक्ती दाबणाऱ्या CAF सूक्ष्म-वातावरणाची उपस्थिती दर्शवू शकते.
MNA ट्रान्सपोर्टर्सची कमी अभिव्यक्ती पातळी आणि MNA चयापचयात सामील असलेल्या प्रमुख प्रथिनांची न आढळणारी पातळी लक्षात घेता, टी पेशींमध्ये MNA ची उपस्थिती अनपेक्षित आहे. दोन स्वतंत्र गटांच्या scRNA-seq विश्लेषण आणि लक्ष्यित qPCR द्वारे NNMT किंवा AOX1 यांपैकी काहीही शोधता आले नाही. हे परिणाम सूचित करतात की MNA चे संश्लेषण टी पेशींद्वारे होत नाही, तर ते सभोवतालच्या TME मधून शोषले जाते. इन विट्रो प्रयोगांवरून असे दिसून येते की टी पेशींमध्ये बाह्य MNA जमा होण्याची प्रवृत्ती असते.
आमच्या इन विट्रो अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की बाह्य MNA टी पेशींमध्ये TNFα ची अभिव्यक्ती प्रेरित करते आणि TNFα प्रमोटरला Sp1 चे बंधन वाढवते. जरी TNFα मध्ये ट्यूमरविरोधी आणि ट्यूमरविरोधी दोन्ही कार्ये असली तरी, अंडाशयाच्या कर्करोगात, TNFα अंडाशयाच्या कर्करोगाच्या वाढीस प्रोत्साहन देऊ शकते (31-33). अंडाशयाच्या ट्यूमर पेशी संवर्धनात TNFα चे निष्प्रभीकरण किंवा उंदरांच्या मॉडेल्समध्ये TNFα सिग्नलचे उच्चाटन केल्याने TNFα-मध्यस्थ दाहक सायटोकाइन उत्पादन सुधारू शकते आणि ट्यूमरची वाढ रोखली जाऊ शकते (32, 35). म्हणून, या प्रकरणात, TME-व्युत्पन्न MNA ऑटोक्रीन लूपद्वारे TNFα-अवलंबित यंत्रणेद्वारे एक दाहक-समर्थक मेटाबोलाइट म्हणून कार्य करू शकते, ज्यामुळे अंडाशयाच्या कर्करोगाची घटना आणि प्रसार वाढतो (31). या शक्यतेवर आधारित, अंडाशयाच्या कर्करोगासाठी एक संभाव्य उपचारात्मक घटक म्हणून TNFα अवरोधाचा अभ्यास केला जात आहे (37, 48, 49). याव्यतिरिक्त, MNA अंडाशयाच्या ट्यूमर पेशींवरील CAR-T पेशींच्या सायटोटॉक्सिसिटीला कमी करते, जे MNA-मध्यस्थ रोगप्रतिकारक शक्तीच्या दमनासाठी आणखी पुरावा प्रदान करते. एकत्रितपणे, हे परिणाम असे मॉडेल सुचवतात की ज्यामध्ये ट्यूमर आणि सीएएफ पेशी बाह्यकोशिकीय टीएमईमध्ये एमएनए स्रवतात. (i) टीएनएफ-प्रेरित अंडाशयाच्या कर्करोगाच्या वाढीस चालना आणि (ii) एमएनए-प्रेरित टी पेशींच्या सायटोटॉक्सिक क्रियेस प्रतिबंध यांद्वारे, याचा ट्यूमरवर दुहेरी परिणाम होऊ शकतो (आकृती 5D).
सारांशतः, जलद पेशी संवर्धन, एकल-पेशी अनुक्रमण आणि चयापचय प्रोफाइलिंग यांच्या एकत्रित वापराद्वारे, या अभ्यासाने HGSC रुग्णांमधील ट्यूमर आणि जलोदर पेशींमधील प्रचंड इम्युनोमेटॅबोलॉमिक फरक उघड केले. या सर्वसमावेशक विश्लेषणाने दाखवले की टी पेशींमध्ये ग्लुकोज ग्रहण आणि मायटोकाँड्रियल क्रियाकलापांमध्ये फरक आहेत, आणि MNA ला एक नॉन-सेल ऑटोनॉमस रोगप्रतिकारक नियामक मेटाबोलाइट म्हणून ओळखले. या माहितीचा मानवी कर्करोगांमध्ये ट्यूमर मायक्रोएन्व्हायर्नमेंट (TME) टी पेशींच्या चयापचयावर कसा परिणाम करते यावर प्रभाव पडतो. जरी टी पेशी आणि कर्करोगाच्या पेशींमध्ये पोषक तत्वांकरिता थेट स्पर्धा नोंदवली गेली असली तरी, मेटाबोलाइट्स ट्यूमरच्या वाढीस चालना देण्यासाठी आणि संभाव्यतः अंतर्जात रोगप्रतिकारक प्रतिसाद दाबण्यासाठी अप्रत्यक्ष नियामक म्हणून देखील कार्य करू शकतात. या नियामक मेटाबोलाइट्सच्या कार्यात्मक भूमिकेचे अधिक सविस्तर वर्णन, ट्यूमरविरोधी रोगप्रतिकारक प्रतिसाद वाढवण्यासाठी पर्यायी धोरणे खुली करू शकते.
रुग्णांचे नमुने आणि क्लिनिकल डेटा कॅनेडियन टिश्यू रिपॉझिटरी नेटवर्कद्वारे प्रमाणित बीसी कॅन्सर ट्यूमर टिश्यू रिपॉझिटरीमधून मिळवण्यात आले. बीसी कॅन्सर रिसर्च एथिक्स कमिटी आणि युनिव्हर्सिटी ऑफ ब्रिटिश कोलंबिया (H07-00463) यांनी मंजूर केलेल्या प्रोटोकॉलनुसार, सर्व रुग्णांचे नमुने आणि क्लिनिकल डेटा मिळवण्यासाठी माहितीपूर्ण लेखी संमती घेण्यात आली किंवा त्यांनी औपचारिकपणे आपली संमती सोडून दिली. हे नमुने प्रमाणित बायोबँकमध्ये (BRC-00290) संग्रहित आहेत. रुग्णांची सविस्तर वैशिष्ट्ये तक्ते S1 आणि S5 मध्ये दर्शविली आहेत. क्रायोप्रिझर्वेशनसाठी, रुग्णाच्या ट्यूमरच्या नमुन्याचे यांत्रिकरित्या विघटन करण्यासाठी स्कॅल्पेलचा वापर केला जातो आणि नंतर एकल पेशी निलंबन (single cell suspension) मिळवण्यासाठी ते १००-मायक्रॉन फिल्टरमधून ढकलले जाते. पेशींचा गोळा (pellet) तयार करण्यासाठी आणि वरचा द्रव (supernatant) काढून टाकण्यासाठी रुग्णाच्या जलोदर द्रवाला (ascites) ४°C तापमानावर १० मिनिटांसाठी १५०० rpm वेगाने सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले. ट्यूमर आणि जलोदरातून मिळवलेल्या पेशी ५०% उष्णतेने निष्क्रिय केलेल्या मानवी AB सीरम (सिग्मा-अल्ड्रिच), ४०% RPMI-1640 (थर्मो फिशर सायंटिफिक) आणि १०% डायमिथाइल सल्फॉक्साइडमध्ये क्रायोप्रिझर्व्ह करण्यात आल्या. या प्रिझर्व्ह केलेल्या एकल पेशी निलंबनांना वितळवून खाली वर्णन केलेल्या मेटाबोलॉमिक्स आणि मेटाबोलाइट निर्धारणासाठी वापरण्यात आले.
संपूर्ण माध्यमामध्ये ०.२२ μm फिल्टर केलेले ५०:५० पूरक RPMI १६४०: AimV यांचा समावेश असतो. RPMI १६४० + २.०५ mM एल-ग्लुटामाइन (थर्मो फिशर सायंटिफिक) मध्ये १०% उष्णतेने निष्क्रिय केलेले मानवी AB सीरम (सिग्मा-अल्ड्रिच), १२.५ mM हेपेस (थर्मो फिशर सायंटिफिक), २ mM एल-ग्लुटामाइन (थर्मो फिशर सायंटिफिक), १ x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनस्ट्रेप) द्रावण (थर्मो फिशर सायंटिफिक) आणि ५० μMB-मरकॅप्टोइथेनॉल पूरक म्हणून दिलेले असते. AimV (इन्व्हिट्रोजन) मध्ये २० mM हेपेस (थर्मो फिशर सायंटिफिक) आणि २ mM एल-ग्लुटामाइन (थर्मो फिशर सायंटिफिक) पूरक म्हणून दिलेले असते. फ्लो सायटोमीटर स्टेनिंग बफरमध्ये ०.२२ मायक्रॉन फिल्टर केलेले फॉस्फेट बफर्ड सलाइन (PBS; इनविट्रोजन) होते, ज्यामध्ये ३% उष्णतेने निष्क्रिय केलेले AB मानवी सीरम (सिग्मा) मिसळलेले होते. सेल एनरिचमेंट बफर हे ०.२२ मायक्रॉन फिल्टर केलेल्या PBS पासून बनलेले आहे आणि त्यात ०.५% उष्णतेने निष्क्रिय केलेले मानवी AB सीरम (सिग्मा-अल्ड्रिच) मिसळलेले आहे.
३७°C पूर्ण माध्यमात, पेशींना १० nM MT DR आणि १०० μM 2-NBDG ने ३० मिनिटांसाठी रंगवले गेले. त्यानंतर, पेशींना ४°C तापमानावर १५ मिनिटांसाठी व्हायबिलिटी डाय eF506 ने रंगवले गेले. पेशींना FC ब्लॉक (eBioscience) आणि ब्रिलियंट स्टेन बफर (BD Biosciences) मध्ये पुन्हा विरघळवा, फ्लो सायटोमीटर स्टेनिंग बफरमध्ये (उत्पादकाच्या सूचनांनुसार) पातळ करा आणि खोलीच्या तापमानावर १० मिनिटांसाठी उबवा. पेशींना अँटीबॉडीजच्या संचाने (तक्ता S2) फ्लो सायटोमेट्री स्टेनिंग बफरमध्ये ४°C तापमानावर २० मिनिटांसाठी रंगवा. विश्लेषणापूर्वी पेशींना फ्लो सायटोमेट्री स्टेनिंग बफरमध्ये (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R कॉन्फिगरेशन) पुन्हा विरघळवा. पेशींच्या संख्येच्या डेटाचे विश्लेषण करण्यासाठी SpectroFlo आणि FlowJo V10 वापरा आणि डेटा तयार करण्यासाठी GraphPad Prism 8 वापरा. 2-NBDG आणि MT DR ची मीडियन फ्लुरोसन्स इंटेन्सिटी (MFI) लॉग-नॉर्मलाइझ करण्यात आली, आणि नंतर मॅच्ड पेशंट्स विचारात घेण्यासाठी सांख्यिकीय विश्लेषणाकरिता पेअर्ड टी टेस्टचा वापर करण्यात आला. विश्लेषणातून ४० पेक्षा कमी इव्हेंट्स असलेले सर्व पॉप्युलेशन्स काढून टाका; सांख्यिकीय विश्लेषण आणि डेटा व्हिज्युअलायझेशन करण्यापूर्वी कोणत्याही नकारात्मक मूल्यांसाठी MFI चे मूल्य १ प्रविष्ट करा.
वरील प्रोसेस पॅनेलच्या मॅन्युअल गेटिंग स्ट्रॅटेजीला पूरक म्हणून, आम्ही फ्लोजो (FlowJo) मध्ये डेड सेल्स काढून टाकल्यानंतर, पेशींना पॉप्युलेशनमध्ये आपोआप नियुक्त करण्यासाठी फुल ॲनोटेशन बाय द शेप रिस्ट्रिक्शन ट्री (FAUST) (21) वापरले. चुकीच्या पद्धतीने वाटप झालेल्या पॉप्युलेशन्सना (PD1+ आणि PD1- ट्यूमर सेल्स एकत्र करून) विलीन करण्यासाठी आणि टिकवून ठेवलेल्या पॉप्युलेशन्ससाठी आम्ही आउटपुटचे मॅन्युअली व्यवस्थापन करतो. प्रत्येक सॅम्पलमध्ये सरासरी २% पेक्षा जास्त सेल्स असतात, ज्यामुळे एकूण ११ पॉप्युलेशन्स तयार होतात.
ल्युकोसाइट विभक्त उत्पादनांपासून (STEMCELL Technologies) PBMC वेगळे करण्यासाठी फिकोल ग्रेडियंट डेन्सिटी सेंट्रीफ्युगेशनचा वापर करण्यात आला. उत्पादकाच्या सूचनांनुसार, CD8 मायक्रोबीड्स (Miltenyi) वापरून PBMC मधून CD8 + T पेशी वेगळ्या करण्यात आल्या आणि ट्रान्सॲक्ट (Miltenyi) वापरून संपूर्ण माध्यमात २ आठवड्यांसाठी वाढवण्यात आल्या. पेशींना IL-7 (१० ng/ml; PeproTech) असलेल्या संपूर्ण माध्यमात ५ दिवस स्थिर ठेवण्यात आले आणि नंतर ट्रान्सॲक्टने पुन्हा उत्तेजित करण्यात आले. ७ व्या दिवशी, उत्पादकाच्या सूचनांनुसार, मानवी CD45 मायक्रोबीड्स (Miltenyi) वापरून सलग तीन फेऱ्यांमध्ये पेशी समृद्ध करण्यात आल्या. फ्लो सायटोमेट्री विश्लेषणासाठी (वर वर्णन केल्याप्रमाणे) पेशींचे विभाजन करण्यात आले आणि LC-MS/MS विश्लेषणासाठी दहा लाख पेशींचे तीन वेळा विभाजन करण्यात आले. खाली वर्णन केल्याप्रमाणे नमुन्यांवर LC-MS/MS द्वारे प्रक्रिया करण्यात आली. आम्ही १,००० आयन संख्येसह गहाळ मेटाबोलाइट मूल्याचा अंदाज लावला. विश्लेषणापूर्वी प्रत्येक नमुना एकूण आयन संख्येने (TIC) सामान्यीकृत केला जातो, लॉगरिथमिकरित्या रूपांतरित केला जातो आणि MetaboAnalystR मध्ये स्वयंचलितपणे सामान्यीकृत केला जातो.
प्रत्येक रुग्णाच्या एकल पेशी निलंबनाला (single cell suspension) वितळवून (थॉ करून) ४० μm फिल्टरमधून संपूर्ण माध्यमात (complete medium) गाळण्यात आले (वर वर्णन केल्याप्रमाणे). उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार, CD8+, CD4+ आणि CD45- पेशींनी नमुने समृद्ध करण्यासाठी (enrich) मायक्रोबीड्स (मिल्टेनी) वापरून चुंबकीय मणी विलगनाद्वारे (magnetic bead separation) सकारात्मक निवडीच्या (positive selection) तीन सलग फेऱ्या (बर्फावर) वापरण्यात आल्या. थोडक्यात, पेशींना पेशी समृद्धीकरण बफरमध्ये (cell enrichment buffer) पुन्हा निलंबित (resuspended) केले जाते (वर वर्णन केल्याप्रमाणे) आणि त्यांची गणना केली जाते. पेशींना मानवी CD8 मणी, मानवी CD4 मणी किंवा मानवी CD45 मणी (मिल्टेनी) यांच्यासोबत ४°C तापमानावर १५ मिनिटांसाठी उबवण्यात आले (incubated), आणि नंतर पेशी समृद्धीकरण बफरने धुतले गेले. नमुना एलएस कॉलममधून (LS column) (मिल्टेनी) पाठवला जातो आणि सकारात्मक (positive) व नकारात्मक (negative) अंश गोळा केले जातात. कालावधी कमी करण्यासाठी आणि पेशी पुनर्प्राप्तीची पायरी (cell recovery step) जास्तीत जास्त करण्यासाठी, CD8-अंश नंतर CD4+ समृद्धीकरणाच्या दुसऱ्या फेरीसाठी वापरला जातो आणि CD4-अंश त्यानंतरच्या CD45- समृद्धीकरणासाठी वापरला जातो. विलगीकरणाच्या संपूर्ण प्रक्रियेदरम्यान द्रावण बर्फावर ठेवा.
मेटाबोलाइट विश्लेषणासाठी नमुने तयार करण्याकरिता, पेशी बर्फासारख्या थंड मिठाच्या द्रावणाने एकदा धुतल्या गेल्या आणि प्रत्येक नमुन्यात १ मिली ८०% मिथेनॉल टाकून, ते व्हॉर्टेक्स केले गेले व द्रव नायट्रोजनमध्ये त्वरित गोठवले गेले. नमुन्यांवर तीन वेळा गोठवणे-वितळवणे प्रक्रिया केली गेली आणि ४°C तापमानावर १५ मिनिटांसाठी १४,००० आरपीएम वेगाने सेंट्रीफ्यूज केले गेले. मेटाबोलाइट्स असलेले सुपरनॅटंट (वरचा द्रव) कोरडे होईपर्यंत बाष्पीभवन केले जाते. मेटाबोलाइट्स ५० μl ०.०३% फॉर्मिक ॲसिडमध्ये पुन्हा विरघळवले गेले, मिसळण्यासाठी व्हॉर्टेक्स केले गेले आणि नंतर कचरा काढण्यासाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले.
वर वर्णन केल्याप्रमाणे मेटाबोलाइट्स वेगळे काढा. मेटाबोलॉमिक्स संशोधनासाठी सुपरनॅटंट एका हाय परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी बाटलीमध्ये स्थानांतरित करा. बॅच इफेक्ट्स टाळण्यासाठी प्रत्येक नमुन्यावर समान संख्येने पेशी वापरून प्रक्रिया करण्यासाठी रँडम ट्रीटमेंट प्रोटोकॉल वापरा. ​​आम्ही AB SCIEX QTRAP 5500 ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (50) वर पूर्वी प्रकाशित झालेल्या ग्लोबल मेटाबोलाइट्सचे गुणात्मक मूल्यांकन केले. क्रोमॅटोग्राफिक विश्लेषण आणि पीक एरिया इंटिग्रेशन मल्टीक्वांट आवृत्ती 2.1 सॉफ्टवेअर (अप्लाइड बायोसिस्टम्स SCIEX) वापरून केले गेले.
गहाळ मेटाबोलाइट मूल्याचा अंदाज घेण्यासाठी १००० आयन गणना वापरली गेली, आणि नमुना प्रक्रियेतील इन्स्ट्रुमेंटल विश्लेषणाद्वारे होणारे बदल दुरुस्त करण्यासाठी प्रत्येक शोधलेल्या मेटाबोलाइटच्या सामान्यीकृत पीक क्षेत्राची गणना करण्यासाठी प्रत्येक नमुन्याचा TIC वापरला गेला. TIC सामान्यीकृत झाल्यानंतर, लॉगरिदमिक रूपांतरण आणि स्वयंचलित नॉर्म लाइन स्केलिंगसाठी MetaboAnalystR(51) (डीफॉल्ट पॅरामीटर) वापरले जाते. आम्ही नमुन्यांच्या प्रकारांमधील मेटाबोलॉम फरकांचे अन्वेषणात्मक विश्लेषण करण्यासाठी vegan R पॅकेजसह PCA वापरले, आणि रुग्णांचे विश्लेषण करण्यासाठी आंशिक रिडंडन्सी विश्लेषण वापरले. नमुन्यांमधील युक्लिडियन अंतराचे क्लस्टरिंग करण्यासाठी हीट मॅप डेंड्रोग्राम तयार करण्याकरिता वॉर्ड पद्धत वापरा. ​​संपूर्ण पेशी प्रकार आणि सूक्ष्म वातावरणात भिन्न प्रमाणात आढळणारे मेटाबोलाइट्स ओळखण्यासाठी आम्ही प्रमाणित मेटाबोलाइट विपुलतेवर limma (52) वापरले. स्पष्टीकरण सोपे करण्यासाठी, आम्ही मॉडेल निर्दिष्ट करण्यासाठी गट माध्य पॅरामीटर वापरतो, आणि सूक्ष्म वातावरणातील पेशी प्रकारांना प्रत्येक गट मानतो (n = ६ गट); सार्थकता चाचणीसाठी, आम्ही प्रत्येक मेटाबोलाइटसाठी तीन पुनरावृत्त मोजमापे केली. चुकीचे पुनरावर्तन टाळण्यासाठी, लिम्मा डिझाइनमध्ये रुग्णाला एक अडथळा म्हणून समाविष्ट केले गेले. वेगवेगळ्या रुग्णांमधील मेटाबोलाइट्समधील फरक तपासण्यासाठी, आम्ही रुग्णांना एका निश्चित पद्धतीने समाविष्ट करून लिम्मा मॉडेल समायोजित केले. आम्ही पेशी प्रकार आणि सूक्ष्म-पर्यावरण यांच्यातील पूर्व-निर्धारित फरकाची सार्थकता Padj <0.05 (बेंजामिनी-होचबर्ग सुधारणा) म्हणून नोंदवतो.
मिल्टेनी डेड सेल रिमूव्हल किट वापरून जोम वाढवल्यानंतर (>८०% जिवंतपणा), १०x ५' जीन एक्सप्रेशन प्रोटोकॉल वापरून एकूण जिवंत गोठवलेल्या असाईट्स आणि ट्यूमरच्या नमुन्यांवर सिंगल-सेल ट्रान्सक्रिप्टोम सिक्वेन्सिंग करण्यात आले. जुळणारे ट्यूमर आणि असाईट्स असलेल्या पाच प्रकरणांचे विश्लेषण करण्यात आले, तथापि एका ट्यूमरच्या नमुन्यातील कमी जिवंतपणामुळे त्याचा समावेश करता आला नाही. रुग्णांची अनेक निवड साध्य करण्यासाठी, आम्ही प्रत्येक रुग्णाचे नमुने १०x क्रोमियम कंट्रोलरच्या लेनमध्ये एकत्र केले आणि असाईट्स व ट्यूमरच्या जागांचे स्वतंत्रपणे विश्लेषण केले. सिक्वेन्सिंगनंतर [इल्यूमिना हायसेक ४००० २८×९८ बीपी पेअर्ड एंड (पीई), क्वेबेक जीनोम; ट्यूमर आणि असाईट्ससाठी अनुक्रमे प्रति सेल सरासरी 73,488 आणि 41,378 रीड्स]], आम्ही CellSNP आणि Vireo (53) वापरले (CellSNP वर आधारित, GRCh38 द्वारे प्रदान केलेल्या सामान्य मानवी SNP (VCF) ला दाता ओळख दिली जाते. आम्ही रुग्णाच्या जीनोटाइप स्थितीची सर्वात जवळची ओळख (IBS) अनुमानित करण्यासाठी SNPRelate वापरतो, ज्यामध्ये नियुक्त न केलेल्या पेशी आणि डुप्लेक्स म्हणून ओळखल्या गेलेल्या पेशी वगळल्या जातात आणि असाईट्स आणि ट्यूमर नमुन्यांमधील दात्यांशी जुळवले जाते (54). या कार्याच्या आधारावर, आम्ही पुढील विश्लेषणासाठी ट्यूमर आणि असाईट्समध्ये भरपूर पेशी प्रतिनिधित्व असलेली तीन प्रकरणे ठेवली. scater (55) आणि scran (56) बायो-कंडक्टर पॅकेजिंगमध्ये मास फिल्ट्रेशन स्टेप केल्यानंतर, विश्लेषणासाठी 6975 पेशी (अनुक्रमे ट्यूमर आणि असाईट्समधून 2792 आणि 4183 पेशी) मिळाल्या. आम्ही जॅकर्ड डिस्टन्सवर आधारित igraph चे (57) लुवेन क्लस्टरिंग ऑफ शेअर्ड नियरेस्ट नेबर नेटवर्क (SNN) वापरतो. अभिव्यक्तीनुसार पेशींचे क्लस्टर तयार केले. मार्कर जीन अभिव्यक्तीच्या आधारावर क्लस्टर्सना संभाव्य पेशी प्रकारांमध्ये मॅन्युअली एनोटेट केले गेले आणि t-SNE वापरून व्हिज्युअलाइझ केले गेले. सायटोटॉक्सिक टी पेशी CD8A आणि GZMA च्या अभिव्यक्तीद्वारे परिभाषित केल्या जातात, ज्यात कमी रायबोसोमल प्रोटीन अभिव्यक्ती असलेले सबक्लस्टर्स वगळले आहेत. आम्ही इझार एट अल. (16) यांच्या प्रकाशित डेटाचा वापर केला, ज्यात त्यांचे t-SNE एम्बेडिंग समाविष्ट आहे, जे इम्युन सेल मार्कर्स आणि NNMT अभिव्यक्तीमधील अभिव्यक्ती ओव्हरलॅप नियंत्रित करू शकते.
फिकोल ग्रेडियंट डेन्सिटी सेंट्रीफ्युगेशनद्वारे PBMC ला ल्युकोसाइट सेपरेशन प्रॉडक्ट्स (STEMCELL टेक्नॉलॉजीज) पासून वेगळे करण्यात आले. CD3 बीड्स (मिल्टेनी) वापरून PBMC मधून CD3+ पेशी वेगळ्या करण्यात आल्या. MNA च्या उपस्थितीत किंवा अनुपस्थितीत, प्लेट-बाउंड CD3 (5μg/ml), सोल्युबल CD28 (3μg/ml) आणि IL-2 (300 U/ml; प्रोल्युकिन) वापरून CD3+ पेशी सक्रिय करण्यात आल्या. एक्सपान्शनच्या शेवटच्या दिवशी, फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे पेशींची जिवंतपणा (फिक्सेबल व्हायबिलिटी डाय eFluor450, eBioscience) आणि पेशींची वाढ (123count eBeads, थर्मो फिशर सायंटिफिक) यांचे मूल्यांकन करण्यात आले. गोल्जीस्टॉप वापरून पेशींना PMA (20 ng/ml) आणि आयोनोमायसिन (1μg/ml) ने 4 तास उत्तेजित करून इफेक्टर फंक्शनचे मूल्यांकन करा आणि CD8-PerCP (RPA-T8, बायोलेजेंड), CD4-AF700 (RPA-T4, बायोलेजेंड) आणि TNFα-फ्लोरोसीन आयसोथायोसायनेट (FITC) (MAb11, बीडी) यांचे निरीक्षण करा. qPCR आणि ChIP पेशींना PMA (20 ng/ml) आणि आयोनोमायसिन (1μg/ml) ने 4 तास उत्तेजित करा. PMA (20 ng/ml) आणि आयोनोमायसिन (1 μg/ml) ने 4 तास उत्तेजित करण्यापूर्वी आणि नंतर ELISA सुपरनॅटंट गोळा करण्यात आला.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) वापरून RNA वेगळे करण्यासाठी उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलचे पालन करा. नमुना एकजीव करण्यासाठी QIAshredder (QIAGEN) वापरा. ​​कॉम्प्लिमेंटरी DNA (cDNA) संश्लेषित करण्यासाठी उच्च-क्षमता RNA ते cDNA किट (Thermo Fisher Scientific) वापरा. ​​खालील प्रोब्ससह (उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार) जीन अभिव्यक्तीचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) वापरा: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ग्लिसराल्डिहाइड-३-फॉस्फेट ऑफ हायड्रोजन (GAPDH)] आणि Hs01010726_m1 (SLC22A2). मायक्रोअॅम्प ऑप्टिकल फिल्मसह मायक्रोअॅम्प फास्ट ऑप्टिकल ९६-वेल रिॲक्शन प्लेटमध्ये (अप्लाइड बायोसिस्टम्स) स्टेपवनप्लस रिअल-टाइम पीसीआर सिस्टीमवर (अप्लाइड बायोसिस्टम्स) नमुने तपासण्यात आले. ३५ पेक्षा जास्त असलेले कोणतेही Ct मूल्य शोध मर्यादेच्या वर मानले जाते आणि ते शोधण्यायोग्य नाही असे चिन्हांकित केले जाते.
पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे ChIP करा (58). थोडक्यात, पेशींवर फॉर्मल्डिहाइड (अंतिम सांद्रता 1.42%) प्रक्रिया करून त्यांना खोलीच्या तापमानावर 10 मिनिटे उबवण्यात आले. पूरक स्वेलिंग बफर (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl आणि 0.1% NP-40) बर्फावर 10 मिनिटे वापरा, नंतर वर्णन केल्याप्रमाणे (58) इम्युनोप्रेसिपिटेशन बफरमध्ये पुन्हा निलंबित करा. त्यानंतर नमुन्यावर खालील चक्रांसह सोनिकेशन करण्यात आले: 10 चक्रे (20 1-सेकंदाचे पल्स) आणि 40 सेकंदांचा स्थिर वेळ. ChIP-ग्रेड इम्युनोग्लोबुलिन G (सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजी; 1μl), हिस्टोन H3 (सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजी; 3μl), NFAT (इन्व्हिट्रोजन; 3μl) आणि SP1 (सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजी; 3μl) अँटीबॉडीज नमुन्यासोबत 4°CC तापमानावर रात्रभर हलवून उबवा. प्रोटीन ए बीड्स (थर्मो फिशर सायंटिफिक) नमुन्यासोबत ४°C तापमानावर १ तास हलक्या हाताने हलवत ठेवा, त्यानंतर डीएनए समृद्ध करण्यासाठी चेलेक्स बीड्स (बायो-रॅड) वापरा आणि प्रथिनांच्या पचनासाठी प्रोटीनेज के (थर्मो फिशर) वापरा. ​​टीएनएफα प्रमोटर पीसीआरद्वारे शोधण्यात आला: फॉरवर्ड, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; याउलट, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (२०७-बीपी उत्पादन). प्रतिमा इमेज लॅब (बायो-रॅड) द्वारे तयार केल्या गेल्या आणि इमेजजे सॉफ्टवेअर वापरून त्यांचे परिमाणीकरण केले गेले.
वर वर्णन केल्याप्रमाणे सेल कल्चर सुपरनॅटंट गोळा करण्यात आला. मानवी TNFα ELISA किट (Invitrogen), मानवी IL-2 ELISA किट (Invitrogen) आणि मानवी IFN-γ ELISA किट (Abcam) यांच्या उत्पादकाच्या कार्यपद्धतीनुसार निर्धारण करण्यात आले. उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार, TNFα आणि IL-2 शोधण्यासाठी सुपरनॅटंट १:१०० प्रमाणात, आणि IFN-γ शोधण्यासाठी १:३ प्रमाणात विरल करण्यात आला. ४५० nm वर शोषणक्षमता मोजण्यासाठी EnVision 2104 मल्टीलेबल रीडर (PerkinElmer) वापरा.
फिकोल ग्रेडियंट डेन्सिटी सेंट्रीफ्युगेशनद्वारे PBMC ला ल्युकोसाइट सेपरेशन प्रॉडक्ट्स (STEMCELL टेक्नॉलॉजीज) पासून वेगळे करण्यात आले. CD3 बीड्स (मिल्टेनी) वापरून PBMC मधून CD3+ पेशी वेगळ्या करण्यात आल्या. MNA च्या उपस्थितीत किंवा अनुपस्थितीत, CD3+ पेशींना प्लेट-बाउंड CD3 (5μg/ml), सोल्युबल CD28 (3μg/ml) आणि IL-2 (300 U/ml; प्रोल्युकिन) वापरून ३ दिवसांसाठी सक्रिय करण्यात आले. ३ दिवसांनंतर, पेशी गोळा करून 0.9% सलाइनने धुतल्या गेल्या आणि पेलेटला त्वरित गोठवण्यात आले. 123count eBeads वापरून फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे (सायटेक अरोरा; 3L-16V-14B-8R कॉन्फिगरेशन) पेशींची गणना करण्यात आली.
वर वर्णन केल्याप्रमाणे मेटाबोलाइट्स काढा. वाळलेल्या अर्काची ४००० सेल इक्विव्हॅलेंट्स/μl या सांद्रतेवर पुनर्रचना करण्यात आली. रिव्हर्स्ड-फेज क्रोमॅटोग्राफी (१२९० इन्फिनिटी II, एजिलेंट टेक्नॉलॉजीज, सांता क्लारा, सीए) आणि कॉर्टेक्स टी३ कॉलम (२.१×१५० मिमी, कणांचा आकार १.६-μm, छिद्रांचा आकार १२०-Å; #१८६००८५००, वॉटर्स) वापरून नमुन्याचे विश्लेषण करा. पोलर मास स्पेक्ट्रोमीटर (६४७०, एजिलेंट), ज्यामध्ये इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण पॉझिटिव्ह मोडमध्ये कार्य करते. मोबाइल फेज ए हे ०.१% फॉर्मिक ऍसिड (पाण्यात) आहे, मोबाइल फेज बी हे ९०% ऍसिटोनायट्राइल, ०.१% फॉर्मिक ऍसिड आहे. एलसी ग्रेडियंट १००% A साठी ० ते २ मिनिटे, ९९% B साठी २ ते ७.१ मिनिटे आणि ९९% B साठी ७.१ ते ८ मिनिटे आहे. त्यानंतर, ०.६ मिली/मिनिटच्या प्रवाह दराने ३ मिनिटांसाठी मोबाइल फेज A वापरून कॉलम पुन्हा संतुलित करा. प्रवाह दर ०.४ मिली/मिनिट आहे आणि कॉलम चेंबर ५०°C पर्यंत गरम केले जाते. रिटेन्शन टाइम (RT) आणि ट्रान्सफॉर्मेशन (RT = ०.८८२ मिनिटे, ट्रान्सफॉर्मेशन १ = १३७→९४.१, ट्रान्सफॉर्मेशन २ = १३७→९२, ट्रान्सफॉर्मेशन ३ = १३७→७८) स्थापित करण्यासाठी MNA चे शुद्ध रासायनिक मानक (M320995, टोरोंटो रिसर्च केमिकल कंपनी, नॉर्थ यॉर्क, ओंटारियो, कॅनडा) वापरा. ​​जेव्हा तिन्ही ट्रान्झिशन्स योग्य रिटेन्शन टाइमवर होतात, तेव्हा विशिष्टता सुनिश्चित करण्यासाठी परिमापनासाठी ट्रान्झिशन १ वापरले जाते. एमएनए (टोरोंटो रिसर्च केमिकल कंपनी) चा मानक वक्र, स्टॉक सोल्यूशनच्या (१ मिग्रॅ/मिली) सहा क्रमिक विरलनाने तयार करण्यात आला, जेणेकरून अनुक्रमे ०.१, १.०, १० आणि १०० नॅनोग्रॅम/मिली आणि १.० आणि १० मायक्रोग्रॅम/मिली द्रवाचे मानक प्राप्त झाले. शोध मर्यादा १ नॅनोग्रॅम/मिली आहे, आणि रेषीय प्रतिसाद १० नॅनोग्रॅम/मिली ते १० मायक्रोग्रॅम/मिली दरम्यान आहे. एलसी/एमएस विश्लेषणासाठी नमुना आणि मानकाच्या दोन मायक्रोलिटरचे प्रत्येक इंजेक्शन वापरले जाते, आणि विश्लेषण प्लॅटफॉर्मची स्थिरता सुनिश्चित करण्यासाठी प्रत्येक आठ इंजेक्शननंतर एक मिश्र गुणवत्ता नियंत्रण नमुना चालवला जातो. एमएनए-उपचारित सर्व पेशी नमुन्यांचे एमएनए प्रतिसाद चाचणीच्या रेषीय मर्यादेत होते. डेटाचे विश्लेषण मासहंटर क्वांटिटेटिव्ह ॲनालिसिस सॉफ्टवेअर (v9.0, एजिलेंट) वापरून केले गेले.
दुसऱ्या पिढीचे αFR-CAR कन्स्ट्रक्ट सॉन्ग एट अल. (59) यांच्याकडून घेण्यात आले होते. थोडक्यात, या कन्स्ट्रक्टमध्ये खालील घटक आहेत: CD8a लीडर सिक्वेन्स, मानवी αFR-विशिष्ट सिंगल-चेन व्हेरिएबल फ्रॅगमेंट, CD8a हिंज आणि ट्रान्समेम्ब्रेन रिजन, CD27 इंट्रासेल्युलर डोमेन आणि CD3z इंट्रासेल्युलर डोमेन. संपूर्ण CAR सिक्वेन्स जेनस्क्रिप्टद्वारे संश्लेषित करण्यात आला, आणि नंतर ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी वापरल्या जाणाऱ्या GFP एक्सप्रेशन कॅसेटच्या वरच्या बाजूस (अपस्ट्रीम) दुसऱ्या पिढीच्या लेंटिव्हायरल एक्सप्रेशन व्हेक्टरमध्ये क्लोन करण्यात आला.
लेंटीव्हायरसचे उत्पादन HEK293T पेशींच्या [अमेरिकन टाईप कल्चर कलेक्शन (ATCC)] ट्रान्सफेक्शनद्वारे केले जाते; या पेशी १०% फीटल बोवाइन सीरम (FBS) आणि १% पेनस्ट्रेप असलेल्या डल्बेकोच्या मॉडिफाईड ईगल माध्यमात वाढवल्या जातात, आणि त्यात CAR-GFP व्हेक्टर व पॅकेजिंग प्लास्मिड्स (psPAX2 आणि pMD2.G, ॲडजीन) साठी लायपोफेक्शन अमाइन (सिग्मा-अल्ड्रिच) वापरले जाते. ट्रान्सफेक्शननंतर ४८ आणि ७२ तासांनी विषाणूयुक्त सुपरनॅटंट गोळा केला, गाळला आणि अल्ट्रासेंट्रीफ्युगेशनद्वारे संहत केला. संहत केलेला विषाणू सुपरनॅटंट ट्रान्सडक्शन होईपर्यंत -८०°C तापमानावर साठवा.
निरोगी दात्याच्या ल्युकोसाइट सेपरेशन प्रॉडक्ट्स (स्टेमसेल टेक्नॉलॉजीज) पासून फिकोल ग्रेडियंट डेन्सिटी सेंट्रीफ्युगेशनद्वारे PBMC वेगळे केले जातात. PBMC मधून CD8+ पेशी वेगळ्या करण्यासाठी पॉझिटिव्ह सिलेक्शन CD8 मायक्रोबीड्स (मिल्टेनी) वापरा. ​​T पेशींना ट्रान्सअॅक्ट (मिल्टेनी) आणि टेक्समॅक्स माध्यमात [मिल्टेनी; ज्यामध्ये ३% उष्णतेने निष्क्रिय केलेले मानवी सीरम, १% पेनस्ट्रेप आणि IL-2 (३०० U/ml) मिसळलेले असते] उत्तेजित करा. उत्तेजित केल्यानंतर चोवीस तासांनी, T पेशींमध्ये लेंटिव्हायरस (१०⁶ पेशींसाठी १० μl संकेंद्रित व्हायरस सुपरनॅटंट) संक्रमित करण्यात आला. संक्रमणाच्या १ ते ३ दिवसांनंतर सायटेक अरोरावर (FSC (फॉरवर्ड स्कॅटर)/SSC (साइड स्कॅटर), सिंगलेट, GFP+ वर) किमान ३०% संक्रमण कार्यक्षमता दर्शवण्यासाठी पेशींच्या GFP अभिव्यक्तीचे मूल्यांकन करा.
CAR-T पेशींना इम्युनोकल्ट (स्टेमसेल टेक्नॉलॉजीज; १% पेनस्ट्रेपसह) मध्ये २४ तासांसाठी खालील परिस्थितीत संवर्धित करण्यात आले: उपचार न केलेले, २५० μM ॲडेनोसिन किंवा १० mM MNA ने उपचारित. पूर्व-उपचारानंतर, CAR-T पेशींना PBS ने धुतले गेले आणि २०,००० SK-OV-3 पेशींसोबत [ATCC; मॅकॉय ५ए माध्यमात (सिग्मा-अल्ड्रिच) १०:१ या प्रमाणात एकत्र केले गेले. इफेक्टर ते टार्गेट गुणोत्तर १ होते, जे पूरक इम्युनोकल्ट माध्यमात तिप्पट वाढवले ​​गेले. SK-OV-3 पेशी आणि डिजिटलिस सॅपोनीन (०.५mg/ml; सिग्मा-अल्ड्रिच) ने विरघळवलेल्या SK-OV-3 पेशी अनुक्रमे नकारात्मक आणि सकारात्मक नियंत्रक म्हणून वापरल्या गेल्या. २४ तासांच्या सह-संवर्धनानंतर, सुपरनॅटंट गोळा करण्यात आला आणि उत्पादकाच्या सूचनांनुसार (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) लॅक्टेट डिहायड्रोजनेज (LDH) मोजण्यात आले. LDH सुपरनॅटंटला LDH बफरमध्ये १:५० प्रमाणात विरल करण्यात आले. पेशी मारण्याची टक्केवारी खालील सूत्र वापरून मोजण्यात आली: पेशी मारण्याची टक्केवारी = सुधारणेची टक्केवारी / कमाल पेशी मारण्याचा दर x १००%, जिथे सुधारणेची टक्केवारी = सह-संवर्धन-फक्त टी-पेशी, आणि कमाल पेशी मारण्याचा दर = पॉझिटिव्ह कंट्रोल-निगेटिव्ह कंट्रोल.
मजकुरात किंवा साहित्य आणि पद्धतींमध्ये वर्णन केल्यानुसार, सांख्यिकीय विश्लेषणासाठी ग्राफपॅड प्रिझम ८, मायक्रोसॉफ्ट एक्सेल किंवा आर v३.६.० वापरा. ​​जर एकाच रुग्णाकडून अनेक नमुने (जसे की जलोदर आणि ट्यूमर) गोळा केले असतील, तर आम्ही योग्यतेनुसार पेअर्ड टी टेस्ट वापरतो किंवा रुग्णाला लिनियर किंवा जनरलाइज्ड मॉडेलमध्ये रँडम इफेक्ट म्हणून समाविष्ट करतो. मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषणासाठी, इम्पॉर्टन्स टेस्ट तीन वेळा केली जाते.
या लेखासाठीच्या पूरक सामग्रीकरिता, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 येथे पहा.
हा एक मुक्त प्रवेश लेख आहे जो क्रिएटिव्ह कॉमन्स ॲट्रिब्युशन-नॉन-कमर्शियल लायसन्सच्या अटींनुसार वितरित केला जातो, जो कोणत्याही माध्यमात वापर, वितरण आणि पुनरुत्पादनास परवानगी देतो, जोपर्यंत अंतिम वापर व्यावसायिक फायद्यासाठी नाही आणि मूळ काम अचूक आहे हे गृहीत धरले जाते. संदर्भ.
टीप: आम्ही तुम्हाला तुमचा ईमेल पत्ता देण्यास फक्त यासाठी सांगतो, जेणेकरून तुम्ही ज्या व्यक्तीची या पेजवर शिफारस कराल, त्या व्यक्तीला हे कळावे की तुम्ही त्यांना हा ईमेल दाखवू इच्छिता आणि तो स्पॅम नाही. आम्ही कोणताही ईमेल पत्ता नोंदवून घेणार नाही.
तुम्ही अभ्यागत आहात की नाही हे तपासण्यासाठी आणि स्वयंचलित स्पॅम सबमिशन रोखण्यासाठी या प्रश्नाचा वापर केला जातो.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson) (Brad H. Nelson) (Brad H. Nelson) डीबेरार्डिनिस), रसेल जी. जोन्स (रसेल जी. जोन्स), फिनीस टी. हॅमिल्टन (फिनीस टी.
एमएनए टी-पेशींची रोगप्रतिकारशक्ती दाबण्यास हातभार लावते आणि मानवी कर्करोगाच्या उपचारासाठी एक संभाव्य इम्युनोथेरपी लक्ष्य आहे.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson) (Brad H. Nelson) (Brad H. Nelson) डीबेरार्डिनिस), रसेल जी. जोन्स (रसेल जी. जोन्स), फिनीस टी. हॅमिल्टन (फिनीस टी.
एमएनए टी-पेशींची रोगप्रतिकारशक्ती दाबण्यास हातभार लावते आणि मानवी कर्करोगाच्या उपचारासाठी एक संभाव्य इम्युनोथेरपी लक्ष्य आहे.
©2021 अमेरिकन असोसिएशन फॉर द ॲडव्हान्समेंट ऑफ सायन्स. सर्व हक्क राखीव. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef आणि COUNTER चे भागीदार आहे. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.