सध्याचा पत्ता: कोलोन ५०९३१, जर्मनी, कोलोन एक्सलन्स क्लस्टर रिसर्च ऑन सेल्युलर स्ट्रेस रिस्पॉन्स इन एजिंग-रिलेटेड डिसीजेस (CECAD).
माइटोकॉन्ड्रियल रोगांचे न्यूरोडीजनरेशन अपरिवर्तनीय मानले जाते कारण न्यूरॉन्सची चयापचय प्लॅस्टिसिटी मर्यादित असते, परंतु शरीरातील न्यूरोनल मेटाबोलिझमच्या पेशी स्वायत्ततेवर माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनचा प्रभाव कमी समजला जातो. येथे, आम्ही पुरकिन्जे न्यूरॉन्सच्या पेशी-विशिष्ट प्रोटीओमची ओळख करून देतो ज्यामध्ये माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन डायनॅमिक्समध्ये व्यत्यय आला आहे ज्यामुळे प्रगतीशील OXPHOS कमतरता आहे. आम्हाला आढळले की माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनमुळे प्रोटिओमिक्सच्या क्षेत्रात एक मोठा बदल झाला, ज्यामुळे शेवटी पेशींच्या मृत्यूपूर्वी अचूक चयापचय कार्यक्रमांचे अनुक्रमिक सक्रियकरण झाले. अनपेक्षितपणे, आम्ही पायरुव्हेट कार्बोक्झिलेज (PCx) आणि इतर अँटी-एजिंग एंजाइमचे स्पष्ट प्रेरण निश्चित केले जे TCA सायकलच्या मध्यस्थांना पूरक आहेत. PCx च्या प्रतिबंधामुळे ऑक्सिडेटिव्ह ताण आणि न्यूरोडीजनरेशन वाढले, जे दर्शविते की OXPHOS नसलेल्या न्यूरॉन्समध्ये एथेरोस्क्लेरोसिसचा संरक्षणात्मक प्रभाव आहे. टर्मिनली डिजनरेटेड न्यूरॉन्समध्ये माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजनची पुनर्संचयित करणे या चयापचय वैशिष्ट्यांना पूर्णपणे उलट करते, ज्यामुळे पेशी मृत्यू टाळता येतो. आमचे निष्कर्ष पूर्वी अज्ञात मार्ग ओळखतात जे माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनला लवचिकता देतात आणि दर्शविते की रोगाच्या शेवटच्या टप्प्यात देखील न्यूरोडीजनरेशन उलट केले जाऊ शकते.
मानवी माइटोकॉन्ड्रियल रोगांशी संबंधित व्यापक न्यूरोलॉजिकल लक्षणांमुळे न्यूरोनल एनर्जी मेटाबोलिझम राखण्यात मायटोकॉन्ड्रियाची मध्यवर्ती भूमिका अधोरेखित होते. यापैकी बहुतेक रोग माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्तीचे नियमन करणाऱ्या जीन उत्परिवर्तनांमुळे होतात (1, 2) किंवा माइटोकॉन्ड्रियल डायनॅमिक्सशी संबंधित जीन नष्ट झाल्यामुळे होतात, जे अप्रत्यक्षपणे माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (mtDNA) च्या स्थिरतेवर परिणाम करतात (3, 4). प्राण्यांच्या मॉडेल्समधील कामातून असे दिसून आले आहे की आसपासच्या ऊतींमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनच्या प्रतिसादात, रूढीवादी चयापचय मार्ग (5-7) सक्रिय केले जाऊ शकतात, जे या जटिल रोगांच्या रोगजननाच्या सखोल आकलनासाठी महत्त्वाची माहिती प्रदान करते. अगदी उलट, मेंदूच्या माइटोकॉन्ड्रियल एडेनोसिन ट्रायफॉस्फेट (ATP) उत्पादनाच्या सामान्य अपयशामुळे होणाऱ्या विशिष्ट पेशी प्रकारांच्या चयापचय बदलांबद्दलची आपली समज मूलभूत आहे (8), रोग रोखण्यासाठी किंवा प्रतिबंधित करण्यासाठी वापरल्या जाऊ शकणार्‍या उपचारात्मक लक्ष्ये ओळखण्याची गरज यावर भर देते. न्यूरोडीजनरेशन रोखा (9). माहितीचा अभाव म्हणजे आजूबाजूच्या ऊतींच्या पेशी प्रकारांच्या तुलनेत मज्जातंतू पेशींमध्ये खूप मर्यादित चयापचय लवचिकता असल्याचे मानले जाते (10). सिनॅप्टिक ट्रान्समिशनला चालना देण्यासाठी आणि दुखापत आणि रोगाच्या परिस्थितीला प्रतिसाद देण्यासाठी न्यूरॉन्सना मेटाबोलाइट्सचा पुरवठा समन्वयित करण्यात या पेशी मध्यवर्ती भूमिका बजावतात हे लक्षात घेता, मेंदूच्या ऊतींच्या आव्हानात्मक परिस्थितींमध्ये पेशी चयापचय जुळवून घेण्याची क्षमता जवळजवळ ग्लिअल पेशींपुरती मर्यादित आहे (11-14). याव्यतिरिक्त, मेंदूच्या ऊतींची अंतर्निहित सेल्युलर विषमता विशिष्ट न्यूरोनल उपसमूहांमध्ये होणाऱ्या चयापचय बदलांच्या अभ्यासात मोठ्या प्रमाणात अडथळा आणते. परिणामी, न्यूरॉन्समध्ये मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनच्या अचूक सेल्युलर आणि मेटाबोलिक परिणामांबद्दल फारसे माहिती नाही.
माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनचे चयापचय परिणाम समजून घेण्यासाठी, आम्ही माइटोकॉन्ड्रियल बाह्य पडदा संलयन (Mfn2) च्या नाशामुळे होणाऱ्या न्यूरोडीजनरेशनच्या वेगवेगळ्या टप्प्यांमध्ये पुरकिन्जे न्यूरॉन्स (PNs) वेगळे केले. मानवांमध्ये Mfn2 उत्परिवर्तन हे चारकोट-मेरी-टूथ प्रकार 2A (15) म्हणून ओळखल्या जाणाऱ्या आनुवंशिक मोटर सेन्सरी न्यूरोपॅथीच्या स्वरूपाशी संबंधित असले तरी, उंदरांमध्ये Mfn2 चा सशर्त नाश हा ऑक्सिडेशनचा एक सुप्रसिद्ध प्रेरण आहे. फॉस्फोरिलेशन (OXPHOS) डिसफंक्शन पद्धत. विविध न्यूरोनल उपप्रकार (16-19) आणि परिणामी न्यूरोडीजनरेटिव्ह फेनोटाइप हे हालचाल विकार (18, 19) किंवा सेरेबेलर अ‍ॅटॅक्सिया (16) सारख्या प्रगतीशील न्यूरोलॉजिकल लक्षणांसह असतात. लेबल-फ्री क्वांटिटेटिव्ह (LFQ) प्रोटीओमिक्स, मेटाबोलॉमिक्स, इमेजिंग आणि व्हायरोलॉजिकल पद्धतींच्या संयोजनाचा वापर करून, आम्ही दाखवतो की प्रगतीशील न्यूरोडीजनरेशन पायरुवेट कार्बोक्सिलेज (PCx) आणि एन्झाईम्सच्या अभिव्यक्तीमध्ये PN च्या धमनी स्क्लेरोसिसमध्ये सामील असलेल्या इतर घटकांना जोरदारपणे प्रेरित करते. या निष्कर्षाची प्रासंगिकता सत्यापित करण्यासाठी, आम्ही विशेषतः Mfn2-कमी असलेल्या PN मध्ये PCx च्या अभिव्यक्तीचे नियमन केले आणि असे आढळले की या ऑपरेशनमुळे ऑक्सिडेटिव्ह ताण वाढला आणि न्यूरोडीजनरेशनचा वेग वाढला, अशा प्रकारे सिद्ध झाले की अझोस्पर्मिया पेशी मृत्युला चयापचय अनुकूलता प्रदान करते. MFN2 ची तीव्र अभिव्यक्ती गंभीर OXPHOS कमतरता, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनएचा मोठ्या प्रमाणात वापर आणि स्पष्टपणे तुटलेल्या माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्कसह टर्मिनल डिजनरेशन PN ला पूर्णपणे वाचवू शकते, जे पुढे जोर देते की न्यूरोडीजनरेशनचा हा प्रकार पेशी मृत्यूपूर्वी रोगाच्या प्रगत टप्प्यात देखील बरा होऊ शकतो.
Mfn2 नॉकआउट PNs मधील मायटोकॉन्ड्रियाचे दृश्यमान करण्यासाठी, आम्ही Cre-आश्रित मायटोकॉन्ड्रियाला पिवळ्या फ्लोरोसेंट प्रथिने (YFP) (mtYFP) (20) Cre अभिव्यक्तीला लक्ष्य करण्यास अनुमती देणारा मायटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी इन विवो तपासला आणि मायटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी तपासली. आम्हाला आढळले की PNs मधील Mfn2 जनुकाचा नाश झाल्यामुळे मायटोकॉन्ड्रियल नेटवर्कचे हळूहळू विभाजन होईल (आकृती S1A), आणि सर्वात पहिला बदल 3 आठवड्यांच्या वयात आढळला. याउलट, कॅल्बिंडिन इम्युनोस्टेनिंगच्या नुकसानाने सिद्ध झालेल्या PN पेशी थराचे महत्त्वपूर्ण ऱ्हास 12 आठवड्यांच्या वयापर्यंत सुरू झाले नाही (आकृती 1, A आणि B). मायटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजीमधील सुरुवातीच्या बदल आणि न्यूरोनल डेथच्या दृश्यमान प्रारंभामधील वेळेच्या विसंगतीमुळे आम्हाला पेशी मृत्यूपूर्वी मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनमुळे होणाऱ्या चयापचय बदलांची तपासणी करण्यास प्रवृत्त केले. आम्ही YFP (YFP+)-एक्सप्रेसिंग PN (आकृती 1C) आणि नियंत्रण उंदरांमध्ये (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) वेगळे करण्यासाठी फ्लोरोसेन्स-अ‍ॅक्टिव्हेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS)-आधारित धोरण विकसित केले, ज्याला यापुढे CTRL (आकृती S1B) असे संबोधले जाईल. YFP सिग्नलच्या सापेक्ष तीव्रतेवर आधारित गेटिंग धोरणाचे ऑप्टिमायझेशन आम्हाला PN च्या YFP+ बॉडी (YFPhigh) ला नॉन-PNs (YFPneg) (आकृती S1B) किंवा पुटेटिव्ह फ्लोरोसेंट अॅक्सॉन/डेंड्रिटिक फ्रॅगमेंट्स (YFPlow; आकृती S1D, डावीकडे), कॉन्फोकल मायक्रोस्कोप (आकृती S1D, उजवीकडे) द्वारे पुष्टी केलेल्या पासून शुद्ध करण्यास अनुमती देते. वर्गीकृत लोकसंख्येची ओळख पडताळण्यासाठी, आम्ही LFQ प्रोटीओमिक्स आणि नंतर प्रमुख घटक विश्लेषण केले आणि आढळले की YFPhigh आणि YFPneg पेशींमध्ये (आकृती S1C) स्पष्ट पृथक्करण आहे. YFPhigh पेशींनी ज्ञात PNs मार्करचे (म्हणजे Calb1, Pcp2, Grid2 आणि Itpr3) निव्वळ संवर्धन दाखवले (21, 22), परंतु न्यूरॉन्स किंवा इतर पेशी प्रकारांमध्ये सामान्यतः व्यक्त केलेल्या प्रथिनांचे कोणतेही संवर्धन झाले नाही (आकृती 1D). स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये गोळा केलेल्या वर्गीकृत YFPhigh पेशींमधील नमुन्यांमधील तुलना केल्याने सहसंबंध गुणांक> 0.9 दिसून आला, जो जैविक प्रतिकृतींमध्ये चांगली पुनरुत्पादकता दर्शवितो (आकृती S1E). थोडक्यात, या डेटाने व्यवहार्य PN च्या तीव्र आणि विशिष्ट अलगावसाठी आमच्या योजनेची पुष्टी केली. कारण वापरलेली L7-cre ड्रायव्हर प्रणाली प्रसूतीनंतर पहिल्या आठवड्यात मोज़ेक पुनर्संयोजन प्रेरित करते (23), आम्ही CTRL मधून उंदीर काढणे सुरू केले आणि सशर्त (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) न्यूरॉन्स गोळा केले. पुनर्संयोजन पूर्ण झाल्यानंतर, 4 आठवड्यांच्या वयात त्याला Mfn2cKO म्हणतात. शेवटचा मुद्दा म्हणून, आम्ही ८ आठवड्यांचा वय निवडला जेव्हा स्पष्ट माइटोकॉन्ड्रियल फ्रॅगमेंटेशन असूनही पीएन थर अखंड होता (आकृती १ बी आणि आकृती एस१ ए). एकूण, आम्ही एकूण ३०१३ प्रथिने मोजली, त्यापैकी सुमारे २२% मायटोकार्ता २.० भाष्यांवर आधारित होते जे मायटोकॉन्ड्रियल प्रोटीओमवर आधारित होते (आकृती १ ई) (आकृती १ ई) (२४). आठवडा ८ मध्ये केलेल्या विभेदक जीन अभिव्यक्ती विश्लेषणातून असे दिसून आले की सर्व प्रथिनांपैकी फक्त १०.५% मध्ये लक्षणीय बदल झाले (आकृती १ एफ आणि आकृती एस१ एफ), ज्यापैकी १९५ प्रथिने डाउन-रेग्युलेटेड होती आणि १२० प्रथिने अप-रेग्युलेटेड होती (आकृती १ एफ). हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की या डेटा सेटचे "इनोव्हेटिव्ह पाथवे विश्लेषण" दर्शविते की विभेदकपणे व्यक्त केलेले जीन्स प्रामुख्याने विशिष्ट चयापचय मार्गांच्या मर्यादित संचाशी संबंधित आहेत (आकृती १ जी). मनोरंजक गोष्ट म्हणजे, OXPHOS आणि कॅल्शियम सिग्नलिंगशी संबंधित मार्गांचे डाउनरेग्युलेशन फ्यूजन-कमी असलेल्या PN मध्ये मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनच्या प्रेरणेची पुष्टी करत असले तरी, मुख्यतः अमीनो अॅसिड चयापचय समाविष्ट असलेल्या इतर श्रेणींमध्ये लक्षणीयरीत्या वाढ केली जाते, जी मायटोकॉन्ड्रियल PN मध्ये होणाऱ्या चयापचयाशी सुसंगत आहे. रीवायरिंग सुसंगत आहे. डिसफंक्शन.
(अ) CTRL आणि Mfn2cKO उंदरांच्या सेरेबेलर विभागांचे प्रातिनिधिक कॉन्फोकल छायाचित्रे ज्यामध्ये PNs (कॅल्बिंडिन, राखाडी) चे प्रगतीशील नुकसान दिसून येते; केंद्रक DAPI सह काउंटरस्टेन केले गेले. (ब) (अ) चे परिमाण (प्रचलनाचे एकतर्फी विश्लेषण, ***P<0.001; n = तीन उंदरांपासून 4 ते 6 वर्तुळे). (क) प्रायोगिक कार्यप्रवाह. (ड) पुरकिन्जे (वर) आणि इतर पेशी प्रकारांसाठी (मध्यम) विशिष्ट मार्करचे उष्णता नकाशा वितरण. (ई) वर्गीकृत PN मध्ये ओळखल्या जाणाऱ्या माइटोकॉन्ड्रियल प्रथिनांची संख्या दर्शविणारा व्हेन आकृती. (फ) 8 आठवड्यात Mfn2cKO न्यूरॉन्समध्ये भिन्नपणे व्यक्त केलेल्या प्रथिनांचा ज्वालामुखी प्लॉट (महत्त्वपूर्ण कट-ऑफ मूल्य 1.3). (ग) सर्जनशीलता मार्ग विश्लेषण 8 आठवड्यांमध्ये वर्गीकृत Mfn2cKO PN मधील पाच सर्वात महत्वाचे अप-रेग्युलेशन (लाल) आणि डाउन-रेग्युलेशन (निळा) मार्ग दर्शविते. प्रत्येक शोधलेल्या प्रथिनाची सरासरी अभिव्यक्ती पातळी दर्शविली आहे. ग्रेस्केल हीट मॅप: समायोजित P मूल्य. ns, महत्त्वाचे नाही.
प्रोटिओमिक्स डेटावरून असे दिसून आले की कॉम्प्लेक्स I, III आणि IV ची प्रथिने अभिव्यक्ती हळूहळू कमी झाली. कॉम्प्लेक्स I, III आणि IV मध्ये सर्व आवश्यक mtDNA-एनकोडेड सबयूनिट होते, तर कॉम्प्लेक्स II, जे फक्त न्यूक्लियर-कोडेड होते, ते मुळात अप्रभावित होते (आकृती 2A आणि आकृती S2A). प्रोटिओमिक्स निकालांशी सुसंगत, सेरेबेलर टिश्यू सेक्शनच्या इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीमध्ये असे दिसून आले की PN मधील कॉम्प्लेक्स IV ची MTCO1 (मायटोकॉन्ड्रियल सायटोक्रोम C ऑक्सिडेस सबयूनिट 1) सबयूनिट पातळी हळूहळू कमी झाली (आकृती 2B). mtDNA-एनकोडेड सबयूनिट Mtatp8 लक्षणीयरीत्या कमी झाली (आकृती S2A), तर न्यूक्लियर-एनकोडेड ATP सिंथेस सबयूनिटची स्थिर-स्थिती पातळी अपरिवर्तित राहिली, जी mtDNA अभिव्यक्ती स्थिर असताना ज्ञात स्थिर ATP सिंथेस सबयूनिट F1 कॉम्प्लेक्सशी सुसंगत आहे. निर्मिती सुसंगत आहे. व्यत्यय (7). रिअल-टाइम पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन (qPCR) द्वारे क्रमवारी लावलेल्या Mfn2cKO PNs मधील mtDNA पातळीचे मूल्यांकन केल्याने mtDNA कॉपी नंबरमध्ये हळूहळू घट झाल्याची पुष्टी झाली. नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, 8 आठवड्यांच्या वयात, mtDNA पातळीच्या फक्त 20% राखले गेले (आकृती 2C). या निकालांशी सुसंगत, Mfn2cKO PNs चे कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपी स्टेनिंग डीएनए शोधण्यासाठी वापरले गेले, जे माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोटाइड्सचा वेळ-अवलंबित वापर दर्शविते (आकृती 2D). आम्हाला आढळले की माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन डिग्रेडेशन आणि स्ट्रेस रिस्पॉन्समध्ये सामील असलेल्या काही उमेदवारांनाच अप-रेग्युलेट केले गेले, ज्यात Lonp1, Afg3l2 आणि Clpx आणि OXPHOS कॉम्प्लेक्स असेंब्ली घटकांचा समावेश आहे. एपोप्टोसिसमध्ये सहभागी असलेल्या प्रथिनांच्या पातळीत कोणतेही महत्त्वपूर्ण बदल आढळले नाहीत (आकृती S2B). त्याचप्रमाणे, आम्हाला आढळले की कॅल्शियम वाहतुकीत सहभागी असलेल्या माइटोकॉन्ड्रिया आणि एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम चॅनेलमध्ये फक्त किरकोळ बदल आहेत (आकृती S2C). याव्यतिरिक्त, ऑटोफॅगीशी संबंधित प्रथिनांच्या मूल्यांकनात कोणतेही महत्त्वपूर्ण बदल आढळले नाहीत, जे इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री आणि इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (आकृती S3) द्वारे विवोमध्ये आढळलेल्या ऑटोफॅगोसोम्सच्या दृश्यमान प्रेरणाशी सुसंगत आहे. तथापि, PNs मध्ये प्रगतीशील OXPHOS बिघाड स्पष्ट अल्ट्रास्ट्रक्चरल माइटोकॉन्ड्रियल बदलांसह आहे. 5 आणि 8 आठवड्यांच्या Mfn2cKO PNs च्या पेशींच्या शरीरात आणि डेंड्रिटिक झाडांमध्ये माइटोकॉन्ड्रियल क्लस्टर्स दिसू शकतात आणि आतील पडद्याच्या संरचनेत खोलवर बदल झाले आहेत (आकृती S4, A आणि B). या अल्ट्रास्ट्रक्चरल बदलांशी आणि mtDNA मध्ये लक्षणीय घट झाल्यामुळे, टेट्रामेथिलरोहोडामाइन मिथाइल एस्टर (TMRM) सह तीव्र सेरेब्रल सेरेबेलर स्लाइसचे विश्लेषण दर्शविते की Mfn2cKO PNs मधील माइटोकॉन्ड्रियल पडदा क्षमता लक्षणीयरीत्या कमी झाली आहे (आकृती S4C).
(अ) OXPHOS कॉम्प्लेक्सच्या अभिव्यक्ती पातळीचे टाइम कोर्स विश्लेषण. ८ आठवड्यात फक्त P<0.05 असलेल्या प्रथिनांचा विचार करा (टू-वे ANOVA). ठिपकेदार रेषा: CTRL च्या तुलनेत कोणतेही समायोजन नाही. (ब) डावीकडे: अँटी-MTCO1 अँटीबॉडी (स्केल बार, २० μm) सह लेबल केलेल्या सेरेबेलर सेक्शनचे उदाहरण. पुरकिन्जे पेशींच्या शरीरांनी व्यापलेला क्षेत्र पिवळ्या रंगाने व्यापलेला आहे. उजवीकडे: MTCO1 पातळीचे परिमाण (प्रचलनाचे एकतर्फी विश्लेषण; तीन उंदरांमधून विश्लेषण केलेले n = ७ ते २० पेशी). (क) क्रमवारी लावलेल्या PN मध्ये mtDNA कॉपी नंबरचे qPCR विश्लेषण (प्रचलनाचे एकतर्फी विश्लेषण; n = ३ ते ७ उंदर). (ड) डावीकडे: अँटी-DNA अँटीबॉडी (स्केल बार, २० μm) सह लेबल केलेल्या सेरेबेलर स्लाइसचे उदाहरण. पुरकिन्जे पेशींच्या शरीरांनी व्यापलेला क्षेत्र पिवळ्या रंगाने व्यापलेला आहे. उजवीकडे: mtDNA जखमांचे परिमाणीकरण (प्रचलिततेचे एकतर्फी विश्लेषण; तीन उंदरांमधील n = 5 ते 9 पेशी). (E) संपूर्ण-सेल पॅच क्लॅम्प रेकॉर्डिंगमध्ये mitoYFP + पुरकिन्जे पेशी (बाण) दर्शविणाऱ्या तीव्र सेरेबेलर विभागाचे उदाहरण. (F) IV वक्रचे परिमाणीकरण. (G) CTRL आणि Mfn2cKO पुरकिन्जे पेशींमध्ये डिपोलरायझिंग करंट इंजेक्शनचे प्रतिनिधी रेकॉर्डिंग. शीर्ष ट्रेस: ​​AP ट्रिगर करणारी पहिली नाडी. तळाचा ट्रेस: ​​कमाल AP वारंवारता. (H) पोस्टसिनॅप्टिक स्पोंटेन्फिक इनपुट (sPSPs) चे परिमाणीकरण. प्रतिनिधी रेकॉर्डिंग ट्रेस आणि त्याचे झूम गुणोत्तर (I) मध्ये दर्शविले आहे. तीन उंदरांमधील n = 5 ते 20 पेशींचे विश्लेषण केलेल्या भिन्नतेचे एकतर्फी विश्लेषण. डेटा सरासरी ±SEM म्हणून व्यक्त केला जातो; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) छिद्रित पॅच क्लॅम्प मोड वापरून रेकॉर्ड केलेल्या उत्स्फूर्त AP चे प्रतिनिधी ट्रेस. शीर्ष ट्रेस: ​​कमाल AP वारंवारता. तळाचा ट्रेस: ​​एका AP चा झूम. (K) (J) नुसार सरासरी आणि कमाल AP वारंवारता मोजा. मान-व्हिटनी चाचणी; चार उंदरांमधून n = 5 पेशींचे विश्लेषण केले गेले. डेटा सरासरी±SEM म्हणून व्यक्त केला आहे; महत्त्वाचा नाही.
८ आठवड्यांच्या Mfn2cKO PN मध्ये स्पष्ट OXPHOS नुकसान आढळून आले, जे दर्शविते की न्यूरॉन्सचे शारीरिक कार्य गंभीरपणे असामान्य आहे. म्हणून, आम्ही तीव्र सेरेबेलर स्लाइसमध्ये संपूर्ण-सेल पॅच क्लॅम्प रेकॉर्डिंग करून ४ ते ५ आठवडे आणि ७ ते ८ आठवड्यांमध्ये OXPHOS-कमी असलेल्या न्यूरॉन्सच्या निष्क्रिय विद्युत वैशिष्ट्यांचे विश्लेषण केले (आकृती २E). अनपेक्षितपणे, Mfn2cKO न्यूरॉन्सची सरासरी विश्रांती पडदा क्षमता आणि इनपुट प्रतिरोध नियंत्रणासारखेच होते, जरी पेशींमध्ये सूक्ष्म फरक होते (तक्ता १). त्याचप्रमाणे, ४ ते ५ आठवड्यांच्या वयात, वर्तमान-व्होल्टेज संबंधात (IV वक्र) कोणतेही महत्त्वपूर्ण बदल आढळले नाहीत (आकृती २F). तथापि, ७ ते ८ आठवड्यांचे कोणतेही Mfn2cKO न्यूरॉन्स IV पथ्ये (हायपरपोलरायझेशन स्टेप) पासून वाचले नाहीत, जे दर्शविते की या शेवटच्या टप्प्यावर हायपरपोलरायझेशन संभाव्यतेसाठी स्पष्ट संवेदनशीलता आहे. याउलट, Mfn2cKO न्यूरॉन्समध्ये, पुनरावृत्ती होणाऱ्या क्रिया क्षमता (AP) डिस्चार्जला कारणीभूत असलेले डिपोलरायझिंग करंट्स चांगल्या प्रकारे सहन केले जातात, जे दर्शविते की त्यांचे एकूण डिस्चार्ज पॅटर्न 8-आठवड्या जुन्या नियंत्रण न्यूरॉन्सपेक्षा लक्षणीयरीत्या वेगळे नाहीत (तक्ता 1 आणि आकृती 2G). त्याचप्रमाणे, उत्स्फूर्त पोस्टसिनॅप्टिक करंट्स (sPSCs) ची वारंवारता आणि मोठेपणा नियंत्रण गटाच्या तुलनेत तुलनात्मक होते आणि घटनांची वारंवारता 4 आठवड्यांपासून 5 आठवड्यांपासून 7 आठवड्यांपासून 8 आठवड्यांपर्यंत समान वाढीसह वाढली (आकृती 2, H आणि I). PNs मध्ये सिनॅप्टिक परिपक्वताचा कालावधी (25). छिद्रित PNs पॅचनंतर समान परिणाम प्राप्त झाले. हे कॉन्फिगरेशन संपूर्ण-सेल पॅच क्लॅम्प रेकॉर्डिंगमध्ये होऊ शकणार्‍या सेल्युलर ATP दोषांच्या संभाव्य भरपाईला प्रतिबंधित करते. विशेषतः, Mfn2cKO न्यूरॉन्सची विश्रांती झिल्ली क्षमता आणि उत्स्फूर्त फायरिंग वारंवारता प्रभावित झाली नाही (आकृती 2, J आणि K). थोडक्यात, हे निकाल असे दर्शवितात की स्पष्ट OXPHOS बिघडलेले PN उच्च-फ्रिक्वेन्सी डिस्चार्ज पॅटर्नशी चांगल्या प्रकारे सामना करू शकतात, हे दर्शविते की एक भरपाई यंत्रणा आहे जी त्यांना जवळजवळ सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रतिसाद राखण्यास अनुमती देते.
डेटा सरासरी ± SEM (प्रचलनाचे एकतर्फी विश्लेषण, होल्म-सिडकची बहु-तुलना चाचणी; *P<0.05) म्हणून व्यक्त केला जातो. युनिट क्रमांक कंसाने दर्शविला जातो.
प्रोटीओमिक्स डेटासेट (आकृती 1G) मधील कोणत्याही श्रेणीमध्ये गंभीर OXPHOS कमतरतेचा प्रतिकार करू शकणारे मार्ग आहेत का हे तपासण्यासाठी आम्ही निघालो, ज्यामुळे प्रभावित PN जवळजवळ सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का राखू शकतो हे स्पष्ट होते (आकृती 2, E ते K). प्रोटीओमिक्स विश्लेषणातून असे दिसून आले की ब्रँचेड चेन अमीनो अॅसिड (BCAA) च्या कॅटाबोलिझममध्ये सामील असलेले एन्झाईम लक्षणीयरीत्या वाढले होते (आकृती 3A आणि आकृती S5A), आणि अंतिम उत्पादन एसिटाइल-CoA (CoA) किंवा सक्सीनाइल CoA आर्टेरिओस्क्लेरोसिस अॅसिड (TCA) चक्रात ट्रायकार्बोक्झिलेट्सना पूरक ठरू शकते. आम्हाला आढळले की BCAA ट्रान्समिनेज 1 (BCAT1) आणि BCAT2 दोन्हीची सामग्री वाढली आहे. ते α-केटोग्लुटारेट (26) पासून ग्लूटामेट निर्माण करून BCAA कॅटाबोलिझमच्या पहिल्या टप्प्याला उत्प्रेरक करतात. ब्रँचेड चेन केटो अॅसिड डिहायड्रोजनेज (BCKD) कॉम्प्लेक्स बनवणारे सर्व सबयुनिट्स अपरेग्युलेटेड आहेत (हे कॉम्प्लेक्स परिणामी BCAA कार्बन स्केलेटनच्या त्यानंतरच्या आणि अपरिवर्तनीय डिकार्बोक्सिलेशनला उत्प्रेरक करते) (आकृती 3A आणि आकृती S5A). तथापि, क्रमवारी लावलेल्या PN मध्ये BCAA मध्ये कोणतेही स्पष्ट बदल आढळले नाहीत, जे या आवश्यक अमीनो अॅसिडच्या वाढत्या सेल्युलर अपटेकमुळे किंवा TCA सायकलला पूरक म्हणून इतर स्त्रोतांचा (ग्लुकोज किंवा लॅक्टिक अॅसिड) वापरामुळे असू शकते (आकृती S5B). OXPHOS नसलेल्या PN मध्ये 8 आठवड्यांच्या वयात ग्लूटामाइन विघटन आणि ट्रान्समिनेशन क्रियाकलापांमध्ये वाढ दिसून आली, जी मायटोकॉन्ड्रियल एन्झाईम्स ग्लूटामाइनेज (GLS) आणि ग्लूटामाइन पायरुवेट ट्रान्समिनेज 2 (GPT2) (आकृती 3, A आणि C) च्या अप-रेग्युलेशनद्वारे प्रतिबिंबित होऊ शकते. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की GLS चे अप-रेग्युलेशन स्प्लिस्ड आयसोफॉर्म ग्लूटामिनेज C (GLS-GAC) पर्यंत मर्यादित आहे (Mfn2cKO/CTRL चे बदल अंदाजे 4.5-पट आहे, P = 0.05), आणि कर्करोगाच्या ऊतींमध्ये त्याचे विशिष्ट अप-रेग्युलेशन माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जीला समर्थन देऊ शकते. (27).
(अ) उष्णता नकाशा 8 आठवड्यांत निर्दिष्ट मार्गासाठी प्रथिने पातळीमध्ये घडी बदल दर्शवितो. (ब) अँटी-पीसीएक्स अँटीबॉडी (स्केल बार, 20 μm) सह लेबल केलेल्या सेरेबेलर स्लाइसचे उदाहरण. पिवळा बाण पुरकिन्जे पेशी शरीराकडे निर्देशित करतो. (क) एथेरोस्क्लेरोसिससाठी एक महत्त्वाचा उमेदवार म्हणून ओळखले जाणारे टाइम कोर्स प्रोटीन अभिव्यक्ती विश्लेषण (मल्टिपल टी-टेस्ट, *FDR <5%; n = 3-5 उंदीर). (ड) वरील: [1-13C]पायरुवेट ट्रेसरमध्ये असलेल्या लेबल केलेल्या कार्बनमध्ये प्रवेश करण्याचे वेगवेगळे मार्ग दर्शविणारा एक योजनाबद्ध आकृती (म्हणजेच, PDH किंवा ट्रान्स-आर्टेरियल मार्गाद्वारे). तळाशी: व्हायोलिन चार्ट [1-13C]पायरुवेट (पेअर केलेले टी-टेस्ट; ** P <0.01) सह तीव्र सेरेबेलर स्लाइस लेबल केल्यानंतर एस्पार्टिक अॅसिड, सायट्रिक अॅसिड आणि मॅलिक अॅसिडमध्ये रूपांतरित झालेल्या सिंगल-लेबल केलेल्या कार्बन (M1) ची टक्केवारी दर्शवितो. (ई) दर्शविलेल्या मार्गाचे व्यापक वेळ इतिहास विश्लेषण. ८ आठवड्यांत फक्त P<0.05 असलेल्या प्रथिनांचा विचार करा. तुटक रेषा: कोणतेही समायोजन मूल्य नाही (प्रचरणाचे द्वि-मार्गी विश्लेषण; * P <0.05; *** P <0.001). डेटा सरासरी±SEM म्हणून व्यक्त केला जातो.
आमच्या विश्लेषणात, BCAA कॅटाबॉलिझम हा प्रमुख अप-नियमन मार्गांपैकी एक बनला आहे. हे तथ्य जोरदारपणे सूचित करते की TCA सायकलमध्ये प्रवेश करणारे वायुवीजन प्रमाण OXPHOS नसलेल्या PN मध्ये बदलले जाऊ शकते. हे न्यूरोनल मेटाबॉलिक रीवायरिंगचे एक प्रमुख स्वरूप दर्शवू शकते, ज्याचा गंभीर OXPHOS डिसफंक्शनच्या देखभालीदरम्यान न्यूरोनल फिजियोलॉजी आणि जगण्यावर थेट परिणाम होऊ शकतो. या गृहीतकाशी सुसंगत, आम्हाला आढळले की मुख्य अँटी-एथेरोस्क्लेरोटिक एंझाइम PCx अप-नियमित आहे (Mfn2cKO/CTRL अंदाजे 1.5 वेळा बदलते; आकृती 3A), जे पायरुवेटचे ऑक्सॅलोएसीटेटमध्ये रूपांतरण उत्प्रेरित करते (28), जे मेंदूच्या ऊतींमध्ये असल्याचे मानले जाते. मधील अभिव्यक्ती अॅस्ट्रोसाइट्सपुरती मर्यादित आहे (29, 30). प्रोटिओमिक्स निकालांशी सुसंगत, कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपीने दर्शविले की OXPHOS-कमी असलेल्या PN मध्ये PCx अभिव्यक्ती विशेषतः आणि लक्षणीयरीत्या वाढली होती, तर PCx प्रतिक्रियाशीलता प्रामुख्याने नियंत्रणाच्या जवळच्या बर्गमन ग्लियल पेशींपर्यंत मर्यादित होती (आकृती 3B). PCx च्या निरीक्षण केलेल्या अपरेग्युलेशनची कार्यात्मक चाचणी करण्यासाठी, आम्ही [1-13C] पायरुवेट ट्रेसरने तीव्र सेरेबेलर स्लाइसवर उपचार केले. जेव्हा पायरुवेटचे पायरुवेट डिहायड्रोजनेज (PDH) द्वारे ऑक्सिडायझेशन केले जाते, तेव्हा त्याचे समस्थानिक लेबल गायब होते, परंतु जेव्हा पायरुवेटचे संवहनी अभिक्रियांद्वारे चयापचय केले जाते तेव्हा ते TCA सायकल इंटरमीडिएट्समध्ये समाविष्ट होते (आकृती 3D). आमच्या प्रोटीओमिक्स डेटाच्या समर्थनार्थ, आम्ही Mfn2cKO स्लाइसच्या एस्पार्टिक अॅसिडमध्ये या ट्रेसरमधून मोठ्या प्रमाणात मार्कर पाहिले, तर सायट्रिक अॅसिड आणि मॅलिक अॅसिडमध्ये देखील मध्यम ट्रेंड होता, जरी तो लक्षणीय नव्हता (आकृती 3D).
डोपामाइन न्यूरॉन्स विशेषतः माइटोकॉन्ड्रियल ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर ए जीन (टीफॅम) नष्ट करतात (आकृती एस६बी) मुळे माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन असलेल्या मिटोपार्क उंदरांच्या डोपामाइन न्यूरॉन्समध्ये, पीसीएक्स अभिव्यक्ती देखील लक्षणीयरीत्या वाढली होती (३१), जी दर्शवते की एसीटोन अॅसिड आर्टेरिओस्क्लेरोसिस शरीरातील न्यूरोनल OXPHOS च्या बिघडलेल्या कार्यादरम्यान रोगाची घटना नियंत्रित केली जाते. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की असे आढळून आले आहे की आर्टेरिओस्क्लेरोसिसशी संबंधित असू शकणाऱ्या न्यूरॉन्समध्ये व्यक्त होणारे अद्वितीय एंजाइम (३२-३४) प्रोपियोनिल-CoA कार्बोक्झिलेज (PCC-A) सारख्या OXPHOS नसलेल्या PN मध्ये लक्षणीयरीत्या वाढले आहेत, मॅलोनिल-CoA प्रोपियोनिल-CoA मध्ये रूपांतरित करते आणि माइटोकॉन्ड्रियल मॅलिक एंजाइम ३ (ME3), ज्याची मुख्य भूमिका मॅलेटमधून पायरुवेट पुनर्प्राप्त करणे आहे (आकृती ३, ए आणि सी) (३३, ३५). याव्यतिरिक्त, आम्हाला Pdk3 एन्झाइममध्ये लक्षणीय वाढ आढळली, जी फॉस्फोरिलेट करते आणि अशा प्रकारे PDH निष्क्रिय करते (36), तर PDH सक्रिय करणाऱ्या Pdp1 एन्झाइममध्ये किंवा PDH एन्झाइम कॉम्प्लेक्समध्ये कोणतेही बदल आढळले नाहीत (आकृती 3A). सातत्याने, Mern2cKO PNs मध्ये, Ser293 (PDH च्या एन्झाइम क्रियाकलापांना प्रतिबंधित करण्यासाठी ओळखले जाणारे) मधील PDH कॉम्प्लेक्सच्या पायरुवेट डिहायड्रोजनेज E1 घटकाच्या α1 सबयूनिट α (PDHE1α) सबयूनिटचे फॉस्फोरायलेशन वाढवले ​​गेले (आकृती S6C) (आकृती S6C). पायरुवेटला रक्तवहिन्यासंबंधी प्रवेश नाही.
शेवटी, आम्हाला आढळले की सक्रियकरण प्रक्रियेदरम्यान, सेरीन आणि ग्लाइसिन बायोसिंथेसिसचा सुपर मार्ग, संबंधित मायटोकॉन्ड्रियल फोलेट (1C) सायकल आणि प्रोलाइन बायोसिंथेसिस (आकृती 1G आणि आकृती S5C) हे सर्व लक्षणीयरीत्या नियंत्रित केले जातात. आजूबाजूच्या ऊती माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनसह सक्रिय होतात (5-7). या प्रोटिओमिक्स डेटाला समर्थन देणाऱ्या कॉन्फोकल विश्लेषणातून असे दिसून आले की OXPHOS नसलेल्या PN मध्ये, 8 आठवड्यांच्या उंदरांच्या सेरेबेलर स्लाइसना मायटोकॉन्ड्रियल फोलेट सायकलचा एक प्रमुख एंजाइम सेरीन हायड्रॉक्सीमेथिलट्रान्सफेरेज 2 (SHMT2) च्या अधीन केले गेले. लक्षणीय रोगप्रतिकारक प्रतिसाद (आकृती S5D). 13 CU-ग्लुकोज-इन्क्युबेटेड तीव्र सेरेबेलर स्लाइसमध्ये, मेटाबोलिक ट्रेसिंग प्रयोगांनी सेरीन आणि प्रोलाइन बायोसिंथेसिसच्या अप-रेग्युलेशनची पुष्टी केली, जे दर्शवते की सेरीन आणि प्रोलाइनमध्ये कार्बन आयसोफॉर्मचा प्रवाह वाढला आहे (आकृती S5E). GLS आणि GPT2 द्वारे प्रोत्साहित केलेल्या प्रतिक्रिया ग्लूटामाइनपासून ग्लूटामेटच्या संश्लेषणासाठी आणि ग्लूटामेट आणि α-केटोग्लुटारेटमधील ट्रान्सअमिनेशनसाठी जबाबदार असल्याने, त्यांचे अपरेग्युलेशन दर्शविते की OXPHOS-कमी असलेल्या न्यूरॉन्सना ग्लूटामेटची मागणी वाढते आहे, हे प्रोलाइनचे वाढलेले जैवसंश्लेषण राखण्यासाठी असू शकते (आकृती S5C). या बदलांच्या उलट, PN-विशिष्ट Mfn2cKO उंदरांच्या सेरेबेलर अॅस्ट्रोसाइट्सच्या प्रोटिओमिक विश्लेषणातून असे दिसून आले की हे मार्ग (सर्व अँटीपेरोक्सिडेसेससह) अभिव्यक्तीमध्ये लक्षणीय बदल झाले नाहीत, अशा प्रकारे हे दर्शविते की हे चयापचय पुनर्निर्देशन क्षीण झालेल्या PN (आकृती S6, D ते G) साठी निवडक आहे.
थोडक्यात, या विश्लेषणांनी PNs मध्ये विशिष्ट चयापचय मार्गांच्या तात्पुरत्या सक्रियतेचे लक्षणीय भिन्न नमुने उघड केले. जरी असामान्य न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शनमुळे लवकर एथेरोस्क्लेरोसिस आणि 1C रीमॉडेलिंग होऊ शकते (आकृती 3E आणि आकृती S5C), आणि अगदी I आणि IV कॉम्प्लेक्सच्या अभिव्यक्तीमध्ये अंदाजे बदल देखील होऊ शकतात, सेरीन डी नोवो संश्लेषणातील बदल केवळ उशीरा टप्प्यातच स्पष्ट झाले. OXPHOS डिसफंक्शन (आकृती 3E आणि आकृती S5C). हे निष्कर्ष एक अनुक्रमिक प्रक्रिया परिभाषित करतात ज्यामध्ये ताण-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल (1C सायकल) आणि सायटोप्लाज्मिक (सेरीन बायोसिंथेसिस) न्यूरोनल चयापचय पुन्हा आकार देण्यासाठी TCA सायकलमधील एथेरोस्क्लेरोसिसच्या वाढीसह सहक्रियात्मकपणे प्रतिसाद देतात.
८ आठवड्यांचे OXPHOS-कमी असलेले PN उच्च-फ्रिक्वेन्सी उत्तेजना क्रियाकलाप राखू शकतात आणि माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनची भरपाई करण्यासाठी लक्षणीय चयापचय पुनर्संयोजन करू शकतात. या शोधामुळे एक मनोरंजक शक्यता निर्माण होते की या क्षणी देखील, या पेशींना न्यूरोडीजनरेशनला विलंब करण्यासाठी किंवा रोखण्यासाठी उपचारात्मक हस्तक्षेप मिळू शकतो. उशीरा. आम्ही दोन स्वतंत्र हस्तक्षेपांद्वारे ही शक्यता सोडवली. पहिल्या पद्धतीमध्ये, आम्ही Cre-dependent adeno-associated virus (AAV) वेक्टर डिझाइन केले जेणेकरून MFN2 निवडकपणे OXPHOS-कमी असलेल्या PNs इन विवोमध्ये व्यक्त करता येईल (आकृती S7A). AAV एन्कोडिंग MFN2 आणि फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन mCherry (Mfn2-AAV) प्राथमिक न्यूरॉन कल्चर इन विट्रोमध्ये सत्यापित केले गेले, ज्यामुळे MFN2 Cre-dependent पद्धतीने व्यक्त झाला आणि माइटोकॉन्ड्रियल आकारविज्ञान वाचले, ज्यामुळे Mfn2cKO न्यूरॉन्समध्ये न्यूरोम्युटेशन रोखले गेले (आकृती S7, B, D आणि E). पुढे, आम्ही 8 आठवड्यांच्या Mfn2-AAV ला Mfn2cKO आणि नियंत्रण उंदरांच्या सेरेबेलर कॉर्टेक्समध्ये स्टिरियोटॅक्टिकली पोहोचवण्यासाठी इन व्हिव्हो प्रयोग केले आणि 12 आठवड्यांच्या उंदरांचे विश्लेषण केले (आकृती 4A). उपचारित Mfn2cKO उंदीर मरण पावले (आकृती 1, A आणि B) (16). इन व्हिव्हो विषाणू ट्रान्सडक्शनमुळे काही सेरेबेलर वर्तुळांमध्ये PN ची निवडक अभिव्यक्ती झाली (आकृती S7, G आणि H). फक्त mCherry (Ctrl-AAV) व्यक्त करणाऱ्या नियंत्रण AAV च्या इंजेक्शनचा Mfn2cKO प्राण्यांमध्ये न्यूरोडीजनरेशनच्या डिग्रीवर कोणताही महत्त्वपूर्ण परिणाम झाला नाही. याउलट, Mfn2-AAV सह ट्रान्सड्यूस केलेल्या Mfn2cKO च्या विश्लेषणाने PN पेशी थराचा (आकृती 4, B आणि C) महत्त्वपूर्ण संरक्षणात्मक प्रभाव दर्शविला. विशेषतः, न्यूरॉन घनता नियंत्रण प्राण्यांपासून जवळजवळ अविभाज्य दिसते (आकृती 4, B आणि C, आणि आकृती S7, H आणि I). MFN1 ची अभिव्यक्ती परंतु MFN2 नाही तर न्यूरोनल डेथ वाचवण्यासाठी तितकीच प्रभावी आहे (आकृती 4C आणि आकृती S7, C आणि F), जे सूचित करते की एक्टोपिक MFN1 ची अभिव्यक्ती MFN2 च्या कमतरतेला प्रभावीपणे पूरक ठरू शकते. सिंगल PN स्तरावर पुढील विश्लेषणातून असे दिसून आले की Mfn2-AAV ने मोठ्या प्रमाणात मायटोकॉन्ड्रियाच्या अल्ट्रास्ट्रक्चरला वाचवले, mtDNA पातळी सामान्य केली आणि अँटी-एंजियोजेनेसिस मार्कर PCx ची उच्च अभिव्यक्ती उलट केली (आकृती 4, C ते E). विश्रांतीच्या स्थितीत सुटका केलेल्या Mfn2cKO उंदरांच्या दृश्य तपासणीत असे दिसून आले की त्यांची स्थिती आणि मोटर लक्षणे (हालचाल S1 ते S3) सुधारली गेली. शेवटी, या प्रयोगांवरून असे दिसून येते की OXPHOS मध्ये गंभीरपणे कमतरता असलेल्या PN मध्ये MFN2 चे विलंबित पुनर्प्रवेश mtDNA वापर उलट करण्यासाठी आणि एथेरोस्क्लेरोसिसला प्रेरित करण्यासाठी पुरेसे आहे, ज्यामुळे अॅक्सॉन डिजनरेशन आणि व्हिव्होमध्ये न्यूरोनल डेथ टाळता येतो.
(अ) दर्शविलेले चयापचय मार्ग सक्रिय झाल्यावर AAV एन्कोडिंग MFN2 इंजेक्ट करण्यासाठी प्रायोगिक वेळापत्रक दर्शविणारी योजना. (ब) Mfn2cKO उंदरांमध्ये 8 आठवड्यांनी ट्रान्सड्यूस केलेल्या आणि अँटी-कॅल्बिंडिन अँटीबॉडीने लेबल केलेल्या 12 आठवड्यांच्या सेरेबेलर स्लाइसच्या प्रतिनिधी कॉन्फोकल प्रतिमा. उजवीकडे: अ‍ॅक्सॉन फायबरचे स्केलिंग. अ‍ॅक्सॉन झूमचे स्केल 450 आणि 75 μm आहे. (क) डावीकडे: AAV ट्रान्सड्यूस लूप (AAV+) मध्ये पुरकिन्जे सेल घनतेचे परिमाण (प्रचलनाचे एकतर्फी विश्लेषण; n = 3 उंदर). उजवीकडे: आठवड्यात 12 व्या दिवशी ट्रान्सड्यूस केलेल्या PN मध्ये mtDNA फोकस विश्लेषण (अनपेअर्ड टी-टेस्ट; तीन उंदरांमधील n = 6 पेशी). * P <0.05; ** P <0.01. (ड) सूचित व्हायरल वेक्टरसह ट्रान्सड्यूस केलेल्या Mfn2cKO सेरेबेलर सेक्शनच्या PN चे प्रतिनिधी ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोग्राफ. गुलाबी मुखवटा डेंड्राइट्सने व्यापलेल्या क्षेत्राचे वर्णन करतो आणि पिवळा ठिपके असलेला चौरस उजवीकडे दिलेला झूम दर्शवितो; n केंद्रक दर्शवितो. स्केल बार, 1μm. (E) 12 आठवड्यात ट्रान्सड्यूस केलेल्या PN मध्ये PCx स्टेनिंगचे उदाहरण दर्शवितो. स्केल बार, 20μm. OE, ओव्हरएक्सप्रेशन; FC, फोल्ड बदल.
शेवटी, आम्ही OXPHOS बिघडलेले पीएन असलेल्यांमध्ये पेरोक्सिडेस-प्रेरित पेशी जगण्याचे महत्त्व तपासले. आम्ही विशेषतः माऊस पीसीएक्स एमआरएनए (एएव्ही-शपीसीएक्स) लक्ष्यित करणारे एमचेरी एन्कोडिंग एएव्ही-शआरएनए (शॉर्ट हेअरपिन आरएनए) तयार केले आणि एमएफएन2सीकेओ उंदरांच्या सेरेबेलममध्ये विषाणू किंवा त्याचे स्क्रॅम्बल्ड कंट्रोल (एएव्ही-स्कर) इंजेक्ट केले. पीसीएक्स अभिव्यक्ती वाढली (आकृती 3C) आणि पीएन सेल थर अजूनही अबाधित होता (आकृती 1A) त्या काळात प्रभावी पीसीएक्स नॉकडाउन साध्य करण्यासाठी वयाच्या चौथ्या आठवड्यात (आकृती 5A) इंजेक्शन देण्यात आले. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की पीसीएक्स (आकृती S8A) खाली पाडल्याने पीएन मृत्यूचा लक्षणीय वेग वाढतो, जो संक्रमित रिंगपर्यंत मर्यादित आहे (आकृती 5, बी आणि सी). PCx अप-रेग्युलेशनमुळे होणाऱ्या चयापचय प्रभावांची यंत्रणा समजून घेण्यासाठी, आम्ही PCx नॉकडाऊन आणि AAV-मध्यस्थ ऑप्टिकल बायोसेन्सर Grx1-roGFP2 एकाच वेळी व्यक्त झाल्यानंतर PNs च्या रेडॉक्स स्थितीचा अभ्यास केला (आकृती S8, B ते D) पेप्टाइड रेडॉक्स संभाव्यतेतील ग्लूटाथियोनच्या सापेक्ष बदलाचे मूल्यांकन करण्यासाठी (38). त्यानंतर, आम्ही FLIM स्थिती (आकृती S8, E ते G) सत्यापित केल्यानंतर सायटोप्लाज्मिक रेडॉक्स स्थितीत संभाव्य बदल शोधण्यासाठी 7 आठवड्यांच्या Mfn2cKO किंवा कंट्रोल लिटरमेट्सच्या तीव्र मेंदूच्या तुकड्यांमध्ये दोन-फोटॉन फ्लोरोसेन्स लाइफटाइम इमेजिंग मायक्रोस्कोपी (FLIM) केली. विश्लेषणात PCx अभिव्यक्ती नसलेल्या एका Mfn2cKO PN च्या ऑक्सिडेशन स्थितीत लक्षणीय वाढ दिसून आली, जी नियंत्रण न्यूरॉन्स किंवा Mfn2cKO PN पेक्षा वेगळी आहे जी फक्त स्क्रॅम्बल्ड shRNA व्यक्त करते (आकृती 5, D आणि E). जेव्हा PCx अभिव्यक्ती कमी-नियमित केली गेली, तेव्हा अत्यंत ऑक्सिडाइज्ड स्थिती दर्शविणाऱ्या Mfn2cKO PN ची टक्केवारी तीन पटीने वाढली (आकृती 5E), जे दर्शवते की PCx अप-नियमनने क्षीण झालेल्या न्यूरॉन्सची रेडॉक्स क्षमता राखली.
(अ) दर्शविलेले चयापचय मार्ग सक्रिय झाल्यावर AAV एन्कोडिंग shPCx इंजेक्ट करण्यासाठी प्रायोगिक वेळापत्रक दर्शविणारी योजना. (ब) Mfn2cKO उंदरांमध्ये 8 आठवड्यांच्या सेरेबेलर विभागांचे प्रतिनिधी कॉन्फोकल छायाचित्रे 4 आठवड्यांनी अँटी-कॅल्सीन्युरिन अँटीबॉडीने ट्रान्सड्यूस केले आणि लेबल केले. स्केल बार, 450μm. (क) AAV-ट्रान्सड्यूस केलेल्या लूपमध्ये पुरकिन्जे पेशी घनतेचे परिमाण (प्रचलनाचे एकतर्फी विश्लेषण; n = 3 ते 4 उंदर). डेटा सरासरी ±SEM म्हणून व्यक्त केला जातो; ***P<0.001. (ड) प्रतिनिधी FLIM चित्र निर्दिष्ट प्रायोगिक परिस्थितीत 7 आठवड्यांच्या PN व्यक्त करणाऱ्या ग्लूटाथिओन रेडॉक्स सेन्सर Grx1-roGFP2 चे सरासरी आयुष्यमान दर्शविते. LUT (लुक-अप टेबल) गुणोत्तर: जगण्याचा कालावधी मध्यांतर (पिकोसेकंदांमध्ये). स्केल बार, 25μm. (E) हिस्टोग्राम दोन उंदरांमध्ये (D) (n=158 ते 368 पेशी) पासून Grx1-roGFP2 जीवनकाळ मूल्यांचे वितरण दर्शवितो. प्रत्येक हिस्टोग्रामवरील पाय चार्ट: लक्षणीयरीत्या लांब (लाल, ऑक्सिडाइज्ड) किंवा लहान (निळा, कमी) जीवनकाळ मूल्य असलेल्या पेशींची संख्या दर्शवितो, जे CTRL-AAV-scr मध्ये सरासरी जीवनकाळ मूल्याच्या 1 SD पेक्षा जास्त आहेत. (F) प्रस्तावित मॉडेल न्यूरोनल PCx च्या अपरेग्युलेशनचा संरक्षणात्मक प्रभाव दर्शवितो.
एकंदरीत, आम्ही येथे प्रदान केलेल्या डेटावरून असे दिसून येते की MFN2 चे पुनर्अभिव्यक्ती गंभीर OXPHOS कमतरता, गंभीर mtDNA कमी होणे आणि अत्यंत असामान्य इस्टा-समान आकारविज्ञान असलेल्या प्रगत PN ला पूर्णपणे वाचवू शकते, ज्यामुळे प्रगत रोगांमध्ये देखील सतत प्रगती होते. न्यूरोडीजनरेशन पेशी मृत्यूपूर्वीच्या टप्प्याचे उलट करता येणारे पुरावे प्रदान करते. चयापचय लवचिकतेची ही डिग्री एथेरोस्क्लेरोसिस (TCA सायकलचे पुनर्वायरनिंग) प्रेरित करण्यासाठी न्यूरॉन्सच्या क्षमतेद्वारे अधिक स्पष्ट होते, जी OXPHOS नसलेल्या PN मध्ये PCx अभिव्यक्तीला प्रतिबंधित करते आणि पेशी मृत्यू वाढवते, ज्यामुळे संरक्षणात्मक भूमिका बजावते (आकृती 5F).
या अभ्यासात, आम्ही पुरावा दिला की OXPHOS डिसफंक्शनला PNs ची प्रतिक्रिया चयापचय कार्यक्रमांद्वारे सक्रिय केलेल्या विभेदक सक्रियकरण मार्गाद्वारे हळूहळू TCA सायकल एथेरोस्क्लेरोसिसमध्ये रूपांतरित होते. आम्ही अनेक पूरक पद्धतींसह प्रोटिओमिक विश्लेषणाची पुष्टी केली आणि उघड केले की जेव्हा गंभीर माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनद्वारे आव्हान दिले जाते तेव्हा, न्यूरॉन्समध्ये चयापचय लवचिकतेचा पूर्वी अज्ञात प्रकार असतो. आमच्या आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, संपूर्ण रीवायरिंग प्रक्रिया आवश्यकतेने न्यूरोडीजनरेशनसह येणारी टर्मिनल मेटाबोलिक स्थिती हळूहळू आणि अपरिवर्तनीयपणे चिन्हांकित करत नाही, परंतु आमचा डेटा सूचित करतो की पेशी मृत्यूपूर्वीच्या टप्प्यात देखील ते देखभाल न्यूरॉन बनवू शकते. कार्यात्मक भरपाई यंत्रणा. हे निष्कर्ष सूचित करते की न्यूरॉन्समध्ये शरीरात चयापचय प्लॅस्टिसिटीची लक्षणीय प्रमाणात असते. ही वस्तुस्थिती सिद्ध करते की MFN2 चे नंतरचे पुनर्प्रक्षेपण मुख्य चयापचय मार्करची अभिव्यक्ती उलट करू शकते आणि PN झीज रोखू शकते. उलटपक्षी, ते एथेरोस्क्लेरोसिसला प्रतिबंधित करते आणि नसा गतिमान करते. ट्रान्ससेक्शुअल.
आमच्या संशोधनातील सर्वात मनोरंजक निष्कर्षांपैकी एक म्हणजे OXPHOS नसलेले PNs विशेषतः धमनीकाठीण्यांना उत्तेजित करणाऱ्या एन्झाईम्सना अप-रेग्युलेट करून TCA सायकल चयापचय सुधारू शकतात. चयापचय पुनर्रचना ही कर्करोगाच्या पेशींची एक सामान्य वैशिष्ट्य आहे, ज्यापैकी काही ग्लूटामाइनवर अवलंबून असतात जेणेकरून TCA सायकल इंटरमीडिएट्सना पूरक बनवता येईल जेणेकरून रिड्यूसिंग समतुल्य तयार होतील, जे श्वसन साखळी चालवतात आणि लिपिड आणि न्यूक्लियोटाइड बायोसिंथेसिस प्रिकर्सर्सचे उत्पादन राखतात (39, 40). अलीकडील अभ्यासात असे दिसून आले आहे की OXPHOS डिसफंक्शन अनुभवणाऱ्या परिधीय ऊतींमध्ये, ग्लूटामाइन/ग्लूटामेट चयापचयचे पुनर्संयोजन देखील एक प्रमुख वैशिष्ट्य आहे (5, 41), जिथे TCA सायकलमध्ये ग्लूटामाइन प्रवेशाची दिशा OXPHOS दुखापतीच्या तीव्रतेवर अवलंबून असते (41). तथापि, शरीरातील न्यूरोनल मेटाबोलिक प्लास्टिसिटीच्या कोणत्याही समानतेबद्दल आणि रोगाच्या संदर्भात त्याच्या संभाव्य प्रासंगिकतेबद्दल स्पष्ट पुराव्याचा अभाव आहे. अलीकडील इन विट्रो अभ्यासात, प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स न्यूरोट्रांसमिशनसाठी ग्लूटामेट पूल एकत्रित करतात असे दर्शविले गेले आहे, ज्यामुळे चयापचय ताण परिस्थितीत ऑक्सिडेटिव्ह मेटाबोलिझम आणि एथेरोस्क्लेरोसिसला प्रोत्साहन मिळते (42). हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की TCA सायकल एन्झाइम सक्सीनेट डिहायड्रोजनेजच्या औषधीय प्रतिबंधाअंतर्गत, पायरुवेट कार्बोक्सिलेशन कल्चर्ड सेरेबेलर ग्रॅन्युल न्यूरॉन्समध्ये ऑक्सॅलोएसीटेटचे संश्लेषण राखते असे मानले जाते (34). तथापि, मेंदूच्या ऊतींशी (जिथे एथेरोस्क्लेरोसिस प्रामुख्याने अॅस्ट्रोसाइट्सपुरते मर्यादित असल्याचे मानले जाते) या यंत्रणांची शारीरिक प्रासंगिकता अजूनही महत्त्वाची शारीरिक महत्त्व आहे (43). या प्रकरणात, आमच्या डेटावरून असे दिसून येते की शरीरात OXPHOS द्वारे खराब झालेले PNs BCAA डिग्रेडेशन आणि पायरुवेट कार्बोक्सिलेशनमध्ये बदलले जाऊ शकतात, जे TCA पूल इंटरमीडिएट्सच्या पूरकतेचे दोन मुख्य स्रोत आहेत. जरी न्यूरोनल एनर्जी मेटाबोलिझममध्ये BCAA कॅटाबोलिझमचे अनुमानित योगदान प्रस्तावित केले गेले असले तरी, न्यूरोट्रान्समिशनसाठी ग्लूटामेट आणि GABA च्या भूमिकेव्यतिरिक्त (44), तरीही या यंत्रणांसाठी कोणतेही पुरावे नाहीत. म्हणून, असे अनुमान करणे सोपे आहे की अकार्यक्षम PNs एथेरोस्क्लेरोसिस वाढवून आत्मसात प्रक्रियेद्वारे चालविल्या जाणाऱ्या TCA इंटरमीडिएट्सच्या वापराची आपोआप भरपाई करू शकतात. विशेषतः, एस्पार्टिक अॅसिडची वाढती मागणी राखण्यासाठी PCx चे अपरेग्युलेशन आवश्यक असू शकते, जे मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन असलेल्या प्रजननशील पेशींमध्ये सुचवले जाते (45). तथापि, आमच्या मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषणाने Mfn2cKO PNs (आकृती S6A) मध्ये एस्पार्टिक अॅसिडच्या स्थिर-स्थिती पातळीमध्ये कोणतेही महत्त्वपूर्ण बदल दिसून आले नाहीत, जे प्रजननशील पेशी आणि पोस्ट-मायटोटिक न्यूरॉन्समधील एस्पार्टिक अॅसिडच्या वेगवेगळ्या चयापचय वापराचे प्रतिबिंबित करते. जरी विवोमध्ये अकार्यक्षम न्यूरॉन्समध्ये PCx अपरेग्युलेशनची अचूक यंत्रणा अद्याप वैशिष्ट्यीकृत केलेली नसली तरी, आम्ही दाखवून दिले की ही अकाली प्रतिक्रिया न्यूरॉन्सची रेडॉक्स स्थिती राखण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावते, जी सेरेबेलर स्लाइसवरील FLIM प्रयोगांमध्ये दाखवण्यात आली होती. विशेषतः, पीएनला पीसीएक्सचे अपरेग्युलेशन करण्यापासून रोखल्याने अधिक ऑक्सिडाइज्ड स्थिती निर्माण होऊ शकते आणि पेशींच्या मृत्यूला गती मिळू शकते. BCAA डिग्रेडेशनचे सक्रियकरण आणि पायरुवेटचे कार्बोक्सिलेशन हे मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनच्या परिधीय ऊतींचे वैशिष्ट्यीकरण करण्याचे मार्ग नाहीत (7). म्हणूनच, ते OXPHOS-कमी असलेल्या न्यूरॉन्सचे एक प्राधान्य वैशिष्ट्य असल्याचे दिसते, जरी ते एकमेव वैशिष्ट्य नसले तरी, जे न्यूरोडीजनरेशनसाठी महत्वाचे आहे. .
सेरेबेलर रोग हा एक विषम प्रकारचा न्यूरोडीजनरेटिव्ह रोग आहे जो सहसा अ‍ॅटॅक्सिया म्हणून प्रकट होतो आणि बहुतेकदा पीएनला नुकसान पोहोचवतो (46). ही न्यूरॉन लोकसंख्या विशेषतः मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनला बळी पडते कारण उंदरांमध्ये त्यांचे निवडक ऱ्हास मानवी स्पिनोसेरेबेलर अ‍ॅटॅक्सियाचे वैशिष्ट्य असलेल्या अनेक मोटर लक्षणांचे पुनरुत्पादन करण्यासाठी पुरेसे आहे (16, 47, 48). अहवालांनुसार, उत्परिवर्ती जनुक असलेले ट्रान्सजेनिक माऊस मॉडेल मानवी स्पिनोसेरेबेलर अ‍ॅटॅक्सियाशी संबंधित आहे आणि त्यात मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन आहे (49, 50), जे पीएनपीएचमध्ये ओएक्सपीएचओएसच्या कमतरतेच्या परिणामांचा अभ्यास करण्याचे महत्त्व अधोरेखित करते. म्हणूनच, या अद्वितीय न्यूरॉन लोकसंख्येला प्रभावीपणे वेगळे करणे आणि अभ्यास करणे विशेषतः योग्य आहे. तथापि, पीएन दाबासाठी खूप संवेदनशील असतात आणि संपूर्ण सेरेबेलर पेशी लोकसंख्येचे कमी प्रमाण देतात हे लक्षात घेता, अनेक ओमिक्स-आधारित अभ्यासांसाठी, संपूर्ण पेशी म्हणून त्यांचे निवडक पृथक्करण करणे अजूनही एक आव्हानात्मक पैलू आहे. इतर पेशी प्रकारांच्या (विशेषतः प्रौढ ऊतींच्या) दूषिततेचा पूर्ण अभाव साध्य करणे जवळजवळ अशक्य असले तरी, आम्ही डाउनस्ट्रीम प्रोटीओमिक्स विश्लेषणासाठी पुरेशा प्रमाणात व्यवहार्य न्यूरॉन्स मिळविण्यासाठी FACS सह प्रभावी पृथक्करण चरण एकत्र केले आणि संपूर्ण सेरेबेलमच्या विद्यमान डेटा सेटच्या तुलनेत आमच्याकडे बरेच उच्च प्रथिने कव्हरेज (सुमारे 3000 प्रथिने) आहेत (51). संपूर्ण पेशींची व्यवहार्यता टिकवून ठेवून, आम्ही येथे प्रदान केलेली पद्धत आम्हाला केवळ मायटोकॉन्ड्रियामधील चयापचय मार्गांमधील बदल तपासण्याची परवानगी देते, परंतु त्याच्या सायटोप्लाज्मिक समकक्षांमधील बदल देखील तपासण्याची परवानगी देते, जे पेशी प्रकार समृद्ध करण्यासाठी मायटोकॉन्ड्रियल मेम्ब्रेन टॅगच्या वापरास पूरक आहे. जटिल ऊतींमध्ये मायटोकॉन्ड्रियाच्या संख्येसाठी नवीन पद्धत (52, 53). आम्ही वर्णन केलेली पद्धत केवळ पुरकिन्जे पेशींच्या अभ्यासाशी संबंधित नाही, तर रोगग्रस्त मेंदूंमध्ये चयापचय बदलांना संबोधित करण्यासाठी कोणत्याही प्रकारच्या पेशीवर सहजपणे लागू केली जाऊ शकते, ज्यामध्ये मायटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शनचे इतर मॉडेल समाविष्ट आहेत.
शेवटी, या चयापचय पुनर्रचना प्रक्रियेदरम्यान आम्ही एक उपचारात्मक विंडो ओळखली आहे जी पेशीय ताणाच्या प्रमुख लक्षणांना पूर्णपणे उलट करू शकते आणि न्यूरोनल डिजनरेशन रोखू शकते. म्हणून, येथे वर्णन केलेल्या रीवायरिंगचे कार्यात्मक परिणाम समजून घेतल्यास माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन दरम्यान न्यूरोनल व्यवहार्यता राखण्यासाठी संभाव्य उपचारांबद्दल मूलभूत अंतर्दृष्टी मिळू शकते. इतर मेंदूच्या पेशी प्रकारांमध्ये ऊर्जा चयापचयातील बदलांचे विश्लेषण करण्याच्या उद्देशाने भविष्यातील संशोधन इतर न्यूरोलॉजिकल रोगांना या तत्त्वाची उपयुक्तता पूर्णपणे प्रकट करण्यासाठी आवश्यक आहे.
MitoPark उंदरांचे वर्णन पूर्वी केले गेले आहे (31). loxP फ्लँकिंग Mfn2 जनुकांसह C57BL/6N उंदरांचे वर्णन पूर्वी केले गेले आहे (18) आणि L7-Cre उंदरांसह क्रॉस केले गेले आहे (23). परिणामी दुहेरी विषमयुग्म संतती नंतर होमोजिगस Mfn2loxP/Mfn2loxP उंदरांसह क्रॉस केली गेली जेणेकरून Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) साठी पुरकिन्जे-विशिष्ट जीन नॉकआउट्स निर्माण होतील. मिलनाच्या उपसमूहात, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP अ‍ॅलील (stop-mtYFP) अतिरिक्त क्रॉसिंगद्वारे सादर केले गेले (20). सर्व प्राण्यांच्या प्रक्रिया युरोपियन, राष्ट्रीय आणि संस्थात्मक मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार केल्या गेल्या आणि जर्मनीतील नॉर्थ राईन-वेस्टफेलिया येथील उमवेल्ट आणि व्हर्ब्राउचेरशुट्झच्या लँडेसमटफरनॅटुर यांनी मंजूर केल्या. प्राण्यांचे काम युरोपियन फेडरेशन ऑफ लॅबोरेटरी अ‍ॅनिमल सायन्सेस असोसिएशनच्या मार्गदर्शनानुसार देखील केले जाते.
गर्भवती महिलेच्या गर्भाशयाच्या विस्थापनाला भूल दिल्यानंतर, उंदराचा गर्भ वेगळा केला जातो (E13). कॉर्टेक्स हँक्सच्या बॅलेन्स्ड सॉल्ट सोल्युशन (HBSS) मध्ये विच्छेदित केला गेला ज्यामध्ये 10 mM हेप्सचा समावेश होता आणि डल्बेकोच्या मॉडिफाइड ईगलच्या माध्यमात पॅपेन (20 U/ml) आणि सिस्टीन (1μg/ml) होते. ऊतींना DMEM मध्ये उबवा आणि एंजाइमॅटिक पचनाद्वारे ते विघटित करा. Ml) 37°C वर 20 मिनिटांसाठी, आणि नंतर DMEM मध्ये यांत्रिकरित्या 10% गर्भाच्या बोवाइन सीरमसह पूरक केले गेले. पेशींना इमेजिंग विश्लेषणासाठी 2×106 प्रति 6 सेमी कल्चर डिशवर किंवा 0.5×105 पेशी/सेमी2 घनतेवर पॉलिलाइसिनने लेपित काचेच्या कव्हरस्लिप्सवर बीज केले गेले. 4 तासांनंतर, माध्यम 1% B27 सप्लिमेंट आणि 0.5 mM ग्लुटामॅक्स असलेल्या न्यूरोबॅसल सीरम-मुक्त माध्यमाने बदलले गेले. त्यानंतर संपूर्ण प्रयोगादरम्यान न्यूरॉन्सना ३७°C आणि ५% CO2 वर ठेवण्यात आले आणि आठवड्यातून एकदा त्यांना आहार देण्यात आला. इन विट्रोमध्ये पुनर्संयोजन करण्यासाठी, दुसऱ्या दिवशी इन विट्रोमध्ये न्यूरॉन्सवर उपचार करण्यासाठी खालील AAV9 विषाणू वेक्टरचे ३μl (२४-वेल कल्चर डिश) किंवा ०.५μl (२४-वेल प्लेट) वापरले गेले: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (अ‍ॅडजीन, कॅटलॉग क्रमांक १०५५३०-AAV9) आणि AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (अ‍ॅडजीन, कॅटलॉग क्रमांक १०५५४५-AAV9).
माऊस Mfn1 आणि Mfn2 पूरक DNA (अनुक्रमे Addgene plasmid #23212 आणि #23213 मधून मिळवलेले) C-टर्मिनसवर V5 अनुक्रम (GKPIPNPLLGLDST) ने चिन्हांकित केले आहेत आणि T2A अनुक्रमाद्वारे फ्रेममध्ये mCherry सह एकत्रित केले आहेत. Grx1-roGFP2 ही हायडेलबर्ग TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) कडून मिळालेली भेट आहे. पारंपारिक क्लोनिंग पद्धतींचा वापर करून tdTomato कॅसेट बदलून, pAAV-CAG-FLEX-tdTomato बॅकबोनमध्ये (अ‍ॅडजीन संदर्भ क्रमांक 28306) कॅसेट सबक्लोन करून pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 आणि pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 वेक्टर तयार केले गेले. नियंत्रण वेक्टर pAAV-CAG-FLEX-mCherry तयार करण्यासाठी अशाच प्रकारची रणनीती वापरली गेली. AAV-shPCx रचना निर्माण करण्यासाठी, प्लाझमिड AAV वेक्टर (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) आवश्यक आहे, ज्यामध्ये shRNA लक्ष्यीकरण माऊस PCx (5′CTTTCGCTTAAGGTGCTAAACTCAGGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) एन्कोड करणारा DNA अनुक्रम असतो. U6 प्रमोटरच्या नियंत्रणाखाली, mCherry चा वापर CMV प्रमोटरच्या नियंत्रणाखाली केला जातो. सहाय्यक AAV वेक्टरचे उत्पादन उत्पादकाच्या सूचनांनुसार (सेल बायोलॅब्स) केले गेले. थोडक्यात, कॅल्शियम फॉस्फेट पद्धतीने २९३AAV पेशी-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) किंवा Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) कोडिंग जीनचे संक्रमणकालीन संक्रमण, तसेच AAV1 कॅप्सिड प्रथिने आणि अॅक्सेसरी प्रोटीन पॅकेजिंग प्लाझ्मिड प्लाझ्मिड, कोडिंग करून mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) वाहून नेणारा ट्रान्सफर प्लाझ्मिड वापरा. ​​क्रूड व्हायरस सुपरनॅटंट कोरड्या बर्फ/इथेनॉल बाथमध्ये फ्रीझ-थॉ सायकलद्वारे आणि फॉस्फेट बफर सलाईन (PBS) मध्ये लायझ केलेल्या पेशींद्वारे मिळवला गेला. AAV वेक्टरला डिस्कन्टिन्युअस आयोडिक्सानॉल ग्रेडियंट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन (32,000 rpm आणि 4°C वर 24 तास) द्वारे शुद्ध केले गेले आणि Amicon ultra-15 सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर वापरून केंद्रित केले गेले. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 जीनोम कॉपी (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX चे जीनोम टायटर पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे (54) होते, रिअल-टाइम क्वांटिटेटिव्ह PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) आणि AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) द्वारे मोजले गेले.
प्राथमिक न्यूरॉन्स बर्फाळ थंड 1x PBS मध्ये स्क्रॅप केले गेले, पेलेट केले गेले आणि नंतर 0.5% ट्रायटन X-100 / 0.5% सोडियम डीऑक्सिकोलेट/PBS लिसिस बफरमध्ये एकरूप केले गेले ज्यामध्ये फॉस्फेटेस आणि प्रोटीज इनहिबिटर (रोचे) होते. बायसिंकोनिनिक अॅसिड अॅसे (थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरून प्रथिने प्रमाणीकरण केले गेले. नंतर प्रथिने SDS-पॉलीअॅक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे वेगळे केले गेले आणि नंतर पॉलीव्हिनिलायडीन फ्लोराइड मेम्ब्रेन (GE हेल्थकेअर) वर ब्लॉट केले गेले. विशिष्ट नसलेल्या जागा ब्लॉक करा आणि TBST (ट्वीनसह ट्रायस-बफर केलेले सलाईन), वॉशिंग स्टेप्स आणि TBST इनक्यूबेटमध्ये दुय्यम अँटीबॉडीमध्ये 5% दुधात प्राथमिक अँटीबॉडी (तपशीलांसाठी टेबल S1 पहा) सह इनक्यूबेट करा. +4°C वर रात्रभर प्राथमिक अँटीबॉडीसह इनक्यूबेट करा. धुतल्यानंतर, खोलीच्या तपमानावर 2 तासांसाठी दुय्यम अँटीबॉडी लावा. त्यानंतर, अँटी-β-अ‍ॅक्टिन अँटीबॉडीसह त्याच ब्लॉटला इनक्यूबेट करून, समान लोडिंगची पुष्टी झाली. केमिल्युमिनेसेन्समध्ये रूपांतरित करून आणि केमिल्युमिनेसेन्स वाढवून शोध (GE हेल्थकेअर).
काचेच्या कव्हरस्लिप्सवर पूर्वी सीड केलेले न्यूरॉन्स खोलीच्या तपमानावर निर्दिष्ट वेळेवर 10 मिनिटांसाठी 4% पॅराफॉर्मल्डिहाइड (PFA)/PBS सह निश्चित केले गेले. कव्हरस्लिप्स प्रथम खोलीच्या तपमानावर 5 मिनिटांसाठी 0.1% ट्रायटन X-100/PBS सह झिरपले जातात आणि नंतर ब्लॉकिंग बफरमध्ये [3% बोवाइन सीरम अल्ब्युमिन (BSA)/PBS]. दुसऱ्या दिवशी, कव्हरस्लिप्स ब्लॉकिंग बफरने धुतले गेले आणि खोलीच्या तपमानावर 2 तासांसाठी योग्य फ्लोरोफोर-कंजुगेटेड सेकंडरी अँटीबॉडीसह इनक्युबेट केले गेले; शेवटी, नमुने 4′,6-डायमिडिनो-2 सह PBS मध्ये पूर्णपणे धुतले गेले -फेनिलिंडोल (DAPI) काउंटरस्टेन केले जाते आणि नंतर मायक्रोस्कोप स्लाइडवर एक्वा-पॉली/माउंटसह निश्चित केले जाते.
उंदरांना (नर आणि मादी) केटामाइन (१३० मिग्रॅ/किलो) आणि झायलाझिन (१० मिग्रॅ/किलो) च्या इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शनने भूल देण्यात आली आणि त्यांना कार्प्रोफेन वेदनाशामक (५ मिग्रॅ/किलो) सह त्वचेखालील इंजेक्शन देण्यात आले, आणि उबदार पॅडने सुसज्ज असलेल्या स्टिरिओटॅक्टिक उपकरणात (कोप्फ) ठेवण्यात आले. कवटी उघड करा आणि मिस हाडाशी संबंधित सेरेबेलर कॉर्टेक्सचा भाग पातळ करण्यासाठी दंत ड्रिल वापरा (लॅम्बडा पासून: शेपटी १.८, बाजूकडील १, लोब्यूल्स IV आणि V शी संबंधित). खालील रक्तवहिन्यासंबंधी अडथळा येऊ नये म्हणून कवटीत काळजीपूर्वक एक लहान छिद्र तयार करण्यासाठी वक्र सिरिंज सुई वापरा. नंतर पातळ काढलेली काचेची केशिका हळूहळू सूक्ष्म-छिद्रात (ड्युरा मेटरच्या वेंट्रल बाजूला -१.३ ते -१ पर्यंत) घातली जाते आणि २०० ते ३०० एनएल एएव्ही मॅन्युअल सिरिंज (नारिशिगे) वापरून १० ते २० मिनिटांच्या खिडकीच्या कालावधीत कमी दाबाने अनेक वेळा मायक्रो-इंजेक्टर (नारिशिगे) मध्ये इंजेक्ट केली जाते. ओतल्यानंतर, विषाणू पूर्णपणे पसरण्यासाठी केशिका आणखी १० मिनिटे ठेवा. केशिका काढून टाकल्यानंतर, जखमेची जळजळ कमी करण्यासाठी आणि प्राण्याला बरे होण्यासाठी त्वचेला काळजीपूर्वक शिवले जाते. शस्त्रक्रियेनंतर अनेक दिवस प्राण्यांवर वेदनाशामक (कॅस्पोफेन) उपचार केले गेले, त्या काळात त्यांच्या शारीरिक स्थितीचे काळजीपूर्वक निरीक्षण केले गेले आणि नंतर त्यांना दिलेल्या वेळेनुसार इच्छामृत्यू देण्यात आले. सर्व प्रक्रिया युरोपियन, राष्ट्रीय आणि संस्थात्मक मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार पार पाडल्या गेल्या आणि जर्मनीतील उत्तर राईन-वेस्टफेलियाच्या उमवेल्ट आणि व्हर्ब्राउचेरशुट्झच्या लँडेसमटफरनाटुर यांनी त्यांना मान्यता दिली.
प्राण्यांना केटामाइन (१०० मिग्रॅ/किलो) आणि झायलाझिन (१० मिग्रॅ/किलो) ने भूल देण्यात आली आणि हृदयाला प्रथम ०.१ एम पीबीएस आणि नंतर पीबीएसमध्ये ४% पीएफए ​​देऊन परफ्यूज करण्यात आले. ४° सेल्सिअस तापमानावर ४% पीएफए/पीबीएसमध्ये रात्रीच्या वेळी ऊतींचे विच्छेदन करून फिक्स करण्यात आले. पीबीएसमध्ये स्थिर मेंदूपासून सॅजिटल सेक्शन (५० μm जाड) तयार करण्यासाठी कंपन करणारा चाकू (लाइका मायक्रोसिस्टम्स जीएमबीएच, व्हिएन्ना, ऑस्ट्रिया) वापरण्यात आला. अन्यथा निर्दिष्ट न केल्यास, खोलीच्या तपमानावर वर वर्णन केल्याप्रमाणे (१३) फ्री-फ्लोटिंग सेक्शनचे स्टेनिंग केले गेले आणि ढवळले गेले. थोडक्यात, प्रथम, प्राप्त झालेले स्लाइस खोलीच्या तपमानावर १५ मिनिटांसाठी ०.५% ट्रायटन एक्स-१००/पीबीएसने पारगम्य केले गेले; काही एपिटोप्ससाठी (पीसीएक्स आणि श्मट२), ८०° सेल्सिअस (पीएच ९) वर ट्रिस-ईडीटीए बफरमध्ये या चरणाऐवजी २५ मिनिटे काप गरम करा. पुढे, विभागांना ब्लॉकिंग बफरमध्ये (३% BSA/PBS) रात्रभर ४°C तापमानावर ढवळत प्राथमिक अँटीबॉडी (टेबल S1 पहा) सह उष्मायन केले गेले. दुसऱ्या दिवशी, विभाग ब्लॉकिंग बफरने धुतले गेले आणि खोलीच्या तपमानावर योग्य फ्लोरोफोर-कंजुगेटेड दुय्यम अँटीबॉडीसह २ तास उष्मायन केले गेले; शेवटी, विभाग PBS मध्ये पूर्णपणे धुतले गेले, DAPI ने काउंटर-स्टेन केले गेले आणि नंतर मायक्रोस्कोप स्लाइडवर AquaPolymount सह निश्चित केले गेले.
नमुना प्रतिमा घेण्यासाठी पांढरा प्रकाश लेसर आणि 405 डायोड अल्ट्राव्हायोलेट लेसरसह सुसज्ज लेसर स्कॅनिंग कॉन्फोकल मायक्रोस्कोप (TCS SP8-X किंवा TCS डिजिटल लाईट शीट, लाइका मायक्रोसिस्टम्स) वापरण्यात आला. फ्लोरोफोरला उत्तेजित करून आणि हायब्रिड डिटेक्टर (HyDs) सह सिग्नल गोळा करून, LAS-X सॉफ्टवेअरचा वापर अनुक्रमिक मोडमध्ये Nyquist सॅम्पलिंगशी सुसंगत स्टॅक केलेल्या प्रतिमा गोळा करण्यासाठी केला गेला: नॉन-क्वांटिटेटिव्ह पॅनेलसाठी, ते अत्यंत गतिमान सिग्नल आहेत (उदाहरणार्थ, सोमॅटिक पेशी आणि डेंड्राइट्समध्ये) mtYFP) ब्राइटआर मोडमध्ये PN ची संख्या शोधण्यासाठी HyD वापरा). पार्श्वभूमी कमी करण्यासाठी 0.3 ते 6 ns पर्यंत गेटिंग लागू केले जाते.
सॉर्ट केलेल्या पेशींचे रिअल-टाइम इमेजिंग. १% B27 सप्लिमेंट आणि ०.५ mM ग्लुटामॅक्स असलेल्या न्यूरोबॅसल-ए माध्यमात सॉर्ट केल्यानंतर, पेशींना ताबडतोब पॉली-एल-लाइसिन-लेपित काचेच्या स्लाईड्सवर (μ-स्लाइड८ वेल, इबिडी, कॅटलॉग क्रमांक ८०८२६) सीड केले गेले, आणि नंतर पेशी स्थिर होण्यासाठी ते ३७°C आणि ५% CO2 वर १ तासासाठी ठेवा. व्हाईट लेसर, HyD, ६३×[१.४ न्यूमेरिकल अपर्चर (NA)] ऑइल ऑब्जेक्टिव्ह लेन्स आणि हीटिंग स्टेजने सुसज्ज असलेल्या लाइका SP8 लेसर स्कॅनिंग कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपवर रिअल-टाइम इमेजिंग केले गेले.
उंदराला कार्बन डायऑक्साइडने त्वरीत भूल देण्यात आली आणि शिरच्छेद करण्यात आला, मेंदू कवटीतून त्वरीत काढून टाकण्यात आला आणि 200μm जाडीच्या (13C लेबलिंग प्रयोगासाठी) किंवा 275μm जाडीच्या (दोन फोटॉन प्रयोगांसाठी) बाणाच्या भागात कापण्यात आला. खालील पदार्थांनी भरलेला हा भाग आइस्क्रीम (HM-650 V, थर्मो फिशर सायंटिफिक, वॉलडॉर्फ, जर्मनी) खालील पदार्थांनी भरलेला आहे: 125 mM बर्फ-थंड, कार्बन-संतृप्त (95% O2 आणि 5% CO2) कमी Ca2 + कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25 mM NaHCO3, 25 mM ग्लुकोज, 0.5 mM CaCl2 आणि 3.5 mM MgCl2 (310 ते 330 mmol ऑस्मोटिक दाब). मिळवलेल्या मेंदूच्या तुकड्या उच्च Ca2 + ACSF (१२५.० mM NaCl, २.५ mM KCl, १.२५ mM सोडियम फॉस्फेट बफर, २५.० mM NaHCO3, २५.० mM d-ग्लुकोज, १.० mM CaCl2 आणि २.० mM MgCl2 (मध्यम) pH ७.४ आणि ३१० ते ३२० mmol) असलेल्या प्री-इन्क्युबेशन चेंबरमध्ये हलवा.
इमेजिंग प्रक्रियेदरम्यान, स्लाइस एका समर्पित इमेजिंग रूममध्ये हलवण्यात आले आणि प्रयोग 32° ते 33°C च्या स्थिर तापमानावर सतत ACSF परफ्यूजन अंतर्गत करण्यात आला. स्लाइस इमेजिंगसाठी लाइका 25x ऑब्जेक्टिव्ह लेन्स (NA 0.95, पाणी), Ti: नीलम लेसर (कॅमेलियन व्हिजन II, कोहेरंट) ने सुसज्ज मल्टीफोटॉन लेसर स्कॅनिंग मायक्रोस्कोप (TCS SP8 MP-OPO, लाइका मायक्रोसिस्टम्स) वापरण्यात आला. लाइका इमेजिंगसाठी फिलिम मॉड्यूल (पिकोहार्प300, पिकोक्वांट) वापरण्यात आला.
Grx1-roGFP2 चा FLIM. PN च्या सायटोप्लाज्मिक रेडॉक्स अवस्थेतील बदल सॅजिटल ब्रेन स्लाइसमध्ये दोन-फोटॉन FLIM द्वारे मोजले गेले, जिथे Grx1-roGFP2 बायोसेन्सरने PN ला लक्ष्य केले. PN लेयरमध्ये, एक व्यवहार्य PN (म्हणजेच, डेंड्राइट्ससह मणीदार रचना किंवा न्यूरोनल मॉर्फोलॉजिकल बदलांचा अभाव) आणि दुहेरी सकारात्मक roGFP2 सेन्सर आणि AAV एन्कोडिंग shRNA PCx किंवा त्याचा नियंत्रण क्रम (प्रत्येक सह-अभिव्यक्त करणारा mCherry) आहे याची खात्री करण्यासाठी स्लाइस पृष्ठभागाच्या सुमारे 50 ते 80 μm खाली अधिग्रहण क्षेत्र निवडले जाते. 2x डिजिटल झूमसह सिंगल-स्टॅक प्रतिमा गोळा करा [उत्तेजना तरंगलांबी: 890 nm; 512 nm 512 पिक्सेल]. शोध: अंतर्गत HyD, फ्लोरोसिन आयसोथियोसायनेट (FITC) फिल्टर गट] आणि 2 ते 3 मिनिटांत प्रतिमा सरासरी वापरुन वक्र फिटिंगसाठी पुरेसे फोटॉन (एकूण 1000 फोटॉन) गोळा केले जातात याची खात्री केली जाते. Grx1-roGFP2 प्रोबची संवेदनशीलता आणि FLIM स्थितीची पडताळणी roGFP2 च्या आयुर्मान मूल्याचे निरीक्षण करून केली गेली जेव्हा परफ्यूजन ACSF मध्ये एक्सोजेनस 10 mM H2O2 जोडला गेला (ऑक्सिडेशन जास्तीत जास्त करण्यासाठी, परिणामी आयुर्मान वाढले), आणि नंतर 2 mM डायथियोथ्रेइटॉल (कमी करण्याची डिग्री कमी करते, परिणामी आयुर्मान कमी होते) जोडला गेला (आकृती S8, D ते G). प्राप्त झालेल्या परिणामांचे विश्लेषण करण्यासाठी FLIMfit 5.1.1 सॉफ्टवेअर वापरा, संपूर्ण प्रतिमेचा एकल घातांकीय क्षय वक्र मोजलेल्या IRF (इन्स्ट्रुमेंट रिस्पॉन्स फंक्शन) मध्ये बसवा आणि χ2 अंदाजे 1 आहे. एका PN चे आयुष्यमान मोजण्यासाठी, मज्जातंतूच्या शरीराभोवतीचा मुखवटा मॅन्युअली काढला गेला आणि प्रत्येक मास्कमधील सरासरी आयुष्यमान परिमाणीकरणासाठी वापरला गेला.
माइटोकॉन्ड्रियल पोटेंशियल विश्लेषण. तीव्र विभागाला १०० एनएम टीएमआरएम थेट परफ्यूज्ड एसीएसएफमध्ये ३० मिनिटांसाठी जोडल्यानंतर, पीएनच्या माइटोकॉन्ड्रियल पोटेंशियल बदलांचे मोजमाप दोन-फोटॉन मायक्रोस्कोपद्वारे केले गेले. टीएमआरएम इमेजिंग ९२० एनएमवर प्रोबला उत्तेजित करून आणि सिग्नल गोळा करण्यासाठी अंतर्गत हायड्रोजन (टेट्रामेथिलरोहोडामाइन आयसोथियोसायनेट: ५८५/४० एनएम) वापरून केले गेले; समान उत्तेजना तरंगलांबी वापरून परंतु वेगळ्या अंतर्गत हायड्रोजन (एफआयटीसी :५२५/५०) वापरून एमटीवायएफपीची प्रतिमा तयार केली गेली. एकल पेशी स्तरावर माइटोकॉन्ड्रियल पोटेंशियलचे मूल्यांकन करण्यासाठी इमेजजेच्या इमेज कॅल्क्युलेटर प्लग-इनचा वापर करा. थोडक्यात, संबंधित चॅनेलच्या सिंगल-स्टॅक कॉन्फोकल प्रतिमेमध्ये पुरकिन्जे सोमालीमध्ये टीएमआरएम सिग्नल दर्शविणारा माइटोकॉन्ड्रियल प्रदेश ओळखण्यासाठी प्लग-इन समीकरण: सिग्नल = मिनी (एमटीवायएफपी, टीएमआरएम) वापरले जाते. नंतर परिणामी मास्कमधील पिक्सेल क्षेत्राचे प्रमाण निश्चित केले जाते आणि नंतर mtYFP चॅनेलच्या संबंधित थ्रेशोल्ड सिंगल-स्टॅक प्रतिमेवर सामान्यीकरण केले जाते जेणेकरून माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता दर्शविणारा माइटोकॉन्ड्रियल अंश मिळेल.
ह्युजेन्स प्रो (सायंटिफिक व्हॉल्यूम इमेजिंग) सॉफ्टवेअर वापरून ही प्रतिमा डिकन्व्होल्युट करण्यात आली. टाइल्सच्या स्कॅन केलेल्या चित्रांसाठी, LAS-X सॉफ्टवेअरद्वारे प्रदान केलेल्या ऑटोमॅटिक स्टिचिंग अल्गोरिथमचा वापर करून एकाच टाइलचे मॉन्टेज बनवले जाते. इमेज कॅलिब्रेशननंतर, इमेजवर पुढील प्रक्रिया करण्यासाठी आणि ब्राइटनेस आणि कॉन्ट्रास्ट एकसमानपणे समायोजित करण्यासाठी इमेजजे आणि अ‍ॅडोब फोटोशॉप वापरा. ​​ग्राफिक तयारीसाठी अ‍ॅडोब इलस्ट्रेटर वापरा.
mtDNA फोकस विश्लेषण. कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपद्वारे डीएनए विरुद्ध अँटीबॉडीज असलेल्या सेरेबेलर सेक्शनवर mtDNA जखमांची संख्या मोजण्यात आली. प्रत्येक पेशीच्या शरीरासाठी आणि केंद्रकासाठी प्रत्येक लक्ष्य क्षेत्र तयार केले गेले आणि संबंधित क्षेत्र मल्टी मेजर प्लग-इन (इमेजजे सॉफ्टवेअर) वापरून मोजण्यात आले. सायटोप्लाज्मिक क्षेत्र मिळविण्यासाठी पेशीच्या शरीराच्या क्षेत्रातून न्यूक्लियर क्षेत्र वजा करा. शेवटी, थ्रेशोल्ड इमेजवर mtDNA दर्शविणाऱ्या सायटोप्लाज्मिक डीएनए पॉइंट्सचे स्वयंचलितपणे प्रमाण मोजण्यासाठी विश्लेषण कण प्लग-इन (इमेजजे सॉफ्टवेअर) वापरण्यात आले आणि प्राप्त परिणाम CTRL उंदरांच्या PN सरासरीनुसार सामान्यीकृत केले गेले. परिणाम प्रति पेशी न्यूक्लियोसाइड्सच्या सरासरी संख्ये म्हणून व्यक्त केले जातात.
प्रथिने अभिव्यक्ती विश्लेषण. एकल पेशी स्तरावर PN मध्ये प्रथिने अभिव्यक्तीचे मूल्यांकन करण्यासाठी ImageJ च्या इमेज कॅल्क्युलेटर प्लग-इनचा वापर करा. थोडक्यात, संबंधित चॅनेलच्या एकल-स्तरीय कॉन्फोकल प्रतिमेमध्ये, समीकरणाद्वारे: सिग्नल = किमान (mtYFP, अँटीबॉडी), पुर्किनामधील विशिष्ट अँटीबॉडीला इम्युनोरिएक्टिव्हिटी दर्शविणारा माइटोकॉन्ड्रियल प्रदेश ओळखला जातो. नंतर परिणामी मास्कमधील पिक्सेल क्षेत्राचे प्रमाण निश्चित केले जाते आणि नंतर प्रदर्शित प्रथिनाचा माइटोकॉन्ड्रियल अंश मिळविण्यासाठी mtYFP चॅनेलच्या संबंधित थ्रेशोल्ड सिंगल-स्टॅक प्रतिमेवर सामान्यीकरण केले जाते.
पुरकिंजे पेशी घनता विश्लेषण. इमेजजेच्या सेल काउंटर प्लग-इनचा वापर पुरकिंजे घनतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी मोजलेल्या पुरकिंजे पेशींच्या संख्येला मोजलेल्या पेशींनी व्यापलेल्या सेरेबेलर रिंगच्या लांबीने भागून केला गेला.
नमुना तयार करणे आणि संकलन. नियंत्रण गट आणि Mfn2cKO उंदरांचे मेंदू 0.1 M फॉस्फेट बफर (PB) मध्ये 2% PFA/2.5% ग्लूटारल्डिहाइडमध्ये निश्चित केले गेले आणि नंतर सिलीएट्स (Leica Mikrosysteme GmbH, व्हिएन्ना, ऑस्ट्रिया) (जाडी 50 ते 60 μm) वापरून कोरोनल विभाग तयार केले गेले. नंतर खोलीच्या तपमानावर 1% os टेट्राऑक्साइड आणि 1.5% पोटॅशियम फेरोसायनाइडमध्ये PB बफरमध्ये 1 तासासाठी निश्चित केले. विभाग तीन वेळा डिस्टिल्ड पाण्याने धुतले गेले आणि नंतर 1% युरेनिल एसीटेट असलेल्या 70% इथेनॉलने 20 मिनिटांसाठी रंगवले गेले. नंतर विभागांना ग्रेडेड अल्कोहोलमध्ये निर्जलीकरण केले गेले आणि सिलिकॉन-लेपित काचेच्या स्लाइड्समध्ये डर्कुपन ACM (अराल्डाइट कास्टिंग रेझिन M) इपॉक्सी रेझिन (इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी सायन्सेस, कॅटलॉग क्रमांक 14040) मध्ये एम्बेड केले गेले आणि शेवटी 60°C वर ओव्हनमध्ये 48 तासांसाठी पॉलिमराइज केले गेले. सेरेबेलर कॉर्टेक्स क्षेत्र निवडण्यात आले आणि लेइका अल्ट्राकट (लेइका मायक्रोसिस्टीम जीएमबीएच, व्हिएन्ना, ऑस्ट्रिया) वर ५० एनएम अल्ट्राथिन विभाग कापले गेले आणि पॉलिस्टीरिन फिल्मने लेपित केलेल्या २×१ मिमी कॉपर स्लिट ग्रिडवर निवडले गेले. हे विभाग १० मिनिटांसाठी H2O मध्ये ४% युरेनिल एसीटेटच्या द्रावणाने रंगवले गेले, H2O ने अनेक वेळा धुतले गेले, नंतर १० मिनिटांसाठी H2O मध्ये रेनॉल्ड्स लीड सायट्रेटने आणि नंतर H2O ने अनेक वेळा धुतले गेले. ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप फिलिप्स CM100 (थर्मो फिशर सायंटिफिक, वॉल्थम, एमए, यूएसए) वापरून TVIPS (Tietz व्हिडिओ आणि इमेज प्रोसेसिंग सिस्टम) TemCam-F416 डिजिटल कॅमेरा (TVIPS GmbH, Gauting, USA) वापरून मायक्रोग्राफ घेण्यात आले. जर्मनी).
AAV ने संक्रमित उंदरांसाठी, मेंदू वेगळा करून 1 मिमी जाडीच्या सॅजिटल सेक्शनमध्ये कापण्यात आला आणि AAV-संक्रमित रिंग (म्हणजे mCherry expressing) ओळखण्यासाठी फ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोप वापरून सेरेबेलमची तपासणी करण्यात आली. ज्या प्रयोगांमध्ये AAV इंजेक्शनमुळे किमान दोन सलग सेरेबेलर रिंगमध्ये पुरकिन्जे सेल लेयर (म्हणजे जवळजवळ संपूर्ण लेयर) ची ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता खूप जास्त असते तेच प्रयोग वापरले जातात. AAV-ट्रान्सड्यूस्ड लूप रात्रीच्या पोस्ट-फिक्सेशनसाठी मायक्रोडिसेक्ट केले गेले (0.1 M कोकोट बफरमध्ये 4% PFA आणि 2.5% ग्लूटारल्डिहाइड) आणि पुढील प्रक्रिया केली गेली. EPON एम्बेडिंगसाठी, फिक्स्ड टिश्यू 0.1 M सोडियम कोकोट बफर (Applichen) ने धुतले गेले आणि 0.1 M सोडियम कोकोट बफर (Applichen) मध्ये 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) ने 4 तास इनक्युबेट केले गेले, नंतर 2 तास धुवा. 0.1 M कोकामाइड बफरसह 3 वेळा पुनरावृत्ती करा. त्यानंतर, ऊतींना निर्जलीकरण करण्यासाठी प्रत्येक इथेनॉल द्रावणात 15 मिनिटे उबविण्यासाठी इथेनॉलची चढती मालिका वापरली गेली. ऊती प्रोपीलीन ऑक्साईडमध्ये हस्तांतरित केली गेली आणि 4°C वर EPON (सिग्मा-अल्ड्रिच) मध्ये रात्रभर उबवली गेली. खोलीच्या तपमानावर ताज्या EPON मध्ये ऊती 2 तास ठेवा आणि नंतर 62°C वर 72 तास एम्बेड करा. 70 nm अल्ट्राथिन भाग कापण्यासाठी अल्ट्रामायक्रोटोम (लाइका मायक्रोसिस्टम्स, UC6) आणि डायमंड चाकू (डायटोम, बीएल, स्वित्झर्लंड) वापरा आणि 37°C वर 15 मिनिटे 1.5% युरेनिल एसीटेटने डाग करा आणि 4 मिनिटे लीड सायट्रेट द्रावणाने डाग करा. कॅमेरा वनव्ह्यू 4K 16-बिट (गॅटन) आणि डिजिटलमायक्रोग्राफ सॉफ्टवेअर (गॅटन) ने सुसज्ज JEM-2100 प्लस ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (JEOL) वापरून इलेक्ट्रॉन मायक्रोग्राफ घेण्यात आले. विश्लेषणासाठी, ५०००× किंवा १०,०००× डिजिटल झूमसह इलेक्ट्रॉन मायक्रोग्राफ मिळवले गेले.
मायटोकॉन्ड्रियाचे मॉर्फोलॉजिकल विश्लेषण. सर्व विश्लेषणांसाठी, इमेजजे सॉफ्टवेअर वापरून डिजिटल प्रतिमांमध्ये वैयक्तिक मायटोकॉन्ड्रियाचे आकृतिबंध मॅन्युअली रेखाटले गेले. वेगवेगळ्या मॉर्फोलॉजिकल पॅरामीटर्सचे विश्लेषण केले जाते. प्रत्येक पेशीच्या एकूण मायटोकॉन्ड्रियल क्षेत्राला सायटोप्लाझम क्षेत्राने (सायटोप्लाझम क्षेत्र = पेशी क्षेत्र-पेशी केंद्रक क्षेत्र) × 100 ने विभाजित करून मिळवलेल्या टक्केवारीत माइटोकॉन्ड्रियल घनता व्यक्त केली जाते. मायटोकॉन्ड्रियाची गोलाकारता सूत्र [4π∙(क्षेत्र/परिमिती 2)] वापरून मोजली जाते. मायटोकॉन्ड्रियाच्या इस्टा मॉर्फोलॉजीचे विश्लेषण केले गेले आणि त्यांच्या मुख्य आकारांनुसार दोन श्रेणींमध्ये ("ट्यूब्युलर" आणि "फोड") विभागले गेले.
ऑटोफॅगोसोम/लायसोसोम संख्या आणि घनता विश्लेषण. डिजिटल प्रतिमेमध्ये प्रत्येक ऑटोफॅगोसोम/लायसोसोमचे रूपरेषा मॅन्युअली रेखाटण्यासाठी इमेजजे सॉफ्टवेअर वापरा. ​​ऑटोफॅगोसोम/लायसोसोम क्षेत्र प्रत्येक पेशीच्या एकूण ऑटोफॅगोसोम/लायसोसोम संरचना क्षेत्राला सायटोप्लाझम क्षेत्राने (सायटोप्लाझम क्षेत्र = पेशी क्षेत्र-न्यूक्लियस क्षेत्र) × 100 ने भागून मोजलेल्या टक्केवारी म्हणून व्यक्त केले जाते. ऑटोफॅगोसोम/लायसोसोमची घनता एकूण संख्येला प्रति पेशी ऑटोफॅगोसोम/लायसोसोम संरचनांच्या संख्येने (सायटोप्लाझमिक क्षेत्राच्या दृष्टीने) (सायटोप्लाझमिक क्षेत्र = पेशी क्षेत्र-न्यूक्लियर क्षेत्र) ने भागून मोजली जाते.
तीव्र विभागणी आणि नमुना तयार करण्यासाठी लेबलिंग. ग्लुकोज लेबलिंग आवश्यक असलेल्या प्रयोगांसाठी, तीव्र मेंदूच्या तुकड्या प्री-इन्क्युबेशन चेंबरमध्ये स्थानांतरित करा, ज्यामध्ये संतृप्त कार्बन (95% O2 आणि 5% CO2), उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लुकोज, 1.0 mM CaCl2 आणि 2.0 mM MgCl2, pH 7.4 आणि 310 ते 320 mOsm पर्यंत समायोजित केले जाते), ज्यामध्ये ग्लुकोज 13 C 6- ग्लुकोज प्रतिस्थापन (युरिसोटॉप, कॅटलॉग क्रमांक CLM-1396) आहे. पायरुवेट लेबलिंग आवश्यक असलेल्या प्रयोगांसाठी, तीव्र मेंदूच्या तुकड्या उच्च Ca2 + ACSF (१२५.० mM NaCl, २.५ mM KCl, १.२५ mM सोडियम फॉस्फेट बफर, २५.० mM NaHCO3, २५.० mM d-ग्लुकोज, १.० mM CaCl2) मध्ये स्थानांतरित करा आणि २.० mM MgCl2 जोडा, pH ७.४ आणि ३१० ते ३२०mOsm पर्यंत समायोजित करा, आणि १ mM १-[१-१३C] पायरुवेट (युरिसोटॉप, कॅटलॉग क्रमांक CLM-१०८२) घाला. ३७°C वर ९० मिनिटे विभागांना उबवा. प्रयोगाच्या शेवटी, विभागांना ७५ मिमी अमोनियम कार्बोनेट असलेल्या जलीय द्रावणाने (pH ७.४) जलद धुतले गेले आणि नंतर ४०:४०:२० (v:v:v) एसीटोनिट्राइल (ACN): मिथेनॉल: पाण्यात एकरूप केले गेले. विभागांना ३० मिनिटे बर्फावर उबवल्यानंतर, नमुने २१,००० ग्रॅमवर ​​४°C वर १० मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले आणि स्पष्ट सुपरनॅटंट स्पीडव्हॅक कॉन्सन्ट्रेटरमध्ये वाळवले गेले. परिणामी वाळलेल्या मेटाबोलाइट पेलेटला विश्लेषण होईपर्यंत -८०°C वर साठवले गेले.
१३ सी-लेबल असलेल्या अमिनो आम्लांचे लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण. लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) विश्लेषणासाठी, मेटाबोलाइट पेलेट 75μl LC-MS ग्रेड पाण्यात (हनीवेल) पुन्हा सस्पेंड करण्यात आले. २१,००० ग्रॅमवर ​​४°C वर ५ मिनिटे सेंट्रीफ्यूगेशन केल्यानंतर, स्पष्टीकरणित सुपरनॅटंटचा २० μl अमिनो आम्ल फ्लक्स विश्लेषणासाठी वापरण्यात आला, तर उर्वरित अर्क ताबडतोब आयन विश्लेषणासाठी वापरण्यात आला (खाली पहा). पूर्वी वर्णन केलेल्या बेंझॉयल क्लोराइड डेरिव्हेटायझेशन प्रोटोकॉल (55, 56) वापरून अमिनो आम्ल विश्लेषण करण्यात आले. पहिल्या चरणात, १०० एमएम सोडियम कार्बोनेट (सिग्मा-अल्ड्रिच) चे १०μl २०μl मेटाबोलाइट अर्कात जोडले गेले आणि नंतर एलसी ग्रेड एसीएनमध्ये २% बेंझॉयल क्लोराइड (सिग्मा-अल्ड्रिच) चे १०μl जोडले गेले. नमुना थोडक्यात व्होर्टेक्स करण्यात आला आणि नंतर २०°C वर ५ मिनिटांसाठी २१,००० ग्रॅमवर ​​सेंट्रीफ्यूज करण्यात आला. साफ केलेले सुपरनॅटंट २ मिली ऑटोसॅम्पलर व्हिलमध्ये शंकूच्या आकाराच्या काचेच्या इन्सर्टसह (२०० μl व्हॉल्यूम) हलवा. Q-Exactive (QE)-HF (अल्ट्रा हाय फील्ड ऑर्बिट्रेप) हाय-रिझोल्यूशन प्रेसिजन मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर सायंटिफिक) शी जोडलेल्या अ‍ॅक्विटी आयक्लास अल्ट्रा-हाय परफॉर्मन्स एलसी सिस्टम (वॉटर्स) वापरून नमुन्यांचे विश्लेषण करण्यात आले. विश्लेषणासाठी, व्युत्पन्न नमुन्याचा २μl १.८μm कण असलेल्या १००×१.० मिमी हाय-स्ट्रेंथ सिलिका T3 कॉलम (वॉटर्स) मध्ये इंजेक्ट करण्यात आला. प्रवाह दर १००μl/मिनिट आहे आणि बफर सिस्टममध्ये बफर A (१० mM अमोनियम फॉर्मेट आणि पाण्यात ०.१५% फॉर्मिक अॅसिड) आणि बफर B (ACN) असतात. ग्रेडियंट खालीलप्रमाणे आहे: ० मिनिटांवर ०%B; ०%B. ० ते ०.१ मिनिटांवर ० ते १५% B; ०.१ ते ०.५ मिनिटांवर १५ ते १७% B; ०.५ ते १४ मिनिटांवर १७ ते ५५% B; १४ ते १४.५ मिनिटांवर ५५ ते ७०% B; १८ मिनिटांवर १४.५ ते ७० ते १००% B; १८ ते १९ मिनिटांवर १००% B; १९ ते १९.१ मिनिटांवर १०० ते ०% B; १९.१ ते २८ मिनिटांवर ०% B (५५, ५६). QE-HF मास स्पेक्ट्रोमीटर पॉझिटिव्ह आयनीकरण मोडमध्ये काम करतो ज्याची मास रेंज m/z (मास/चार्ज रेशो) 50 ते 750 आहे. लागू केलेले रिझोल्यूशन 60,000 आहे आणि मिळवलेले गेन कंट्रोल (AGC) आयन लक्ष्य 3×106 आहे आणि कमाल आयन वेळ 100 मिलिसेकंद आहे. गरम केलेला इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI) स्रोत 3.5 kV च्या स्प्रे व्होल्टेजवर, केशिका तापमान 250°C, शीथ एअरफ्लो 60 AU (मनमानी युनिट्स) आणि 20 AU. 250°C च्या ऑक्झिलरी एअरफ्लोवर काम करतो. S ​​लेन्स 60 AU वर सेट केला आहे.
१३C लेबल असलेल्या सेंद्रिय आम्लांचे अ‍ॅनियन क्रोमॅटोग्राफी-एमएस विश्लेषण. उर्वरित मेटाबोलाइट अवक्षेपण (५५μl) हे डायोनेक्स आयन क्रोमॅटोग्राफी सिस्टम (ICS ५०००+, थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरून QE-HF मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर सायंटिफिक) शी जोडलेल्या वापरून विश्लेषण केले गेले. थोडक्यात, ५μl मेटाबोलाइट अर्क HPLC (२ मिमी × २५० मिमी, कण आकार ४μm, थर्मो फिशर सायंटिफिक) ने सुसज्ज असलेल्या डायोनेक्स आयनपॅक AS११-HC कॉलममध्ये १ च्या फिलिंग रेशोसह पुश-इन आंशिक लूप मोडमध्ये इंजेक्ट केले गेले. ) डायोनेक्स आयनपॅक AG११-HC गार्ड कॉलम (२ मिमी x ५० मिमी, ४μm, थर्मो फिशर सायंटिफिक). कॉलमचे तापमान ३०°C वर राखले जाते आणि ऑटोसॅम्पलर ६°C वर सेट केला जातो. एल्युएंट जनरेटरद्वारे पोटॅशियम हायड्रॉक्साइड ग्रेडियंट तयार करण्यासाठी डीआयोनाइज्ड पाण्याने प्रदान केलेले पोटॅशियम हायड्रॉक्साइड कार्ट्रिज वापरा. ३८०μl/मिनिट या प्रवाह दराने चयापचयांचे पृथक्करण, खालील ग्रेडियंट लागू करणे: ० ते ३ मिनिटे, १० मिमी कोह; ३ ते १२ मिनिटे, १० ते ५० मिमी कोह; १२ ते १९ मिनिटे, ५० ते १०० मिमी कोह; १९ ते २१ मिनिटे, १०० मिमी कोह; २१ ते २१.५ मिनिटे, १०० ते १० मिमी कोह. स्तंभ ८.५ मिनिटांसाठी १० मिमी कोह अंतर्गत पुन्हा संतुलित करण्यात आला.
स्तंभानंतर एल्युटेड मेटाबोलाइट्स १५०μl/मिनिट आयसोप्रोपॅनॉल सप्लिमेंट स्ट्रीमसह एकत्र केले जातात आणि नंतर नकारात्मक आयनीकरण मोडमध्ये कार्यरत असलेल्या उच्च-रिझोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटरकडे निर्देशित केले जातात. MS ६०,००० च्या रिझोल्यूशनसह m/z ५० ते ७५० पर्यंतच्या वस्तुमान श्रेणीचे निरीक्षण करत आहे. AGC १×१०६ वर सेट केले आहे आणि कमाल आयन वेळ १०० ms वर ठेवला आहे. गरम केलेला ESI स्रोत ३.५ kV च्या स्प्रे व्होल्टेजवर चालवला गेला. आयन स्त्रोताच्या इतर सेटिंग्ज खालीलप्रमाणे आहेत: केशिका तापमान २७५°C; शीथ गॅस प्रवाह, ६० AU; सहाय्यक गॅस प्रवाह, ३००°C वर २० AU आणि S लेन्स ६० AU वर सेट केले आहे.
१३C लेबल असलेल्या मेटाबोलाइट्सचे डेटा विश्लेषण. समस्थानिक गुणोत्तराच्या डेटा विश्लेषणासाठी ट्रेसफाइंडर सॉफ्टवेअर (आवृत्ती ४.२, थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरा. ​​प्रत्येक संयुगाची ओळख एका विश्वासार्ह संदर्भ संयुगाद्वारे सत्यापित केली गेली आणि स्वतंत्रपणे विश्लेषण केले गेले. समस्थानिक समृद्धी विश्लेषण करण्यासाठी, प्रत्येक १३C समस्थानिक (Mn) च्या काढलेल्या आयन क्रोमॅटोग्राम (XIC) चे क्षेत्रफळ [M + H] + मधून काढले गेले, जिथे n हा लक्ष्य संयुगाचा कार्बन क्रमांक आहे, जो अमीनो आम्लांचे विश्लेषण करण्यासाठी वापरला जातो किंवा [MH] + आयनांचे विश्लेषण करण्यासाठी वापरला जातो. XIC ची वस्तुमान अचूकता प्रति दशलक्ष पाच भागांपेक्षा कमी आहे आणि RT ची अचूकता ०.०५ मिनिटे आहे. प्रत्येक शोधलेल्या समस्थानिकाचे गुणोत्तर संबंधित संयुगाच्या सर्व समस्थानिकांच्या बेरजेशी मोजून संवर्धन विश्लेषण केले जाते. हे गुणोत्तर प्रत्येक समस्थानिकासाठी टक्केवारी मूल्ये म्हणून दिले आहेत आणि परिणाम मोलर टक्के समृद्धी (MPE) म्हणून व्यक्त केले आहेत, जसे की पूर्वी वर्णन केले आहे (४२).
गोठवलेल्या न्यूरॉन पेलेटला बर्फाळ ८०% मिथेनॉल (v/v) मध्ये एकरूप केले गेले, व्हर्टेक्स केले गेले आणि -२०°C वर ३० मिनिटांसाठी उष्मायन केले गेले. नमुना पुन्हा व्हर्टेक्स करा आणि +४°C वर ३० मिनिटांसाठी ढवळून घ्या. नमुना २१,००० ग्रॅमवर ​​४°C वर ५ मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज करण्यात आला आणि नंतर परिणामी सुपरनॅटंट गोळा केला गेला आणि त्यानंतरच्या विश्लेषणासाठी २५°C वर स्पीडव्हॅक कॉन्सन्ट्रेटर वापरून वाळवला गेला. वर वर्णन केल्याप्रमाणे, क्रमवारी लावलेल्या पेशींच्या अमीनो आम्लांवर LC-MS विश्लेषण केले गेले. ट्रेसफाइंडर (आवृत्ती ४.२, थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरून, प्रत्येक संयुगाच्या मोनोआयसोटोपिक वस्तुमानाचा वापर करून डेटा विश्लेषण केले गेले. प्रीप्रोसेसकोर सॉफ्टवेअर पॅकेज (५७) वापरून मेटाबोलाइट डेटाचे क्वांटाइल सामान्यीकरण केले गेले.
स्लाइस तयार करणे. उंदराला कार्बन डायऑक्साइडने त्वरीत भूल देण्यात आली आणि त्याचा शिरच्छेद करण्यात आला, मेंदू कवटीतून त्वरीत काढून टाकण्यात आला आणि बर्फाने भरलेल्या कंपन करणाऱ्या चाकूचा (HM-650 V, थर्मो फिशर सायंटिफिक, वॉलडॉर्फ, जर्मनी) वापर करून तो 300 ते 375 μm सॅजिटल विभागात कापण्यात आला. थंड कार्बन गॅसिफिकेशन (95% O2 आणि 5% CO2) कमी Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लुकोज, 1.0 mM CaCl2 आणि 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 आणि 310 ते 330 mOsm मध्ये समायोजित करा). मिळवलेले मेंदूचे तुकडे जास्त Ca2 + ACSF (१२५.० mM NaCl, २.५ mM KCl, १.२५ mM सोडियम फॉस्फेट बफर, २५.० mM NaHCO3, २५.० mM d-ग्लुकोज, ४.० mM CaCl2 आणि mM ३.५ MgCl2) pH ७.४ आणि ३१० ते ३२० mOsm असलेल्या चेंबरमध्ये हलवा. काप २० ते ३० मिनिटे साठवा जेणेकरून रेकॉर्डिंग करण्यापूर्वी ते पुनर्संचयित करता येतील.
रेकॉर्डिंग. सर्व रेकॉर्डिंगसाठी स्थिर रेकॉर्डिंग चेंबर आणि २०x वॉटर इमर्सन ऑब्जेक्टिव्ह लेन्स (सायंटिफिका) ने सुसज्ज असलेल्या मायक्रोस्कोप स्टेजचा वापर करण्यात आला. पुटेटिव्ह पुरकिन्जे पेशी (i) शरीराचा आकार, (ii) सेरेबेलमचे शारीरिक स्थान आणि (iii) फ्लोरोसेंट mtYFP रिपोर्टर जीनच्या अभिव्यक्तीद्वारे ओळखल्या गेल्या. ५ ते ११ मेगोहम्सच्या टिप रेझिस्टन्ससह पॅच पिपेट बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका (GB150-10, 0.86 मिमी × १.५ मिमी × १०० मिमी, सायन्स प्रोडक्ट्स, हॉफहेम, जर्मनी) आणि क्षैतिज पिपेट इन्स्ट्रुमेंट्स (P-1000, सटर), नोवाटो, सीए) द्वारे बाहेर काढला जातो. सर्व रेकॉर्डिंग ELC-03XS npi पॅच क्लॅम्प अॅम्प्लिफायर (npi इलेक्ट्रॉनिक GmbH, टॅम, जर्मनी) द्वारे केले गेले, जे सॉफ्टवेअर सिग्नल (आवृत्ती 6.0, केंब्रिज इलेक्ट्रॉनिक, केंब्रिज, यूके) द्वारे नियंत्रित केले गेले. हा प्रयोग १२.५ kHz च्या सॅम्पलिंग दराने रेकॉर्ड करण्यात आला. सिग्नल अनुक्रमे १.३ आणि १० kHz च्या कटऑफ फ्रिक्वेन्सीसह दोन शॉर्ट-पास बेसेल फिल्टर्स वापरून फिल्टर केला जातो. मेम्ब्रेन आणि पिपेटची कॅपेसिटन्स अॅम्प्लिफायर वापरून कॉम्पेन्सेशन सर्किटद्वारे भरपाई केली जाते. सर्व प्रयोग ऑर्का-फ्लॅश ४.० कॅमेरा (हमामात्सु, गर्डेन, जर्मनी) च्या नियंत्रणाखाली केले गेले, जे होकावो सॉफ्टवेअर (आवृत्ती २.८, हमामात्सु, गर्डेन, जर्मनी) द्वारे नियंत्रित केले गेले.
नियमित संपूर्ण पेशींचे कॉन्फिगरेशन आणि विश्लेषण. रेकॉर्डिंग करण्यापूर्वी लगेच, खालील पदार्थ असलेल्या अंतर्गत द्रावणाने पिपेट भरा: ४.० एमएम केसीएल, २.० एमएम नॅक्ल, ०.२ एमएम ईजीटीए, १३५.० एमएम पोटॅशियम ग्लुकोनेट, १०.० एमएम हेप्स, ४.० एमएम एटीपी (एमजी), ०.५ एमएम ग्वानोसिन ट्रायफॉस्फेट (जीटीपी) (ना) आणि १०.० एमएम क्रिएटिनिन फॉस्फेट हे पीएच ७.२५ मध्ये समायोजित केले गेले आणि ऑस्मोटिक दाब २९० एमओएसएम (सुक्रोज) होता. पडदा फुटण्यासाठी ० पीएचा बल लागू केल्यानंतर लगेच, विश्रांती पडदा क्षमता मोजली गेली. -४०, -३०, -२० आणि -१० पीएचे हायपरपोलराइज्ड करंट लागू करून इनपुट रेझिस्टन्स मोजला जातो. व्होल्टेज प्रतिसादाची तीव्रता मोजा आणि इनपुट रेझिस्टन्स मोजण्यासाठी ओमचा नियम वापरा. व्होल्टेज क्लॅम्पमध्ये ५ मिनिटांसाठी उत्स्फूर्त क्रियाकलाप रेकॉर्ड करण्यात आला आणि सेमी-ऑटोमॅटिक रेकग्निशन स्क्रिप्ट वापरून इगोर प्रो (आवृत्ती ३२ ७.०१, वेव्हमेट्रिक्स, लेक ओस्वेगो, ओरेगॉन, यूएसए) मध्ये sPSC ओळखले गेले आणि मोजले गेले. IV वक्र आणि स्थिर-स्थिती प्रवाह वेगवेगळ्या पोटेंशियल्सवर (-११० mV पासून सुरू होणारे) बॅटरी क्लॅम्प करून आणि ५ mV चरणांमध्ये व्होल्टेज वाढवून मोजले जातात. AP चे उत्पादन विध्रुवीकरण प्रवाह लागू करून तपासले गेले. विध्रुवीकरण प्रवाह पल्स लागू करताना सेलला -७० mV वर क्लॅम्प करा. प्रत्येक रेकॉर्डिंग युनिटचा स्टेप आकार स्वतंत्रपणे समायोजित करा (१० ते ६० pA). सर्वाधिक AP वारंवारता निर्माण करणाऱ्या पल्स स्पाइक्सची मॅन्युअली गणना करून कमाल AP वारंवारता मोजा. AP थ्रेशोल्डचे विश्लेषण विध्रुवीकरण पल्सच्या दुसऱ्या व्युत्पन्नाचा वापर करून केले जाते जे प्रथम एक किंवा अधिक AP ट्रिगर करते.
छिद्रित पॅच कॉन्फिगरेशन आणि विश्लेषण. मानक प्रोटोकॉल वापरून छिद्रित पॅच रेकॉर्डिंग करा. खालील घटक नसलेले ATP- आणि GTP-मुक्त पिपेट वापरा: 128 mM ग्लुकोनेट K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA आणि 2 mM MgCl2, आणि pH 7.2 (KOH वापरून) समायोजित करा. पेशी पडद्याची अनियंत्रित पारगम्यता रोखण्यासाठी ATP आणि GTP इंट्रासेल्युलर द्रावणातून वगळले जातात. पंच केलेला पॅच रेकॉर्ड मिळविण्यासाठी पॅच पिपेट अॅम्फोटेरिसिन-युक्त अंतर्गत द्रावणाने (अंदाजे 200 ते 250μg/ml; G4888, सिग्मा-अल्ड्रिच) भरलेले असते. अॅम्फोटेरिसिन डायमिथाइल सल्फोक्साइडमध्ये विरघळले गेले (अंतिम एकाग्रता: 0.1 ते 0.3%; DMSO; D8418, सिग्मा-अल्ड्रिच). वापरलेल्या DMSO च्या एकाग्रतेचा अभ्यास केलेल्या न्यूरॉन्सवर कोणताही महत्त्वपूर्ण परिणाम झाला नाही. पंचिंग प्रक्रियेदरम्यान, चॅनेल रेझिस्टन्स (Ra) चे सतत निरीक्षण केले गेले आणि Ra आणि AP चे मोठेपणा स्थिर झाल्यानंतर (२०-४० मिनिटे) प्रयोग सुरू करण्यात आला. २ ते ५ मिनिटांसाठी व्होल्टेज आणि/किंवा करंट क्लॅम्पमध्ये उत्स्फूर्त क्रियाकलाप मोजला जातो. इगोर प्रो (आवृत्ती ७.०५.२, वेव्हमेट्रिक्स, यूएसए), एक्सेल (आवृत्ती २०१०, मायक्रोसॉफ्ट कॉर्पोरेशन, रेडमंड, यूएसए) आणि ग्राफपॅड प्रिझम (आवृत्ती ८.१.२, ग्राफपॅड सॉफ्टवेअर इंक., ला जोला, सीए) वापरून डेटा विश्लेषण केले गेले. उत्स्फूर्त एपी ओळखण्यासाठी, इगोरप्रोचे न्यूरोमॅटिक v3.0c प्लग-इन वापरले जाते. दिलेल्या थ्रेशोल्डचा वापर करून एपी स्वयंचलितपणे ओळखा, जे प्रत्येक रेकॉर्डसाठी वैयक्तिकरित्या समायोजित केले जाते. स्पाइक इंटरव्हल वापरून, जास्तीत जास्त तात्काळ स्पाइक वारंवारता आणि सरासरी स्पाइक वारंवारता सह स्पाइक वारंवारता निश्चित करा.
पीएन आयसोलेशन. पूर्वी प्रकाशित प्रोटोकॉलशी जुळवून घेऊन, एका विशिष्ट टप्प्यावर (५८) उंदराच्या सेरेबेलममधून पीएन शुद्ध केले गेले. थोडक्यात, सेरेबेलमचे विच्छेदन आणि बर्फाच्या थंड पृथक्करण माध्यमात बारीक केले गेले [HBSS Ca2+ आणि Mg2+ शिवाय, २० एमएम ग्लुकोज, पेनिसिलिन (५० यु/मिली) आणि स्ट्रेप्टोमायसिन (०.०५ मिग्रॅ/मिली) सह पूरक], आणि नंतर ते माध्यम पपेनमध्ये पचवले गेले [HBSS, १-सिस्टीन·एचसीएल (१ मिग्रॅ/मिली), पेपेन (१६ यु/मिली) आणि डीऑक्सिरिबोन्यूक्लिझ I (DNase I; ०.१ मिग्रॅ/मिली) सह पूरक] ३० मिनिटे ३०°C वर उपचार करा. प्रथम, एंजाइमॅटिक पचन रोखण्यासाठी, अंड्यातील श्लेष्मा (१० मिग्रॅ/मिली), बीएसए (१० मिग्रॅ/मिली) आणि डीनेज (०.१ मिग्रॅ/मिली) असलेल्या एचबीएसएस माध्यमात खोलीच्या तपमानावर ऊती धुवा आणि नंतर २० मिग्रॅ ग्लुकोज असलेल्या एचबीएसएस माध्यमात एचबीएसएसमध्ये हळूवारपणे बारीक करून पेनिसिलिन (५० यु/मिली), स्ट्रेप्टोमायसिन (०.०५ मिग्रॅ/मिली) आणि डीनेज (०.१ मिग्रॅ/मिली) एकल पेशी सोडतात. परिणामी पेशी निलंबन ७०μm सेल स्ट्रेनरद्वारे फिल्टर केले गेले, नंतर पेशी सेंट्रीफ्यूगेशन (१११० आरपीएम, ५ मिनिटे, ४°C) द्वारे पेलेट केल्या गेल्या आणि सॉर्टिंग माध्यमात पुन्हा सस्पेंड केल्या गेल्या [एचबीएसएस, २० मिग्रॅ ग्लुकोज, २०% गर्भातील गोवंशीय) सीरम, पेनिसिलिन (५० यु/मिली) आणि स्ट्रेप्टोमायसिन (०.०५ मिग्रॅ/मिली)]; प्रोपिडियम आयोडाइडसह पेशींच्या व्यवहार्यतेचे मूल्यांकन करा आणि पेशींची घनता १×१०६ ते २×१०६ पेशी/मिली पर्यंत समायोजित करा. फ्लो सायटोमेट्रीपूर्वी, सस्पेंशन ५० μm सेल स्ट्रेनरद्वारे फिल्टर केले गेले.
फ्लो सायटोमीटर. FACSAria III मशीन (BD बायोसायन्सेस) आणि FACSDiva सॉफ्टवेअर (BD बायोसायन्सेस, आवृत्ती 8.0.1) वापरून 4°C वर सेल सॉर्टिंग करण्यात आले. सेल सस्पेंशन 100 μm नोजल वापरून 20 psi च्या दाबाखाली ~2800 इव्हेंट्स/सेकंद दराने सॉर्ट केले गेले. पारंपारिक गेटिंग निकष (पेशी आकार, बायमोडल भेदभाव आणि स्कॅटरिंग वैशिष्ट्ये) इतर पेशी प्रकारांपासून PN चे योग्य पृथक्करण सुनिश्चित करू शकत नसल्यामुळे, mitoYFP+ ​​आणि नियंत्रण mitoYFP − उंदरांमध्ये YFP तीव्रता आणि ऑटोफ्लोरेसेन्सची थेट तुलना करून गेटिंग स्ट्रॅटेजी सेट केली जाते. YFP 488 nm लेसर लाइनसह नमुना विकिरणित करून उत्तेजित होतो आणि 530/30 nm बँड पास फिल्टर वापरून सिग्नल शोधला जातो. mitoYFP+ ​​उंदरांमध्ये, Rosa26-mitoYFP रिपोर्टर जीनची सापेक्ष ताकद देखील न्यूरोनल बॉडी आणि अॅक्सॉन तुकड्यांमध्ये फरक करण्यासाठी वापरली जाते. ७-एएडी ५६१ एनएम पिवळ्या लेसरने उत्तेजित केले जाते आणि मृत पेशी वगळण्यासाठी ६७५/२० एनएम बँडपास फिल्टरने शोधले जाते. त्याच वेळी अ‍ॅस्ट्रोसाइट्स वेगळे करण्यासाठी, सेल सस्पेंशनला ACSA-2-APC ने रंगवले गेले, नंतर नमुना ६४० एनएम लेसर लाइनने विकिरणित केला गेला आणि सिग्नल शोधण्यासाठी ६६०/२० एनएम बँडपास फिल्टर वापरला गेला.
गोळा केलेल्या पेशींना सेंट्रीफ्यूगेशन (१११० आरपीएम, ५ मिनिटे, ४°से) द्वारे पेलेट केले गेले आणि वापर होईपर्यंत -८०°सेल्सिअस तापमानावर साठवले गेले. प्रक्रियात्मक परिवर्तनशीलता कमी करण्यासाठी Mfn2cKO उंदीर आणि त्यांच्या कचरा पिल्लांचे एकाच दिवशी वर्गीकरण केले जाते. FACS डेटा प्रेझेंटेशन आणि विश्लेषण फ्लोजो सॉफ्टवेअर (फ्लोजो एलएलसी, अ‍ॅशलँड, ओरेगॉन, यूएसए) वापरून केले गेले.
वर नमूद केल्याप्रमाणे (५९), नंतरच्या mtDNA क्वांटिफिकेशनसाठी क्रमवारी लावलेल्या न्यूरॉन्समधून DNA वेगळे करण्यासाठी रिअल-टाइम PCR वापरला जातो. सुरुवातीला वेगवेगळ्या पेशींवर qPCR चालवून रेषीयता आणि थ्रेशोल्ड संवेदनशीलता तपासली गेली. थोडक्यात, ५० ​​mM tris-HCl (pH ८.५), १ mM EDTA, ०.५% Tween २० आणि proteinase K (२०० ng/ml) असलेल्या लिसिस बफरमध्ये ३०० PN गोळा करा आणि ५५°C वर १२० मिनिटे इनक्युबेट करा. प्रोटीनेज K चे पूर्ण निष्क्रियीकरण सुनिश्चित करण्यासाठी पेशींना १० मिनिटांसाठी ९५°C वर आणखी इनक्युबेट केले गेले. mt-Nd1 साठी विशिष्ट TaqMan प्रोब (थर्मो फिशर) वापरून, mtDNA ७९००HT रिअल-टाइम PCR सिस्टम (थर्मो फिशर सायंटिफिक) मध्ये अर्ध-परिमाणात्मक PCR द्वारे मोजले गेले. विज्ञान, कॅटलॉग क्रमांक Mm04225274_s1), mt-Nd6 (थर्मो फिशर सायंटिफिक, कॅटलॉग क्रमांक AIVI3E8) आणि 18S (थर्मो फिशर सायंटिफिक, कॅटलॉग क्रमांक Hs99999901_s1) जीन्स.
प्रोटीओम नमुना तयार करणे. द्रावण ९५°C वर १० मिनिटे गरम करून आणि सोनिकेट करून, लिसिस बफरमध्ये [६ M ग्वानिडाइन क्लोराईड, १० mM ट्रायस(२-कार्बोक्साइथिल) फॉस्फिन हायड्रोक्लोराईड, १० mM क्लोरोएसीटामाइड आणि १०० mM ट्रायस- HCl मध्ये लायस फ्रोझन न्यूरॉन पेलेट्स]. बायोरप्टर (डायजेनोड) वर १० मिनिटे (३० सेकंद पल्स / ३० सेकंद पॉज कालावधी). नमुना २० mM ट्रायस-एचसीएल (पीएच ८.०) मध्ये १:१० पातळ केला गेला, ३०० एनजी ट्रिप्सिन गोल्ड (प्रोमेगा) सह मिसळला गेला आणि संपूर्ण पचन साध्य करण्यासाठी ३७°C वर रात्रभर उष्मायन केले गेले. दुसऱ्या दिवशी, नमुना २०,००० ग्रॅमवर ​​२० मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज करण्यात आला. सुपरनॅटंट ०.१% फॉर्मिक अॅसिडने पातळ केले गेले आणि द्रावण स्व-निर्मित स्टेजटिप्सने डिसॉल्ट केले गेले. हा नमुना स्पीडव्हॅक इन्स्ट्रुमेंटमध्ये (एपेनडॉर्फ कॉन्सन्ट्रेटर प्लस ५३०५) ४५°C तापमानावर वाळवण्यात आला आणि नंतर पेप्टाइड ०.१% फॉर्मिक अॅसिडमध्ये निलंबित करण्यात आला. सर्व नमुने एकाच व्यक्तीने एकाच वेळी तयार केले. अॅस्ट्रोसाइट नमुन्यांचे विश्लेषण करण्यासाठी, ४ μg डिसॉल्टेड पेप्टाइड्सना टँडम मास टॅग (TMT10plex, कॅटलॉग क्रमांक ९०११०, थर्मो फिशर सायंटिफिक) सह लेबल करण्यात आले ज्याचा पेप्टाइड ते TMT अभिकर्मक गुणोत्तर १:२० होता. TMT लेबलिंगसाठी, ७० μl निर्जल ACN मध्ये ०.८ मिलीग्राम TMT अभिकर्मक पुन्हा सस्पेंड करण्यात आला आणि वाळलेल्या पेप्टाइडची पुनर्रचना ०.१ M TEAB (ट्रायथाइलअमोनियम बायकार्बोनेट) च्या ९ μl मध्ये करण्यात आली, ज्यामध्ये ACN मध्ये ७ μl TMT अभिकर्मक जोडले गेले. एकाग्रता ४३.७५% होती. ६० मिनिटांच्या उष्मायनानंतर, ५% हायड्रॉक्सिलामाइनच्या २ μl ने प्रतिक्रिया शांत करण्यात आली. लेबल केलेले पेप्टाइड्स गोळा केले गेले, वाळवले गेले, ०.१% फॉर्मिक अॅसिड (FA) च्या २००μl मध्ये पुन्हा सस्पेंड केले गेले, दोन भागात विभागले गेले आणि नंतर स्वयं-निर्मित स्टेजटिप्स वापरून डिसॉल्ट केले गेले. अल्टीमेट ३००० अल्ट्रा हाय परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफ (अल्टीमेट ३००० अल्ट्रा हाय परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफ) वापरून, दोन भागांपैकी एक भाग १३०Å१.७μm C१८ कणांनी भरलेल्या १ मिमी x १५० मिमी अ‍ॅक्विटी क्रोमॅटोग्राफिक कॉलमवर फ्रॅक्शन केला गेला (वॉटर्स, कॅटलॉग क्रमांक SKU: १८६००६९३५). थर्मो फिशर सायंटिफिक). ३०μl/मिनिटाच्या प्रवाह दराने पेप्टाइड्स वेगळे करा, १% ते ५०% बफर B पासून ८५ मिनिटांसाठी ९६ मिनिटांच्या स्टेपवाइज ग्रेडियंटसह वेगळे करा, ५०% ते ९५% बफर B पासून ३ मिनिटांसाठी, नंतर ९५% बफर B साठी ८ मिनिटे; बफर A हा ५% ACN आणि १० mM अमोनियम बायकार्बोनेट (ABC) आहे, आणि बफर B हा ८०% ACN आणि १० mM ABC आहे. दर ३ मिनिटांनी अपूर्णांक गोळा करा आणि त्यांना दोन गटांमध्ये (१ + १७, २ + १८, इ.) एकत्र करा आणि व्हॅक्यूम सेंट्रीफ्यूजमध्ये वाळवा.
LC-MS/MS विश्लेषण. मास स्पेक्ट्रोमेट्रीसाठी, पेप्टाइड्स (क्रमांक r119.aq) 25 सेमी, 75 μm आतील व्यासाच्या PicoFrit विश्लेषणात्मक स्तंभावर (नवीन ऑब्जेक्टिव्ह लेन्स, भाग क्रमांक PF7508250) वेगळे केले गेले होते जे 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ माध्यमाने सुसज्ज होते (डॉ. Maisch, mat), Use EASY-nLC 1200 (थर्मो फिशर सायंटिफिक, जर्मनी). स्तंभ 50°C वर ठेवण्यात आला होता. बफर A आणि B हे अनुक्रमे पाण्यात 0.1% फॉर्मिक अॅसिड आणि 80% ACN मध्ये 0.1% फॉर्मिक अॅसिड आहेत. पेप्टाइड्स 65 मिनिटांसाठी 6% ते 31% बफर B पासून 65 मिनिटांसाठी आणि 31% ते 50% बफर B पासून 5 मिनिटांसाठी 200 nl/मिनिट ग्रेडियंटसह वेगळे केले गेले. ऑर्बिट्रेप फ्यूजन मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर सायंटिफिक) वर एल्युटेड पेप्टाइड्सचे विश्लेषण करण्यात आले. पेप्टाइड प्रिकर्सर m/z मापन 350 ते 1500 m/z च्या रेंजमध्ये 120,000 च्या रिझोल्यूशनसह केले जाते. 27% सामान्यीकृत टक्कर उर्जेचा वापर करून, 2 ते 6 च्या चार्ज स्टेटसह सर्वात मजबूत प्रिकर्सर उच्च ऊर्जा C ट्रॅप डिसोसिएशन (HCD) क्लीवेजसाठी निवडला जातो. सायकल वेळ 1 सेकंद वर सेट केला आहे. पेप्टाइड फ्रॅगमेंटचे m/z मूल्य 5×104 च्या सर्वात लहान AGC लक्ष्य आणि 86 ms च्या कमाल इंजेक्शन वेळेचा वापर करून आयन ट्रॅपमध्ये मोजले गेले. फ्रॅगमेंटेशननंतर, प्रिकर्सर 45 सेकंदांसाठी डायनॅमिक एक्सक्लुजन लिस्टमध्ये ठेवण्यात आला. TMT-लेबल असलेले पेप्टाइड्स ५० सेमी, ७५ μm अक्लेम पेपमॅप कॉलमवर वेगळे केले गेले (थर्मो फिशर सायंटिफिक, कॅटलॉग क्रमांक १६४९४२), आणि मायग्रेशन स्पेक्ट्राचे विश्लेषण ऑर्बिट्रेप लुमोस ट्रायब्रिड मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर सायंटिफिक) वर केले गेले जे हाय-फील्ड असममित वेव्हफॉर्म आयन (FAIMS) उपकरणाने सुसज्ज आहे (थर्मो फिशर सायंटिफिक) -५० आणि -७० V च्या दोन भरपाई व्होल्टेजवर चालते. सिंक्रोनाइझेशन प्रिकर्सरवर आधारित निवडलेले MS3 TMT रिपोर्ट आयन सिग्नल मापनासाठी वापरले जाते. पेप्टाइड वेगळे करणे EASY-nLC १२०० वर केले गेले, ९०% रेषीय ग्रेडियंट एल्युशन वापरून, ६% ते ३१% बफर एकाग्रतेसह; बफर A ०.१% FA होता, आणि बफर B ०.१% FA आणि ८०% ACN होता. विश्लेषणात्मक कॉलम ५०°C वर चालवला जातो. FAIMS भरपाई व्होल्टेजनुसार मूळ फाइल विभाजित करण्यासाठी फ्रीस्टाइल (आवृत्ती १.६, थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरा.
प्रथिने ओळख आणि परिमाणीकरण. एकात्मिक अँड्रोमेडा शोध इंजिन वापरून, मूळ डेटाचे विश्लेषण मॅक्सक्वांट आवृत्ती 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) वापरून केले गेले. एक्वेरिया व्हिक्टोरिया कडून मिळवलेल्या क्रे रीकोम्बिनेज आणि वायएफपी अनुक्रमांव्यतिरिक्त, पेप्टाइड फ्रॅगमेंट स्पेक्ट्रामध्ये माऊस संदर्भ प्रोटीओम (प्रोटिओम आयडी UP000000589, मे २०१७ मध्ये युनिप्रोट वरून डाउनलोड केलेले) च्या कॅनोनिकल अनुक्रम आणि आयसोफॉर्म अनुक्रमासाठी शोध घेण्यात आला. मेथिओनाइन ऑक्सिडेशन आणि प्रथिने एन-टर्मिनल एसिटिलेशन व्हेरिएबल बदल म्हणून सेट केले गेले; सिस्टीन कार्बामोयल मेथिलेशन निश्चित बदल म्हणून सेट केले गेले. पचन पॅरामीटर्स "विशिष्टता" आणि "ट्रिप्सिन/पी" वर सेट केले आहेत. प्रथिने ओळखण्यासाठी वापरल्या जाणाऱ्या पेप्टाइड्स आणि रेझर पेप्टाइड्सची किमान संख्या 1 आहे; अद्वितीय पेप्टाइड्सची किमान संख्या 0 आहे. पेप्टाइड नकाशा जुळण्याच्या परिस्थितीत, प्रथिने ओळख दर 0.01 होता. "दुसरा पेप्टाइड" पर्याय सक्षम आहे. वेगवेगळ्या मूळ फायलींमध्ये यशस्वी ओळख हस्तांतरित करण्यासाठी "रनमधील जुळणी" पर्याय वापरा. ​​लेबल-मुक्त परिमाणीकरण (LFQ) (60) साठी LFQ किमान गुणोत्तर संख्या 1 वापरा. ​​प्रत्येक वेळेच्या बिंदूवर किमान एका जीनोटाइप गटात किमान दोन वैध मूल्यांसाठी LFQ तीव्रता फिल्टर केली जाते आणि 0.3 रुंदी असलेल्या सामान्य वितरणातून एक्स्ट्रापोलेट केली जाते आणि 1.8 खाली हलवली जाते. LFQ निकालांचे विश्लेषण करण्यासाठी Perseus संगणकीय प्लॅटफॉर्म (https://maxquant.net/perseus/) आणि R (https://r-project.org/) वापरा. ​​विभेदक अभिव्यक्ती विश्लेषणासाठी लिम्मा सॉफ्टवेअर पॅकेजमधील द्वि-मार्गी मध्यम t चाचणी वापरली गेली (61). ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally आणि pheatmap वापरून एक्सप्लोरेटरी डेटा विश्लेषण केले जाते. TMT-आधारित प्रोटिओमिक्स डेटाचे विश्लेषण MaxQuant आवृत्ती 1.6.10.43 वापरून केले गेले. सप्टेंबर २०१८ मध्ये डाउनलोड केलेल्या UniProt च्या मानवी प्रोटीओमिक्स डेटाबेसमधून कच्चा प्रोटीओमिक्स डेटा शोधा. विश्लेषणात उत्पादकाने प्रदान केलेला समस्थानिक शुद्धता सुधारणा घटक समाविष्ट आहे. विभेदक अभिव्यक्ती विश्लेषणासाठी R मध्ये लिम्मा वापरा. ​​मूळ डेटा, डेटाबेस शोध परिणाम आणि डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह आणि परिणाम हे सर्व डेटा सेट आयडेंटिफायर PXD019690 सह PRIDE भागीदार भांडाराद्वारे ProteomeXchange अलायन्समध्ये संग्रहित केले जातात.
कार्यात्मक भाष्ये विश्लेषण समृद्ध करतात. 8 आठवड्यांपूर्वी डेटा सेटच्या कार्यात्मक भाष्य अटींची समृद्धता निश्चित करण्यासाठी इन्जेन्युटी पाथवे अॅनालिसिस (QIAGEN) टूलचा वापर करण्यात आला (आकृती 1). थोडक्यात, LC-MS/MS (टँडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री) डेटा विश्लेषणातून मिळवलेली परिमाणात्मक प्रथिने यादी खालील फिल्टर निकषांसह वापरली जाते: मस मस्क्युलस प्रजाती आणि पार्श्वभूमी म्हणून निवडली जाते आणि श्रेणी दर्शवते की बेंजामिनीने 0.05 किंवा त्यापेक्षा कमी समृद्धीसाठी समायोजित केलेले P मूल्य महत्त्वपूर्ण मानले जाते. या आलेखासाठी, समायोजित P मूल्यावर आधारित प्रत्येक क्लस्टरमधील शीर्ष पाच अतिरिक्त श्रेणी दर्शविल्या आहेत. बेंजामिनी, क्रिगर आणि येकुटीली (Q = 5%) च्या दोन-स्टेज रेषीय बूस्ट प्रोग्रामचा वापर करून, प्रत्येक श्रेणीमध्ये ओळखल्या जाणाऱ्या महत्त्वाच्या उमेदवारांवर टाइम-कोर्स प्रोटीन अभिव्यक्ती विश्लेषण केले जाते आणि प्रत्येक पंक्तीचे स्वतंत्रपणे विश्लेषण केले जाते. सुसंगत SD स्वीकारण्याची आवश्यकता नाही.
या अभ्यासाच्या निकालांची प्रकाशित डेटाबेसशी तुलना करण्यासाठी आणि आकृती १ मध्ये व्हेन आकृती तयार करण्यासाठी, आम्ही परिमाणात्मक प्रथिने यादी मिटोकार्टा २.० भाष्यांसह एकत्रित केली (२४). आकृती तयार करण्यासाठी ड्रॉ व्हेन आकृती (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) हे ऑनलाइन साधन वापरा.
प्रोटीओमिक्स विश्लेषणासाठी वापरल्या जाणाऱ्या सांख्यिकीय प्रक्रियांबद्दल तपशीलवार माहितीसाठी, कृपया मटेरियल्स अँड मेथड्सच्या संबंधित विभागाचा संदर्भ घ्या. इतर सर्व प्रयोगांसाठी, संबंधित दंतकथेत तपशीलवार माहिती मिळू शकते. अन्यथा निर्दिष्ट केल्याशिवाय, सर्व डेटा सरासरी ± SEM म्हणून व्यक्त केला जातो आणि सर्व सांख्यिकीय विश्लेषणे ग्राफपॅड प्रिझम 8.1.2 सॉफ्टवेअर वापरून केली गेली.
या लेखासाठी पूरक साहित्यासाठी, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 पहा.
हा एक मुक्त प्रवेश लेख आहे जो क्रिएटिव्ह कॉमन्स अॅट्रिब्यूशन-नॉन-कमर्शियल लायसन्सच्या अटींनुसार वितरित केला जातो, जो कोणत्याही माध्यमात वापर, वितरण आणि पुनरुत्पादन करण्यास परवानगी देतो, जोपर्यंत अंतिम वापर व्यावसायिक फायद्यासाठी नाही आणि मूळ काम योग्य आहे असा आधार आहे. संदर्भ.
टीप: आम्ही तुम्हाला फक्त तुमचा ईमेल पत्ता देण्यास सांगतो जेणेकरून तुम्ही पेजवर शिफारस केलेल्या व्यक्तीला कळेल की तुम्हाला ईमेल त्यांना दाखवायचा आहे आणि तो स्पॅम नाही. आम्ही कोणतेही ईमेल पत्ते कॅप्चर करणार नाही.
तुम्ही अभ्यागत आहात की नाही हे तपासण्यासाठी आणि स्वयंचलित स्पॅम सबमिशन रोखण्यासाठी हा प्रश्न वापरला जातो.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. लार्सन
अकार्यक्षम न्यूरॉन्सच्या प्रोटिओमिक्स विश्लेषणातून असे दिसून आले की न्यूरोडीजनरेशनला रोखण्यासाठी चयापचय कार्यक्रम सक्रिय केले जातात.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. लार्सन
अकार्यक्षम न्यूरॉन्सच्या प्रोटिओमिक्स विश्लेषणातून असे दिसून आले की न्यूरोडीजनरेशनला रोखण्यासाठी चयापचय कार्यक्रम सक्रिय केले जातात.
©2020 अमेरिकन असोसिएशन फॉर द ॲडव्हान्समेंट ऑफ सायन्स. सर्व हक्क राखीव. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef आणि COUNTER चे भागीदार आहे. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.