इम्युनोमोड्युलेटरी मेटाबोलाइट्स हे ट्यूमर मायक्रोएनव्हायरमेंट (TME) चे एक प्रमुख वैशिष्ट्य आहे, परंतु काही अपवाद वगळता, त्यांची ओळख मोठ्या प्रमाणात अज्ञात आहे. येथे, आम्ही उच्च-दर्जाच्या सेरस कार्सिनोमा (HGSC) असलेल्या रुग्णांच्या ट्यूमर आणि जलोदरमधील ट्यूमर आणि टी पेशींचे विश्लेषण केले जेणेकरून या वेगवेगळ्या TME कंपार्टमेंट्सचे मेटाबोलोम उघड होईल. जलोदर आणि ट्यूमर पेशींमध्ये व्यापक मेटाबोलाइट फरक आहेत. जलोदरच्या तुलनेत, ट्यूमर-घुसखोरी करणाऱ्या टी पेशी 1-मिथाइलनिकोटीनामाइड (MNA) मध्ये लक्षणीयरीत्या समृद्ध होतात. T पेशींमध्ये MNA ची पातळी वाढली असली तरी, निकोटीनामाइड N-मिथाइलट्रान्सफेरेज (S-adenosylmethionine पासून निकोटीनामाइडमध्ये मिथाइल गटांचे हस्तांतरण उत्प्रेरित करणारा एंजाइम) ची अभिव्यक्ती फायब्रोब्लास्ट्स आणि ट्यूमर पेशींपुरती मर्यादित आहे. कार्यात्मकदृष्ट्या, MNA ट्यूमर-प्रोत्साहन करणारे सायटोकाइन ट्यूमर नेक्रोसिस फॅक्टर अल्फा स्राव करण्यासाठी T पेशींना प्रेरित करते. म्हणून, TME-व्युत्पन्न MNA T पेशींच्या रोगप्रतिकारक नियमनात योगदान देते आणि मानवी कर्करोगाच्या उपचारांसाठी संभाव्य इम्युनोथेरपी लक्ष्य दर्शवते.
ट्यूमर-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्सचा ट्यूमर-विरोधी रोगप्रतिकारक शक्तीवर खोलवर प्रतिबंधात्मक प्रभाव पडू शकतो आणि अधिकाधिक पुरावे दर्शवितात की ते रोगाच्या प्रगतीसाठी एक प्रमुख प्रेरक शक्ती म्हणून देखील काम करू शकतात (1). वॉरबर्ग परिणामाव्यतिरिक्त, अलिकडच्या काळात ट्यूमर पेशींच्या चयापचय स्थितीचे आणि ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरणाच्या (TME) रोगप्रतिकारक स्थितीशी असलेल्या त्यांच्या संबंधाचे वर्णन करण्यास सुरुवात झाली आहे. उंदीर मॉडेल्स आणि मानवी टी पेशींवरील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की ग्लूटामाइन चयापचय (2), ऑक्सिडेटिव्ह चयापचय (3) आणि ग्लुकोज चयापचय (4) विविध रोगप्रतिकारक पेशी उपसमूहांवर स्वतंत्रपणे कार्य करू शकतात. या मार्गांमधील अनेक मेटाबोलाइट्स टी पेशींच्या ट्यूमर-विरोधी कार्याला प्रतिबंधित करतात. हे सिद्ध झाले आहे की कोएन्झाइम टेट्राहायड्रोबायोप्टेरिन (BH4) च्या नाकाबंदीमुळे टी पेशींच्या प्रसाराला नुकसान होऊ शकते आणि शरीरात BH4 ची वाढ CD4 आणि CD8 द्वारे मध्यस्थी केलेल्या ट्यूमर-विरोधी रोगप्रतिकारक प्रतिसादाला वाढवू शकते. याव्यतिरिक्त, BH4 (5) च्या प्रशासनाद्वारे काइन्युरेनिनचा इम्युनोसप्रेसिव्ह प्रभाव वाचवता येतो. आयसोसाइट्रेट डिहायड्रोजनेज (IDH) म्युटंट ग्लिओब्लास्टोमामध्ये, एनॅन्टिओमेटाबॉलिक (R)-2-हायड्रॉक्सीग्लुटारेट (R-2-HG) चे स्राव टी पेशी सक्रियकरण, प्रसार आणि सायटोलिसिस क्रियाकलाप रोखते (6). अलीकडे, असे दिसून आले आहे की ग्लायकोलिसिसचे उप-उत्पादन, मिथाइलग्लायॉक्सल, मायलोइड उत्पत्तीच्या सप्रेसर पेशींद्वारे तयार केले जाते आणि मिथाइलग्लायॉक्सलचे टी पेशी हस्तांतरण इफेक्टर टी पेशी कार्य रोखू शकते. उपचारात, मिथाइलग्लायॉक्सलचे तटस्थीकरण मायलोइड-व्युत्पन्न सप्रेसर पेशी (MDSC) च्या क्रियाकलापांवर मात करू शकते आणि माऊस मॉडेल्समध्ये चेकपॉइंट ब्लॉकेड थेरपीला सहक्रियात्मकपणे वाढवू शकते (7). हे अभ्यास एकत्रितपणे टी पेशी कार्य आणि क्रियाकलाप नियंत्रित करण्यात TME-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्सच्या प्रमुख भूमिकेवर भर देतात.
गर्भाशयाच्या कर्करोगात टी पेशींचे बिघडलेले कार्य मोठ्या प्रमाणात नोंदवले गेले आहे (8). हे अंशतः हायपोक्सिया आणि असामान्य ट्यूमर व्हॅस्क्युलेचर (9) मध्ये अंतर्निहित चयापचय वैशिष्ट्यांमुळे आहे, ज्यामुळे ग्लुकोज आणि ट्रिप्टोफॅनचे लॅक्टिक अॅसिड आणि काइन्युरेनिन सारख्या उप-उत्पादनांमध्ये रूपांतर होते. जास्त बाह्य पेशीय लॅक्टेट इंटरफेरॉन-γ (IFN-γ) चे उत्पादन कमी करते आणि मायलोसप्रेसिव्ह उपसमूहांचे भेदभाव वाढवते (10, 11). ट्रिप्टोफॅनचे सेवन थेट टी पेशींच्या प्रसारास प्रतिबंध करते आणि टी पेशी रिसेप्टर सिग्नलिंगला प्रतिबंधित करते (12-14). या निरीक्षणांना न जुमानता, ऑप्टिमाइझ्ड मीडिया वापरून इन विट्रो टी पेशी संस्कृतीमध्ये रोगप्रतिकारक चयापचयाभोवती बरेच काम केले गेले, किंवा व्हिव्होमध्ये होमोलोगस माऊस मॉडेल्सपर्यंत मर्यादित होते, ज्यापैकी कोणतेही मानवी कर्करोग आणि शारीरिक मॅक्रो आणि सूक्ष्म वातावरणाची विषमता पूर्णपणे प्रतिबिंबित करत नाही.
गर्भाशयाच्या कर्करोगाचे एक सामान्य वैशिष्ट्य म्हणजे पेरिटोनियल प्रसार आणि जलोदर दिसणे. जलोदरमध्ये पेशी द्रव जमा होणे हे प्रगत रोग आणि खराब रोगनिदानाशी संबंधित आहे (15). अहवालांनुसार, हा अद्वितीय भाग हायपोक्सिक आहे, त्यात व्हॅस्क्युलर एंडोथेलियल ग्रोथ फॅक्टर (VEGF) आणि इंडोलेमाइन 2,3-डायऑक्सीजेनेज (IDO) चे उच्च स्तर आहेत आणि ते T नियामक पेशी आणि मायलॉइड इनहिबिटर पेशी (15-18) द्वारे घुसवले जाते. जलोदरचे चयापचय वातावरण ट्यूमरपेक्षा वेगळे असू शकते, म्हणून पेरिटोनियल जागेत टी पेशींचे पुनर्प्रोग्रामिंग अस्पष्ट आहे. याव्यतिरिक्त, ट्यूमर वातावरणात असलेल्या जलोदर आणि मेटाबोलाइट्समधील प्रमुख फरक आणि विषमता रोगप्रतिकारक पेशींच्या घुसखोरीला आणि ट्यूमरवरील त्यांच्या कार्याला अडथळा आणू शकते आणि पुढील संशोधन आवश्यक आहे.
या समस्या सोडवण्यासाठी, आम्ही वेगवेगळ्या पेशी प्रकारांचा (CD4 + आणि CD8 + T पेशींसह) तसेच ट्यूमरच्या आत आणि दरम्यान अभ्यास करण्यासाठी एक संवेदनशील पेशी पृथक्करण आणि द्रव क्रोमॅटोग्राफी टँडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS/MS) पद्धत तयार केली. त्याचे मेटाबोलाइट्स रुग्णाच्या समान जलोदर आणि ट्यूमर वातावरणात पेशींमध्ये पसरतात. या प्रमुख लोकसंख्येच्या चयापचय स्थितीचे अत्यंत निराकरण केलेले पोर्ट्रेट प्रदान करण्यासाठी आम्ही ही पद्धत उच्च-आयामी प्रवाह सायटोमेट्री आणि एकल-सेल आरएनए सिक्वेन्सिंग (scRNA-seq) सोबत वापरतो. या पद्धतीमुळे ट्यूमर टी पेशींमध्ये 1-मिथाइलनिकोटीनामाइड (MNA) च्या पातळीत लक्षणीय वाढ दिसून आली आणि इन विट्रो प्रयोगांवरून असे दिसून आले की T पेशींच्या कार्यावर MNA चा इम्युनोमोड्युलेटरी प्रभाव पूर्वी अज्ञात होता. सर्वसाधारणपणे, ही पद्धत ट्यूमर आणि रोगप्रतिकारक पेशींमधील परस्पर चयापचय परस्परसंवाद प्रकट करते आणि रोगप्रतिकारक नियमन मेटाबोलाइट्समध्ये अद्वितीय अंतर्दृष्टी प्रदान करते, जे T पेशी-आधारित डिम्बग्रंथि कर्करोग इम्युनोथेरपी उपचार संधींच्या उपचारांसाठी उपयुक्त ठरू शकते.
आम्ही एकाच वेळी ग्लुकोज अपटेकचे प्रमाण मोजण्यासाठी उच्च-आयामी प्रवाह सायटोमेट्री वापरली [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) आणि माइटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलाप [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) हे रोगप्रतिकारक पेशी आणि ट्यूमर पेशींच्या लोकसंख्येमध्ये फरक करणारे वैशिष्ट्यपूर्ण मार्कर आहेत (टेबल S2 आणि आकृती S1A). या विश्लेषणातून असे दिसून आले की T पेशींच्या तुलनेत, जलोदर आणि ट्यूमर पेशींमध्ये ग्लुकोज अपटेक पातळी जास्त असते, परंतु माइटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलापांमध्ये कमी फरक असतो. ट्यूमर पेशींचे सरासरी ग्लुकोज अपटेक [CD45-EpCAM (EpCAM)+] T पेशींपेक्षा तीन ते चार पट आहे आणि CD4 + T पेशींचे सरासरी ग्लुकोज अपटेक CD8 + T पेशींपेक्षा 1.2 पट आहे, जे दर्शवते की ट्यूमर घुसखोरी करणाऱ्या लिम्फोसाइट्स (TIL) च्या चयापचय आवश्यकता वेगवेगळ्या असतात (आकृती 1A). याउलट, ट्यूमर पेशींमधील माइटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलाप CD4 + T पेशींप्रमाणेच असतो आणि दोन्ही पेशी प्रकारांची माइटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलाप CD8 + T पेशींपेक्षा जास्त असते (आकृती 1B). सर्वसाधारणपणे, हे परिणाम चयापचय पातळी उघड करतात. ट्यूमर पेशींची चयापचय क्रिया CD4 + T पेशींपेक्षा जास्त असते आणि CD4 + T पेशींची चयापचय क्रिया CD8 + T पेशींपेक्षा जास्त असते. पेशी प्रकारांमध्ये हे परिणाम असूनही, ट्यूमरच्या तुलनेत CD4 + आणि CD8 + T पेशींच्या चयापचय स्थितीत किंवा जलोदरात त्यांच्या सापेक्ष प्रमाणात कोणताही सुसंगत फरक नाही (आकृती 1C). याउलट, CD45-पेशी अपूर्णांकात, ट्यूमरमधील EpCAM+ पेशींचे प्रमाण जलोदरच्या तुलनेत वाढले (आकृती 1D). आम्हाला EpCAM+ आणि EpCAM- पेशी घटकांमध्ये स्पष्ट चयापचय फरक देखील आढळला. EpCAM+ (ट्यूमर) पेशींमध्ये EpCAM- पेशींपेक्षा जास्त ग्लुकोज शोषण आणि मायटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलाप असतो, जो TME मधील ट्यूमर पेशींमधील फायब्रोब्लास्ट्सच्या चयापचय क्रियाकलापांपेक्षा खूप जास्त असतो (आकृती 1, E आणि F).
(A आणि B) ग्लुकोज अपटेकची मध्यवर्ती फ्लोरोसेन्स तीव्रता (MFI) (2-NBDG) (A) आणि CD4 + T पेशींची माइटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलाप (MitoTracker गडद लाल) (B) प्रतिनिधी आलेख (डावीकडे) आणि सारणीबद्ध डेटा (उजवीकडे), जलोदर आणि ट्यूमरमधून CD8 + T पेशी आणि EpCAM + CD45-ट्यूमर पेशी. (C) जलोदर आणि ट्यूमरमध्ये CD4 + आणि CD8 + पेशींचे (CD3 + T पेशींचे) प्रमाण. (D) जलोदर आणि ट्यूमरमध्ये EpCAM + ट्यूमर पेशींचे प्रमाण (CD45−). (E आणि F) EpCAM + CD45-ट्यूमर आणि EpCAM-CD45-मॅट्रिक्स ग्लुकोज अपटेक (2-NBDG) (E) आणि माइटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलाप (MitoTracker गडद लाल) (F) प्रतिनिधी आलेख (डावीकडे) आणि सारणीबद्ध डेटा (उजवीकडे) जलोदर आणि ट्यूमर पेशी. (G) प्रवाह सायटोमेट्रीद्वारे CD25, CD137 आणि PD1 अभिव्यक्तीचे प्रतिनिधी आलेख. (H आणि I) CD4 + T पेशी (H) आणि CD8 + T पेशी (I) वर CD25, CD137 आणि PD1 अभिव्यक्ती. (J आणि K) CCR7 आणि CD45RO च्या अभिव्यक्तीवर आधारित भोळे, मध्यवर्ती मेमरी (Tcm), इफेक्टर (Teff) आणि इफेक्टर मेमरी (Tem) फेनोटाइप. जलोदर आणि ट्यूमरमध्ये CD4 + T पेशी (J) आणि CD8 + T पेशी (K) च्या प्रतिनिधी प्रतिमा (डावीकडे) आणि सारणी डेटा (उजवीकडे). जोडलेल्या टी-चाचणीद्वारे निर्धारित केलेले P मूल्ये (*P<0.05, **P<0.01 आणि ***P<0.001). रेषा जुळलेल्या रुग्णांचे प्रतिनिधित्व करते (n = 6). FMO, फ्लोरोसेन्स वजा एक; MFI, मध्यवर्ती फ्लोरोसेन्स तीव्रता.
पुढील विश्लेषणातून उच्च निराकरण झालेल्या टी पेशींच्या फेनोटाइपिक स्थितीमधील इतर महत्त्वपूर्ण फरक दिसून आले. ट्यूमरमध्ये सक्रिय (आकृती 1, G ते I) आणि इफेक्टर मेमरी (आकृती 1, J आणि K) जलोदर (CD3 + T पेशींचे प्रमाण) पेक्षा जास्त वारंवार आढळतात. त्याचप्रमाणे, सक्रियकरण मार्कर (CD25 आणि CD137) आणि डिप्लेशन मार्कर [प्रोग्राम केलेले सेल डेथ प्रोटीन 1 (PD1)] च्या अभिव्यक्तीद्वारे फिनोटाइपचे विश्लेषण केल्याने असे दिसून आले की जरी या लोकसंख्येची चयापचय वैशिष्ट्ये भिन्न आहेत (आकृती S1, B ते E), परंतु साधा, इफेक्टर किंवा मेमरी सबसेट्स (आकृती S1, F ते I) मध्ये कोणतेही महत्त्वपूर्ण चयापचय फरक सातत्याने दिसून आले नाहीत. सेल फेनोटाइप (21) स्वयंचलितपणे नियुक्त करण्यासाठी मशीन लर्निंग पद्धती वापरून या निकालांची पुष्टी करण्यात आली, ज्यामुळे रुग्णाच्या जलोदर (आकृती S2A) मध्ये मोठ्या संख्येने अस्थिमज्जा पेशी (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ची उपस्थिती दिसून आली. सर्व ओळखल्या गेलेल्या पेशी प्रकारांमध्ये, या मायलॉइड पेशींच्या संख्येने सर्वाधिक ग्लुकोज शोषण आणि माइटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलाप दर्शविला (आकृती S2, B ते G). हे निकाल HGSC रुग्णांमध्ये जलोदर आणि ट्यूमरमध्ये आढळणाऱ्या बहु पेशी प्रकारांमधील मजबूत चयापचय फरक अधोरेखित करतात.
TIL ची मेटाबोनॉमिक वैशिष्ट्ये समजून घेण्यातील मुख्य आव्हान म्हणजे ट्यूमरमधून पुरेशी शुद्धता, गुणवत्ता आणि प्रमाण असलेले T पेशी नमुने वेगळे करणे. अलीकडील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की फ्लो सायटोमेट्रीवर आधारित सॉर्टिंग आणि मणी समृद्धी पद्धती सेल्युलर मेटाबोलाइट प्रोफाइलमध्ये बदल घडवू शकतात (22-24). या समस्येवर मात करण्यासाठी, आम्ही LC-MS/MS द्वारे विश्लेषण करण्यापूर्वी शस्त्रक्रियेने पुनर्संचयित केलेल्या मानवी डिम्बग्रंथि कर्करोगापासून TIL वेगळे करण्यासाठी आणि वेगळे करण्यासाठी मणी समृद्धी पद्धत ऑप्टिमाइझ केली (सामग्री आणि पद्धती पहा; आकृती 2A). मेटाबोलाइट बदलांवर या प्रोटोकॉलचा एकूण प्रभाव मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही वरील मणी वेगळे करण्याच्या चरणानंतर निरोगी दात्यांनी सक्रिय केलेल्या T पेशींच्या मेटाबोलाइट प्रोफाइलची तुलना अशा पेशींशी केली ज्या मणी वेगळे केल्या नव्हत्या परंतु बर्फावर राहिल्या. या गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषणात असे आढळून आले की या दोन परिस्थितींमध्ये उच्च सहसंबंध आहे (r = 0.77), आणि 86 मेटाबोलाइट्सच्या गटाची तांत्रिक पुनरावृत्तीक्षमता उच्च पुनरावृत्तीक्षमता आहे (आकृती 2B). म्हणून, या पद्धती पेशी प्रकार संवर्धनाच्या प्रक्रियेतून जात असलेल्या पेशींमध्ये अचूक मेटाबोलाइट विश्लेषण करू शकतात, अशा प्रकारे HGSC मध्ये विशिष्ट मेटाबोलाइट्स ओळखण्यासाठी पहिले उच्च-रिझोल्यूशन प्लॅटफॉर्म प्रदान करतात, ज्यामुळे लोकांना पेशी विशिष्टतेची सखोल समज मिळते. लैंगिक चयापचय कार्यक्रम.
(अ) चुंबकीय मणी संवर्धनाचे योजनाबद्ध आकृती. LC-MS/MS द्वारे विश्लेषण करण्यापूर्वी, पेशी चुंबकीय मणी संवर्धनाच्या सलग तीन फेऱ्या करतील किंवा बर्फावर राहतील. (ब) चयापचयांच्या विपुलतेवर समृद्धी प्रकाराचा परिणाम. प्रत्येक समृद्धी प्रकारासाठी सरासरी तीन मोजमापे ± SE. राखाडी रेषा 1:1 संबंध दर्शवते. अक्ष लेबलमध्ये दर्शविलेल्या पुनरावृत्ती मोजमापांचा इंट्रा-क्लास सहसंबंध (ICC). NAD, निकोटीनामाइड एडेनाइन डायन्यूक्लियोटाइड. (क) रुग्ण मेटाबोलाइट विश्लेषणाच्या कार्यप्रवाहाचा योजनाबद्ध आकृती. रुग्णांकडून जलोदर किंवा ट्यूमर गोळा केले जातात आणि क्रायोप्रीझर्व केले जातात. प्रत्येक नमुन्याचा एक छोटासा भाग फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे विश्लेषण केला गेला, तर उर्वरित नमुन्यांचे CD4+, CD8+ आणि CD45- पेशींसाठी संवर्धनाच्या तीन फेऱ्या केल्या गेल्या. या पेशी अंशांचे विश्लेषण LC-MS/MS वापरून केले गेले. (ड) प्रमाणित मेटाबोलाइट विपुलतेचा उष्णता नकाशा. डेंड्रोग्राम नमुन्यांमधील युक्लिडियन अंतरांच्या वॉर्डच्या क्लस्टरिंगचे प्रतिनिधित्व करतो. (ई) नमुना मेटाबोलाइट नकाशाचे प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए), प्रत्येक नमुन्याच्या तीन प्रतिकृती दर्शविते, त्याच रुग्णाचे नमुने एका रेषेने जोडलेले आहेत. (एफ) रुग्णावर कंडिशन केलेल्या नमुन्याच्या मेटाबोलाइट प्रोफाइलचा पीसीए (म्हणजेच, आंशिक रिडंडन्सी वापरून); नमुना प्रकार बहिर्गोल हल द्वारे मर्यादित आहे. PC1, मुख्य घटक 1; PC2, मुख्य घटक 2.
पुढे, आम्ही सहा HGSC रुग्णांच्या प्राथमिक जलोदर आणि ट्यूमरमधील CD4 +, CD8 + आणि CD45-पेशी अंशांमधील 99 मेटाबोलाइट्सचे विश्लेषण करण्यासाठी ही समृद्धी पद्धत लागू केली (आकृती 2C, आकृती S3A आणि टेबल S3 आणि S4). मूळ मोठ्या जिवंत पेशींच्या नमुन्याच्या 2% ते 70% पर्यंत स्वारस्याची लोकसंख्या असते आणि रुग्णांमध्ये पेशींचे प्रमाण मोठ्या प्रमाणात बदलते. मणी वेगळे केल्यानंतर, स्वारस्याचा समृद्ध अंश (CD4+, CD8+ किंवा CD45-) सरासरी नमुन्यातील सर्व जिवंत पेशींच्या 85% पेक्षा जास्त असतो. ही समृद्धी पद्धत आम्हाला मानवी ट्यूमर टिश्यू मेटाबोलिझममधून पेशींच्या लोकसंख्येचे विश्लेषण करण्यास अनुमती देते, जे मोठ्या नमुन्यांमधून करणे अशक्य आहे. या प्रोटोकॉलचा वापर करून, आम्ही निर्धारित केले की l-कायन्युरेनिन आणि एडेनोसिन, हे दोन चांगले वैशिष्ट्यीकृत इम्युनोसप्रेसिव्ह मेटाबोलाइट्स ट्यूमर टी पेशी किंवा ट्यूमर पेशींमध्ये वाढले होते (आकृती S3, B आणि C). म्हणूनच, हे निकाल रुग्णाच्या ऊतींमध्ये जैविकदृष्ट्या महत्त्वाचे चयापचय शोधण्यासाठी आपल्या पेशी पृथक्करण आणि वस्तुमान स्पेक्ट्रोमेट्री तंत्रज्ञानाची निष्ठा आणि क्षमता दर्शवितात.
आमच्या विश्लेषणातून रुग्णांमध्ये आणि रुग्णांमधील पेशी प्रकारांचे मजबूत चयापचय पृथक्करण देखील दिसून आले (आकृती 2D आणि आकृती S4A). विशेषतः, इतर रुग्णांच्या तुलनेत, रुग्ण 70 ने वेगवेगळी चयापचय वैशिष्ट्ये दर्शविली (आकृती 2E आणि आकृती S4B), जे दर्शविते की रुग्णांमध्ये लक्षणीय चयापचय विषमता असू शकते. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की इतर रुग्णांच्या तुलनेत (1.2 ते 2 लिटर; टेबल S1), रुग्ण 70 मध्ये गोळा केलेल्या जलोदरचे एकूण प्रमाण (80 मिली) कमी होते. मुख्य घटक विश्लेषणादरम्यान (उदाहरणार्थ, आंशिक रिडंडन्सी विश्लेषण वापरून) आंतर-रुग्ण विषमतेचे नियंत्रण पेशी प्रकारांमधील सुसंगत बदल दर्शविते आणि पेशी प्रकार आणि/किंवा सूक्ष्म पर्यावरण मेटाबोलाइट प्रोफाइलनुसार स्पष्टपणे एकत्रित केले जातात (आकृती 2F). एकल चयापचयांच्या विश्लेषणाने या परिणामांवर जोर दिला आणि पेशी प्रकार आणि सूक्ष्म पर्यावरणातील महत्त्वपूर्ण फरक उघड केले. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की सर्वात जास्त फरक MNA मध्ये दिसून येतो, जो सामान्यतः CD45- पेशींमध्ये आणि ट्यूमरमध्ये घुसखोरी करणाऱ्या CD4+ आणि CD8+ पेशींमध्ये समृद्ध असतो (आकृती 3A). CD4 + पेशींसाठी, हा परिणाम सर्वात स्पष्ट आहे आणि CD8 + पेशींमधील MNA देखील वातावरणामुळे जोरदार प्रभावित होताना दिसते. तथापि, हे महत्त्वाचे नाही, कारण ट्यूमर CD8+ स्कोअरसाठी सहा रुग्णांपैकी फक्त तीन रुग्णांचे मूल्यांकन केले जाऊ शकते. MNA व्यतिरिक्त, जलोदर आणि ट्यूमरमधील वेगवेगळ्या प्रकारच्या पेशींमध्ये, TIL मध्ये खराब वैशिष्ट्यीकृत असलेले इतर मेटाबोलाइट्स देखील भिन्न प्रमाणात समृद्ध असतात (आकृती S3 आणि S4). म्हणून, हे डेटा पुढील संशोधनासाठी इम्युनोमोड्युलेटरी मेटाबोलाइट्सचा एक आशादायक संच उघड करतात.
(अ) जलोदर आणि ट्यूमरमधील CD4+, CD8+ आणि CD45- पेशींमध्ये MNA चे सामान्यीकृत प्रमाण. बॉक्स प्लॉट मध्यक (रेषा), इंटरक्वार्टाइल रेंज (फ्रेम हिंग) आणि डेटा रेंज दर्शवितो, इंटरक्वार्टाइल रेंज (फ्रेम व्हिस्कर) च्या 1.5 पट पर्यंत. पेशंट मटेरियल्स अँड मेथड्समध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, P मूल्य (*P<0.05 आणि **P<0.01) निश्चित करण्यासाठी रुग्णाच्या लिमा मूल्याचा वापर करा. (ब) MNA चयापचय (60) चे योजनाबद्ध आकृती. चयापचय: ​​S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, निकोटीनामाइड; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, निकोटीनामाइड रायबोज; NMN, निकोटीनामाइड मोनोन्यूक्लियोटाइड. एन्झाईम्स (हिरवे): NNMT, निकोटीनामाइड N-मिथाइलट्रान्सफेरेज; SIRT, sirtuins; NAMPT, निकोटीनामाइड फॉस्फोरिबोसिल ट्रान्सफेरेज; AOX1, अल्डीहाइड ऑक्सिडेस 1; NRK, निकोटीनामाइड रायबोसाइड काइनेज; NMNAT, निकोटीनामाइड मोनो न्यूक्लियोटाइड अॅडेनिलेट ट्रान्सफेरेज; Pnp1, प्युरिन न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरिलेज. (C) जलोदर (राखाडी) आणि ट्यूमर (लाल; n = 3 रुग्ण) च्या scRNA-seq चे t-SNE. (D) scRNA-seq वापरून ओळखल्या जाणाऱ्या वेगवेगळ्या पेशी लोकसंख्येमध्ये NNMT अभिव्यक्ती. (E) SK-OV-3, मानवी भ्रूण मूत्रपिंड (HEK) 293T, T पेशी आणि MNA-उपचारित T पेशींमध्ये NNMT आणि AOX1 चे अभिव्यक्ती. SK-OV-3 च्या सापेक्ष दुमडलेला अभिव्यक्ती दर्शविला आहे. SEM सह अभिव्यक्ती नमुना दर्शविला आहे (n = 6 निरोगी दाते). ३५ पेक्षा जास्त Ct मूल्ये शोधता येत नाहीत (UD). (F) SK-OV-3, HEK293T, T पेशी आणि ८mM MNA सह उपचारित T पेशींमध्ये SLC22A1 आणि SLC22A2 ची अभिव्यक्ती. SK-OV-3 च्या सापेक्ष दुमडलेली अभिव्यक्ती दर्शविली आहे. SEM सह अभिव्यक्ती नमुना दर्शविला आहे (n = ६ निरोगी दात्या). ३५ पेक्षा जास्त Ct मूल्ये शोधता येत नाहीत (UD) मानली जातात. (G) MNA सह ७२ तासांच्या उष्मायनानंतर सक्रिय निरोगी दात्याच्या T पेशींमध्ये पेशी MNA सामग्री. SEM सह अभिव्यक्ती नमुना दर्शविला आहे (n = ४ निरोगी दात्या).
निकोटीनामाइड एन-मिथाइलट्रान्सफेरेज (NNMT; आकृती 3B) द्वारे S-adenosyl-1-methionine (SAM) पासून निकोटीनामाइड (NA) मध्ये मिथाइल गटाचे हस्तांतरण करून MNA तयार केले जाते. NNMT विविध मानवी कर्करोगांमध्ये जास्त प्रमाणात व्यक्त होते आणि ते प्रसार, आक्रमण आणि मेटास्टेसिसशी संबंधित आहे (25-27). TME मधील T पेशींमध्ये MNA चा स्रोत चांगल्या प्रकारे समजून घेण्यासाठी, आम्ही तीन HGSC रुग्णांच्या जलोदर आणि ट्यूमरमधील पेशी प्रकारांमध्ये NNMT च्या अभिव्यक्तीचे वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी scRNA-seq वापरले (सारणी S5). अंदाजे 6,500 पेशींच्या विश्लेषणातून असे दिसून आले की जलोदर आणि ट्यूमर वातावरणात, NNMT अभिव्यक्ती गृहीत धरलेल्या फायब्रोब्लास्ट आणि ट्यूमर पेशींच्या लोकसंख्येपुरती मर्यादित होती (आकृती 3, C आणि D). हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की PTPRC (CD45 +) (आकृती 3D आणि आकृती S5A) व्यक्त करणाऱ्या कोणत्याही लोकसंख्येमध्ये स्पष्ट NNMT अभिव्यक्ती नाही, जी दर्शवते की मेटाबोलाइट स्पेक्ट्रममध्ये आढळलेला MNA T पेशींमध्ये प्रवेश केला गेला आहे. अल्डीहाइड ऑक्सिडेस 1 (AOX1) ची अभिव्यक्ती MNA ला 1-मिथाइल-2-पायरीडोन-5-कार्बोक्सामाइड (2-PYR) किंवा 1-मिथाइल-4-पायरीडोन-5-कार्बोक्सामाइड (4- PYR) मध्ये रूपांतरित करते; आकृती 3B) देखील COL1A1 (आकृती S5A) व्यक्त करणाऱ्या फायब्रोब्लास्ट्सच्या लोकसंख्येपुरती मर्यादित आहे, जे एकत्रितपणे सूचित करतात की T पेशींमध्ये पारंपारिक MNA चयापचय क्षमता नसते. HGSC रुग्णांच्या जलोदरातून दुसऱ्या स्वतंत्र पेशी डेटा सेटचा वापर करून या MNA-संबंधित जनुकांच्या अभिव्यक्ती पॅटर्नची पडताळणी करण्यात आली (आकृती S5B; n = 6) (16). याव्यतिरिक्त, MNA ने उपचार केलेल्या निरोगी दात्याच्या T पेशींच्या क्वांटिटेटिव्ह पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन (qPCR) विश्लेषणातून असे दिसून आले की नियंत्रण SK-OV-3 डिम्बग्रंथि ट्यूमर पेशींच्या तुलनेत, NNMT किंवा AOX1 जवळजवळ व्यक्त झाले नाही (आकृती 3E). हे अनपेक्षित परिणाम सूचित करतात की MNA फायब्रोब्लास्ट्स किंवा ट्यूमरमधून TME मधील जवळच्या T पेशींमध्ये स्रावित होऊ शकते.
जरी उमेदवारांमध्ये विद्राव्य वाहक 22 (SLC22) कुटुंब (SLC22A1, SLC22A2 आणि SLC22A3) द्वारे एन्कोड केलेल्या सेंद्रिय केशन ट्रान्सपोर्टर्स 1 ते 3 (OCT1, OCT2 आणि OCT3) च्या कुटुंबाचा समावेश असला तरी, MNA चे संभाव्य ट्रान्सपोर्टर्स अद्याप अपरिभाषित आहेत (28). निरोगी दाता T पेशींमधून mRNA च्या QPCR ने SLC22A1 चे कमी अभिव्यक्ती स्तर दर्शविले परंतु SLC22A2 चे अदृश्य स्तर दर्शविले, ज्यामुळे पुष्टी झाली की ते पूर्वी साहित्यात नोंदवले गेले होते (आकृती 3F) (29). याउलट, SK-OV-3 डिम्बग्रंथि ट्यूमर सेल लाइनने दोन्ही ट्रान्सपोर्टर्सचे उच्च स्तर व्यक्त केले (आकृती 3F).
टी पेशींमध्ये परदेशी एमएनए शोषण्याची क्षमता आहे की नाही याची चाचणी घेण्यासाठी, निरोगी दात्या टी पेशींचे एमएनएच्या वेगवेगळ्या सांद्रतेच्या उपस्थितीत ७२ तासांसाठी संवर्धन करण्यात आले. बाह्य एमएनए नसताना, एमएनएची पेशीय सामग्री शोधता येत नाही (आकृती ३G). तथापि, बाह्य एमएनएने उपचार केलेल्या सक्रिय टी पेशींमध्ये पेशींमध्ये एमएनए सामग्रीमध्ये डोस-आश्रित वाढ दिसून आली, ६ एमएम एमएनए पर्यंत (आकृती ३G). हा निकाल दर्शवितो की ट्रान्सपोर्टर अभिव्यक्तीची कमी पातळी आणि इंट्रासेल्युलर एमएनए चयापचयसाठी जबाबदार असलेल्या मुख्य एंजाइमची कमतरता असूनही, टीआयएल अजूनही एमएनए घेऊ शकते.
रुग्णांच्या टी पेशी आणि इन विट्रो एमएनए शोषण प्रयोगांमधील मेटाबोलाइट्सचे स्पेक्ट्रम कर्करोगाशी संबंधित फायब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) एमएनए स्रावित करण्याची शक्यता वाढवते आणि ट्यूमर पेशी टीआयएलच्या फेनोटाइप आणि कार्याचे नियमन करू शकतात. टी पेशींवर एमएनएचा प्रभाव निश्चित करण्यासाठी, निरोगी दाता टी पेशी एमएनएच्या उपस्थितीत किंवा अनुपस्थितीत इन विट्रो सक्रिय केल्या गेल्या आणि त्यांच्या प्रसार आणि सायटोकाइन उत्पादनाचे मूल्यांकन केले गेले. सर्वाधिक डोसमध्ये एमएनए जोडल्यानंतर 7 दिवसांनी, लोकसंख्या दुप्पट होण्याची संख्या माफक प्रमाणात कमी झाली, तर सर्व डोसमध्ये जोम राखला गेला (आकृती 4A). याव्यतिरिक्त, बाह्य एमएनएच्या उपचारांमुळे ट्यूमर नेक्रोसिस फॅक्टर-α व्यक्त करणाऱ्या CD4 + आणि CD8 + T पेशींच्या प्रमाणात वाढ झाली (TNFα; आकृती 4B). याउलट, CD4 + T पेशींमध्ये IFN-γ चे इंट्रासेल्युलर उत्पादन लक्षणीयरीत्या कमी झाले, परंतु CD8 + T पेशींमध्ये नाही आणि इंटरल्यूकिन 2 मध्ये कोणताही महत्त्वपूर्ण बदल झाला नाही (IL-2; आकृती 4, C आणि D). म्हणून, या MNA-उपचारित T पेशी संस्कृतींमधील सुपरनॅटंट्सच्या एन्झाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉर्बेंट परख (ELISA) मध्ये TNFα मध्ये लक्षणीय वाढ, IFN-γ मध्ये घट आणि IL-2 मध्ये कोणताही बदल दिसून आला नाही (आकृती 4, E ते G). . IFN-γ ची घट दर्शवते की MNA T पेशींच्या ट्यूमर-विरोधी क्रियाकलापांना प्रतिबंधित करण्यात भूमिका बजावू शकते. T पेशी-मध्यस्थ सायटोटॉक्सिसिटीवर MNA चा प्रभाव अनुकरण करण्यासाठी, हिरव्या फ्लोरोसेंट प्रथिने (GFP) -CAR-T) पेशींद्वारे नियंत्रित फोलेट रिसेप्टर α आणि CAR-T (GFP) ला लक्ष्य करणारे काइमेरिक अँटीजेन रिसेप्टर T (FRα-CAR-T) पेशी निरोगी दात्याच्या परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर पेशी (PBMC) द्वारे तयार केल्या जातात. CAR-T पेशी MNA च्या उपस्थितीत 24 तासांसाठी संवर्धित केल्या गेल्या आणि नंतर 10:1 च्या इफेक्टर ते लक्ष्य गुणोत्तरावर फोलेट रिसेप्टर α व्यक्त करणाऱ्या मानवी SK-OV-3 डिम्बग्रंथि ट्यूमर पेशींसह सह-संवर्धित केल्या गेल्या. MNA उपचारांमुळे FRα-CAR-T पेशींच्या मारण्याच्या क्रियाकलापात लक्षणीय घट झाली, जी एडेनोसिनने उपचार केलेल्या FRα-CAR-T पेशींसारखीच होती (आकृती 4H).
(अ) दिवस ७ वर कल्चरमधून थेट एकूण व्यवहार्य पेशींची संख्या आणि लोकसंख्या दुप्पट होणे (PD). बार आलेख सहा निरोगी दात्यांच्या सरासरी + SEM दर्शवितो. किमान n = ३ स्वतंत्र प्रयोगांमधील डेटा दर्शवितो. (B ते D) CD3/CD28 आणि IL-2 चा वापर ७ दिवसांसाठी त्यांच्या संबंधित MNA सांद्रतेवर T पेशी सक्रिय करण्यासाठी केला गेला. विश्लेषणापूर्वी, पेशींना PMA/ionomycin सह GolgiStop सह ४ तासांसाठी उत्तेजित केले गेले. T पेशींमध्ये TNFα (B) अभिव्यक्ती. जिवंत पेशींमध्ये TNFα अभिव्यक्तीची उदाहरण प्रतिमा (डावीकडे) आणि सारणी डेटा (उजवीकडे). T पेशींमध्ये IFN-γ (C) आणि IL-2 (D) अभिव्यक्ती. सायटोकिन्सची अभिव्यक्ती फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे मोजली गेली. बार आलेख सरासरी (n = ६ निरोगी दात्यांच्या) + SEM दर्शवितो. P मूल्य निश्चित करण्यासाठी भिन्नतेचे एकतर्फी विश्लेषण आणि पुनरावृत्ती केलेले माप (*P<0.05 आणि **P<0.01) वापरा. ​​किमान n = ३ स्वतंत्र प्रयोगांमधील डेटा दर्शवितो. (E ते G) CD3/CD28 आणि IL-2 चा वापर 7 दिवसांसाठी त्यांच्या संबंधित MNA सांद्रतेवर T पेशी सक्रिय करण्यासाठी करण्यात आला. PMA/ionomycin उत्तेजनाच्या 4 तास आधी आणि नंतर माध्यम गोळा केले गेले. TNFα (E), IFN-γ (F) आणि IL-2 (G) ची सांद्रता ELISA द्वारे मोजली गेली. बार आलेख सरासरी (n = 5 निरोगी दाते) + SEM दर्शवितो. भिन्नतेचे एकतर्फी विश्लेषण आणि पुनरावृत्ती मोजमाप वापरून P मूल्य निश्चित केले जाते (*P<0.05). ठिपकेदार रेषा शोधण्याची शोध मर्यादा दर्शवते. (H) सेल लिसिस परख. FRα-CAR-T किंवा GFP-CAR-T पेशींना 24 तासांसाठी एडेनोसिन (250μM) किंवा MNA (10 mM) सह समायोजित केले गेले, किंवा उपचार न करता सोडले गेले (Ctrl). SK-OV-3 पेशींच्या किलिंगची टक्केवारी मोजली गेली. P मूल्य वेल्च टी चाचणी (*P<0.5 आणि **P<0.01) द्वारे निश्चित केले गेले.
MNA-आश्रित TNFα अभिव्यक्ती नियमनाची यांत्रिक समज मिळविण्यासाठी, MNA-उपचारित T पेशींच्या TNFα mRNA मधील बदलांचे मूल्यांकन करण्यात आले (आकृती 5A). MNA ने उपचार केलेल्या निरोगी दात्या T पेशींनी TNFα ट्रान्सक्रिप्शन पातळीत दुप्पट वाढ दर्शविली, जे दर्शवते की MNA TNFα ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनावर अवलंबून आहे. या संभाव्य नियामक यंत्रणेची तपासणी करण्यासाठी, TNFα चे नियमन करणारे दोन ज्ञात ट्रान्सक्रिप्शन घटक, म्हणजे सक्रिय T सेल न्यूक्लियर फॅक्टर (NFAT) आणि विशिष्ट प्रथिने 1 (Sp1), प्रॉक्सिमल TNFα प्रमोटरशी MNA बंधनाच्या प्रतिसादात मूल्यांकन केले गेले (30). TNFα प्रमोटरमध्ये 6 ओळखल्या जाणाऱ्या NFAT बंधन साइट्स आणि 2 Sp1 बंधन साइट्स आहेत, एका साइटवर ओव्हरलॅप होत आहेत [-55 बेस पेअर्स (bp) from 5'cap] (30). क्रोमॅटिन इम्युनोप्रिसिपिटेशन (ChIP) ने दर्शविले की MNA सह उपचार केल्यावर, TNFα प्रमोटरशी Sp1 चे बंधन तीन पटीने वाढले. NFAT चा समावेश देखील वाढला आणि महत्त्वाच्या जवळ आला (आकृती 5B). या डेटावरून असे दिसून येते की MNA Sp1 ट्रान्सक्रिप्शनद्वारे TNFα च्या अभिव्यक्तीचे नियमन करते आणि काही प्रमाणात NFAT च्या अभिव्यक्तीचे नियमन करते.
(अ) MNA शिवाय संवर्धित केलेल्या T पेशींच्या तुलनेत, MNA ने उपचार केलेल्या T पेशींमध्ये TNFα अभिव्यक्तीचा पट बदल. SEM सह अभिव्यक्तीचा नमुना दर्शविला आहे (n = 5 निरोगी दाते). किमान n = 3 स्वतंत्र प्रयोगांमधून डेटा दर्शवितो. (ब) NFAT आणि Sp1 नंतर 8 mM MNA सह किंवा त्याशिवाय उपचार केलेल्या T पेशींच्या TNFα प्रवर्तकांना (Ctrl) आणि PMA/ionomycin उत्तेजनासह 4 तासांसाठी एकत्रित केले गेले. इम्युनोग्लोबुलिन G (IgG) आणि H3 अनुक्रमे इम्युनोप्रिसिपिटेशनसाठी नकारात्मक आणि सकारात्मक नियंत्रणे म्हणून वापरले गेले. ChIP च्या परिमाणीकरणातून असे दिसून आले की MNA-उपचारित पेशींमध्ये TNFα प्रवर्तकाशी Sp1 आणि NFAT चे बंधन नियंत्रणाच्या तुलनेत अनेक पटीने वाढले आहे. किमान n = 3 स्वतंत्र प्रयोगांमधून डेटा दर्शवितो. अनेक t-चाचण्यांद्वारे निर्धारित P मूल्य (*** P <0.01). (क) HGSC च्या जलोदरांच्या तुलनेत, T पेशी (नॉन-साइटोटॉक्सिक) ने ट्यूमरमध्ये TNF ची वाढलेली अभिव्यक्ती दर्शविली. रंग वेगवेगळ्या रुग्णांचे प्रतिनिधित्व करतात. प्रदर्शित पेशींचे यादृच्छिकपणे 300 पर्यंत नमुने घेतले गेले आहेत आणि ओव्हरड्रॉइंग मर्यादित करण्यासाठी हलवले गेले आहेत (** पॅडज = 0.0076). (D) गर्भाशयाच्या कर्करोगासाठी MNA चे प्रस्तावित मॉडेल. MNA हे TME मधील ट्यूमर पेशी आणि फायब्रोब्लास्टमध्ये तयार होते आणि T पेशींद्वारे ते शोषले जाते. MNA Sp1 चे TNFα प्रमोटरशी बंधन वाढवते, ज्यामुळे TNFα ट्रान्सक्रिप्शन आणि TNFα सायटोकाइन उत्पादन वाढते. MNA IFN-γ मध्ये देखील घट घडवते. T पेशींच्या कार्याच्या प्रतिबंधामुळे मारण्याची क्षमता कमी होते आणि ट्यूमरची वाढ वेगवान होते.
अहवालांनुसार, TNFα चे पुढील आणि मागील बाजूवर अवलंबून अँटी-ट्यूमर आणि अँटी-ट्यूमर प्रभाव आहेत, परंतु डिम्बग्रंथि कर्करोगाच्या वाढीस आणि मेटास्टेसिसला चालना देण्यात त्याची एक सुप्रसिद्ध भूमिका आहे (31-33). अहवालांनुसार, डिम्बग्रंथि कर्करोग असलेल्या रुग्णांमध्ये जलोदर आणि ट्यूमर ऊतींमध्ये TNFα चे प्रमाण सौम्य ऊतींपेक्षा जास्त असते (34-36). यंत्रणेच्या बाबतीत, TNFα पांढऱ्या रक्त पेशींचे सक्रियकरण, कार्य आणि प्रसार नियंत्रित करू शकते आणि कर्करोगाच्या पेशींचा फेनोटाइप बदलू शकते (37, 38). या निष्कर्षांशी सुसंगत, विभेदक जीन अभिव्यक्ती विश्लेषणातून असे दिसून आले की जलोदरच्या तुलनेत ट्यूमर ऊतींमधील T पेशींमध्ये TNF लक्षणीयरीत्या वाढले होते (आकृती 5C). TNF अभिव्यक्तीतील वाढ केवळ नॉन-सायटोटॉक्सिक फेनोटाइप असलेल्या T पेशींच्या लोकसंख्येत स्पष्ट होती (आकृती S5A). थोडक्यात, हे डेटा HGSC मध्ये MNA चे दुहेरी इम्युनोसप्रेसिव्ह आणि ट्यूमर प्रोत्साहित करणारे प्रभाव आहेत या दृष्टिकोनाचे समर्थन करतात.
फ्लो सायटोमेट्रीवर आधारित फ्लोरोसेंट लेबलिंग ही TIL चयापचय अभ्यासण्यासाठी मुख्य पद्धत बनली आहे. या अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की दुय्यम लिम्फॉइड अवयवांमधील परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स किंवा टी पेशींच्या तुलनेत, म्युरिन आणि मानवी TIL मध्ये ग्लुकोज शोषण्याची प्रवृत्ती जास्त असते (4, 39) आणि मायटोकॉन्ड्रियल फंक्शन हळूहळू कमी होते (19, 40). जरी आपण या अभ्यासात समान परिणाम पाहिले असले तरी, मुख्य विकास म्हणजे ट्यूमर पेशींच्या चयापचय आणि त्याच रिसेक्ट केलेल्या ट्यूमर टिश्यूमधून TIL ची तुलना करणे. या मागील काही अहवालांशी सुसंगत, जलोदर आणि ट्यूमरमधील ट्यूमर (CD45-EpCAM +) पेशींमध्ये CD8 + आणि CD4 + T पेशींपेक्षा जास्त ग्लुकोज शोषण असते, ज्यामुळे ट्यूमर पेशींच्या उच्च ग्लुकोज शोषणाची तुलना T पेशींशी करता येते हे समर्थन करते. T पेशींच्या स्पर्धेची संकल्पना. TME. तथापि, ट्यूमर पेशींची मायटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलाप CD8 + T पेशींपेक्षा जास्त आहे, परंतु मायटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलाप CD4 + T पेशींसारखीच आहे. हे परिणाम ट्यूमर पेशींसाठी ऑक्सिडेटिव्ह चयापचय महत्वाचे आहे या उदयोन्मुख थीमला बळकटी देतात (41, 42). ते असेही सुचवतात की CD8 + T पेशी CD4 + T पेशींपेक्षा ऑक्सिडेटिव्ह डिसफंक्शनसाठी अधिक संवेदनशील असू शकतात किंवा CD4 + T पेशी माइटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलाप राखण्यासाठी ग्लुकोज व्यतिरिक्त कार्बन स्रोत वापरू शकतात (43, 44). हे लक्षात घेतले पाहिजे की आम्हाला CD4 + T प्रभावक, T प्रभावक मेमरी आणि जलोदरातील T मध्यवर्ती मेमरी पेशींमधील ग्लुकोज अपटेक किंवा माइटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलापांमध्ये कोणताही फरक आढळला नाही. त्याचप्रमाणे, ट्यूमरमधील CD8 + T पेशींच्या भिन्नतेच्या स्थितीचा ग्लुकोज अपटेकमधील बदलांशी काहीही संबंध नाही, जो इन विट्रोमध्ये कल्चर्ड टी पेशी आणि इन विवोमध्ये मानवी TIL मधील महत्त्वपूर्ण फरक अधोरेखित करतो (22). या निरीक्षणांची पुष्टी निष्पक्ष स्वयंचलित पेशी लोकसंख्या वाटपाच्या वापराद्वारे देखील करण्यात आली, ज्याने पुढे असे दिसून आले की ट्यूमर पेशींपेक्षा जास्त ग्लुकोज अपटेक आणि माइटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलाप असलेल्या CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + पेशी प्रचलित आहेत परंतु त्यांच्यात मेटाबॉलिक सक्रिय पेशी लोकसंख्या आहे. ही लोकसंख्या scRNA-seq विश्लेषणात ओळखल्या जाणाऱ्या मायलॉइड सप्रेसर पेशी किंवा प्लाझ्मासाइटॉइड डेंड्रिटिक पेशींच्या पोटेटिव्ह उप-लोकसंख्या दर्शवू शकते. जरी हे दोन्ही मानवी डिम्बग्रंथि ट्यूमरमध्ये नोंदवले गेले आहेत [45], तरीही त्यांना या मायलॉइड उप-लोकसंख्येचे वर्णन करण्यासाठी पुढील काम आवश्यक आहे.
जरी फ्लो सायटोमेट्री-आधारित पद्धती पेशी प्रकारांमधील ग्लुकोज आणि ऑक्सिडेटिव्ह चयापचयातील सामान्य फरक स्पष्ट करू शकतात, तरीही TME मध्ये माइटोकॉन्ड्रियल चयापचयासाठी ग्लुकोज किंवा इतर कार्बन स्रोतांद्वारे तयार होणारे अचूक चयापचय अद्याप निश्चित केलेले नाहीत. दिलेल्या TIL उपसमूहाला चयापचयांची उपस्थिती किंवा अनुपस्थिती नियुक्त करण्यासाठी, एक्साइज्ड टिश्यूमधून पेशींच्या लोकसंख्येचे शुद्धीकरण आवश्यक आहे. म्हणून, मास स्पेक्ट्रोमेट्रीसह एकत्रित केलेली आमची पेशी समृद्धी पद्धत जुळणाऱ्या रुग्णांच्या नमुन्यांमध्ये T पेशी आणि ट्यूमर पेशींच्या लोकसंख्येमध्ये भिन्नरित्या समृद्ध असलेल्या चयापचयांबद्दल अंतर्दृष्टी प्रदान करू शकते. जरी या पद्धतीचे फ्लोरोसेन्स-सक्रिय पेशी वर्गीकरणापेक्षा फायदे असले तरी, अंतर्निहित स्थिरता आणि/किंवा जलद टर्नओव्हर रेटमुळे काही मेटाबोलाइट लायब्ररी प्रभावित होऊ शकतात (22). तरीही, आमची पद्धत दोन मान्यताप्राप्त इम्युनोसप्रेसिव्ह चयापचय, एडेनोसिन आणि काइन्युरेनिन ओळखण्यास सक्षम होती, कारण ते नमुना प्रकारांमध्ये मोठ्या प्रमाणात बदलतात.
ट्यूमर आणि TIL उपप्रकारांचे आमचे मेटाबोनॉमिक विश्लेषण डिम्बग्रंथि TME मध्ये मेटाबोलाइट्सच्या भूमिकेबद्दल अधिक अंतर्दृष्टी प्रदान करते. प्रथम, फ्लो सायटोमेट्री वापरून, आम्ही असे निर्धारित केले की ट्यूमर आणि CD4 + T पेशींमधील माइटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलापांमध्ये कोणताही फरक नाही. तथापि, LC-MS/MS विश्लेषणाने या लोकसंख्येमध्ये मेटाबोलाइट्सच्या विपुलतेमध्ये महत्त्वपूर्ण बदल उघड केले, जे दर्शविते की TIL चयापचय आणि त्याच्या एकूण चयापचय क्रियाकलापांबद्दलच्या निष्कर्षांना काळजीपूर्वक अर्थ लावणे आवश्यक आहे. दुसरे म्हणजे, MNA हा मेटाबोलाइट आहे ज्यामध्ये CD45-पेशी आणि जलोदरमधील T पेशींमध्ये सर्वात जास्त फरक आहे, ट्यूमर नाही. म्हणून, कंपार्टमेंटलायझेशन आणि ट्यूमर स्थानाचा TIL चयापचयवर वेगवेगळा परिणाम होऊ शकतो, जो दिलेल्या सूक्ष्म वातावरणात संभाव्य विषमता हायलाइट करतो. तिसरे, MNA-उत्पादक एंजाइम NNMT ची अभिव्यक्ती प्रामुख्याने CAF पर्यंत मर्यादित आहे, जे कमी प्रमाणात ट्यूमर पेशी आहे, परंतु ट्यूमर-व्युत्पन्न T पेशींमध्ये शोधण्यायोग्य MNA पातळी पाहिली जातात. डिम्बग्रंथि CAF मध्ये NNMT च्या अतिप्रदर्शनाचा कर्करोगाला चालना देणारा प्रभाव ज्ञात आहे, अंशतः CAF चयापचय, ट्यूमर आक्रमण आणि मेटास्टेसिसला चालना देण्यामुळे (27). जरी TIL ची एकूण पातळी मध्यम असली तरी, CAF मध्ये NNMT ची अभिव्यक्ती कर्करोग जीनोम अॅटलस (TCGA) मेसेन्कायमल उपप्रकाराशी जवळून संबंधित आहे, जी खराब रोगनिदानाशी संबंधित आहे (27, 46, 47). शेवटी, MNA क्षयीकरणासाठी जबाबदार असलेल्या एंजाइम AOX1 ची अभिव्यक्ती देखील CAF लोकसंख्येपुरती मर्यादित आहे, जे सूचित करते की T पेशींमध्ये MNA चयापचय करण्याची क्षमता नाही. हे निकाल या कल्पनेला समर्थन देतात की जरी या निष्कर्षाची पडताळणी करण्यासाठी पुढील काम आवश्यक असले तरी, T पेशींमध्ये MNA ची उच्च पातळी इम्युनोसप्रेसिव्ह CAF सूक्ष्म वातावरणाची उपस्थिती दर्शवू शकते.
एमएनए ट्रान्सपोर्टर्सची कमी अभिव्यक्ती पातळी आणि एमएनए चयापचयात सहभागी असलेल्या प्रमुख प्रथिनांचे अदृश्य स्तर पाहता, टी पेशींमध्ये एमएनएची उपस्थिती अनपेक्षित आहे. एनएनएमटी किंवा एओएक्स१ हे दोन्हीही scRNA-seq विश्लेषण आणि दोन स्वतंत्र गटांच्या लक्ष्यित qPCR द्वारे शोधले जाऊ शकले नाहीत. हे निकाल सूचित करतात की एमएनए टी पेशींद्वारे संश्लेषित केले जात नाही, परंतु आसपासच्या TME मधून शोषले जाते. इन विट्रो प्रयोग दर्शवितात की टी पेशी बाह्य MNA जमा करतात.
आमच्या इन विट्रो अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की बाह्य MNA T पेशींमध्ये TNFα ची अभिव्यक्ती प्रेरित करते आणि TNFα प्रवर्तकाशी Sp1 चे बंधन वाढवते. जरी TNFα मध्ये अँटी-ट्यूमर आणि अँटी-ट्यूमर दोन्ही कार्ये आहेत, तरी डिम्बग्रंथि कर्करोगात, TNFα डिम्बग्रंथि कर्करोगाच्या वाढीस प्रोत्साहन देऊ शकते (31-33). डिम्बग्रंथि ट्यूमर पेशी संस्कृतीमध्ये TNFα चे तटस्थीकरण किंवा माऊस मॉडेल्समध्ये TNFα सिग्नल काढून टाकल्याने TNFα-मध्यस्थ दाहक सायटोकाइन उत्पादन सुधारू शकते आणि ट्यूमरची वाढ रोखू शकते (32, 35). म्हणून, या प्रकरणात, TME-व्युत्पन्न MNA ऑटोक्राइन लूपद्वारे TNFα-आश्रित यंत्रणेद्वारे प्रो-इंफ्लेमेटरी मेटाबोलाइट म्हणून काम करू शकते, ज्यामुळे डिम्बग्रंथि कर्करोगाची घटना आणि प्रसार वाढतो (31). या शक्यतेच्या आधारावर, डिम्बग्रंथि कर्करोगासाठी संभाव्य उपचारात्मक एजंट म्हणून TNFα ब्लॉकेडचा अभ्यास केला जात आहे (37, 48, 49). याव्यतिरिक्त, MNA CAR-T पेशींच्या सायटोटॉक्सिसिटीला डिम्बग्रंथि ट्यूमर पेशींवर बिघडवते, ज्यामुळे MNA-मध्यस्थ रोगप्रतिकारक दडपशाहीसाठी पुढील पुरावे मिळतात. एकत्रितपणे, हे निकाल एक मॉडेल सूचित करतात ज्यामध्ये ट्यूमर आणि CAF पेशी बाह्य पेशी TME मध्ये MNA स्राव करतात. (i) TNF-प्रेरित डिम्बग्रंथि कर्करोगाच्या वाढीस उत्तेजन आणि (ii) MNA-प्रेरित T पेशी सायटोटॉक्सिक क्रियाकलाप प्रतिबंधाद्वारे, याचा दुहेरी ट्यूमर प्रभाव असू शकतो (आकृती 5D).
शेवटी, जलद पेशी संवर्धन, एकल-पेशी अनुक्रमण आणि चयापचय प्रोफाइलिंग यांचे संयोजन वापरून, या अभ्यासात HGSC रुग्णांमध्ये ट्यूमर आणि जलोदर पेशींमधील प्रचंड इम्युनोमेटाबोलोमिक फरक उघड झाला. या व्यापक विश्लेषणातून असे दिसून आले की टी पेशींमध्ये ग्लुकोज अपटेक आणि माइटोकॉन्ड्रियल क्रियाकलापांमध्ये फरक आहेत आणि MNA ला नॉन-सेल ऑटोनॉमस इम्यून रेग्युलेटरी मेटाबोलाइट म्हणून ओळखले गेले. मानवी कर्करोगांमध्ये TME चा T सेल चयापचय कसा प्रभावित होतो यावर या डेटाचा प्रभाव पडतो. जरी T पेशी आणि कर्करोग पेशींमधील पोषक तत्वांसाठी थेट स्पर्धा नोंदवली गेली असली तरी, मेटाबोलाइट्स ट्यूमरच्या प्रगतीला चालना देण्यासाठी आणि कदाचित अंतर्जात रोगप्रतिकारक प्रतिक्रियांना दडपण्यासाठी अप्रत्यक्ष नियामक म्हणून देखील काम करू शकतात. या नियामक मेटाबोलाइट्सच्या कार्यात्मक भूमिकेचे पुढील वर्णन ट्यूमर-विरोधी रोगप्रतिकारक प्रतिसाद वाढविण्यासाठी पर्यायी धोरणे उघड करू शकते.
कॅनेडियन टिश्यू रिपॉझिटरी नेटवर्कने प्रमाणित केलेल्या बीसी कॅन्सर ट्यूमर टिश्यू रिपॉझिटरीद्वारे रुग्णांचे नमुने आणि क्लिनिकल डेटा मिळवण्यात आला. बीसी कॅन्सर रिसर्च एथिक्स कमिटी आणि युनिव्हर्सिटी ऑफ ब्रिटिश कोलंबिया (H07-00463) ने मंजूर केलेल्या प्रोटोकॉलनुसार, सर्व रुग्णांचे नमुने आणि क्लिनिकल डेटाने सूचित लेखी संमती घेतली किंवा औपचारिकपणे त्यांची संमती सोडून दिली. नमुने प्रमाणित बायोबँक (BRC-00290) मध्ये संग्रहित केले जातात. रुग्णाची तपशीलवार वैशिष्ट्ये टेबल्स S1 आणि S5 मध्ये दर्शविली आहेत. क्रायोप्रीझर्वेशनसाठी, रुग्णाच्या ट्यूमरच्या नमुन्याचे यांत्रिकरित्या विघटन करण्यासाठी आणि नंतर एकल पेशी निलंबन मिळविण्यासाठी 100-मायक्रॉन फिल्टरमधून ढकलण्यासाठी स्केलपेलचा वापर केला जातो. पेशींना गोळ्या घालण्यासाठी आणि सुपरनॅटंट काढून टाकण्यासाठी रुग्णाच्या जलोदरांना 1500 आरपीएमवर 4°C वर 10 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले. ट्यूमर आणि जलोदरांपासून मिळवलेल्या पेशी ५०% उष्णता-निष्क्रिय मानवी एबी सीरम (सिग्मा-अल्ड्रिच), ४०% RPMI-१६४० (थर्मो फिशर सायंटिफिक) आणि १०% डायमिथाइल सल्फोक्साइडमध्ये क्रायोप्रीझर्व्ह केल्या गेल्या. हे जतन केलेले एकल पेशी सस्पेंशन वितळवले गेले आणि खाली वर्णन केलेल्या चयापचय आणि मेटाबोलाइट निर्धारणासाठी वापरले गेले.
संपूर्ण माध्यमात ०.२२ μm फिल्टर केलेले ५०:५० पूरक RPMI १६४० असते: AimV. RPMI १६४० + २.०५ mM l-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर सायंटिफिक) १०% उष्णता-निष्क्रिय मानवी AB सीरम (सिग्मा-अल्ड्रिच), १२.५ mM हेप्स (थर्मो फिशर सायंटिफिक), २ mM l-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर सायंटिफिक) फिशर सायंटिफिक), १ x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमायसिन (पेनस्ट्रेप) द्रावण (थर्मो फिशर सायंटिफिक) आणि ५० μMB-मर्कॅपटोएथेनॉल असते. AimV (इन्व्हिट्रोजन) २० mM हेप्स (थर्मो फिशर सायंटिफिक) आणि २ mM l-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर सायंटिफिक) ने पूरक असते. फ्लो सायटोमीटर स्टेनिंग बफरमध्ये ०.२२ μm फिल्टर केलेले फॉस्फेट बफर केलेले सलाईन (PBS; इन्व्हिट्रोजन) ३% उष्णता-निष्क्रिय AB मानवी सीरम (सिग्मा) ने पूरक असते. पेशी समृद्धीकरण बफर 0.22μm फिल्टर केलेल्या PBS ने बनलेला आहे आणि 0.5% उष्णता-निष्क्रिय मानवी AB सीरम (सिग्मा-अल्ड्रिच) ने पूरक आहे.
३७°C पूर्ण माध्यमात, पेशींना १० nM MT DR आणि १०० μM 2-NBDG ने ३० मिनिटांसाठी रंगवले गेले. पुढे, पेशींना ४°C वर १५ मिनिटांसाठी व्हेबिलिटी डाई eF506 ने रंगवले गेले. FC ब्लॉक (eBioscience) आणि ब्रिलियंट स्टेन बफर (BD बायोसायन्सेस) मध्ये पेशी पुन्हा सस्पेंड करा, फ्लो सायटोमीटर स्टेनिंग बफरमध्ये पातळ करा (निर्मात्याच्या सूचनांनुसार), आणि खोलीच्या तपमानावर १० मिनिटे इनक्युबेट करा. ४°C वर फ्लो सायटोमेट्री स्टेनिंग बफरमध्ये २० मिनिटांसाठी अँटीबॉडीजच्या संचाने (टेबल S2) पेशींना रंगवा. विश्लेषणापूर्वी फ्लो सायटोमेट्री स्टेनिंग बफरमध्ये (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R कॉन्फिगरेशन) पेशी पुन्हा सस्पेंड करा. पेशींची संख्या डेटाचे विश्लेषण करण्यासाठी SpectroFlo आणि FlowJo V10 वापरा आणि डेटा तयार करण्यासाठी GraphPad Prism 8 वापरा. 2-NBDG आणि MT DR ची मध्यवर्ती फ्लोरोसेन्स तीव्रता (MFI) लॉग-सामान्यीकृत करण्यात आली आणि नंतर जुळणाऱ्या रुग्णांची गणना करण्यासाठी सांख्यिकीय विश्लेषणासाठी एक जोडीदार टी चाचणी वापरली गेली. विश्लेषणातून 40 पेक्षा कमी घटना असलेल्या सर्व लोकसंख्या काढून टाका; सांख्यिकीय विश्लेषण आणि डेटा व्हिज्युअलायझेशन करण्यापूर्वी कोणत्याही नकारात्मक मूल्यांसाठी 1 चे MFI मूल्य प्रविष्ट करा.
वरील प्रक्रिया पॅनेलच्या मॅन्युअल गेटिंग स्ट्रॅटेजीला पूरक म्हणून, आम्ही FlowJo मधील मृत पेशी काढून टाकल्यानंतर पॉप्युलेशनला आपोआप सेल नियुक्त करण्यासाठी शेप रिस्ट्रिक्शन ट्री (FAUST) (21) द्वारे पूर्ण भाष्य वापरले. चुकीच्या पद्धतीने वाटप केलेल्या पॉप्युलेशन (PD1+ ला PD1-ट्यूमर पेशींसह एकत्रित करून) आणि राखून ठेवलेल्या पॉप्युलेशन विलीन करण्यासाठी आम्ही मॅन्युअली आउटपुट व्यवस्थापित करतो. प्रत्येक नमुन्यात एकूण 11 पॉप्युलेशनसाठी सरासरी 2% पेक्षा जास्त पेशी असतात.
ल्युकोसाइट सेपरेशन उत्पादनांपासून पीबीएमसी वेगळे करण्यासाठी फिकोल ग्रेडियंट डेन्सिटी सेंट्रीफ्यूगेशनचा वापर करण्यात आला (STEMCELL Technologies). उत्पादकाच्या सूचनांनुसार, सीडी८ + टी पेशी पीबीएमसीपासून सीडी८ मायक्रोबीड्स (मिल्टेनी) वापरून वेगळ्या करण्यात आल्या आणि ट्रान्सअॅक्ट (मिल्टेनी) वापरून पूर्ण माध्यमात २ आठवडे वाढवण्यात आल्या. आयएल-७ (१० एनजी/मिली; पेप्रोटेक) असलेल्या संपूर्ण माध्यमात पेशींना ५ दिवस उभे राहण्याची परवानगी देण्यात आली आणि नंतर ट्रान्सअॅक्टने पुन्हा उत्तेजित करण्यात आले. ७ व्या दिवशी, उत्पादकाच्या सूचनांनुसार, मानवी सीडी४५ मायक्रोबीड्स (मिल्टेनी) सलग तीन फेऱ्यांमध्ये पेशी समृद्ध करण्यासाठी वापरण्यात आले. फ्लो सायटोमेट्री विश्लेषणासाठी (वर वर्णन केल्याप्रमाणे) पेशींचे अल्युकोटेशन करण्यात आले आणि एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषणासाठी तीन वेळा अल्युकोटेशन करण्यात आले. खाली वर्णन केल्याप्रमाणे एलसी-एमएस/एमएस द्वारे नमुने प्रक्रिया करण्यात आले. आम्ही १,००० च्या आयन संख्येसह गहाळ मेटाबोलाइट मूल्याचा अंदाज लावला. प्रत्येक नमुना एकूण आयन क्रमांक (TIC) द्वारे सामान्यीकृत केला जातो, लॉगरिथमिकली रूपांतरित केला जातो आणि विश्लेषणापूर्वी MetaboAnalystR मध्ये स्वयंचलितपणे सामान्यीकृत केला जातो.
प्रत्येक रुग्णाचे एकल पेशी निलंबन वितळवून 40 μm फिल्टरद्वारे पूर्ण माध्यमात फिल्टर केले गेले (वर वर्णन केल्याप्रमाणे). उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार, CD8+, CD4+ आणि CD45- पेशींसाठी (बर्फावर) नमुने समृद्ध करण्यासाठी मायक्रोबीड्स (मिल्टेनी) वापरून चुंबकीय मणी वेगळे करून सकारात्मक निवडीच्या सलग तीन फेऱ्या वापरल्या गेल्या. थोडक्यात, पेशींना पेशी समृद्धी बफरमध्ये (वर वर्णन केल्याप्रमाणे) पुन्हा निलंबित केले जाते आणि मोजले जाते. पेशींना मानवी CD8 मणी, मानवी CD4 मणी किंवा मानवी CD45 मणी (मिल्टेनी) 4°C वर 15 मिनिटांसाठी उबवले गेले आणि नंतर पेशी समृद्धी बफरने धुतले गेले. नमुना LS स्तंभ (मिल्टेनी) मधून जातो आणि सकारात्मक आणि नकारात्मक अपूर्णांक गोळा केले जातात. कालावधी कमी करण्यासाठी आणि पेशी पुनर्प्राप्ती चरण जास्तीत जास्त करण्यासाठी, CD8-अपूर्णांक नंतर CD4+ संवर्धनाच्या दुसऱ्या फेरीसाठी वापरला जातो आणि त्यानंतरच्या CD45-संवर्धनासाठी CD4-अपूर्णांक वापरला जातो. पृथक्करण प्रक्रियेदरम्यान द्रावण बर्फावर ठेवा.
मेटाबोलाइट विश्लेषणासाठी नमुने तयार करण्यासाठी, पेशींना एकदा बर्फाच्या थंड मीठाच्या द्रावणाने धुतले गेले आणि प्रत्येक नमुन्यात 1 मिली 80% मिथेनॉल जोडले गेले, नंतर व्हर्टेक्स केले गेले आणि द्रव नायट्रोजनमध्ये स्नॅप फ्रोझन केले गेले. नमुने तीन फ्रीझ-थॉ सायकलच्या अधीन केले गेले आणि 14,000 आरपीएमवर 4°C वर 15 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले. मेटाबोलाइट्स असलेले सुपरनॅटंट कोरडे होईपर्यंत बाष्पीभवन केले जाते. मेटाबोलाइट्स 0.03% फॉर्मिक ऍसिडच्या 50 μl मध्ये पुन्हा विरघळले गेले, मिसळण्यासाठी व्हर्टेक्स केले गेले आणि नंतर कचरा काढून टाकण्यासाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले.
वर वर्णन केल्याप्रमाणे मेटाबोलाइट्स काढा. मेटाबोलॉमिक्स संशोधनासाठी सुपरनॅटंटला उच्च कार्यक्षमता असलेल्या लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी बाटलीमध्ये स्थानांतरित करा. बॅच इफेक्ट्स टाळण्यासाठी प्रत्येक नमुन्यावर समान संख्येच्या पेशींसह उपचार करण्यासाठी यादृच्छिक उपचार प्रोटोकॉल वापरा. ​​आम्ही AB SCIEX QTRAP 5500 ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (50) वर पूर्वी प्रकाशित झालेल्या जागतिक मेटाबोलाइट्सचे गुणात्मक मूल्यांकन केले. मल्टीक्वांट आवृत्ती 2.1 सॉफ्टवेअर (अप्लाइड बायोसिस्टम्स SCIEX) वापरून क्रोमॅटोग्राफिक विश्लेषण आणि पीक एरिया इंटिग्रेशन केले गेले.
गहाळ मेटाबोलाइट मूल्याचा अंदाज घेण्यासाठी १००० ची आयन गणना वापरली गेली आणि नमुना प्रक्रियेतून वाद्य विश्लेषणाद्वारे केलेल्या बदलांसाठी सुधारणा करण्यासाठी प्रत्येक शोधलेल्या मेटाबोलाइटच्या सामान्यीकृत शिखर क्षेत्राची गणना करण्यासाठी प्रत्येक नमुन्याचा TIC वापरला गेला. TIC सामान्यीकृत झाल्यानंतर, लॉगरिथमिक रूपांतरण आणि स्वयंचलित नॉर्म लाइन स्केलिंगसाठी MetaboAnalystR(51) (डिफॉल्ट पॅरामीटर) वापरला जातो. आम्ही नमुना प्रकारांमधील मेटाबोलोम फरकांचे अन्वेषणात्मक विश्लेषण करण्यासाठी व्हेगन R पॅकेजसह PCA वापरला आणि रुग्णांचे विश्लेषण करण्यासाठी आंशिक रिडंडन्सी विश्लेषण वापरले. नमुन्यांमधील युक्लिडियन अंतर क्लस्टर करण्यासाठी उष्णता नकाशा डेंड्रोग्राम तयार करण्यासाठी वॉर्ड पद्धत वापरा. ​​संपूर्ण पेशी प्रकार आणि सूक्ष्म वातावरणात भिन्न प्रमाणात मेटाबोलाइट्स ओळखण्यासाठी आम्ही प्रमाणित मेटाबोलाइट विपुलतेवर लिम्मा (52) वापरला. स्पष्टीकरण सोपे करण्यासाठी, आम्ही मॉडेल निर्दिष्ट करण्यासाठी गट सरासरी पॅरामीटर वापरतो आणि सूक्ष्म वातावरणातील पेशी प्रकारांना प्रत्येक गट म्हणून विचारात घेतो (n = 6 गट); महत्त्व चाचणीसाठी, आम्ही प्रत्येक मेटाबोलाइटसाठी तीन पुनरावृत्ती मोजमाप केले. खोटे प्रतिकृती टाळण्यासाठी, रुग्णाला लिम्मा डिझाइनमध्ये अडथळा म्हणून समाविष्ट केले गेले. वेगवेगळ्या रुग्णांमधील मेटाबोलाइट्समधील फरक तपासण्यासाठी, आम्ही रुग्णांसह लिम्मा मॉडेल निश्चित पद्धतीने समायोजित केले. आम्ही पेशी प्रकार आणि पॅडज <0.05 (बेंजामिनी-होचबर्ग सुधारणा) च्या सूक्ष्म वातावरणातील पूर्व-निर्दिष्ट कॉन्ट्रास्टचे महत्त्व नोंदवतो.
मिल्टेनी डेड सेल रिमूव्हल किट (>८०% व्यवहार्यता) वापरून व्हिजोर एन्रिचमेंट केल्यानंतर, १०x ५′जीन एक्सप्रेशन प्रोटोकॉल वापरून एकूण जिवंत गोठलेल्या जलोदर आणि ट्यूमर नमुन्यांवर सिंगल-सेल ट्रान्सक्रिप्टोम सिक्वेन्सिंग करण्यात आले. जुळणाऱ्या ट्यूमर आणि जलोदर असलेल्या पाच केसेसचे विश्लेषण करण्यात आले, जरी एका ट्यूमर नमुन्यातील कमी व्यवहार्यतेमुळे त्याचा समावेश रोखला गेला. रुग्णांच्या अनेक निवडी साध्य करण्यासाठी, आम्ही १०x क्रोमियम कंट्रोलरच्या लेनमध्ये प्रत्येक रुग्णाचे नमुने एकत्र केले आणि जलोदर आणि ट्यूमर साइट्सचे स्वतंत्रपणे विश्लेषण केले. सिक्वेन्सिंगनंतर [इल्युमिना हायसेक ४००० २८×९८ बीपी पेअर्ड एंड (पीई), क्यूबेक जीनोम; ट्यूमर आणि जलोदरसाठी प्रति पेशी सरासरी ७३,४८८ आणि ४१,३७८ वाचन]], आम्ही CellSNP आणि Vireo (५३) वापरले (CellSNP वर आधारित GRCh38 द्वारे प्रदान केलेल्या सामान्य मानवी SNP (VCF) ला दात्याची ओळख दिली जाते. आम्ही रुग्णाच्या जीनोटाइप स्थितीची (IBS) जवळची ओळख (IBS) काढण्यासाठी SNPRelate वापरतो, ज्यामध्ये डुप्लेक्स म्हणून ओळखल्या जाणाऱ्या न नियुक्त केलेल्या पेशी आणि पेशी वगळून आणि जलोदर आणि ट्यूमर नमुन्यांमधील जुळणारे दाते (५४) वगळता. या कार्याच्या आधारावर, आम्ही डाउनस्ट्रीम विश्लेषणासाठी ट्यूमर आणि जलोदरमध्ये मुबलक पेशी प्रतिनिधित्व असलेले तीन केस राखले. स्केटर (५५) आणि स्क्रॅन (५६) बायोकंडक्टर पॅकेजिंगमध्ये मास फिल्ट्रेशन स्टेप केल्यानंतर, विश्लेषणासाठी यामुळे ६९७५ पेशी (अनुक्रमे ट्यूमर आणि जलोदरमधून २७९२ आणि ४१८३ पेशी) मिळाल्या. आम्ही शेअर्ड नेअरस्टेअर नेबर नेटवर्क (SNN) च्या igraph's (५७) Louvain क्लस्टरिंगचा वापर करतो. अभिव्यक्तीनुसार क्लस्टर पेशींमधील जॅककार्ड अंतर. मार्कर जीन अभिव्यक्तीवर आधारित पुटेटिव्ह सेल प्रकारांमध्ये क्लस्टर्स मॅन्युअली एनोटेट केले गेले आणि t-SNE सह व्हिज्युअलाइज केले गेले. सायटोटॉक्सिक टी पेशी CD8A आणि GZMA च्या अभिव्यक्तीद्वारे परिभाषित केल्या जातात, कमी राइबोसोमल प्रोटीन अभिव्यक्ती असलेल्या सबक्लस्टर वगळता. आम्ही इझार एट अल. (16) च्या प्रकाशित डेटामध्ये प्रवेश केला, ज्यामध्ये त्यांचे t-SNE एम्बेडिंग समाविष्ट आहे, जे रोगप्रतिकारक पेशी मार्कर आणि NNMT अभिव्यक्तीमधील अभिव्यक्ती ओव्हरलॅप नियंत्रित करू शकते.
फिकोल ग्रेडियंट डेन्सिटी सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे पीबीएमसीला ल्युकोसाइट सेपरेशन उत्पादनांपासून (एसटीईएमसीएल टेक्नॉलॉजीज) वेगळे केले गेले. सीडी३ बीड्स (मिल्टेनी) वापरून सीडी३ + पेशी पीबीएमसीपासून वेगळे केले गेले. एमएनएच्या उपस्थितीत किंवा अनुपस्थितीत, सीडी३+ पेशी प्लेट-बाउंड सीडी३ (५μg/मिली), विरघळणारे सीडी२८ (३μg/मिली) आणि आयएल-२ (३०० यु/मिली; प्रोल्युकिन) सह सक्रिय केल्या गेल्या. विस्ताराच्या शेवटच्या दिवशी, व्यवहार्यता (फिक्सेबल व्हायबिलिटी डाई ईफ्लूर४५०, ईबायोसायन्स) आणि प्रसार (१२३काउंट ईबीड्स, थर्मो फिशर सायंटिफिक) यांचे फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे मूल्यांकन केले गेले. GolgiStop वापरून PMA (20 ng/ml) आणि ionomycin (1μg/ml) असलेल्या पेशींना 4 तासांसाठी उत्तेजित करून इफेक्टर फंक्शनचे मूल्यांकन करा आणि CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) आणि TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD) चे निरीक्षण करा. 4 तासांसाठी PMA (20 ng/ml) आणि ionomycin (1μg/ml) असलेल्या qPCR आणि ChIP पेशींना उत्तेजित करा. PMA (20 ng/ml) आणि ionomycin (1 μg/ml) असलेल्या उत्तेजित होण्यापूर्वी आणि नंतर ELISA सुपरनॅटंट 4 तासांसाठी गोळा केले गेले.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) वापरून RNA वेगळे करण्यासाठी उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलचे अनुसरण करा. नमुना एकरूप करण्यासाठी QIAshredder (QIAGEN) वापरा. ​​पूरक DNA (cDNA) संश्लेषित करण्यासाठी उच्च-क्षमतेचा RNA ते cDNA किट (थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरा. ​​खालील प्रोबसह (निर्मात्याच्या प्रोटोकॉलनुसार) जनुक अभिव्यक्तीचे प्रमाण मोजण्यासाठी TaqMan रॅपिड अॅडव्हान्स्ड मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरा: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट ऑफ हायड्रोजन (GAPDH)] आणि Hs01010726_m1 (SLC22A2). हे नमुने स्टेपवनप्लस रिअल-टाइम पीसीआर सिस्टम (अ‍ॅप्लाईड बायोसिस्टम्स) (अ‍ॅप्लाईड बायोसिस्टम्स) वर मायक्रोअ‍ॅप ऑप्टिकल फिल्मसह मायक्रोअ‍ॅप फास्ट ऑप्टिकल ९६-वेल रिअ‍ॅक्शन प्लेट (अ‍ॅप्लाईड बायोसिस्टम्स) मध्ये चालवले गेले. ३५ पेक्षा जास्त असलेले कोणतेही सीटी मूल्य डिटेक्शन थ्रेशोल्डपेक्षा जास्त मानले जाते आणि ते शोधण्यायोग्य नाही असे चिन्हांकित केले जाते.
आधी वर्णन केल्याप्रमाणे ChIP करा (58). थोडक्यात, पेशींना फॉर्मल्डिहाइड (अंतिम सांद्रता 1.42%) ने उपचार केले गेले आणि खोलीच्या तपमानावर 10 मिनिटे उष्मायन केले गेले. पूरक सूज बफर (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl आणि 0.1% NP-40) बर्फावर 10 मिनिटे वापरा, नंतर वर्णन केल्याप्रमाणे इम्युनोप्रिसिपिटेशन बफरमध्ये पुन्हा सस्पेंड करा (58). त्यानंतर नमुना खालील चक्रांसह सोनिकेट केला गेला: 10 चक्र (20 1-सेकंद पल्स) आणि 40 सेकंदांचा स्थिर वेळ. ChIP-ग्रेड इम्युनोग्लोबुलिन G (सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजी; 1μl), हिस्टोन H3 (सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजी; 3μl), NFAT (इन्व्हिट्रोजन; 3μl) आणि SP1 (सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजी; 3μl) अँटीबॉडीज 4°CC वर नमुन्यासह रात्रभर शेक करा. ४°C तापमानावर नमुना घेऊन १ तास हलक्या हाताने हलवून प्रोटीन A बीड्स (थर्मो फिशर सायंटिफिक) उबवा, नंतर DNA समृद्ध करण्यासाठी चेलेक्स बीड्स (बायो-रॅड) वापरा आणि प्रथिने पचनासाठी प्रोटीनेज K (थर्मो फिशर) वापरा. ​​TNFα प्रमोटर PCR द्वारे शोधला गेला: फॉरवर्ड, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; उलट, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (२०७-bp उत्पादन). प्रतिमा इमेज लॅब (बायो-रॅड) द्वारे तयार केल्या गेल्या आणि इमेजजे सॉफ्टवेअर वापरून प्रमाणित केल्या गेल्या.
वर वर्णन केल्याप्रमाणे सेल कल्चर सुपरनॅटंट गोळा करण्यात आला. हे निर्धारण उत्पादकाच्या मानवी TNFα ELISA किट (इन्व्हिट्रोजन), मानवी IL-2 ELISA किट (इन्व्हिट्रोजन) आणि मानवी IFN-γ ELISA किट (अ‍ॅबकॅम) च्या प्रक्रियेनुसार केले गेले. उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार, TNFα आणि IL-2 शोधण्यासाठी सुपरनॅटंट 1:100 आणि IFN-γ शोधण्यासाठी 1:3 पातळ केले गेले. 450 nm वर शोषण मोजण्यासाठी EnVision 2104 मल्टीलॅबल रीडर (पर्किनएल्मर) वापरा.
फिकोल ग्रेडियंट डेन्सिटी सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे पीबीएमसीला ल्युकोसाइट सेपरेशन उत्पादनांपासून (एसटीईएमसीएल टेक्नॉलॉजीज) वेगळे केले गेले. सीडी३ बीड्स (मिल्टेनी) वापरून सीडी३ + पेशी पीबीएमसीपासून वेगळे केले गेले. एमएनएच्या उपस्थितीत किंवा अनुपस्थितीत, सीडी३+ पेशी प्लेट-बाउंड सीडी३ (५μg/मिली), विरघळणारे सीडी२८ (३μg/मिली) आणि आयएल-२ (३०० यु/मिली; प्रोल्युकिन) सह ३ दिवसांसाठी सक्रिय केल्या गेल्या. ३ दिवसांनंतर, पेशी गोळा केल्या गेल्या आणि ०.९% सलाईनने धुतल्या गेल्या आणि पेलेट स्नॅप फ्रोझन करण्यात आला. १२३काउंट ईबीड्स वापरून फ्लो सायटोमेट्री (सायटेक ऑरोरा; ३एल-१६व्ही-१४बी-८आर कॉन्फिगरेशन) द्वारे पेशींची गणना केली गेली.
वर वर्णन केल्याप्रमाणे अर्क मेटाबोलाइट्स. वाळलेल्या अर्काची पुनर्रचना ४००० सेल समतुल्य/μl च्या एकाग्रतेवर करण्यात आली. रिव्हर्स्ड-फेज क्रोमॅटोग्राफी (१२९० इन्फिनिटी II, एजिलेंट टेक्नॉलॉजीज, सांता क्लारा, सीए) आणि कॉर्टेक्स टी३ कॉलम (२.१×१५० मिमी, कण आकार १.६-μm, छिद्र आकार १२०-Å; #१८६००८५००, वॉटर्स) द्वारे नमुन्याचे विश्लेषण करा. ध्रुवीय वस्तुमान स्पेक्ट्रोमीटर (६४७०, एजिलेंट), ज्यामध्ये इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण सकारात्मक मोडमध्ये कार्य करते. मोबाइल फेज ए ०.१% फॉर्मिक अॅसिड (H2O मध्ये), मोबाइल फेज बी ९०% एसीटोनिट्राइल, ०.१% फॉर्मिक अॅसिड आहे. १००% A साठी LC ग्रेडियंट ० ते २ मिनिटे, ९९% B साठी २ ते ७.१ मिनिटे आणि ९९% B साठी ७.१ ते ८ मिनिटे आहे. नंतर ३ मिनिटांसाठी ०.६ मिली/मिनिट या प्रवाह दराने स्तंभाला मोबाइल फेज A सह पुन्हा संतुलित करा. . प्रवाह दर ०.४ मिली/मिनिट आहे आणि स्तंभ कक्ष ५०°C पर्यंत गरम केला जातो. धारणा वेळ (RT) आणि परिवर्तन (RT = ०.८८२ मिनिटे, परिवर्तन १ = १३७→९४.१, रूपांतर २ = १३७→९२, रूपांतर ३ = १३७→७८) स्थापित करण्यासाठी MNA चे शुद्ध रासायनिक मानक (M320995, टोरंटो रिसर्च केमिकल कंपनी, नॉर्थ यॉर्क, ओंटारियो, कॅनडा) वापरा. ​​जेव्हा तिन्ही संक्रमणे योग्य धारणा वेळेवर होतात, तेव्हा विशिष्टता सुनिश्चित करण्यासाठी परिमाणीकरणासाठी संक्रमण १ वापरले जाते. एमएनए (टोरंटो रिसर्च केमिकल कंपनी) चा मानक वक्र स्टॉक सोल्युशनच्या सहा सिरीयल डायल्युशनद्वारे (१ मिलीग्राम/मिली) तयार करण्यात आला ज्यामुळे अनुक्रमे ०.१, १.०, १० आणि १०० एनजी/मिली आणि १.० आणि १०μg/मिली द्रवपदार्थाचे मानके प्राप्त झाले. शोध मर्यादा १ एनजी/मिली आहे आणि रेषीय प्रतिसाद १० एनजी/मिली आणि १०μg/मिली दरम्यान आहे. एलसी/एमएस विश्लेषणासाठी नमुना आणि मानकाच्या दोन मायक्रोलिटरचे प्रत्येक इंजेक्शन वापरले जाते आणि विश्लेषण प्लॅटफॉर्मची स्थिरता सुनिश्चित करण्यासाठी दर आठ इंजेक्शन्समध्ये मिश्रित गुणवत्ता नियंत्रण नमुना चालवला जातो. सर्व एमएनए-उपचारित पेशी नमुन्यांचे एमएनए प्रतिसाद परखाच्या रेषीय श्रेणीत होते. मासहंटर क्वांटिटेटिव्ह अॅनालिसिस सॉफ्टवेअर (v9.0, एजिलेंट) वापरून डेटा विश्लेषण केले गेले.
दुसऱ्या पिढीतील αFR-CAR रचना सॉन्ग आणि इतरांकडून घेतली गेली आहे. (59). थोडक्यात, रचनामध्ये खालील सामग्री आहे: CD8a लीडर सिक्वेन्स, मानवी αFR-विशिष्ट सिंगल-चेन व्हेरिएबल फ्रॅगमेंट, CD8a बिजागर आणि ट्रान्समेम्ब्रेन क्षेत्र, CD27 इंट्रासेल्युलर डोमेन आणि CD3z इंट्रासेल्युलर डोमेन. संपूर्ण CAR अनुक्रम GenScript द्वारे संश्लेषित केला गेला आणि नंतर ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी वापरल्या जाणाऱ्या GFP एक्सप्रेशन कॅसेटच्या अपस्ट्रीममधील दुसऱ्या पिढीतील लेंटिव्हायरल एक्सप्रेशन वेक्टरमध्ये क्लोन केला गेला.
लेंटिव्हायरस HEK293T पेशींच्या [अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC)] संक्रमणाद्वारे तयार केला जातो; डल्बेकोच्या सुधारित ईगल माध्यमात वाढवले ​​जाते ज्यामध्ये 10% गर्भातील बोवाइन सीरम (FBS) आणि 1% पेनस्ट्रेप असते आणि CAR-GFP व्हेक्टर वापरला जातो आणि पॅकेजिंग प्लाझ्मिड (psPAX2 आणि pMD2.G, Addgene) लिपोफेक्शन अमाइन (सिग्मा-अल्ड्रिच) वापरतात. विषाणू असलेले सुपरनॅटंट संक्रमणानंतर 48 आणि 72 तासांनी गोळा केले गेले, फिल्टर केले गेले आणि अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे केंद्रित केले गेले. ट्रान्सडक्शन होईपर्यंत -80°C वर केंद्रित व्हायरल सुपरनॅटंट साठवा.
PBMC हे निरोगी दात्याच्या ल्युकोसाइट पृथक्करण उत्पादनांपासून (STEMCELL Technologies) Ficoll ग्रेडियंट डेन्सिटी सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे वेगळे केले जातात. PBMC पासून CD8+ पेशी वेगळे करण्यासाठी पॉझिटिव्ह सिलेक्शन CD8 मायक्रोबीड्स (मिल्टेनी) वापरा. ​​ट्रान्सअॅक्ट (मिल्टेनी) आणि TexMACS माध्यमात [मिल्टेनी; 3% उष्णता-निष्क्रिय मानवी सीरम, 1% पेनस्ट्रेप आणि IL-2 (300 U/ml) सह पूरक] टी पेशींना उत्तेजित करा. उत्तेजनानंतर चोवीस तासांनंतर, टी पेशींना लेन्टीव्हायरस (प्रति 106 पेशींमध्ये 10 μl केंद्रित व्हायरस सुपरनॅटंट) ने ट्रान्सड्यूस केले गेले. सायटेक ऑरोरा (FSC (फॉरवर्ड स्कॅटर)/SSC (साइड स्कॅटर), सिंगलेट, GFP+ वर ट्रान्सड्यूस केल्यानंतर 1 ते 3 दिवसांनी), पेशींच्या GFP अभिव्यक्तीचे मूल्यांकन करा जेणेकरून किमान 30% ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता दिसून येईल.
खालील परिस्थितीत इम्युनोकल्ट (STEMCELL टेक्नॉलॉजीज; १% पेनस्ट्रेपसह पूरक) मध्ये २४ तासांसाठी CAR-T पेशींचे संवर्धन करण्यात आले: उपचार न केलेले, २५० μM एडेनोसिन किंवा १० mM MNA सह उपचार केले गेले. प्रीट्रीटमेंटनंतर, CAR-T पेशी PBS ने धुतल्या गेल्या आणि २०,००० SK-OV-३ पेशींसह एकत्र केल्या गेल्या [ATCC; मॅककॉय ५A माध्यमात (सिग्मा-अल्ड्रिच) १०% FBS आणि १% पेनस्ट्रेपसह १० वर पूरक: १ चा इफेक्टर टू टार्गेट रेशो पूरक इम्युनोकल्ट माध्यमात त्रिकोणी स्वरूपात वाढवला गेला. डिजिटलिस सॅपोनिन (०.५mg/ml; सिग्मा-अल्ड्रिच) सह लायझ केलेल्या SK-OV-३ पेशी आणि SK-OV-३ पेशी अनुक्रमे नकारात्मक आणि सकारात्मक नियंत्रण म्हणून वापरल्या गेल्या. २४ तासांच्या सह-मशागतीनंतर, सुपरनॅटंट गोळा करण्यात आला आणि उत्पादकाच्या सूचनांनुसार लॅक्टेट डिहायड्रोजनेज (LDH) मोजण्यात आले (LDH ग्लो सायटोटॉक्सिसिटी अॅसे किट, प्रोमेगा). LDH सुपरनॅटंट LDH बफरमध्ये १:५० पातळ करण्यात आला. खालील सूत्र वापरून मारण्याची टक्केवारी मोजण्यात आली: मारण्याची टक्केवारी = सुधारणाची टक्केवारी / कमाल मारण्याचा दर x १००%, जिथे सुधारण्याची टक्केवारी = फक्त सह-संस्कृती-टी पेशी, आणि कमाल मारण्याचा दर = सकारात्मक नियंत्रण-नकारात्मक नियंत्रण.
मजकूर किंवा साहित्य आणि पद्धतींमध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे, सांख्यिकीय विश्लेषणासाठी ग्राफपॅड प्रिझम 8, मायक्रोसॉफ्ट एक्सेल किंवा आर v3.6.0 वापरा. ​​जर एकाच रुग्णाकडून (जसे की जलोदर आणि ट्यूमर) अनेक नमुने गोळा केले गेले असतील, तर आम्ही जोडीदार टी चाचणी वापरतो किंवा योग्य असल्यास रुग्णाला रेषीय किंवा सामान्यीकृत मॉडेलमध्ये यादृच्छिक परिणाम म्हणून समाविष्ट करतो. मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषणासाठी, महत्त्व चाचणी तीन प्रतींमध्ये केली जाते.
या लेखासाठी पूरक साहित्यासाठी, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 पहा.
हा एक मुक्त प्रवेश लेख आहे जो क्रिएटिव्ह कॉमन्स अॅट्रिब्यूशन-नॉन-कमर्शियल लायसन्सच्या अटींनुसार वितरित केला जातो, जो कोणत्याही माध्यमात वापर, वितरण आणि पुनरुत्पादन करण्यास परवानगी देतो, जोपर्यंत अंतिम वापर व्यावसायिक फायद्यासाठी नाही आणि मूळ काम योग्य आहे असा आधार आहे. संदर्भ.
टीप: आम्ही तुम्हाला फक्त तुमचा ईमेल पत्ता देण्यास सांगतो जेणेकरून तुम्ही पेजवर शिफारस केलेल्या व्यक्तीला कळेल की तुम्हाला ईमेल त्यांना दाखवायचा आहे आणि तो स्पॅम नाही. आम्ही कोणतेही ईमेल पत्ते कॅप्चर करणार नाही.
तुम्ही अभ्यागत आहात की नाही हे तपासण्यासाठी आणि स्वयंचलित स्पॅम सबमिशन रोखण्यासाठी हा प्रश्न वापरला जातो.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson) (Brad H. Nelson) (Brad H. Nelson) डीबेरार्डिनिस), रसेल जी. जोन्स (रसेल जी. जोन्स), फिनीस टी. हॅमिल्टन (फिनीस टी.
एमएनए टी पेशींच्या रोगप्रतिकारक शक्तीला दडपशाही करण्यास हातभार लावते आणि मानवी कर्करोगाच्या उपचारांसाठी संभाव्य इम्युनोथेरपी लक्ष्याचे प्रतिनिधित्व करते.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson) (Brad H. Nelson) (Brad H. Nelson) डीबेरार्डिनिस), रसेल जी. जोन्स (रसेल जी. जोन्स), फिनीस टी. हॅमिल्टन (फिनीस टी.
एमएनए टी पेशींच्या रोगप्रतिकारक शक्तीला दडपशाही करण्यास हातभार लावते आणि मानवी कर्करोगाच्या उपचारांसाठी संभाव्य इम्युनोथेरपी लक्ष्याचे प्रतिनिधित्व करते.
©2021 अमेरिकन असोसिएशन फॉर द ॲडव्हान्समेंट ऑफ सायन्स. सर्व हक्क राखीव. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef आणि COUNTER चे भागीदार आहे. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.